甲钴胺分散片及其制备方法

专利名称：甲钴胺分散片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甲钴胺分散片及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术：
随着我国人民的生活水平的不断提高，糖尿病的发病率在逐步上升。据世界卫生组织统计，我国的糖尿病患者自1998年到2000年已经达到2000万人，而且上升趋势极为明显，如果不进行有效的控制，到2010年将达到6000万人。周围神经病变是糖尿病的最常见的严重的并发症之一，发病率可达到80％左右。糖尿病周围神经性病变会使患者产生肢体麻木，严重时会出现肢体溃疡、肌肉萎缩和剧烈的疼痛，甚至引起肢体的坏死导致残废。
甲钴胺为周围神经病变的治疗药物，属于维生素B12类，别名为甲基维生素B12。它通过促进神经细胞内核酸和蛋白质以及神经髓鞘的合成，从而修复受损伤的周围神经。其化学名称为α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)-Co-甲钴酰胺，英文化学名为α-(5，6-dinethylbenzimidazolyl)-Co-methyl-cobamide，分子式为C63H91CoN13O14P，分子量1344.38，主要成分的化学结构为 从1948年Spies等人把维生素B12作为药物研究以来，维生素B12的研究取得飞速的发展，到目前为止，作为药物的维生素B12主要有氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺。前两种维生素B12在人体内没有生物活性氰钴胺(维生素B12)在体内经与钴胺运载蛋白结合形成Tcs-VB12复合物而摄入细胞，然后由溶酶体蛋白酶释放出羟钴胺，羟钴胺在细胞液中甲基化生成甲钴胺。后两种辅酶型维生素B12已经实现人工合成，这为周围神经病变患者的治疗提供了有力武器。在修复受损的神经组织方面，腺苷钴胺必须先转化为甲钴胺才能作为辅酶参与一碳单位循环，从而促进核酸、蛋白质和卵磷脂的合成。
甲钴胺主要存在于生物的血液、髓液中，与氰钴胺相比，其对神经组织有良好的传递性，通过甲基转化反应促进核酸、蛋白质、脂质代谢，修复被损伤的神经组织。
甲钴胺为周围神经病变的治疗药物，属于维生素B12类，别名为甲基维生素B12。它通过促进神经细胞内核酸和蛋白质以及神经髓鞘的合成，从而修复受损伤的周围神经，目前已广泛应用于临床。临床试验结果表明，甲钴胺是治疗糖尿病神经病变的一种安全、有效的药物；甲钴胺和对周围性面瘫均有良好治疗作用，且疗效优于维生素B12；甲钴胺对肘管综合症手术后功能恢复具有促进作用，其疗效优于维生素B12；甲钴胺还有阻止青光眼性视野恶化和促进其视野改善的作用。
分散片剂型使药物溶出快，起效快，服用方便，可直接口服，也可分散于温水中服用，特别适合老人及吞咽有困难的患者，基于分散片这样的优点，有必要提供甲钴胺分散片。

发明内容
本发明的目的在于提供一种甲钴胺分散片。
本发明的另一目的在于提供上述甲钴胺分散片的制备方法。
本发明所述分散片每1000片含有以下组分甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠 5-10g低取代-羟丙基纤维素 15-30g微晶纤维素 50-65g聚维酮 1-3g微粉硅胶 5g甜菊素 5g硬脂酸镁 1g滑石粉 1g其中1.羧甲基淀粉钠是优良的膨胀型崩解剂，崩解效果明显，对甲钴胺的测定无干扰。
2.低取代羟丙基纤维素是一种新型辅料，具有崩解作用，能增加药片崩解后分散的细度，且不影响甲钴胺的测定。
3.微晶纤维素也作为片剂的崩解剂，有良好的崩解效果不干扰主药的测定。
4.PVP作为粘合剂。
5.甜菊甙为矫味剂。
本发明所述的制备方法为在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠 5-10g低取代-羟丙基纤维素15-30g微晶纤维素 50-65g聚维酮 1-3g微粉硅胶 5g甜菊素 5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于50～60℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
本发明甲钴胺分散片的规格优选为500μg片，含量限度为含甲钴胺(C63H91CoN13O14P)应为标示量的90.0～110.0％。
检查项中制订了有关物质、溶出度和片剂的其他常规检查。按照“化学药品药学部分指导原则”中对有关物质检查的规定，对按处方工艺制成的片剂进行有关物质检测结果按自身对照法计算分别为1.70％、1.62％、1.48％，稳定性研究(加速试验、长期试验9个月)结果表明，本发明产品的有关物质限度定为不大于3％。
本发明产品溶出度测定采用小杯法，桨法75转/分钟，高效液相色谱法测定，溶出均一性较好，三批样品溶出度测定结果平均值分别为100.59％、100.56％、100.16％，溶出限度定为不低于标示量的80％。
含量测定采用高效液相色谱法测定。通过方法学试验，精密度较好，RSD均小于2％；平均回收率为99.61±0.90％(n＝9)，RSD为0.90％，三批样品的含量测定结果分别为100.24％、101.36％、99.14％，含量限度订为90.0％～110.0％。
在初步稳定性考察中，因素试验结果表明，甲钴胺分散片对光较敏感，有关物质增加，高温(60℃)条件对甲钴胺分散片有关物质稍有影响，高湿条件下片重增加较为明显，但不影响其他质量指标；加速试验和长期放置试验9个月后，产品的质量没有明显的变化，各项指标仍在质量标准的要求范围内。因此，本发明产品应避免高温并严格避光、密闭保存，有效期为2年。
甲钴胺为周围神经病变的治疗药物，属于维生素B12类，别名为甲基维生素B12。它通过促进神经细胞内核酸和蛋白质以及神经髓鞘的合成，从而修复受损伤的周围神经，目前已广泛应用于临床。甲钴胺可治疗糖尿病神经系统疾病；缓解麻木和疼痛，迅速缓解神经痛；随机开放临床试验显示，甲钴胺能加速面神经功能的恢复；Hanai组织的多中心临床试验显示甲钴胺改善颈椎病引起的疼痛、感觉异常等神经症状有很好的疗效；甲钴胺促进断指再植后手指感觉的恢复双盲试验，表明甲钴胺对断指再植患者的神经功能恢复有重要作用；一项双盲研究表明，对周围神经病变的治疗甲钴胺比其它维生素更有效。国内临床研究也表明甲钴胺组在治疗糖尿病神经病变方面疗效优于其它维生素B族。
临床安全性评价陈家伦等人的临床研究中，甲钴胺副作用发生率为5.6％，无一例因副作用退出研究。
本发明制备方法工艺简单、合理，制出的分散片各项指标均符合要求。
甲钴胺分散片的规格是0.5mg/片。
分散时限的测定是将药片置于20±1℃的100ml水中振摇至完全分散所需时间。(中国药典2000年版二部附录IA)在强光照射(4500±500lx)甲钴胺极不稳定，照射4小时，甲钴胺的降解产物增加到4.26％。按2号处方制备甲钴胺片做如下试验(每批生产100片)。
4.1全部操作在自然光条件下进行，从配料到压成片约3小时。
4.2全部操作严格在避光条件下进行，必要时用弱红光照明。
按照前述处方及工艺制备甲钴胺分散片，抽取一定量作为样品，置于高温条件下(60℃)10天，考察其质量变化。结果见表1。
表1 高温对甲钴胺分散片质量的影响

结论在高温(60℃)条件下考察10天，甲钴胺分散片的有关物质变化不大，在此条件下甲钴胺分散片是稳定的。
取甲钴胺分散片置于高湿条件下(RH92.5％)，放置10天，考察其质量变化。结果见表2。
表2 高湿对甲钴胺分散片质量的影响

结论甲钴胺片在高湿条件下(RH92.5％)放置10天，有关物质基本没有变化，片重明显增加，说明甲钴胺分散片吸湿性较强，包装应注意密闭。
取甲钴胺分散片，置于强光条件下(4500lx)5小时，考察甲钴胺分散片质量的变化。结果见表3。
表3 强光照射对甲钴胺分散片质量的影响

结论甲钴胺分散片在强光条件下(4500lx)放置5小时，有关物质变化较大，说明甲钴胺分散片在光照条件下质量不稳定，包装及储存应注意避光。
由于本发明分散片见光易分解，且具有一定的吸湿性，因此，包装材料一定要避光性能好，密闭性能好。取甲钴胺分散片，采用双铝包装，在光照4500lx、湿度92.5％的环境下放置30天，考察甲钴胺分散片的质量变化。结果见表4。
表4 包装对甲钴胺分散片质量的影响

因此，本发明分散片采用双铝包装。
本发明在方便病患的前提下，提供了甲钴胺分散片这一剂型，相对于普通片剂，分散性好，均一性好，溶出度好，(指前面所述的溶出度测定采用小杯法，桨法75转/分钟，高效液相色谱法测定，溶出均一性较好，三批样品溶出度测定结果平均值分别为100.59％、100.56％、100.16％)使吸收更为迅速，生物利用度更高，服用更方便，尤其适合老、幼和吞服固体困难的病患者。


图1为本发明流程2为标准曲线图3同批样品6次的溶出曲线4三批样品的溶出均一性曲线图具体实施方式
实施例1在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠 5g低取代-羟丙基纤维素15g微晶纤维素 65g聚维酮 3g微粉硅胶 5g甜菊素 5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于50℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
实施例2在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠7g低取代-羟丙基纤维素 20g微晶纤维素 60g聚维酮 2g微粉硅胶5g甜菊素 5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于55℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
实施例3在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠9g低取代-羟丙基纤维素 25g微晶纤维素 55g聚维酮 2g微粉硅胶5g甜菊素 5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于55℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
实施例4在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠10g低取代-羟丙基纤维素 30g微晶纤维素 50g聚维酮 1g微粉硅胶5g甜菊素 5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于60℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
比较例1本实验例对实施例1-4的产品进行崩解时限和分散均匀性的测定，说明本发明分散片具有良好的崩解分散性能。
崩解时限按中国药典2000版二部附录崩解时限测定法测定，以20℃±1℃水为溶剂，3分钟内应完全崩解。
分散均匀性取两片，置于100毫升20℃±1℃水中振摇，记录全部崩解并能通过2号筛的所需时间。
表5

实验例1本实验例为实施例1-3产品甲钴胺分散片质量标准研究试验。
含量限度本品为甲钴胺分散片。规格为每片含甲钴胺(C63H91C0O14P)500μg，实施例1-3产品含量测定结果为100.24％、101.36％、99.14％。结果表明，三批样品的含量均在90.0％～110.0％之间，因此本品的含量限度定为标示量的90.0％～110.0％。
性状无臭无味，色深红，辅料均为白色，压制成片后，显淡红色。故本品性状为淡红色片。三批样品性状见表6。
表6 三批样品性状检查结果

鉴别光谱法鉴别避光操作。取产品，研细，加水制成每1ml约含甲钴胺50μg的溶液，滤过，取滤液照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)测定，可见本品在波长266、342、522nm左右处有最大吸收，结果见下表7表7 三批样品最大吸收波长测定结果

根据上述结果，可将266±1nm、342±1nm、522±1nm作为特征吸收波长用于产品鉴别。
高效液相色谱法鉴别在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间与对照品主峰的保留时间一致，三批样品供试品溶液主峰的保留时间均与对照品主峰的保留时间一致。
化学显色反应鉴别取本品细粉适量(约相当于甲钴胺1mg)，加硫酸氢钾50mg，置坩埚中，灼烧至熔融，放冷，加水3ml，煮沸使溶解，加酚酞指示液1滴，滴加氢氧化钠溶液至显淡红色后，加醋酸钠0.5g，稀醋酸0.5ml与1-亚硝基-2-萘酚-3.6-二磺酸钠0.5ml，即显红色或橙红色，加盐酸0.5ml，煮沸1分钟，颜色不消失。三批样品均显上述反应。取辅料的混合物适量，同法操作，不显上述反应，表明辅料不干扰此项鉴别。检查按照中国药典2000年版二部片剂通则项下要求，制定本品的检查项目。有关物质本品的有关物质检测采用HPLC法。自身对照法计算，色谱条件与系统适用性同“含量测定”项。
最低检测限参照中国药典2000年版二部附录XVIIIA中方法，以信噪比约为3∶1的相应注入甲钴胺的量确定检测限。
取对照品适量，精密称定，连续稀释制成每1ml含甲钴胺0.181μg/ml的溶液，进样20μl，观察主成分峰高约为基线噪音的3倍，以此得出甲钴胺最低检测限为3.62ng。
专属性辅料的干扰试验由于本品含量极低，仅为500μg/片，样品大部分为辅料，应考察是否影响有关物质的测定。我们按片剂处方，称取辅料适量(约相当于甲钴胺分散片4片的辅料量)，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液10μl进样。照有关物质项下测定并记录色谱图，基本无杂峰出现。
加速破坏试验为验证该方法能否检测出样品中的有关物质和在放置时降解产生的杂质，我们对样品进行了在强光照射、高温、高湿和酸、碱、氧化等条件下的破坏性试验，通过检测其中的杂质以确定方法的专属性。
1)高温试验 取105℃放置40小时的样品，照有关物质测定项下操作。
2)光照试验 取经4500lx光照2天的样品，照有关物质测定项下操作。
3)高湿试验 取在RH92.5％条件下放置10天的样品，照有关物质测定项下操作。
4)酸破坏试验 取本品研细的细粉适量(约相当于甲钴胺4mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置6小时，再用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0左右，加流动相稀释至刻度，摇匀，照有关物质测定项下操作。
5)碱破坏试验 取本品研细的细粉适量(约相当于甲钴胺4mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置1小时，再用盐酸溶液调节pH值至6.0左右，加流动相稀释至刻度，摇匀，照有关物质测定项下操作。
6)氧化试验 取本品研细的细粉适量(约相当于甲钴胺4mg)，置10ml量瓶中，加浓度为3％的双氧水5ml，摇匀，放置6小时，加流动相稀释至刻度，摇匀，照有关物质测定项下操作。
测定法避光操作。取本品，研细，精密称取细粉适量，加流动相振摇溶解并稀释制成每1ml约含甲钴胺400μg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液3.0ml置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10～20％。另分别精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，进样，记录色谱图至主成分峰的保留时间的3倍。供试品溶液中的各有关物质峰面积总和均不得大于对照溶液主峰面积，三批样品测定结果见表8。
表8 三批样品有关物质测定结果

有关物质％＝供试品溶液中有关物质峰面积的和/对照溶液主峰面积×3％依据以上检测结果，将本品有关物质的限度定为不得过3.0％。含量均匀度属小剂量片剂，为保证含量均匀，符合中国药典2000年版之规定，应做含量均匀度检查。按中国药典2000年版二部附录V D高效液相色谱法测定，色谱条件见“含量测定”项。
测定法对照品溶液的制备避光操作。取105℃干燥至恒重的甲钴胺对照品适量，精密称定，加流动相振摇溶解并稀释制成每1ml约含甲钴胺50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备避光操作。取本品1片，置10ml量瓶中，加流动相适量，振摇，使甲钴胺溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相液相色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，应符合中国药典2000年版二部附录X E的规定，结果见表9。
表9 甲钴胺分散片含量均匀度测定结果


溶出度测定方法拟采用高效液相法测定，参照含量测定方法进行。
回收率试验分别精密称取甲钴胺适量(高、中、低三组)，按处方量加入相应的各辅料，置100ml溶出杯中，桨法75转，搅拌10分钟，取溶液适量滤过，并配制成高、中、低三组浓度(分别相当于测定浓度5μg/ml的120％、100％和80％)的9份溶液；另精密称取甲钴胺对照品适量，加流动相定量稀释制成5μg/ml的对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算，回收率。结果见表10。
表10 甲钴胺溶出度测定方法学回收率试验结果

本法测定溶出度准确度较高。
溶出条件的选择小杯法的确定因甲钴胺分散片的标示量为500μg，含量较小，因此我们采用小杯法测定甲钴胺的溶出度，溶剂量为100ml。
溶出介质的确定甲钴胺在水中略溶，为胃溶片，因此我们选择了水、0.1mol/L的盐酸作为溶剂进行试验，转速为75转/分，3、5、10分钟分别取样，测定结果见表11，表12。
表11 溶出介质为水的溶出度(％)

表12 溶出介质为0.1mol/ml盐酸的溶出度(％)

试验结果表明，甲钴胺分散片在水和0.1mol/l盐酸两种介质的溶出结果无明显差异，因用水更为方便，因此我们确定水为溶出介质。
溶出转速的选择我们初步选择了50转/分钟、75转/分钟两种转速，进行了试验，在3、5、10分钟分别取样，进行测定，测定结果见表13、表14。
表13 转速为50转/分钟的溶出度(％)

表14 转速为75转/分钟的溶出度(％)

结果表明，转速为75转/分钟时，3分钟平均溶出度达88.66％，5分钟时基本完全溶出；转速为50转/分钟则溶出度偏低。为使试验准确，故确定转速为75转/分钟。溶出均一性试验我们在以水为溶出介质，转速为75转/分钟的条件下，用三批样品作了同批和批间溶出均一性试验。
5.3.3.1批内均一性试验取实施例1产品，测定6次溶出度，结果见下表15。
表15 溶出度均一性试验结果


按上述六组溶出结果绘制溶出曲线，见图22。结果表明此溶出度测定方法重现性较好。
5.3.3.2批间溶出均一性试验取三批样品(实施例1、2、3)分别进行1次溶出度测定，结果见下表16表16 甲钴胺分散片批间溶出均一性试验


按上述结果绘制三批样品的溶出曲线，见图23。
表17三批样品的批间溶出差异结果

结果表明不同批次间的溶出度测定结果RSD小于5％，本品的生产工艺较稳定。溶出度测定法避光操作。取本品，照溶出度测定方法(中国药典2000年版二部附录XC第三法)，以100ml水为溶剂，转速为75转/分钟，依法操作。经10分钟，取溶液适量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另精密称取105℃干燥至恒重的甲钴胺对照品适量，加流动相溶解，并稀释制成每1ml含甲钴胺5μg的溶液，作为对照品溶液。精取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按外标法以峰面积计算每片的溶出量，溶出度计算公式为溶出度(％)＝(A样/W样)/(A标/W标)。三批样品溶出度测定依照上述方法，测定三批样品的溶出度，测定结果见表18。
表18 三批样品溶出度检查结果

根据上述样品的测定结果，本品10分钟时的溶出量限量定为标示量的80％是较为合适的。分散均匀性照“中国药典2000年版二部附录IA片剂”中“分散片”的要求检查，三批样品在3分钟内均全部崩解并通过2号筛。结果见下表19表19 三批样品分散均匀性检查结果

结果表明本品的分散均匀性符合规定。微生物限度检查照微生物限度检查法(中国药典2000年版二部附录ⅪJ)测定，三批样品检查结果见下表20表20 微生物限度检查结果

含量测定采用高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)。色谱条件与系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(18∶82)，用磷酸或0.2mol/L氢氧化钾调节pH至4.5为流动相；检测波长为342nm。严格避光操作。理论板数以甲钴胺主成分峰计算，应不低于2000，主成分峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
按上述色谱条件，严格避光操作，检测三批样品(实施例1、2、3)，记录色谱图，计算理论板数分别为n＝3477、3480、3537，分离度R＞1.5，符合要求。
系统适用性重复性试验取200μg/ml的甲钴胺溶液10μl，连续进样5次，记录峰面积，结果RSD为0.68％，小于2％，符合规定。
方法的验证线性关系和范围避光操作。精密称取甲钴胺对照品21.7mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解配成434ug/ml的溶液，精密吸取0.2、2、4、8、16、25ml置于25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。配制成每1ml含甲钴胺3.472、34.72、69.44、138.88、277.76、434μg的溶液，精取10μl进样，每个浓度进样2次，取平均值，以峰面积(A)对样品浓度(C)作回归计算，回归方程，结果见表21。
表21 甲钴胺峰面积与浓度的线性关系

标准曲线见图2。
回收率试验分别精密称取甲钴胺适量，按处方量加入相应的各辅料，用流动相溶解，滤过，并配制成高、中、低三组浓度(分别相当于测定浓度200μg/ml的120％、100％和80％)的9份溶液；另精密称取甲钴胺对照品适量，加流动相定量稀释制成200μg/ml的对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，依法测定，按外标法以峰面积计算回收率。结果见表22表22 甲钴胺含量测定方法学回收率试验结果

结果表明本法测定甲钴胺的含量准确度较高。溶液稳定性避光操作。配制浓度为200μg/ml的溶液，在0、4、8、24、48小时分别进样10μl，记录色谱图，并计算其相对标准偏差RSD，结果见表23。
表23 溶液稳定性测定结果

专属性比较辅料的HPLC色谱图与样品的HPLC图谱，可见片剂的辅料不干扰甲钴胺的含量测定。
测定法对照品溶液的制备避光操作。取105℃干燥至恒重的甲钴胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解，并稀释制成每1ml含甲钴胺为200μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备避光操作。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于甲钴胺2mg)置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得每1ml含甲钴胺为200μg的溶液。
测定法分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入高效液相，依法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
测定三批样品结果见表24。
表24 甲钴胺分散片三批样品含量测定结果

结论三批甲钴胺分散片含C63H91CoN13O14P均在标示量的90.0～110.0％规定内。
同批样品6次的溶出曲线图见图3。
三批样品溶出均一性曲线图见图4。
实验例2本实验例为本发明产品的稳定性实验数据。
1.样品实施例1、2、3产品，规格500μg/片。
2.考察项目及条件2.1因素影响试验2.1.1强光照射试验取供试样品一批(批号030820)，置于密闭洁净容器中，在4500lx±500lx光照下放置，分别于0、5、10天取样，按照考察内容进行检测。
2.1.2高温试验取供试样品，在60℃条件下放置，分别于0、5、10天取样，按照考察内容进行检测。
2.1.3高湿度试验取供试样品，开口置于密闭恒湿的洁净容器中，在RH90.0％±5％(饱和KNO3溶液，RH92.5％)和RH75％±5％(饱和NaCl溶液)条件下放置，分别于0、5、10天取样，按照考察内容进行检测。
2.2加速试验供试品3批，模拟上市包装，在温度40℃±2℃，相对湿度75％±5％的条件下放置6个月；分别在考察的0、1、2、3、6个月末，取样一次，按照考察的内容进行项目检测。
2.3长期试验供试品3批，模拟上市包装，在温度25℃±2℃，相对湿度60％±10％的条件下放置12个月，分别与考察的0、3、6个月末取样一次，按照考察的内容进行项目检测。
3.考察内容外观色泽、分散均匀性、含量、有关物质、溶出度4.结果4.1因素影响试验4.1.1光照试验光照10天后，甲钴胺分散片中有关物质从1.68％升至10.61％，光照10天后含量从100.37％降到78.13％，均有很大变化，溶出度稍有减少，其它指标无明显变化，见表25、图1～10。
4.1.2高温试验60℃高温条件放置10天后，甲钴胺分散片的有关物质从1.68％升至2.74％，其他指标无明显变化，见表26、图11～14。
4.1.3高湿度试验RH92.5％高湿条件放置5天后，重量增加9.32％，按照要求改在RH75％高湿度条件下考察，放置10天后，重量增加2.14％，其他指标基本无变化，见表27、图15～18。
4.2加速试验条件加速试验条件放置6个月后，三批样品中甲钴胺有关物质分别从1.68％、1.56％、1.76％升至2.24％、2.18％、2.23％，稍有增加，含量等其他指标无明显变化，见表28、图19～42。
4.3长期试验长期试验到目前进行了9个月，并仍在继续。在本试验的条件下，放置9个月后，三批样品中甲钴胺分散片的有关物质、含量等指标基本无变化，见表29；图43～57。
5.结论因素试验结果表明，甲钴胺分散片对光较敏感，有关物质增加，高温条件对甲钴胺分散片有关物质、含量稍有影响，高湿条件片重增加较为明显，但不影响其他质量指标；加速试验和长期放置试验9个月后，本品的质量没有明显的变化，各项指标仍在质量标准的要求范围内。因此，本品应避高温并严格避光、密闭保存，有效期定为2年。
表25 光照(4500lx)试验结果实施例1

表26 高温(60℃)试验结果实施例2


表27 高湿(RH75％)影响试验结果实施例3

表28 加速试验结果

表29 长期试验结果

实验例3本实验例为本发明产品药理研究资料。
1药理作用1.1甲钴胺易为神经细胞的亚微结构如细胞核、线粒体等所摄取给Wistar鼠肌注甲钴胺和氰钴胺，投药2，5，18h后将鼠处死，观察显示甲钴胺在5h内可以很好地转移进入细胞器内，18h时仍然保持高浓度，从而有效地发挥药理作用，而氰钴胺则很差。
1.2甲钴胺促进神经细胞内核酸和蛋白质的合成给大白鼠饲以缺乏维生素B12和叶酸的饮食，通过摄入3H标记的尿苷来观察脊神经细胞RNA的动力学改变，发现用甲钴胺组与腺苷钴胺组及正常饮食组相比，前者RNA是增加的。
1.3甲钴胺促进髓鞘磷脂合成将甲钴胺和其他维生素B12分别加入鼠小脑细胞培养液中观察神经髓鞘形成，甲钴胺组可见鼠神经髓鞘形成增加，而其它维生素B12组则无此现象。
1.4甲钴胺促进轴浆转运和轴突再生用链脲菌素造成大鼠糖尿病模型，大鼠轴浆转运速度降低50％。甲钴胺通过促进蛋白质的合成，使轴索骨架蛋白输送正常化，从而使轴浆转运恢复正常。甲钴胺组与对照组的轴浆转运速度有显著性差异。用丙烯酰胺造成鼠周围神经病变(轴突变性)模型，肌注甲钴胺组与肌注生理盐水组相比，前者的轴突和髓鞘的数目较多。表明甲钴胺能刺激轴突再生。
1.5甲钴胺加速突触传递的恢复和脑内乙酰胆碱含量的正常化大白鼠坐骨神经挤压变性后，其中一组用甲钴胺，另一组则不用。以胞内微电极方法测量终板电位，结果发现甲钴胺组的终板电位的恢复较早，表明甲钴胺可以加速突触传递。以缺乏胆碱的饲料饲养大鼠进行实验，发现甲钴胺可使低下的脑内乙酰胆碱含量正常化。
1.6甲钴胺具有促进神经再生的功能切断家兔腓神经并予以缝合，对甲钴胺组(500ug·d-1，共30d)和对照组的神经组织学检查，包括运动神经传导速度和轴浆转运。在背侧神经根注射3H-亮氨酸，以观察轴浆转运速度。实验表明甲钴胺组和对照组的有髓神经纤维数量都比缝合时有增长，但甲钴胺组明显增多，甲钴胺组中亮氨酸在轴突内转运的数量更多，速度更快(P＜0.01＝。甲钴胺组的运动神经传导速度亦有明显改善(P＜0.01)。
2药物动力学大白鼠口服57Co-CH3B12(25ugkg-1)，72h后，肾、肾上腺、胰、肝、胃的浓度较高，肌肉、睾丸、脑神经等处浓度较低。给大白鼠静脉注射57Co-CH3B12(10ug·kg-1)，24h后，肾、肾上腺、肠、胰、脑垂体的浓度较高，眼、脊髓、脑、肌肉等处浓度低。主要从粪尿中排出。甲钴胺片剂，健康人一次口服120ug，1500ug，均在给药后3h达到血药峰值，其吸收呈剂量依赖性。t1/2等药代动力学参数如表30所示。
表30 甲钴胺的药代动力学参数


服药后8h，尿中总B12的排泄量为用药后24h排泄量的40％～80％。健康人连续使用12周，1500ugd-1至停药后4周的血清总B12的变化值如下给药4周后，血清总B12的变化值约为给药前的2倍，以后逐渐增加，到12周后约2.8倍，中止给药4周的1.8倍。健康人一次肌注或静注甲钴胺500ug，肌注Tmax为0.9±0.1h，静注Tmax3min。最高血清总B12浓度增加部分(Cmax)分别为22.4±1.1、85.0±8.9ng·ml-1。给药后144h，肌注、静注给药的AUC分别为204±12.9，358.6±34.4ng·h·ml-1。健康人静注甲钴胺连用10d，血清总B12浓度(Cmin)随着给药天数的增加而上升。第一天、第二天、第三天给药后的Cmin分别为3.9±1.2ng·ml-1、5.3±1.8ng·ml-1、6.8±1.5ng·ml-1，后一浓度一直维持到给药后期。
实验例4本实验例为本发明产品毒理研究资料。
I.急性毒性小鼠经口服用甲钴胺的LD50大于1000mg/kg。大鼠经口服用甲钴胺的LD50大于500mg/kg。
II.亚急性毒性大鼠口服给药1个月，剂量分别为0.2、2.0、20mg/kg/日，一般症状、体重、血液、尿脏器重量及病理组织学检查等均无特殊变化。
III.长期毒性大鼠口服给药6个月，剂量分别为0.2、2.0、20mg/kg/日，一般症状、体重、血液、尿、脏器重量及病理组织学检查等均无特殊变化。
IV.生殖毒性在大鼠和小鼠的器官形成期口服给药，剂量分别为0.2、2.0、20mg/kg/日，胎仔和新生仔均未出现异常，也未见有致畸现象发生。
V.无机汞的甲基化在试管内，本品与氯化汞反应生成甲基汞，但是在人血液等蛋白质存在的条件下观察不到这项反应。
VI.另外，用无机汞添加的饲料饲养大鼠时，没有因经口投与本品而增加生物体的甲基汞。进一步用无机汞添加的饲料饲养雄性大鼠，并经口投与6个月，分别给予1.5、15mg/kg/日甲钴胺，在一般症状、血液、尿检及病理组织学的观察中，其结果均未见因同时投与无机汞和甲钴胺而带来的影响。
权利要求
1.一种甲钴胺分散片，其特征在于，所述的分散片每1000片含有以下组分甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠5-10g低取代-羟丙基纤维素 15-30g微晶纤维素 50-65g聚维酮 1-3g微粉硅胶5g甜菊素 5g硬脂酸镁1g滑石粉 1g。
2.根据权利要求1所述的甲钴胺分散片，其特征在于，所述的分散片每1000片含有以下组分甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠5g低取代-羟丙基纤维素 15g微晶纤维素 65g聚维酮 3g微粉硅胶5g甜菊素 5g硬脂酸镁1g滑石粉 1g。
3.根据权利要求1或2所述的甲钴胺分散片，其特征在于，所述的分散片规格为500μg/片。
4.甲钴胺分散片的制备方法，其特征在于，所述方法为在避光条件下，将甲钴胺原料过100目筛，羧甲基淀粉钠、低取代-羟丙基纤维素、微晶纤维素、聚维酮、微粉硅胶、甜菊素、硬脂酸镁、滑石粉过80目筛，称取如下量甲钴胺 0.5g羧甲基淀粉钠5-10g低取代-羟丙基纤维素 15-30g微晶纤维素50-65g聚维酮1-3g微粉硅胶 5g甜菊素5g按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于50～60℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，共1000片，检验合格后包装。
全文摘要
本发明提供了一种甲钴胺分散片及其制备方法，所述的分散片每1000片含有以下组分甲钴胺0.5g、羧甲基淀粉钠5－10g、低取代－羟丙基纤维素15－30g、微晶纤维素50－65g、聚维酮1－3g、微粉硅胶5g、甜菊素5g、硬脂酸镁1g、滑石粉1g。该分散片在避光条件下制备。将甲钴胺原料过100目筛，辅料过80目筛，称量，按照等量递加原则将辅料与甲钴胺混合均匀，加入适量30％乙醇制成软材，过20目尼龙筛，制成颗粒，并于50～60℃干燥，过20目筛，整粒，称取约1g硬脂酸镁和1g滑石粉，过筛并与颗粒混合均匀，压片，检验合格后包装。本发明甲钴胺分散片分散性好，均一性好，溶出度好，使吸收更为迅速，生物利用度更高，服用更方便，尤其适合老、幼和吞服固体困难的病患者。
文档编号A61P3/10GK1742748SQ20051010579
公开日2006年3月8日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者周卓和 申请人:周卓和