专利名称：诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂的制作方法
技术领域：
本发明属医学免疫学诊断技术领域，特别涉及结核分枝杆菌ESAT6蛋白作为皮肤变态反应原在结核菌感染检测中的应用。
背景技术：
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万。1993年世界卫生组织(WHO)史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申遏制结核病的行动刻不容缓。
中国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，中国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在中国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位；分离出的分枝杆菌中，结核分枝杆菌占86.4％，牛分枝杆菌占2.5％，非结核分枝杆菌占11.1％，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。因此，结核病的早期诊断、鉴别诊断和流行病学调查对结核病的早期、有效化疗和控制结核菌传播都有极其重要的意义。
旧结核菌素、纯蛋白衍化物(PPD)是结核分支杆菌培养滤液蛋白，其作用于人体会激发已致敏机体产生细胞免疫反应，激活T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞增殖、聚集，包裹抗原形成结节，这就是迟发型变态(DTH)反应，其反应强度与细胞免疫呈平行关系。旧结核菌素不易标准化和易发生非特异性反应，目前已经很少使用。PPD皮肤试验已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，中国一直使用硬结≥5mm为阳性，≥20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童≥15mm为强阳性的标准。但由于PPD中含有许多分支杆菌(包括致病性分支杆菌、环境中非致病性分支杆菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分支杆菌复合群感染，还是接触环境中非结核分支杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。因此，PPD皮试诊断结核菌感染的特异性差，用该方法进行结核病流行病学抽样调查获得的结核菌感染率是不准确的，并不能真正反映人群中结核菌感染的实际状况。目前许多国家的学者都在研究新的抗原作为皮肤变态反应原，以期建立新的结核皮肤诊断试剂。
38kDa蛋白又称为Phos蛋白、抗原78、Pab蛋白、抗原5，是脂蛋白，既存在于分枝杆菌细胞内，又分泌于细胞外，是结核分枝杆菌培养滤液中的主要成分之-，其编码序列与大肠杆菌磷酸结合蛋白Phos有51％的同源性。目前的研究已表明天然的38kDa蛋白和重组的38kDa蛋白的免疫原性一致，均可诱导结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌致敏的豚鼠产生DTH反应，缺乏种特异性；38kDa蛋白(抗原5)也可诱导PPD皮试阳性的人体产生典型的DTH反应，但似乎其特异性和敏感性均不如PPD；进一步研究发现38kDa蛋白抗原C末端附近存在一个免疫原性强的T细胞抗原决定簇，其合成多肽38.G(350-369位氨基酸)是结核分枝杆菌复合群特异的，可诱导结核分枝杆菌、BCG致敏小鼠和PPD皮试阳性的健康人产生DTH反应。与PPD相比，合成多肽38.G特异性有所改善，能鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌感染，但依然不能鉴别结核分枝杆菌感染和BCG接种。因此，38kDa蛋白不能作为结核病特异的皮肤诊断试剂。
6kDa早期分泌抗原靶(6kDa early secretory antigenic target，简称ESAT6)蛋白是一种低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，ESAT6蛋白未经糖基化，理论上推导的分子量为9,904Da，等电点为pI4.5。但经双向凝胶电泳和免疫印迹转移分析发现该蛋白有两个等电点pI4和pI4.5，这可能与蛋白质的修饰有关，如酰胺侧链的脱酰胺作用、氧化作用或磷酸化作用。在未变性条件下，凝胶过滤和SDS-PAGE显示其分子量为24kDa，可能是该蛋白的自然构型为多聚体所致；在变性条件下，SDS-PAGE显示其分子量为6kDa；而质谱分析其分子量为9,890±10Da，未发现多聚体形式，说明所形成的多聚体之间的联系可能是非常弱的。它由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌基因组的RD1区域编码，但所有卡介苗菌株及绝大部分环境分枝杆菌基因组均丢失该区域，不表达ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多个T淋巴细胞抗原表位，该蛋白或其多肽可作为T细胞刺激抗原，用于诊断结核菌感染、活动性结核病；目前也在研究其作为疫苗的可能性。但尚未见其作为人用结核皮肤变态反应原的研究报道。
发明内容
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提供一种诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，可用于鉴别卡介苗接种者、特异地检测结核菌感染的皮肤诊断变态反应原，用于人类结核菌感染的检测及其使用方法、剂量和判断标准。
本发明提出的一种诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，其特征在于，所述的结核变态反应原采用结核分枝杆菌ESAT6蛋白。
所述的ESAT6蛋白可为天然的结核分枝杆菌ESAT6蛋白或通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白。
所述的皮肤试剂可为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白浓度为6ug-15ug；本发明还提出将结核分枝杆菌ESAT6蛋白作为结核变态反应原用于人体皮肤试验，检测结核感染者和结核病患者，鉴别卡介苗接种者的特异性皮肤试剂。
本发明用于人体的上述结核皮肤诊断变态反应试剂的具体使用方法包括以下步骤
吸取结核皮肤诊断变态反应试剂0.1ml，所述的皮肤试剂为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌ESAT6蛋白浓度为6ug-15ug；皮内注射于人的前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应(即有无过敏、水泡、淋巴结炎等症状)。反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、＜10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、＜20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应。
每个结核感染者皮内注射0.6ug以上均可引起迟发型变态反应，实际应用(从经济核算的角度)时，注射0.6ug-1.5ug的ESAT6即可，皮内注射后72小时左右是人皮肤反应较理想的观测时间，与PPD反应不同，不会出现水泡、坏死、淋巴管炎、淋巴结炎等症状。
本发明的特点及技术效果本申请人研究证明应用结核分枝杆菌ESAT6蛋白作为结核变态反应原制备成诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，可引起结核感染的人体产生免疫应答。该试剂可特异地诱导结核感染者产生迟发型变态反应，可鉴别是BCG接种、环境中非结核分枝杆菌感染后造成的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染，可用于结核菌感染检测、结核病临床诊断和鉴别诊断、机体免疫反应监测。
具体实施例方式
实施例11.诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂的制备(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白作为结核变态反应原；(2)稀释液的配制16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。
(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白，使其浓度为1Sug/ml；(4)混匀后除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用(若保存得当，可保持活性一年)。
2.上述皮肤试剂在人体的应用(1)吸取上述皮肤试剂0.1ml，皮内注射于人的前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应；(2)结果判定标准反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、＜10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、＜20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应)。
实施例21.诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂的制备(1)采用天然结核分枝杆菌ESAT6蛋白作为结核变态反应原；(2)稀释液的配制16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至6.8，加双蒸馏水定容至2000ml。
(3)用稀释液稀释所述的ESAT6蛋白，使其浓度为6ug/ml；(4)混匀后除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用(若保存得当，可保持活性一年)。
2.本发明的皮肤诊断试剂的应用(1)吸取上述的皮肤诊断试剂0.1ml，皮内注射于人的前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应。
(2)结果判定标准反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、＜10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、＜20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应)。
实施例31.诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂的制备(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白作为结核变态反应原；(2)稀释液的配制16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.0，加双蒸馏水定容至2000ml。
(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白，使其浓度为10ug/ml；(4)混匀后除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用(若保存得当，可保持活性一年)。
2.本发明的上述皮肤诊断试剂在人体的应用(1)吸取上述的皮肤诊断试剂0.1ml，皮内注射于人的前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应。
(2)结果判定标准反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、＜10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、＜20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应)。
表1为采用本实施例制备的诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂诱发本申请人的结核病中心工作人员皮肤反应结果。
表1
(2)结果分析张翠英和张俊仙PPD和本实施例的试剂皮肤试验均呈强阳性反应，说明她们2人均已感染了结核分枝杆菌，结核分枝杆菌很可能在体内增殖活跃，需要预防治疗；李洪敏、朱红、吴雪琼PPD皮肤试验呈强或中等阳性反应，但本实施例的试剂皮肤试验中等或弱阳性反应，说明她们感染了少量结核分枝杆菌，不需要预防治疗；张灵霞和郑越虽然PPD皮肤试验呈中等阳性反应，但本实施例的试剂皮肤试验均阴性，说明他们PPD皮肤试验阳性是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏，并没有感染结核分枝杆菌；曹立雪来自农村，不知是否接种卡介苗，上肢也未见卡痕，其PPD皮肤试验弱阳性而本实施例的试剂皮肤试验阴性，说明其PPD皮肤试验弱阳性很可能是接触环境中非结核分枝杆菌所致；李娟和翟兴情PPD、本发明的皮肤诊断试剂皮肤试验均阴性，说明她们既未感染分枝杆菌，也未接种卡介苗。10名志愿者中，1人PPD皮肤试验出现水泡，而本发明的皮肤诊断试剂皮肤试验无1人出现过敏、水泡、淋巴结炎等症状。
通过上述实验结果证明本发明可用于鉴别卡介苗接种者，特异地检测结核菌感染者及结核病患者。
权利要求
1.一种诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，其特征在于，所述的结核变态反应原采用结核分枝杆菌ESAT6蛋白。
2.如权利要求1所述的诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，其特征在于，所述的ESAT6蛋白为天然的结核分枝杆菌ESAT6蛋白或通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白。
3.如权利要求1所述的诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，其特征在于，所述的皮肤试剂为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌ESAT6蛋白浓度为6ug-15ug。
4.将ESAT6蛋白作为结核变态反应原用于人体皮肤试验，检测结核感染者和结核病患者，鉴别卡介苗接种者的特异性皮肤试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤吸取结核皮肤诊断变态反应试剂0.1ml，所述的皮肤试剂为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌ESAT6蛋白浓度为6ug-15ug；皮内注射于人的前臂掌侧中央；注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径，并记录有无异常反应；判断标准反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、＜10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、＜20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应。
全文摘要
本发明涉及诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂，属医学免疫学诊断技术领域，本发明的特异性皮肤试剂，由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，所述的结核变态反应原采用结核分枝杆菌ESAT6蛋白。本发明还提出将结核分枝杆菌ESAT6蛋白作为结核变态反应原用于人体皮肤试验，检测结核感染者和结核病患者，鉴别卡介苗接种者的特异性皮肤试剂。本发明可引起结核感染的人体产生免疫应答。该试剂可特异地诱导结核感染者产生迟发型变态反应，可鉴别是BCG接种、环境中非结核分枝杆菌感染后造成的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染，可用于结核菌感染检测、结核病临床诊断和鉴别诊断、机体免疫反应监测。
文档编号A61K39/04GK1683009SQ200510055288
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月18日 优先权日2005年3月18日
发明者吴雪琼, 张灵霞, 张翠英, 张俊仙, 史迎昌, 朱琳 申请人:中国人民解放军第三○九医院