专利名称：阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种新的基因治疗复合制剂，具体涉及阿霉素类抗肿瘤 药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途和使用方法。
背景技术：
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)，属于微小病毒科(parvoviridae),目前已 发现的AAV至少有8种血清型，AAV1-AAV8。它们的主要区别在衣壳蛋白，并因此导致各 种不同血清型AAV对不同的组织和细胞感染效率不同。目前基因治疗领域普遍采用的AAV 为血清型2，即AAV2。由基因工程改造产生的重组腺相关病毒称rAAV， rAAV作为基因传 递载体的优越性主要有①AAV对人体无致病性，十分安全，约80%的成年人的血清中可 以检测到AAV壳蛋白的抗体，但不表现出疾病；②免疫原性低，可以反复多次使用；③宿 主范围广，并能感染分裂细胞和非分裂细胞； 野生型AAV可定点整合至人的19号染色 体，并能较稳定的存在，既避免了其他病毒因随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因 激活的危险，又为外源基因的表达提供了较固定的染色体环境。重组后的rAAV特异性的基 因组整合虽不明显，但可以环状或串联状核外附加体的形式长期存在，介导外源基因持续稳 定表达；⑤AAV具有较好的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于纯化和 储存。因此，作为一种基因导入系统，AAV载体在遗传性疾病基因治疗中的应用日见增多， 据不完全统计，截止2006年1月，在全世界范围内开展的基因治疗临床试验中38项(3.3%) 采用重组腺相关病毒作载体(简称rAAV)，主要应用于遗传病。目前在眼底病如遗传性视 网膜变性等疾病的基因治疗实验研究中也不乏使用rAAV的。但是，AAV载体也存在某些局限性①AAV病毒感染后，其携带的外源基因需要经过 较长时间才开始表达，这是因为AAV为单链DNA病毒，进入细胞后必须转变成双链才开始 表达，因此不适合用于需要治疗基因快速显效的疾病；②对细胞的感染和转导效率低，通 常比腺病毒低1X1()S 1X10M咅。通常需要按一个细胞至少1乂103 1乂104个AAV病毒颗 粒数计算并使用，而腺病毒则只需按一个细胞10 100个病毒颗粒计算并使用。◎总体上 讲，治疗基因的表达水平较低。因此，实际应用中很难达到预期的治疗效果。
如何才能增加rAAV对细胞的感染和转导效率呢？己知rAAV进入细胞首先必须与细胞表面的膜受体结合。已知二类受体与rAAV进入细胞有关， 一类是基础受体，如硫酸肝素蛋 白多糖，另一类是共受体，如整合素a 。 rAAV进入细胞的过程先后由基础受体和共受体介导。因此，细胞表面受体的丰度决定了 rAAV的感染效率。由于细胞膜表面的受体数 量较难改变，故要提高rAAV对细胞的转导效率主要拟从提高rAAV介导的治疗基因表达效 率着手。rAAV是一种单链DNA病毒，根据rAAV的生活周期，当AAV单独感染细胞时，AAV 与受体结合后启动内化，然后脱去衣壳，进而被转移到核内。一部分单链病毒DNA被宿主 细胞识为受损伤的DNA而被降解。另一部分单链病毒DNA通过以自身为模板进行复制形成 双链，或由二条方向不同的单链病毒DNA以碱基配对的方式形成双链。只有双链DNA分子 才能进一步转录表达外源基因。因此，rAAV从单链到双链的转变是限制rAAV表达的一个 瓶颈。当有辅助病毒感染时，AAV将出现产毒性感染，即发生大量病毒DNA复制，并产生新 的病毒颗粒。目前已知的辅助病毒有腺病毒和疱疹病毒。辅助病毒感染可以在AAV感染之 前、同时或之后进行。有研究报道腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1A、 EIB、 E2A 和E4。单疱病毒中的ICPO、 ICP4、螺旋酶、引物酶复合物UL5、 UL8、 UL52、和DNA结合 蛋白UL29参与。因此，在生产AAV及rAAV时必须同时采用腺病毒或单疱病毒联合感染， 或与带有腺病毒E1A、 E1B、 E2A和E4辅助基因的质粒共转染。本领域技术人员认为，由于腺病毒的免疫原性较强，可能影响rAAV携带的外源基因表 达的持续时间。在基因治疗研究和临床试验中通常都是单独使用rAAV,故效果不理想。有文献报道某些因素如紫外线照射、Y射线照射、某些化学致癌剂处理后，在某些类型 的晡乳动物细胞，即使没有辅助病毒存在也可发生AAV产毒性感染。虽然这些情形下，每 个细胞产生AAV病毒的量比有辅助病毒存在时低几个数量级，但这一事实提示还可以采取 除辅助病毒以外的其他方法人为提高AAV的转导效率。不仅增加基因治疗的效果，也提高 了基因治疗的安全性。阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，属于DNA拓扑异构酶抑制物，临床上常用的有阿 霉素、表阿霉素，商品名有多柔吡星、表柔吡星、比柔吡星等，用于治疗恶性肿瘤。阿霉素 又称14-羟基正定霉素，阿得里亚霉素，14-羟基柔红霉素，外文縮写有ADM或DR或DOX 或DXR。化学名为(7S: 9S) -9-羟乙酰基-4-甲氧基-7， 8， 9， 10-四氣-6, 7， 9， 11-四羟 基-7-0-(2，，3，，6，，-三去氧-3，-氯基-a-l-来苏已吡喃基)-5，12-萘二酮。分子式C27H29N011。DXR是从S'treptomycer peucetisu var， caerius的发酵液中提取的一种糖苷抗生素。因其抗瘤谱 广，对乏氧细胞有效，故在肿瘤治疗中占有重要地位。DXR在化学结构、性状、作用机制和 体内过程与柔红霉素(DNR)极为相似，其差别仅在侧链C-14上为羟基(CH20H)，但对 多种动物肿瘤的抑制率均高于DNR，且毒性略低。DXR既含有脂溶性的蒽环配基，又有水 溶性的柔红糖胺，并有酸性酚羟基和碱性氨基，具有很强的抗肿瘤活性。其抗肿瘤作用可归 纳为四个方面 一，与DNA结合，其配基嵌入DNA双螺旋碱基对(主要为G-C碱基对)之 间，嵌入配基的B环和C环与碱基发生作用，这样DNA作为核酸合成模板的功能受损，抑 制DNA聚合酶的活性，阻碍DNA和RNA的合成；二， DXR在酶的作用下还原为半醌自由 基，此自由基的形成与心脏毒性有关；三，与铜、铁形成的螯合物可增强其和DNA的结合; 四，DXR与细胞膜的磷脂结合，破坏膜酶(如腺苷酸环化酶)的活性、细胞膜的结构与功能。 DXR对细胞增殖各期均有杀伤作用，为细胞周期非特异性药物，对S早期及M期最显著， G1期及S晚期则不敏感，并对G1、 G2期有延缓作用。迄今为止，未曾有关于阿霉素提高AAV介导的基因转导效率和表达水平，和尝试在基 因治疗时特别是对变性和遗传性疾病基因治疗时使用阿霉素以提高AAV介导的转导效率和 基因表达水平的报道。发明内容本发明的目的是提供一种新的用于基因治疗的复合制剂，具体涉及阿霉素类抗肿瘤药物 与腺相关病毒的复合制剂及其用途。本发明采用一定浓度的阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒组成复合制剂、以及在眼病、 遗传病及恶性肿瘤基因治疗时联合(同时或先后)使用阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒， 以增强腺相关病毒介导的基因的转导效率和表达水平；本发明还公开了系统给予阿霉素或局 部使用阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒、以及复合制剂的基质；阿霉素在提高腺相关病毒 介导的基因转导效率与表达水平、改善腺相关病毒载体基因治疗效果的新的药用用途。本发明实验证实由阿霉素与AAV组成的新的AAV制剂，或在给予AAV时联合使用阿 霉素可显著提高AAV介导的转导效率、基因表达水平和持续时间，改善AAV载体的治疗效 果。本发明所述的复合制剂，它含以下物质作为活性成分 (1)阿霉素类抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素，或称多柔吡星、表柔吡星和比柔吡星。 (2)腺相关病毒，AAV1、 AAV2、 AAV5或其他血清型如AAV3、 AAV4、 AAV6、 AAV7、 或AAV8。所述的复合制剂，其活性成分的剂量如下-(1 )在复合制剂中阿霉素类抗肿瘤药物的剂量为0.001-10 u g。(2)在复合制剂中腺相关病毒的剂量为1X 10e9-l X 10el2病毒颗粒。所述的复合制剂的基质可以是生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液、细胞培养基等。本发明所述的复合制剂可以是冻干形式或液体形式。本发明所述的复合制剂可以采用局部注射或静脉注射。局部注射包括视网膜下注射、玻 璃体腔内注射或前房注射；肌肉注射；腹腔注射；关节腔注射；经导管肝内、肾内、心脏内 灌注；肿瘤内注射等。还包括局部给予腺相关病毒，同时或先后静脉注射阿霉素类抗肿瘤药 物等。本发明提供的上述复合制剂及阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒联合使用的方法可显 著改善腺相关病毒作为基因传递载体治疗疾病的疗效。联合使用一定剂量的阿霉素类抗肿瘤 药物，能明显增加腺相关病毒对正常和肿瘤细胞的转导效率，使腺相关病毒介导的外源基因 的表达时间明显提前、阳性率明显增加、表达水平明显提高，同时又没有明显的毒副作用。 本发明尤其适用在眼病、遗传病以及肿瘤等疾病基因治疗中的应用。本发明的目的是通过下述步骤实现的-(1 )体外细胞培养实验证实阿霉素可明显提高腺相关病毒对视网膜细胞和肿瘤细胞的转导 效率和基因表达水平。 A阿霉素显著提高腺相关病毒对体外培养的视网膜细胞的转导效率和基因表达水平 视网膜细胞(APRE-19或原代培养的RPE)培养采用6孔细胞培养板，每孔接种2X105 RPE细胞，或2乂106成人视网膜神经细胞。依据加入阿霉素和rAAV2的时间顺序不同将实验分为三组第一组预先加入阿霉素孵育 24小时后再感染rAAV2;第二组同时加入阿霉素和rAAV2;第三组先加入rAAV2感染24 小时后再加入阿霉素。rAAV2分别带有GFP报告基因或Luc报告基因，用量均为每一个细胞 1X 104病毒颗粒。阿霉素终浓度为0.001-2.6 u g/ml。对于感染rAAV2-GFP的细胞，可以通过GFP的表达反映rAAV2的转导和表达效率。 我们根据GFP荧光出现的时间、表达GFP荧光的细胞数量、以及GFP荧光强度来判断rAAV2 载体的转导效率和所携带基因的表达水平。GFP阳性细胞数量及GFP荧光强度的检测通过荧 光显微镜观察及流式细胞仪分析来完成。对于感染rAAV2-Luc的细胞，通过加入相应的底物
后定量检测细胞裂解液的荧光强度，来反映rAAV2的转导效率。单独应用1X104 rAAV2—GFP感染人RPE细胞，直到感染后第5天(120小时)才能 观察到少量细胞表达GFP荧光，并且荧光很弱。随感染时间的延长，GFP阳性细胞数量增加 但较缓慢，荧光强度增强不明显。实验显示，单独用rAAV2—GFP时GFP阳性细胞数量少， 荧光弱。感染后第7天流式细胞仪检测，GFP阳性率为13.5%, GFP的平均亮度为2.75。若在使用rAAV2—GFP感染人RPE细胞时，同时加入阿霉素，GFP的表达明显提前、 表达量也明显增加。当阿霉素终浓度为0.1ug/ml (O.lug)、 1.3ixg/ml (1.3ug)禾Q1.7ug/ml (1.7ng)时，24小时便可观察到GFP表达；当阿霉素的终浓度为0.001 ug/ml (0.001 ng)、 0.01ng/ml (0.01 Ug)和0.05ug/ml (0.05 Pg)时，rAAV2感染后48小时，可通过荧光显微 镜观察到GFP荧光。随感染时间延长，表达GFP的细胞数量明显增多，荧光强度显著增强。 显微镜下观察细胞形态好，未见细胞病变，Tunel检测细胞凋亡与对照无明显差异。当阿霉素 的浓度为2.6n g/ml时，感染后12小时既可在荧光显微镜下观察到大量细胞表达GFP荧光， 且荧光很亮。在随后的24小时和48小时观察，荧光强度进一步增强，同时细胞形态发生明 显变化，形态类似神经元样，进而细胞变圆，脱落或凋亡。第7天时细胞全部脱落。若在细胞培养液中预先加入阿霉素孵育24小时后，再加入rAAV2—GFP，可以使GFP 表达提前更明显，表达量增加更显著。其对rAAV2—GFP转导效率提高的程度明显比同时应 用阿霉素和rAAV2—GFP时高。当阿霉素终浓度为0.1 u g/ml禾P 1.3 u g/ml时，加入rAAV2— GFP后12小时既可见细胞表达GFP荧光，随感染的时间延长，GFP阳性细胞数量明显增多， 荧光增强。细胞形态好，无变圆、凋亡和漂浮现象。如果先加入rAAV广GFP感染细胞，24小时后再加入阿霉素，同样可以使GFP表达提前， 表达量增加，但提前和增加的程度要比同时应用阿霉素和rAAV2—GFP时低Western blot分析以上各组GFP蛋白表达量，单独应用rAAV2—GFP感染人RPE细胞时， GFP阳性信号很弱。联合应用阿霉素后细胞内GFP蛋白含量明显增加，而且增加的程度与阿 霉素的剂量有关，与加入阿霉素和rAAV2—GFP的时间顺序也有关。细胞感染rAAV2—GFP 后第7天收集细胞，比较加入不同浓度的阿霉素以及预先加入、同时加入和延迟加入阿霉素 的细胞内GFP蛋白表达量。结果表明，当阿霉素浓度为0.1yg/ml时，细胞内GFP蛋白含量 最高，然后依次为1.3ug/ml、 0.01 u g/ml和0.001 u g/ml。在阿霉素浓度相同的情况下，预先 加入阿霉素孵育24小时后再加入rAAV2—GFP者，细胞内GFP蛋白含量最高，其次分别为 同时加入阿霉素和rAAV2—GFP者和先加入rAAV2—GFP感染，24小时后加入阿霉素者。分别将1 X 106、 1 X 107、 1 X 108或1 X 109 rAAV2-Luc单独或联合0.1 U g/ml (0.1 W g) 浓度的阿霉素同时加入到培养的RPE细胞中，感染后第3天检测细胞裂解液内荧光的强度，
从而分析比较不同条件下rAAV2-Luc对RPE细胞的转导效率。结果表明，当1><106腺相关 病毒载体联合应用0.1 y g/mi浓度的阿霉素后可使rAAV2在细胞内的转导效率提高约300倍， 达到单独应用rAAV2-Luc 1乂109时的效果，相当于将病毒量提高了 3个数量级。当1X109 rAAVrLuc与0.1 u g/ml的阿霉素共同感染细胞后,rAAV2的转导效率比单独应用时提高了 500 余倍。由此可见，rAAV2-LuC联合应用小剂量阿霉素后细胞内外源基因Luc的含量远远高于 单独应用rAAV广Luc者，阿霉素显示出强大的加快和提高rAAV2所携带的基因表达效率的 作用。除了上述建株的RPE细胞外，本发明单独使用rAAV2—GFP或联合阿霉素感染原代培养 的成人RPE细胞、虹膜色素上皮细胞和人视网膜神经细胞均获得了与建株的RPE细胞相同 的结果。B阿霉素显著提高腺相关病毒对体外细胞培养的肿瘤细胞的转导效率和基因表达水平。AAV2_GFP单独或联合终浓度为0.1ug/ml (0.1 ug)、 1.3 u g /ml (1.3 w g)、 1.7wg/ml (1.7 " g)阿霉素分别感染人非小细胞肺癌细胞株NCIH446、人小细胞肺癌细胞株NCIH460、 人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC7721和人胃癌细胞株SGC7901。 0.1 w g/ml的阿霉素能后不同程度的提髙AAV2对5种肿瘤细胞的转导效率和基因表达水平。未见明显细胞 变圆和漂浮。而对于联合使用1.3yg/ml和1.7ug/ml阿霉素的肿瘤细胞，GFP阳性细胞数量 和荧光亮度与使用0.1yg/ml阿霉素的细胞无明显差别，但细胞均出现明显的变圆、凋亡和漂 浮。按照rAAV2-GFP与0.1 P g/ml阿霉素共同感染细胞后GFP阳性细胞数量及亮度从高到低 将肿瘤细胞排序，依次为SGC7901、 NCIH446、 SMMC7721、 NCIH460和A549。结果表明， 在恶性肿瘤治疗过程中如将化学治疗结合基因治疗，化学药物一方面对肿瘤细胞起到抑制生 长和促进凋亡的作用，另一方面又能有效提高治疗基因的转导和表达，起到双重作用，因此, 这一新方法对于提高恶性肿瘤的治疗效果会有所帮助。(2)体内实验证实阿霉素可明显提高腺相关病毒对活体视网膜细胞、肿瘤细胞及多种组织的转导效率和基因表达水平。 A阿霉素显著提高腺相关病毒对活体视网膜细胞的转导效率和基因表达水平，提高治疗效果 在上述体外实验基础上，进一步观察阿霉素在体内是否也可以有效安全地加快和提高 GFP在视网膜细胞中的表达。实验分为3组，第一组右眼视网膜下间隙联合注射rAAV2-GFP 和阿霉素，左眼视网膜下间隙单独注射rAAV2-GFP。第二组右眼玻璃体腔内注射阿霉素， 视网膜下间隙注射rAAV2-GFP，左眼视网膜下间隙注射rAAV2-GFP。第三组腹腔内注射阿 霉素，右眼视网膜下间隙注射rAAV2-GFP，左眼为正常对照眼。结果显示注射后24小时，
视网膜下间隙同时给子rAAV2-GFP和阿霉素，或玻璃体腔内注射阿霉素，同时视网膜下注射 rAAV2-GFP的实验眼，均可在体视镜下观察到眼底已出现GFP荧光，而单独应用rAAV2-GFP 的眼底或腹腔注射阿霉素，同时视网膜下注射rAAV2-GFP的实验眼的眼底均未观察到荧光。 注射后1周体视镜下观察眼底，视网膜下间隙同时应用阿霉素与rAAV2-GFP的眼底，GFP 荧光较强，而单独应用rAAV2-GFP和腹腔内注射阿霉素，同时视网膜下注射rAAV2-GFP 的实验眼的眼底，荧光微弱，分布的范围小。选取8周龄Balb/c小鼠，麻醉后分别在视网膜下腔注射AAV2-Luc和AAV2-Luc+ DXR(阿 霉素)。分别于视网膜下注射24、 48、 72小时和6天、9天、21天、28天后将小鼠麻醉经小 动物活体成像观察报告基因Luc在小鼠视网膜内的表达。结果表明联合应用阿霉素时，报告 基因Luc在视网膜细胞表达的时间提前，从6天提前到注射后24小时即可检测到阳性信号； 随着感染时间的延长，视网膜内检测到的阳性信号逐渐增强，而联合应用化疗药物阿霉素的 眼内荧光始终比单独应用AAV2-GFP的眼内荧光强、范围大。HE染色后观察视网膜内细胞， 未见明显坏死、凋亡及炎症反应。取3周龄RCS大鼠，雌雄不限，随机分成3组，分别在视网膜下注射生理盐水、AAV-2-CNTF、 AAV2-CNTF+DXR。注射后5周多聚甲醛灌注后取眼球，制成HE切片后OLYMPAS 显微镜下观察计数RCS大鼠外核层细胞数量。视网膜下注射生理盐水组外核层细胞仅剩一 层甚至消失，单纯注射AAVrCNTF组外核层细胞层数大约有3-4层，联合应用AAV2-CNTF 和DXR时外核层细胞层数在5-6层。上述实验结果显示，单独使用rAAV2感染视网膜细胞如RPE细胞时，其携带的外源基 因GFP表达出现的时间晚，表达GFP荧光的阳性细胞数量少即阳性率低，同时细胞内GFP 或Luc的含量也低。加入一定剂量的阿霉素后，可以明显加快外源基因的表达，由单独使用 时第5天才开始表达，提前至12或24小时便开始表达即出现GFP荧光，同时GFP阳性细 胞数量明显增多，GFP或Luc含量增加。但不同浓度的阿霉素对提高和加快rAAV2转导效率 的作用不尽相同，其中以0.1ug/ml至1.3pg/ml这两个浓度最为安全有效。另外，相同浓度 的阿霉素，依据其加入的时间不同，对rAAV2转导效率的提高程度也不同，预先加入阿霉素 作用最明显，其次分别为同时加入阿霉素和24小时后加入阿霉素者。此外，阿霉素也能显著 提高rAAV2在肿瘤细胞内的转导效率和基因表达水平。此外，当注射腺相关病毒如AAVs-EGFP时，联合注射阿霉素，还可以使腺相关病毒在 视网膜内的表达时间明显延长，可长时期高水平表达外原基因。B阿霉素显著提高腺相关病毒对活体内的多种组织和肿瘤中的转导效率和基因表达水平。
将阿霉素与腺相关病毒联合注射到小鼠腹腔内，，腺相关病毒为AAV2-Luc，用量为1-3 X1(T个病毒颗粒，阿霉素用量分别为5ug和15ug。活体成像显示阿霉素可明显增加腺相关病毒在腹腔内的表达效率和持续时间。肿瘤模型选用人肺癌NCIH460裸小鼠模型，先将人肺癌NCIH460细胞接种到Balb/c裸 小鼠后肢皮下，4周后肿瘤生长至8-10mm直径。分别将AAV2-Luc 1X 101()或3X 101()个病毒 颗粒与0.01 u g、 0.1 y g、 1 u g、 g、 5u g及10y g阿霉素混合后，用PBS调整体积至50ul， 然后直接注射到肿瘤内，或分别将AAV2-Luc注射到肿瘤内，lwg、 2Pg、 5ug、 10ug、 50 ng及100ug阿霉素注射到腹腔内。于注射后48小时、96小时活体荧光成像检测肿瘤内荧 光强度。检测结果表明阿霉素可明显增加腺相关病毒在肿瘤内的表达效率。本发明经实验证实，抗肿瘤药物阿霉素在一定剂量浓度时可显著加快和提高rAAV2所介 导的外源基因在视网膜细胞内的表达，对细胞无明显毒、副作用。对于改善眼底病基因治疗 的效果很有帮助；此外，利用阿霉素也能显著提高rAAV2在肿瘤细胞内的转导效率这一特点， 可在恶性肿瘤治疗过程中将化学治疗结合基因治疗，化学药物一方面对肿瘤细胞起到抑制生 长和促进凋亡的作用，另一方面又能有效提高治疗基因的转导和表达，起到双重作用，因此 本发明的方法对于提高恶性肿瘤的治疗效果有帮助。本发明涉及的病毒与药物的来源如下① 带GFP报告基因的2型腺相关病毒载体AAV2—GFP和带有报告基因Luc的2型腺相关病 毒载体AAV2—Luc,由本元正阳基因技术有限公司提供。② 抗肿瘤药物阿霉素为深圳万乐药业有限公司生产的多柔吡星，产品批号0504El。本发明涉及的各种细胞的来源和培养方法如下各种细胞成人RPE细胞(APRE-19)为ATCC产品。原代培养的成人RPE细胞、原代培养的成人视网膜神经细胞培养方法如下眼球用75 %酒精消毒，庆大霉素及PBS反复冲洗。然后仔细修剪去除眼球周围的脂肪组织，从赤道部 将眼球剪成两部分。弃去含有角膜的部分眼球；另外一部分含有视网膜，小心剪除玻璃体腔 中的玻璃体；在解剖镜下将视网膜小心取出放入盛有PBS的刻度离心管中，PBS洗3次，加 入一倍体积的0.25%Try-EDTA 37'C消化60分钟。成人RPE细胞直接在眼杯内用 0.25%Try-EDTA消化60分钟。然后分别吸出0.250/。Try-EDTA后加入含有15%FBS的 DMEM/F12培养基(Invitrogenlnc)吹打细胞成细胞悬液。显微镜下计数。以每孔2乂105的 细胞数量分至6孔板中。在37i:、 <:02体积分数为5%的培养箱内培养。每天观察一次。神经细胞7天换液一次，RPE细胞3天换液一次。
各种肿瘤细胞株，包括人非小细胞肺癌细胞株NCIH446、人小细胞肺癌细胞株NCIH460、 人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC7721和人胃癌细胞株SGC7901。由中科院生化 与细胞所提供。
图1—4:荧光显微镜照相，被AAV2—GFP单独感染或AAV2—GFP联合不同浓度阿霉素感染的 RPE细胞内GFP表达的观察，其中，图h 单独应用AAV2—GFPlX10e9感染RPE细胞后第5天，细胞生长良好，荧光显微 镜下可见表达GFP的细胞数量少，散在分布，GFP荧光强度弱。A和B为同一视野下RPE细胞 的荧光照片和黑白照片，X100;C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X400。图2 AAV2—GFP 1X 10e9与0. 01 u g/mi阿霉素同时感染RPE细胞后第5天，细胞生长形 态好，部分细胞表达GFP荧光。A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X100。图3 AAV2—GFP 1X 10e9与0.1 u g/ral阿霉素同时感染RPE细胞后第5天，绝大部分细 胞表达GFP， GFP荧光强。细胞形态好，未见凋亡细胞存在。A和B为同一视野下RPE细胞的 荧光照片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，XIOO。 图4 MV2—GFPlX10e9与2.6ug/ml阿霉素同时感染RPE细胞后第5天，绝大多数细胞 表达GFP荧光，且荧光强。但细胞失去原有的正常形态，变成神经元样细胞，继而变圆，凋 亡。细胞数目明显减少。A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X50; C和D 为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，XIOO。图5荧光显微镜照相，AAV2—GFP单独感染或AAV2—GFP联合阿霉素感染原代培养的成人 IPE细胞后GFP表达的观察，其中，AAV2—GFP 1X10e9单独或与0. lug/ml阿霉素同时感染原代培养的成人IPE细胞 后第5天，A和B为单独用AAV2—GFP 1X 10e9感染的IPE在同一视野下的荧光照片和黑白 照片，极少数IPE细胞表达GFP荧光X100; C和D为与0.1ug/ml阿霉素同时感染的IPE细 胞同一视野下的荧光照片和黑白照片，XIOO。图6荧光显微镜照相，被AAV2—GFP单独感染或AAV2—GFP联合阿霉素感染的肿瘤细胞 NCIH446中GFP表达的观察，其中，AAV2—GFPlX10e9单独或与0. lug/m1(0. lug)阿霉素同时感染肿瘤细胞NCIH446
后48小时，联合应用阿霉素的肿瘤细胞内GFP阳性细胞数量及荧光强度均较单独应用AAV2 -GFP多。A和B为同一视野下单独应用AAV2—GFP单独感染NCIH446细胞的荧光照片和黑白 照片，X100; C和D为同一视野下联合应用阿霉素感染NCIH446细胞的荧光照片和黑白照片， X画。
图7流式细胞仪观察分别被AAV2—GFP或AAV2—GFP联合不同浓度阿霉素感染的RPE细 胞GFP表达情况。
图8流式细胞仪观察分别被AAV2—GFP或AAV2—GFP联合不同浓度阿霉素感染的肿瘤细 胞GFP表达情况。
图9 Western blot检测分别被AAV2—GFP或AAV2—GFP联合不同浓度阿霉素感染RPE细 胞后GFP表达情况，
其中，AAV2-GFPlX10e9联合不同浓度的阿霉素同时感染RPE细胞后第7天，Westernblot 检测细胞内GFP表达量，从高到低的顺序为AAV2-GFP联合0.1wg/ml阿霉素、AAV2-GFP联 合1. 3 u g/ml阿霉素、AAV2-GFP联合0. 01 u g/ml阿霉素、AAV2-GFP联合0. 001 u g/ml阿霉 素、单独使用AAV2-GFP。单独使用AAV2-GFP时条带很弱，以至于无法看到。
图10 Western blot检测不同时间加入阿霉素与AAV2—GFP共同感染RPE细胞后GFP表 达情况，
其中，0.1 p g/ml阿霉素分别与AAV2-GFP同时或之前或之后24小时加入，AAV2-GFP感 染细胞后第7天，Westernblot检测细胞内GFP表达量，从高到低的顺序为预先加入阿霉 素(左2)、同时加入阿霉素(左l)、后加阿霉素(左3)。
图11:体视镜观察AAV2—GFP或AAV2—GFP联合0. 1 y g/ml阿霉素视网膜下注射后对视网 膜细胞的感染情况，其中，A单独应用r-AAV2-GFP视网膜下注射第3天，体视镜观察眼底未见明显荧光，B rAAV2-GFP联合应用0.1 y g/ml阿霉素视网膜下注射后第3天，体视镜观察眼底， 可见GFP荧光，但较弱，范围小，仅局限在注射点附近，C单独应用r-AAV2-GFP视网膜下注射后1周，体视镜观察，可见GFP荧光，但荧光弱且分布较局限，
D rAAV2-GFP联合应用0. 1 y g/ml阿霉素视网膜下注射后1周，GFP荧光增强，范围增大。
图12小动物活体成像观察AAV2—Luc (右眼)或AAV2—Luc联合0. 1 w g/ml阿霉素(左眼) 视网膜下注射(左侧小鼠)和玻璃体腔内注射(右侧小鼠)后对视网膜细胞的感染情况，联
合应用阿霉素显著增加AAV2-Luc对视网膜细胞的感染效率。图13单独应用AAV2 — CNTF lxl0e-10或联合应用AAV2—CNTF lxl0e10与阿霉素1 H g, 经内路法注射入3周龄RCS大鼠视网膜下间隙后第5周，HE切片观察联合应用AAV2—CNTF lxl0e10与阿霉素时视网膜内外核层存留的细胞数目较单独应用AAV2—CNTF lxl0e10时多， 其中，A未经治疗时RCS大鼠视网膜外核层细胞几乎全部发生凋亡，丧失；X400,B视网膜下注射生理盐水时RCS大鼠视网膜外核层细胞几乎全部发生凋亡，丧 失；X400，C单独应用AAV2—CNTF lxl0e10时RCS大鼠视网膜内可见有3-4层外核层细胞 存留；X400，D联合应用AAV2—CNTF lxl0e10与阿霉素1 u g时RCS大鼠视网膜内可见有5-6 层外核层细胞存留；X400。
具体实施方式
实施例1阿霉素加快和提高rMV-GFP对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平根据阿霉素加入时间的不同，将实验分为三组第一组预先加入阿霉素孵育，24小时 后再加入rAAV2—GFP;第二组同时加入阿霉素与rAAV2—GFP;第三组先加入rAAV2_GFP感染， 24小时后再加入阿霉素。按每孔2X1()5将RPE (APRE-19， ATCC)细胞接种在6孔细胞培养板中，24小时后细胞 贴壁，分别将1X109 rAAV2-GFP与终浓度为0. 001 u g/ml (O.OOlug)、 0. 01 u g/ml (0.01 Ug)、 0.05ug/ml (0.05y g)、 0. lug/ml (0. lyg)、 1.3ug/ml U.3y g)、 1.7ug/ml (1.7 Ug)、 2.6"g/ml (2.6ng)阿霉素同时或先或后加入到培养的细胞中。然后每天用荧光显微 镜观察并照相记录被感染的细胞GFP荧光的亮度、细胞形态与病变状态。4天或7天后胰蛋 白酶消化，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数及GFP荧光强度、Western blot检测GFP表达量。上述检测结果如下，若单独使用rAAV2_GFP感染细胞，第5天(120小时)起才能观察 到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，7天时细胞计数，细胞数量为2. 25 X105，流式细胞仪检测GFP阳性率为13.5%，平均亮度2.75。见图1。若同时加入0. 1 P g/ml (0. lug)、 1.3pg/ml (1.3ug)或1.7ng/ml (1.7ug)浓度的阿霉素，GFP表达时间明显 提前，表达量显著增加。感染后24小时便可观察到GFP表达，并且此时表达GFP荧光的细胞 数量和荧光强度明显高于单独应用rAAV2—GFP感染细胞时第7天的情况。感染后第4天流式细胞议分析显示GFP阳性率分别为78.2%、 76. 5%和76%，平均亮度为68. 5、 65. 2和67. 7。
随感染时间的延长，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高，同时细胞生长形态好， 无变圆及凋亡的细胞。感染后7天计数细胞，细胞数量分别为2.17X105、 2.09X1()S和2.05 X105;流式细胞仪分析显示GFP阳性率分别为97.8X、 97.3%和97. 5%。 GFP的平均亮度分 别为107.8、 103.6和105. 3。当同时使用的阿霉素浓度为0. 001 u g/ml、 0. 01 u g/ml和0.05 y g/ml时，rAAV2-GFP感染细胞后48小时便可通过荧光显微镜观察到GFP荧光。4天时流式 结果如下GFP阳性率分别为19. 1%、 41.2%、 62.1%，平均亮度为2. 33、 4. 78和24. 8。 7天 时经胰酶消化细胞后计数，细胞数量分别为2.21Xl(f和2. 20X 105。流式细胞仪检测结果 GFP阳性率分别为66. 8%、 74. 4%和88.1%。 GFP的平均亮度分别为28. 4、 49. 3和73. 8。 此 时，细胞形态好，无病变及凋亡的细胞。当阿霉素的浓度为2.6ug/ml时，在感染后12小时 观察即可见大量细胞表达GFP荧光，且荧光很亮。在随后的24小时和48小时观察到，荧光 强度进一步增强，同时细胞形态发生明显变化，表现为失去正常的RPE所呈现的梭形或多边 形或椭圆形，伸出突起，形态类似神经元样，进而细胞变圆，出现脱落或凋亡。细胞数量明 显较空白对照组和其他感染组少，到第5天时，细胞全部变圆，大部分细胞漂浮，第7天时 细胞全部脱落，无法分析。见图2、 3、 4、 7、 9、 10。若预先加入阿霉素，孵育24小时后再加入rAAV2-GFP感染，可更明显地加快和提高GFP 的表达。当阿霉素浓度为0. 1 u g/ml (0. lug)和1.3ug/ml (1.3ug)时，加入rAAV广GFP 后12小时既可见细胞表达GFP荧光，随感染的时间延长，GFP阳性细胞数量明显增多，荧光 增强。细胞形态好，无变圆、凋亡和漂浮现象。rAAV2—GFP感染后第7天计数细胞，细胞数 量分别为2. 15X 105和2. 06X 105;流式细胞仪检测，GFP阳性率分别为98. 5%和98. 6%， GFP 的平均亮度为153和155.7。若先加入r-AAV2-GFP感染，24小时后再加入阿霉素，同样可加快和提高GFP的表达效 率。结果如下当阿霉素浓度为0. lyg/ml (0. lyg)和1.3ug/ml U.3ixg)时，rMV2— GFP感染24小时后可见部分细胞表达GFP荧光。感染后第7天，细胞形态好，无凋亡和脱落。 计数细胞，数量分别为2. 16Xl()5和2.06X 105，流式细胞分析，GFP阳性率分别为94. 7%和 90.6%， GFP的平均亮度为65.5和67. 7。见图9除了上述建株的RPE细胞外，单独使用AAV2—GFP病毒或联合使用阿霉素感染原代培养 的人RPE细胞和IPE细胞，获得了与建株的RPE细胞相同的结果。实施例2阿骞素加快和提髙rMV-Luc对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平按每孔1X1()5将RPE (APRE-19， ATCC)细胞接种在24孔细胞培养板中，24小时后细
胞贴壁，分别将1X106、 1X107、 1X 108或1X 109rAAV2-Luc单独或联合0.1 y g/ml (0.1 p g) 浓度的阿霉素同时加入培养的细胞中，感染后第3天，经过胰蛋白酶消化，收集细胞后裂解， 向裂解液中加入相应地底物，检测细胞裂解液内荧光的强度，从而来分析比较不同条件下 rAAV2-Luc对RPE细胞的转导效率。结果如下单独应用腺相关病毒从1X 106到1X 109时细 胞内Luc荧光强度值(RIU)分别为131、 136、 613和3556，当上述腺相关病毒分别与0. 1 u g/ml的阿霉素联合应用时测得细胞内Luc荧光强度值(RIU)分别为3211、 16237、 209866 和1637928。结果表明，当1X106腺相关病毒载体联合应用0.1ug/ml浓度的阿霉素后可使 rAAV2在细胞内的转导效率提高约300倍，达到单独应用rAAV厂Luc 1X 109时的效果，相当于 将病毒量提高了 3个数量级。当1 X 109 rAAV厂Luc与0. 1 u g/ml的阿霉素共同感染细胞后， rAAV2的转导效率比单独应用时提高了 500余倍。实施例3阿霉素加快和提髙rMV-GFP和rMV-Luc对活体视网膜细胞的转导效率和基因表 达水平，提髙治疗效果。A阿霉素提高MV介导的基因在活体视网膜细胞内的表达水平选取8周龄SD大鼠10只(其中一只麻醉后死亡)，雌雄不限，随机分为3组，第一组 右眼视网膜下间隙联合注射rAAV2-GFP和阿霉素(2.5ul)， rAAV2-GFP的用量为1X 109病毒 颗粒，阿霉素浓度分别为0. 1 u g/ml (O.lug)和1.3yg/ml (1.3ug);左眼为对照眼，视 网膜下间隙单独注射rAAV2-GFP， 1X 109病毒颗粒(2. 5ul)。第二组右眼玻璃体腔内注射阿 霉素(2ul),浓度分别为0. 1 u g/ml (0. lPg)和1.3ug/ml (1.3ug)，视网膜下间隙注射 rAAV2-GFP， 1X 109病毒颗粒(2. 5ul)，左眼为对照眼，视网膜下间隙注射rAAV2-GFP， 1X109 病毒颗粒(2.5ul)。第三组腹腔内注射阿霉素(lml)，浓度为L3ug/ml。右眼视网膜下 间隙注射rAAV2-GFP， 1乂109病毒颗粒(2.5ul)，左眼为正常对照眼。结果显示注射后24 小时，视网膜下间隙同时给予rAAV2-GFP和阿霉素，或玻璃体腔内注射阿霉素，同时视网膜 下注射rAAV2-GFP的实验眼，均可在体视镜下观察到眼底己出现GFP荧光，但荧光较弱；而 单独应用rAAV2-GFP的眼底或腹腔注射阿霉素，同时视网膜下注射rAAV2-GFP的实验眼的眼 底均未观察到荧光。注射后1周体视镜下观察眼底，可见因视网膜下注射引起的限局性网膜 脱离已恢复，视网膜下间隙同时应用阿霉素与rAAV2-GFP的眼底，GFP荧光较强，GFP荧光围 绕在注射点周围呈点状分布，面积较大，并可见有中等大小的血管及其分支走行于荧光之上。 单独应用rAAV2-GFP和腹腔内注射阿霉素，同时视网膜下注射rAAV2-GFP的实验眼的眼底，
荧光微弱，分布的范围小。但阿霉素的给药方式相同，但剂量不同的个体间，眼底GFP荧光 开始表达的时间与强度未见明显区别。见图11。选取8周龄Balb/c小鼠，麻醉后分别在视网膜下腔注射AAV2-Luc和AAV2-Luc+ DXR1 y g 各2ul。具体剂量左眼AAV厂GFP 2X109 (2ul)个病毒颗粒，右眼AAV厂GFP 2Xl(f个病毒 颗粒联合DXR lpg。分别于视网膜下注射24、 48、 72小时和6天、9天、21天、28天后将 小鼠麻醉经小动物活体成像观察报告基因Luc在小鼠视网膜内的表达。结果表明单独应用 AAV2-Luc进行视网膜下注射时，直到第6天才可见视网膜内Luc的表达；而联合应用化疗药 物DXR，在注射24小时后便可通过Luc生物素荧光判断视网膜内已有Luc基因的表达，随着 感染时间的延长，报告基因Luc在视网膜内的表达增强，而联合应用化疗药物DXR的眼内荧 光始终比单独应用AAV2-GFP的眼内荧光强、范围大。视网膜下注射1周和2周后多聚甲醛灌 注后取眼球，5%冰醋酸后固定24小时，石蜡包埋后连续切片，切片厚度约6pm， HE染色后 观察视网膜内细胞，未见明显坏死、凋亡及炎症反应。见图12。取3周龄RCS大鼠,雌雄不限，随机分成3组，分别在视网膜下注射生理盐水(2ul) 、 AAV-2-CNTF 1X10'° (2ul)个病毒颗粒、AAV厂CNTF 1 X 10'。个病毒颗粒+DXR lug (共2ul)。注 射后5周多聚甲醛灌注后取眼球，5%冰醋酸后固定，石蜡包埋，HE染色后观察切片。OLYMPAS 显微镜下观察计数RCS大鼠外核层细胞数量。视网膜下注射生理盐水组外核层细胞仅剩一层 甚至局部完全消失，单纯注射AAV2-CNTF组外核层细胞层数大约有3-4层，联合应用AAV2-CNTF 和DXR lug时外核层细胞层数在5-6层，三组之间p值均小于0.05，差异有统计学意义。 见图13。实施例4阿霉素加快和提高rMV-GFP对肿瘤细胞的转导效率和基因表达水平按每孔1X105将多种肿瘤细胞，包括人非小细胞肺癌细胞株NCIH446、人小细胞肺癌细 胞株NCIH460、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株S醒C7721和人胃癌细胞株SGC7901，接 种在24孔细胞培养板中，24小时后细胞贴壁，分别将lX109rAAV2-GFP单独或与0. lug/ml (0. lug)、 1.3ug/ral (1.3pg)、 1.7yg/ml (1.7ug)浓度的阿霉素同时加入到培养的细 胞中。感染后24小时荧光显微镜观察，单独应用rAAV2-GFP感染的5种肿瘤细胞内均未见明 显荧光；在联合应用阿霉素的肿瘤细胞中，SGC7901和NCIH446内部分细胞出现GFP荧光， 细胞形态好，未见细胞变圆。感染后48小时，单独使用rAAV2-GFP感染的SGC7901和NCIH446 细胞内可见有少量表达GFP荧光的细胞，其余3种肿瘤细胞内仍未见明显荧光，细胞形态好。 而在r AAV厂GFP与0. 1 u g/ml阿霉素共同感染的细胞中，SGC7901和NCIH446内GFP阳性细 胞进一步增多，荧光更亮。见图5。 S躍C7721、 NCIH460和A549内可见少量细胞出现GFP荧 光。此时，5种肿瘤细胞形态均正常，未见明显细胞变圆和漂浮。而对于联合使用1.3ug/ml 和1. 7" g/ml阿霉素的肿瘤细胞，GFP阳性细胞数量和荧光亮度与使用0.1 u g/ml阿霉素的 细胞无明显差别，但细胞均出现明显的变圆、凋亡和漂浮。感染后72小时，与单独使用r AAV2-GFP感染的肿瘤细胞相比，5种联合应用0. 1 u g/ml阿霉素感染的肿瘤细胞内表达GFP 荧光的细胞数量明显多且亮。流式细胞检测结果如下单独应用rAAV2-GFP感染S,C7721、 SGC7901、 NCIH446、 NCIH460和A549细胞72小时后，GFP阳性率分别为30. 8%、 39. 1%、 34. 6%、 26.3%和22.5%，平均亮度分别为21.7、 26.4、 20.3、 11. 2和13. 4;联合应用0.1 u g/ml阿 霉素后GFP阳性率分别为73.4%、 87.2%、 82.9%、 52.3%和43. 4%，平均亮度为45.8、 68.5、 64.2、 29.4、 26.6。当阿霉素的浓度为1. 3 P g/ml和1. 7 y g/ml时，因细胞变圆、漂浮，无 法测得流式结果。按照rMV2-GFP与0.1 u g/ml阿霉素共同感染细胞后GFP阳性细胞数量及 亮度从高到低将肿瘤细胞排序，依次为SGC7901、 NCIH446、 SMMC7721、 NCIH460和A549。见 图6、 8。上述实验结果表明，单独应用rAAV2作为基因传递载体对视网膜和肿瘤等细胞的转导效 率较低，基因表达水平也较低，而且基因开始表达所需要的时间较长。抗肿瘤药物阿霉素在 一定剂量范围内可以安全有效地加快和提高rAAV2转导效率和基因表达水平。当阿霉素浓度 为O. lng/ml至1.3ug/ml时，既可以显著加快和提高GFP的表达，又不产生明显的抑制细 胞生长，诱导细胞凋亡等副作用。而当阿霉素浓度达到2.6wg/ml时，在提高rAAV2转导效 率的同时，出现严重的细胞毒性反应，细胞很快变圆，发生凋亡。因此，阿霉素的剂量对于 使用阿霉素来提高rAAV2转导效率这一新方法来说非常重要。同时体内外实验结果提示，阿 霉素与rAAV2-GFP给药的时间顺序和途径也是十分重要的。细胞中预先加入阿霉素孵育，然 后再加入rAAV2感染，对GFP表达加快和提高的效果最为显著；其次为同时加入者；最后为 先加入rAAV2，后加入阿霉素者。表明提前应用阿霉素可能更有帮助。眼局部给药包括视网 膜下和玻璃体给药明显比全身给药效果好。
权利要求
1、阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质(1)阿霉素类抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素，或称多柔吡星、表柔吡星和比柔吡星；(2)腺相关病毒，包括AAV1、AAV2、AAV5或其他血清型如AAV3、AAV4、AAV6、AAV7和/或AAV8。
2、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的腺相关病毒的用量为IX 109 1X10'3AAV病毒颗粒。
3、 根据权利要求l所述的复合制剂，其特征是所述的阿霉素的用量为0.001-10
4、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的复合制剂中的基质是注射 用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基。
5、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的制剂是冻干形式或液体形 式。
6、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是其给药方式采用局部注射或静脉 注射方式。
7、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式是阿霉素与 腺相关病毒混合后以混合物形式给药，或分别给予阿霉素与腺相关病毒，包括在 局部分别注射阿霉素与腺相关病毒，或同时静脉注射阿霉素与腺相关病毒；或局 部注射腺相关病毒或静脉注射阿霉素。
8、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式其中的给药 的时间顺序是提前注射阿霉素然后再注射腺相关病毒，或同时注射阿霉素与腺相 关病毒，或先注射腺相关病毒后再注射阿霉素。
9、 权利要求1所述的复合制剂在制备提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表 达水平与持续时间和/或改善腺相关病毒载体基因治疗效果药物中的用途。
10、 按权利要求9的用途，其特征是所述的用途是制备眼病基因治疗、遗传病基因治疗、恶性肿瘤基因治疗、治疗各种类型的关节炎、治疗各种类型的心脏病、 治疗肝脏的各种代谢性疾病和/或治疗肌肉或神经系统退性变药物中的用途。
11、 根据权利要求io的用途，其特征是其中眼病基因治疗，其剂量为o.ooi-iUg阿霉素；1X109-1X1012AAV病毒颗粒；釆用视网膜下注射、玻璃体腔内注 射或前房注射。
12、 根据权利要求10的用途，其特征是其中遗传病基因治疗，其剂量为0. 01-10 ixg阿霉素；1X10'°-1X10"AAV病毒颗粒；采用肌肉注射、腹腔注射、或经导 管肝内或肾内灌注方式。
13、 根据权利要求10的用途，其特征是其中恶性肿瘤基因治疗，其剂量为0. 01-10 "g阿霉素；1X1(T-1X10、AV病毒颗粒；采用肿瘤内注射或腹腔注射方式。
14、 根据权利要求10的用途，其特征是其中治疗各种类型的关节炎，其剂量为 0.001-lug阿霉素；1X1(T-1X10'2AAV病毒颗粒；采用关节腔内或其周围注射方式。
15、 根据权利要求10的用途，其特征是其中治疗各种类型的心脏病，其剂量为 0.01-10ng阿霉素；1X101。-1X10"AAV病毒颗粒；采用经导管心脏内灌注。
16、 根据权利要求IO所述的的用途，其特征是其中治疗肝脏的各种代谢性疾病， 其剂量为O.Ol-lOug阿霉素;1X10'°-1X10"AAV病毒颗粒；采用经导管肝内 灌注方式。
17、 根据权利要求10的用途，其特征是其中治疗肌肉或神经系统退性变，其剂 量为O.Ol-lOixg阿霉素；1X10'°-1X10'3AAV病毒颗粒；采用肿瘤内注射方式。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。公开了在使用腺相关病毒作为基因传递载体时，联合使用一定剂量的阿霉素，可使腺相关病毒开始表达外源基因的时间明显提前，转导效率和基因表达水平明显增加，表达时间也明显延长，实验结果表明，复合制剂对细胞未见明显的毒、副作用。本发明复合制剂和使用方法可用于指导和辅助眼病、遗传性疾病和肿瘤等的基因治疗。
文档编号A61P19/02GK101116748SQ20061002966
公开日2008年2月6日 申请日期2006年8月1日 优先权日2006年8月1日
发明者刘新建, 吴小兵, 吴继红, 张圣海, 李川源, 李惠明, 董小岩, 玮 裘, 谢匡成, 陈霞芳, 倩 黄 申请人:上海市第一人民医院