专利名称：用于治疗脂肪团的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于脂肪团(cellulite)的局部治疗或中胚层治疗(mesotherapeutic treatment)的药物制剂，其含有作为活性成分的PDE3抑制剂，可选地以及其他具有抗脂肪团活性的物质。
背景技术：
脂肪团或“水肿-纤维硬化脂膜病”(oedematous-fibroscleroticpanniculopathy)是一种影响皮下组织——位于真皮以下、主要为脂肪性质的组织——的病症。脂肪团几乎只影响妇女，大约80-85％的成年女性人群患此病。皮下脂肪组织占妇女体重的25％，并行使3个基本功能a)其提供物理和机械保护；b)其释放涉及于脂质代谢的脂质和蛋白质；和c)其行使内分泌和旁分泌作用。
就统计学而言，该缺陷影响到大多数白人妇女。在其他人种的妇女中该问题则少见得多。最易患该病症的是“地中海”妇女，一般是由于其雌激素供应更为丰富的缘故。
甚至苗条的妇女也往往呈现更明显的大腿脂肪堆积。
一些因素具有不利影响，引起影响到脂肪物质微循环的局部变化。最终，这导致组织血管系统的解剖学和功能学障碍，产生影响皮下组织和紧邻其上的层即真皮的问题。
脂肪团由脂肪组织微循环的退化、以及随后其最重要的代谢功能的改变引起。
这一组织退化的可见后果是脂肪细胞的体积增加、细胞间隙的流体滞留和流体停滞。
脂肪团可能具有遗传(家族性易患病倾向性)、体质、激素和血管方面的原因，经常被以下所加重久坐生活方式、压力、肝病、不良饮食、肠道病症或以显著流体滞留为特征的病症。
激素失衡(影响卵巢、垂体和甲状腺激素)是脂肪团发生的原因；由于雌激素的作用及其对微循环的影响，妇女易患此病症、尤其是处于青春期、妊娠期和绝经前期阶段的妇女，此时卵巢激素的活性位于峰值。
对脂肪团的易感性因此主要是基于激素而非遗传的因素。
皮下结缔组织的结构特征具有明显的两性差别，这使妇女易生成真皮脂肪团特征性的脂肪组织不规则突出。已提出女性与男性相比皮下脂肪组织抗脂肪分解活性(α2-肾上腺素能依赖性受体)占优势，可促进大腿脂肪沉积增加，因此出现脂肪团(Rosenbaum等，Plastic and ReconstructiveSurgery，101(7)1934-1939，1998)。
此外，源于臀部、髋部或大腿部位的脂肪细胞对儿茶酚胺的脂肪分解响应低于源于内脏脂肪组织的脂肪细胞对儿茶酚胺的响应(Lafontan和Berlan，TIPS，24276-283，2003)，这使得脂肪组织倾向于在这些部位聚集。
目前，脂肪团通常如下治疗-物理疗法除了按摩技术外，目前广泛使用如电子脂肪分解以及更近期的激光疗法、离子电泳、超声疗法和臭氧疗法等技术；不过，这些技术均不能从根本上解决问题。
-膳食添加物市场上有众多膳食添加物(无机盐、尤其是钾、维生素、“燃脂剂”或利尿植物提取物、肠调节剂和生物类黄酮)，声称可增加代谢、改善循环、保护细胞免于损伤并减少脂肪吸收；但是没有有效的临床试验已知可支持这些膳食添加物治疗脂肪团的功效。
-药理学活性产品根据公布于European J.of Dermatology(10(8)596-603，2000的一项研究，在被分析的32种用于脂肪团的产品中，最常见的活性成分是咖啡因，其出现于14种医药产品中。
其他广泛使用的化合物是a)氨茶碱，由于其增加cAMP和脂解作用的能力；关于其抗脂肪团活性的有利和不利发现均已发表。
b)左甲状腺素，其利用甲状腺激素增加代谢的能力。鉴于左甲状腺素的高剂量，可能发生全身性吸收，随后产生心脏刺激效应并干扰甲状腺，这对甲状腺机能亢进患者尤其有害。
c)七叶皂苷，由于其血管保护性类肝素能力。
-中胚层疗法(mesotherapy)这一技术涉及将通常以全身途径施用的药物局部皮内注射。该方法允许少量的产品直接注射入脂肪团部位；该技术因此是非全身性的并且不非常具有侵犯性。使用中胚层疗法可以获得长期治疗效果，因为药物在皮肤水平的吸收较慢。目前用于脂肪团治疗的中胚层疗法中使用的化合物是辅酶A、磷脂酰胆碱、氨茶碱、七叶皂苷和顺势疗法(homeopathic)产品。
脂肪细胞是一种大小容易变化的细胞脂肪生成则体积增大，脂肪分解则体积减小。
脂肪生成由LPL(脂蛋白脂酶)引起临近毛细管的脂肪细胞合成并释放LPL，其水解存在于极低密度脂蛋白(VLDL)和kilomicron中的甘油三酯(TG)。甘油和脂肪酸被释放出来，被脂肪细胞捕获，并被酯化成甘油三酯。
脂肪分解由激素敏感性脂肪酶(HSL)引起该酶水解脂肪细胞中的TG为游离脂肪酸和甘油。活性酶被cAMP依赖性蛋白激酶A磷酸化。
cAMP合成依赖于两种相反的酶系统d)腺苷酸环化酶，其将ATP转化为cAMP。它被α2-肾上腺素能受体负性调节，被β肾上腺素能受体正性调节。
e)磷酸二酯酶，其将cAMP分解为对HSL为惰性的AMP。该活性受咖啡因、茶碱和氨茶碱的抑制。
此外，脂肪细胞分泌多种因子，如瘦素(leptin)(饱感因子(satietyfactor))、血管生成因子(血管紧张素原)、前列腺素PGE2(抗脂肪分解性质)和PGI2(细胞分化)、溶血磷脂酸(细胞增殖)和类固醇。
治疗策略脂肪团治疗的药理学基础的发展已经经历了一系列阶段。在八十年代，使用黄嘌呤(咖啡因)抑制磷酸二酯酶(PDE)。在九十年代，寻求具有排水和抗水肿活性的植物提取物(类黄酮和皂苷类(saponosides))以改善静脉淋巴功能不足(venolymphatic insufficiency)来解决此问题。更近期，已经尝试以细胞外基质和降解酶组分重建结缔组织。
但是，最有希望的治疗方法看来是设计用于增加脂肪细胞代谢和脂肪分解的一种方法。
脂肪分解由以下引发a)β-肾上腺素能受体刺激；b)腺苷或α2-肾上腺素能受体抑制；c)磷酸二酯酶抑制。
已有一系列临床实验评价了局部应用β-肾上腺素能刺激剂(异丙肾上腺素(isoprenalin))、α2-肾上腺素能拮抗剂(育亨宾)和磷酸二酯酶抑制剂(氨茶碱)的效果。结果表明通过药理学方法而不用节食或锻炼，可以获得局部脂肪减少(Greenway等，Obes res，3561S-568S，1995)。
刺激β-肾上腺素能受体可增加脂肪细胞中的cAMP浓度，因此刺激脂肪分解。另一种增加cAMP的方法是通过抑制磷酸二酯酶而防止其降解。
最常见的PDE抑制剂(咖啡因、茶碱和氨茶碱)并不令人满意，因为它们的特异性低并且局部吸收能力差。PDE3、尤其是PDE3B存在于人脂肪细胞中；因此似乎有必要选择性地抑制这些酶的亚型以获得限定于脂肪组织内的效果。
关于该主题提交的专利EP692250是关于黄酮改善微循环的用途，GB1588501、FR2797765、EP1261310和EP1259221涉及黄嘌呤活化脂酶的化妆品用途。
由以上给出的信息可见，脂肪分解活性对于脂肪团的治疗是必须而非足够的。迄今已经使用的治疗方法常常使用磷酸二酯酶抑制剂如黄嘌呤，还没有被证实是完全令人满意的，因此特别需要新的、有效的用于这种多因素、皮下脂肪形态改变的治疗方法。
在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，(2003)，13，3983-3987中描述了一组作为选择性PDE3B抑制剂、潜在可用于治疗肥胖的芳基二氢哒嗪酮类和芳基二甲基吡唑啉酮类化合物。
发明内容
现已发现PDE3(磷酸二酯酶-3)抑制剂、特别是主要在人脂肪组织中表达的PDE3B同种型的抑制剂令人惊讶地有效对抗脂肪团。
相应地，本发明提供PDE3、优选PDE3B抑制剂在制备用于脂肪团的局部或中胚层疗法的药物组合物中的用途。
在PDE3抑制剂中，优选化合物阿那格雷(anagrelide)、西洛他唑(cilostazoI)、匹莫苯(pimobendan)、米力农(milrinone)、氨力农(amrinone)、olprinone、依诺昔酮(enoximone)、环己喹酰胺(cilostamide)、维司力农(vesnarinone)、曲喹嗪(trequinsin)和其药学上可接受的盐。特别优选米力农、曲喹嗪和环己喹酰胺。
根据本发明另一组优选的PDE3抑制剂是Bioorganic & MedicinalChemistry Letters，(2003)，13，3983-3987中描述的化合物，特别是下述化合物1)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮(化合物8a)2)3-{2-[4-(4，4-二甲基-5-氧代-4，5-二氢-1-H-吡唑-3-基)-2，3-二氟-苯基氨基]-6-氧代-环己-1-烯基甲基}-苄腈(化合物18n)3)5-{4-[2-(2，6-二氯-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮(化合物18h)4)5-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮(化合物18a)5)5-{4-[2-(3-硝基-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮(化合物18f)6)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-2-氟-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮(化合物14)此处所用的术语“局部”意为设计用于或涉及局部应用和作用。局部用组合物优选为乳膏、非油性乳膏、软膏、油性-非油性制剂(oil-non oilformulation)、凝胶、喷雾-凝胶和贴剂的形式。用于中胚层疗法时，组合物应采用适合于局部皮内注射的形式，优选注射溶液的形式。
对于局部用形式，活性成分的浓度基于组合物总重量为0.1-3％、优选1-2％，对于用于中胚层疗法的注射形式，活性成分的浓度基于组合物总重量为0.1-1％。除了PDE3抑制剂外，根据本发明的组合物可含有对微循环有活性的化合物、化合物的混合物或提取物，优选皂苷或黄酮或含有它们的提取物。最优选的是银杏(Ginkgo biloba)、山金车属(arnica)、菠萝(ananas)、当归(Angelica siniensis)、积雪草(Centella asiatica)的提取物、以及七叶皂苷。
对微循环有活性的化合物、提取物或物质的混合物以浓度0.1-4％包含于组合物中。
根据本发明的组合物可进一步含有药学上可接受的赋形剂，如佐剂、特别是水或酒精(乙醇)、维生素、特别是生育酚、右旋泛醇或棕榈酸视黄醇酯、增稠剂、防腐剂、保护性胶体、润湿剂、芳香剂、电解质、润湿剂、胶凝剂、皮肤促渗剂、聚合物或共聚物、乳化剂、乳液稳定剂和其他药学上可接受的赋形剂。
优选的防腐剂是低变应原性物质，如乙醇或苯甲醇。
局部制剂可含有油酸的不饱和衍生物，如10-反-12-顺-亚油酸。
特别适合的胶凝剂为卡波姆，更优选卡波姆940、聚丙烯酰胺、异链烷烃-聚乙二醇单十二醚-7、黄原胶、角叉菜胶、阿拉伯树胶、瓜耳胶、琼脂凝胶、藻酸盐和甲基羟基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、聚丙烯酸酯类、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、胶态二氧化硅。脲和泛醇是根据本发明的润湿剂的实例。
制备本发明药物组合物的技术对于本领域技术人员是已知的，其例如描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第XVIII版，MackPublishing Co.中。
上述含有PDE3抑制剂的药物组合物方便地用于人、优选妇女的脂肪团局部治疗中。
以下实施例更详细地阐述本发明。
实施例实施例1.非油性乳膏(％重量)活性成分氨力农1七叶皂苷 2赋形剂单硬脂酸甘油酯8聚乙二醇十六十八烷醇醚(Macrogol cetostearyl ether) 2.5液体石蜡 2白凡士林 2肉豆蔻酸异丙酯4肉豆蔻醇 3对-羟基苯甲酸酯 0.3纯化水适量至 100g实施例1.2活性成分米力农1赋形剂十六醇十八醇混合物4.5单硬脂酸甘油酯8.0液体石蜡 2
白凡士林2二甲硅油0.30肉豆蔻酸异丙酯 1肉豆蔻醇3精油适量纯化水适量至100g实施例1.3活性成分曲喹嗪 2赋形剂油酸5.0硬脂酸聚乙二醇酯40(Macrogol stearate 40) 9.0十六醇十八醇混合物 6.0丁基羟基苯甲醚 0.02氨丁三醇0.1二甲硅油0.3卡波普(Carbopol)980 0.3丙二醇 20.0亚硫酸钠0.1精油适量纯化水适量至100g实施例2水醇凝胶(Hydroalcoholic gel)(％重量)活性成分米力农 2赋形剂
卡波姆1.5乙醇96°EP40ml精油 适量三乙醇胺 适量以调节pH纯化水适量至 100g实施例3亲脂性乳膏(％重量)活性成分氨力农1赋形剂二异硬脂酸聚甘油(3)酯 4油酸甘油酯2蜂蜡 7二辛醚10己基癸醇/月桂酸己基癸酯 1085％甘油 5七水硫酸镁1对-羟基苯甲酸酯 0.1精油 适量纯化水适量至 100g实施例4非油性乳膏(％重量)活性成分3-{2-[4-(4，4-二甲基-5-氧代-4，5-二氢-1-H-吡唑-3-基)-2，3-二氟-苯基氨基]-6-氧代-环己-1-烯基甲基}-苄腈1赋形剂油酸 5.0硬脂酸聚乙二醇酯409.0
十六醇十八醇混合物6.0丁基羟基苯甲醚0.02氨丁三醇 0.1二甲硅油 0.3卡波普980 0.3丙二醇20.0亚硫酸钠 0.1纯化水适量至 100g以下活性成分可根据实施例4制成非油乳膏6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮；5-{4-[2-(2，6-二氯-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；5-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；5-{4-[2-(3-硝基-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-2-氟-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮。
实施例5用于中胚层疗法的注射溶液(5ml/瓶)(用量以mg/ml计)活性成分米力农5赋形剂焦亚硫酸钠，乳酸 0.2-0.5加纯化水适量至5ml
实施例6功效试验脂肪团是一个具有多因素病因学的难题，其中脂肪生成发挥关键作用。因此，在筛选潜在的抗脂肪团药物的初始阶段，体外测定脂肪分解活性是一个要素，尽管它对于最终候选药物的确定而言在总体上是不充分的。因此脂肪分解活性的体外试验必须与评价体内功效的试验相结合。
体外试验●由脂肪细胞甘油三酯的脂肪分解所产生的细胞外甘油的测定体外脂肪分解试验使用人脂肪细胞进行，所述脂肪细胞是通过诱导分化而得自其祖先细胞前脂肪细胞(Promocell)的原代培养物。实际的脂肪细胞分化是通过测定甘油-3-磷酸酯脱氢酶(一种在成熟脂肪细胞但不在前脂肪细胞中表达的酶)并使用油红O(Sigma)测定胞内水平聚集的脂质而确定的。
将PDE3抑制剂与脂肪细胞以不同浓度预孵育15分钟；然后加入能够诱发脂肪分解弱刺激作用的10nM异丙肾上腺素(1μM异丙肾上腺素可获得25％最大响应)。4小时后移走培养基，用油红O测定每孔内所聚集的胞内脂质的量。
脂肪分解活性通过测定甘油三酯水解后释放到细胞外基质中的甘油而评价。
在此试验中，具有PDE3抑制剂、包括根据本发明的选择性PDE3抑制剂的制剂被证实与含有非选择性PDE抑制剂(咖啡因、茶碱)的类似制剂相比具有相当或更好的效果。
在培养的人脂肪细胞中某些PDE抑制剂对由10nM异丙肾上腺素刺激的甘油释放的活性
●脂肪细胞中cAMP生成的测定cAMP为细胞内信使，其水平取决于其合成(腺苷酸环化酶活性)和分解(磷酸二酯酶活性)。将脂肪细胞转移至盐溶液中，向其中加入脂解剂(腺苷酸环化酶活化剂)、抗脂解剂(磷酸二酯酶活化剂)和PDE3抑制剂。孵育适当一段时间后，中断孵育，提取细胞内形成的cAMP。将细胞提取物冻干、然后复溶并用特殊的商业可得比色酶免疫测定法(EIA)(Amersham，Cayman)测定。根据厂商的说明书测定cAMP水平。在本试验中，具有根据本发明的PDE3拮抗剂的制剂证实比类似的含有非选择性PDE抑制剂(咖啡因、茶碱)的制剂更有效。
体内试验对大腿外上部呈明显脂肪团的10名健康成年女性进行了检查。
每名患者作为其自身对照以评价有效性和安全性。将含有活性成分(1％米力农)的乳膏以随机方式涂敷于一只大腿的外部，而将乳膏基质(无活性成分)涂敷于另一只大腿的同样区域。
使用约2-3cm的乳膏治疗，按摩2-3分钟直至被吸收，每天重复两次，持续2个月。
试验过程中，患者不施行锻炼计划并且不受任何膳食限制。
定期测量每只大腿在膝盖和大转子之间三分之二处的周长，直至治疗结束时。药物治疗的大腿与未治疗的大腿相比，周长缩短了2.9±0.7cm，其范围为1.3-4.7cm。
在观察阶段末期，测定血中的PDE3，并未检测到化合物的存在。
权利要求
1.用于局部施用的药物组合物，其含有PDE3抑制剂作为活性成分，用于治疗脂肪团。
2.权利要求1所要求的药物组合物，其含有PDE3B同种型抑制剂作为活性成分。
3.权利要求1-2所要求的组合物，其中所述抑制剂选自下组阿那格雷、西洛他唑、匹莫苯、米力农、氨力农、olprinone、依诺昔酮、环己喹酰胺、维司力农和曲喹嗪。
4.权利要求3所要求的组合物，其中所述抑制剂为米力农、环己喹酰胺或曲喹嗪。
5.权利要求1-2所要求的组合物，其中所述抑制剂选自下组a)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮；b)3-{2-[4-(4，4-二甲基-5-氧代-4，5-二氢-1-H-吡唑-3-基)-2，3-二氟-苯基氨基]-6-氧代-环己-1-烯基甲基}-苄腈；c)5-{4-[2-(2，6-二氯-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；d)5-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；e)5-{4-[2-(3-硝基-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；f)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-2-氟-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮。
6.权利要求1-5所要求的组合物，其为凝胶、喷雾凝胶、乳膏、非油性乳膏、油性-非油性制剂、软膏或贴膏的形式。
7.权利要求1-5所要求的组合物，其为适于局部皮内注射或中胚层疗法的形式。
8.权利要求7所要求的组合物，其为注射溶液的形式。
9.权利要求1-8所要求的组合物，其中活性成分的量为以重量计0.1-3％。
10.权利要求6和9所要求的组合物，其中所述的量为以重量计1-2％。
11.权利要求7-9所要求的组合物，其中所述的量为以重量计0.1-1％。
12.权利要求1-11所要求的组合物，进一步含有对微循环有活性的化合物、物质的混合物或提取物。
13.权利要求12所要求的组合物，含有山金车属、银杏、凤梨、当归(Angelica siniensis)或积雪草的提取物。
14.权利要求12所要求的组合物，其中所述化合物为皂苷或黄酮。
15.权利要求14所要求的组合物，其中所述化合物为七叶皂苷。
16.权利要求12-15所要求的组合物，其中对微循环有活性的化合物、物质的混合物或提取物以按重量计0.1-4％的浓度存在。
17.PDE3抑制剂在制备用于脂肪团的局部或中胚层疗法的药物组合物中的用途。
18.权利要求17所要求的用途，其中PDE3B抑制剂选自下组阿那格雷、西洛他唑、匹莫苯、米力农、氨力农、olprinone、依诺昔酮、环己喹酰胺、维司力农、曲喹嗪。
19.权利要求17所要求的用途，其中PDE3B抑制剂选自下组a)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮；b)3-{2-[4-(4，4-二甲基-5-氧代-4，5-二氢-1-H-吡唑-3-基)-2，3-二氟-苯基氨基]-6-氧代-环己-1-烯基甲基}-苄腈；c)5-{4-[2-(2，6-二氯-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；d)5-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-苯基]-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；e)5-{4-[2-(3-硝基-苄基)-3-氧代-环己-1-烯基氨基]-2-氟-苯基}-4，4-二甲基-2，4-二氢-吡唑-3-酮；f)6-[4-(2-苄基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-2-氟-苯基]-5-甲基-4，5-二氢-2-H-哒嗪-3-酮。
全文摘要
本申请公开了用于局部施用或用于中胚层疗法的含有PDE3抑制剂作为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗脂肪团中的用途。
文档编号A61K31/4166GK101076323SQ200580042736
公开日2007年11月21日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月14日
发明者M·兰迪尼, S·朱利亚尼, A·焦利蒂 申请人:曼纳里尼里切尔凯有限公司