专利名称：软紫草抗hiv的一种水溶性成分及其提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种软紫草水溶性提取物，该提取物包括一种单体化合物(I)或含有这个单体化合物的3个组合物。从软紫草中提取分离得到的一种具有抗人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)活性成分，该成分化学成分分类上属于二氢苯骈呋喃衍生物类，木脂体的一种。
背景技术：
软紫草(Arnebia euchroma(Royle) Johnston.)为紫草科软紫草属植物，又名新疆紫草、新藏假紫草，多为草本，以根入药。味苦，性寒，具清热凉血，解毒透疹之功效。近代药理学研究证明，紫草具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗生育、抗肿瘤、保肝、止血等多种生理活，已广泛用于医药领域。其主要化学成分为脂溶性化合物。水溶性成分主要为紫草多糖和酚酸类。
经检索发现，日本学者KashiwadaY.等在《Yakugaku Zasshi》第1993年113卷1期818-824发表的Screening test of crude drug extract on anti-HIV activity(生药提取物中抗HIV活性物质的筛选研究)和《J.Nat Prod》(天然产物研究)第1995年58卷3期392-400发表的Anti-AIDS agents，18 Sodium and potassium salts ofcaffeic acid tetramers from Arnebia euchroma as anti-HIV agents(来源于新疆紫草中的抗HIV物质——咖啡酸四聚体的18钠盐和钾盐)中报道，从中国内蒙古生长的新疆紫草干燥根的热水提取物有很强的抗HIV-1活性，其70％含水丙酮提取物具有对抗急性感染的H9细胞中的HIV复制的作用，其有效成分为咖啡酸四聚体的钠、钾盐。该文作者首次提出了用新疆紫草的化学成分之一咖啡酸四聚体的钠、钾盐治疗HIV的可能性，但除了咖啡酸四聚体的钠、钾盐以外的其他成分没有报道。本发明中，我们也分离得到了咖啡酸四聚体的衍生物，同时我们也分离得到一种抗HIV活性比咖啡酸四聚体更强的物质——二氢苯骈呋喃类。另外，迄今为止国内外也未见此物质有抗HIV作用的研究的报道。
发明内容
本发明是通过如下技术实施的，本发明以新疆产的软紫草为原料，但并不以此限止本发明内容。
取新疆软紫草根，先用正己烷脱去脂溶性成分、再用丙酮水溶液提取，水溶部分分别用乙酸乙酯和正丁醇除去中强极性成分，余下的水溶液层经过MCI-Gel CHP-20P、Sephadex LH-20分离后，在ODS C18上，用10％-60％甲醇溶液梯度洗脱后分离得到1个单体化合物和含有该单体化合物的组合化合物。对化合物I用C13-NMR、DEPT、1H-NMR、1H-H COSY、HMBC等光谱测定，确定其化学结构为 化合物I以细胞毒法(MTT法)实验测定了以上化合物及其组合化合物的抗HIV体外活性和细胞毒作用，结果见表1，
图1、2、3和4，相关参数见表2。其中图1为化合物I、组合物1和组合物2浓度与病毒抑制率的关系；图2为组合物3和阳性对照药物齐多夫定浓度与病毒抑制率的关系；图3为化合物I、组合物1和组合物2浓度与细胞毒性的关系；图4为组合物3和阳性对照药物齐多夫定浓度与细胞毒性的关系。
由表1、表2，图1、2、3和4可知，化合物I及其组合化合物在实验浓度范围内(2.8-10μg/ml时具有很强的抗HIV作用，其中化合物I的作用最强。组分1细胞毒性最小，水溶性最好。
本发明从软紫草中寻找到一个二氢苯骈呋喃类成分，该成分具有抗HIV作用，其强度大于过去文献报导的咖啡酸四聚体，有用于治疗HIV感染的前景，也可作为先导化合物，进一步合成新的抗HIV化合物。
表1.化合物I及含有化合物I的组合物抗HIV体外实验结果
表2. 不同样品的抗HIV参数
*注.阳性对照为 齐多夫定具体实施方式
实验部分1.提取物的制备取生药软紫草(优化实验材料为新疆软紫草)的干燥根，用正己烷脱脂，药材凉干。脱脂后的药材400克，加入70％丙酮水溶液4000ml浸泡12小时，过滤，滤液减压浓缩，回收丙酮。得浓缩液，再加入等体积的乙酸乙酯萃取多次后，余下水溶液，用正丁醇萃取3-4次至正丁醇层为浅红色。将水溶液浓缩成稠膏，冷冻干燥，得干燥物34克，备用。
取MCI-Gel CHP 20P，用95％乙醇调和、装柱，浸泡12小时后，分别用95％乙醇和蒸馏水充分洗脱。取上述干燥物，用适量蒸馏水溶解，上柱，用0-50％甲醇水梯度洗脱，TLC检识，合并相同流份，取4个流份，即10％、20％、30％、40％甲醇洗脱液，浓缩干燥。
取上述4个流份，溶解后，分别经Sephadex LH-20，用不同比例的甲醇-水梯度洗脱(1∶0→3∶7)进一步分离，合并相同流份，得8个不同的洗脱物。进一步经ODS C18柱，用10—60％甲醇梯度洗脱，纯化，分离得4个提取物。浓缩，干燥，经光谱解析，其中1个组分为单体即单体化合物I。
2.结构鉴定化合物I淡棕色粉末，三氯化铁乙醇溶液显蓝绿色，提示结构中有酚羟基，溴甲酚蓝乙醇液原位薄层显阳性，提示化合物酚酸类。化合物I的13C-NMR、DEPT、1H-NMR、H-H COSY、HMQC和HMBC谱，分别见图5、6、7、8、9和10。
化合物I碳谱中，δ110—150ppm处为苯环上碳的峰，推断有两个苯环，结合DEPT谱，可知苯环上有7个碳被取代。δ174.2ppm处有一个羧基峰，结合氢谱可知此羧基连在苯环上。δ88.7ppm处的单峰为与氧原子相连的次甲基碳的信号；δ69.2ppm处的峰为羟甲基碳的信号；δ56.4ppm和δ56.5ppm处的峰为2个甲氧基碳的信号；δ51.4ppm处的峰为次甲基碳的信号。(见13C-NMR和DEPT谱)化合物I的氢谱中，δ3.87ppm和δ3.92ppm处有2个尖锐的单峰，为7′和11位的甲氧基氢的吸收峰；结合碳谱及HMQC谱可知，δ5.7ppm处的峰位2位氢的信号；结合H-H COSY谱可知δ3.81ppm处的峰为3位氢的信号；δ4.27ppm和δ4.35ppm处为10位羟甲基氢的吸收峰；δ7.62ppm和δ7.64ppm为羰基取代苯环氢的吸收峰；δ7.11ppm为2′位氢的吸收峰；根据5′和6′位氢的偶合常数可知δ6.87ppm为5′位氢的吸收峰，δ6.94ppm为6′位氢的吸收峰。(见1H-NMR、HMQC和cosy谱)在HMBC谱中，与H-3有远程偶合的相关碳的化学位移分别是150.9、133.6、128.0、119.8、88.7和69.3ppm；与H-2有远程偶合的相关的碳的化学位移分别是150.9、133.6、128.0、119.3、110.9、69.3和51.4ppm。通过以上信息，结合氢谱数据，可确证C-4、C-5、C-8和C-9的化学位移分别是119.8、115.0、150.9和128.0ppm。
化合物I1H-NMR(Me2CO-d6+D2O)，δppm5.7(1H，dd，J＝6.6，H-2)，3.81(1H，t，J＝6.0，H-3)，7.64(1H，s，H-4)，7.62(1H，s，H-7)，7.11(1H，d，J＝1.8 H-2′)，6.87(1H，d，J＝8.2，H-5′)，3.87(3H，s，H-7′)，3.91(3H，s，H-11)，6.94(1H，dd，J＝8.2，1.8，H-6′)，4.27(1H，dd，J＝10.1，7.2，H-10)，4.35(1H，t，J＝5.3，H-10)化合物I13C-NMR(Me2CO-d6+D2O)，δppm88.7(C-2)，51.4(C-3)，119.8(C-4)，132.0(C-5)，144.1(C-6)，115.0(C-7)，150.9(C-8)，128.0(C-9)，69.3(C-10)，56.5(C-11)，174.2(C-12)
3.抗HIV细胞培养药效实验(1)病毒人免疫缺陷病毒1型标准病毒株HIV-1 III B，临床分离对齐多夫定(AZT)敏感的病毒株，用微量全血培养法进行细胞培养，冰冻保存。
(2)细胞正常人T淋巴细胞传代细胞株MT-2，正常人外周血单核细胞PBMC(培养方法同样是微量全血培养法)。
(3)阳性药人免疫缺陷病毒1型逆转录酶抑制剂齐多夫定(AZT)。
(4)培养液生长培养液由培养基RPMI加入1％L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、庆大霉素(100U/ml)组成。细胞混悬液用培养液调节细胞计数至2×105/ml)。
(5)96孔板中每孔加入培养液、100μl细胞混悬液、50μl经过DMSO助溶并稀释的样品，共做8个稀释度，相互之间为2倍、50μl稀释的HIV-III B病毒液。每实验组设3个复孔。同时分别设细胞对照组，病毒对照组，药物对照组。
(6)细胞于37℃二氧化碳培养箱中培养，至第6天MTT法细胞染色。
(7)培养结束时，加入溶解液，放置6-7小时左右，用酶标仪于550nm处测定OD值。确定被测样品保护细胞的程度。
4.细胞毒性试验方法筛选样品的细胞毒性试验，基本方法同“细胞培养药效实验试验”，将生长培养液50μl/孔，代替为病毒稀释液50μl/孔。
权利要求
1.一种作为抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的软紫草根水溶性提取物，该提取物包括一种单体化合物(I)或含有这个单体化合物的3个组合物。该单体化合物的化学特征可命名为2-(3′-甲氧基，4′-羟基)-苯基，3-羟甲基，5-羧基，6-甲氧基-二氢苯骈呋喃[2-(3′-methoxy，4′-hydroxy)-phenyl，3-hydroxymethyl，5-formic acid，6-methoxy-dehydrobenzofuran]结构式表达如下 化合物I
2.根据权利1所述的作为抗HIV的软紫草根水溶性单体化合物和水溶性成分组合物，其特征是，将软紫草或优化实验品种-新疆软紫草分别用正己烷除去脂溶性部分，用70％丙酮回流提取后的水溶液层，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取后的水溶液层分别经过MCI-Gel CHP 20P、Sephadex LH-20上分离后，再在ODS-C18上，用10％--60％甲醇溶液梯度洗脱后分离得到。
全文摘要
一种作为抗HIV的软紫草水溶性提取物，该提取物包括一种单体化合物(I)或含有化合物I的3个组合化合物，属于新发现的抗HIV活性成分。单体化合物I的化学结构式如图。本发明所述化合物抗HIV的作用强度优于过去文献报导的紫草咖啡酸四聚体，有用于治疗HIV感染的前景，也可作为先导化合物，进一步合成系列的抗HIV化合物。
文档编号A61P31/00GK1982303SQ200510129949
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者买尔旦·马合木提, 贺金华, 堵年生 申请人:新疆医科大学