专利名称：海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究的制作方法
技术领域：
本发明为抗癌新药的实验方法研究，从整体、细胞、分子、基因水平探讨了海嘧啶的抗肿瘤作用机制。
中医药在治疗肿瘤方面有其独特功效，其扶正祛邪理论的具体应用不仅能控制恶性肿瘤的生长，而且能提高病人的生存质量，延长生存期，已经得到公认。目前仅见于复方环磷酰胺片(环磷酰胺加人参皂甙)、复方氟脲嘧啶胶囊(FT-207加人参多糖)、而且都是口服制剂。根据目前的研究概况看，尽管中西复方抗癌制剂的效果要优于单用化疗药和中草药，由于都是口服制剂，研究水平只停留在药理作用上，并未从分子水平揭示药物作用的原理，因此，很难进一步发挥中西结合的更大优势，研究水平也很难登上一个新的台阶。
本发明的目的，在于从整体、细胞、分子以及基因水平观察和研究海嘧啶对肿瘤细胞的影响，旨在为海嘧啶抗肿瘤作用提供新的实验依据，找出药理学特点，并深入地阐明其作用机制。
本发明的主要技术内容是，海嘧啶的药物组成是，海藻、昆布、半夏、郁金、黄芪、苦参、5-氟脲嘧啶(5-Fu)，制成水针注射剂海嘧啶诱导人胃癌细胞分化及机理的研究如下(一)人胃癌BGC-823细胞的培养培养条件，采用DMEM培养基(含10％小牛血清)37℃，5％CO2进行培养，加入药物培养一定时间后进行各项实验，并用光学显微镜观察。
(二)海嘧啶对人胃癌BGC-823细胞增殖能力的影响将培养的BGC-823细胞随机分为对照组和给药组。同时设溶剂对照组、生理盐水对照组。给药组每瓶加入海嘧啶。对照组除更换培养液外，不加任何药物，每个药物浓度组设三个样份，分别在给药倾去含药的培养液，用Hanks液洗细胞三次，最后加入完全DMEM培养液4ml，悬浮细胞。作细胞计数，并用台酚蓝拒染法测定细胞存活率。上述操作在0-4℃冰浴条件下进行。
(三)海嘧啶对人胃癌BGC-823细胞形态及细胞核DNA结构的影响将待测细胞的PBS液离心洗涤2次，取少量细胞涂片，速入95％冷乙醇固定15分钟，干燥。用1％醋酸酸化30秒钟，0.01％AO染色10分钟。用PBS液(pH4.8)洗涤1分钟，0.01MCaCl2分化2分钟，再放入三个含PBS液(pH4.8)的染色缸洗三次，用PBS液临时封固，置激光共聚扫描显微镜观察，观察参数如下数值孔径1.3，油镜100倍，激光兰光激发波长488nm，输出功率5mW。阻挡滤片530/30BP、630/30BP、发射波长515nm(DNA绿光)、630nm(RNA、红光)。Z轴方向由细胞项部至底部0.6u步进“切片”。对人胃癌BGC-823细胞进行断层共聚焦扫描成象采焦的共聚焦图像经InSIGHT专业图像板图处理，用InSIGHT计算机IQ软件做三维重建。
(四)海嘧啶对人胃癌BGC-823细胞间通讯的影响采用划痕标记染料示踪技术(SLDT)方法进行。接种1×106个BGC-823细胞在35mm直经平皿内，次日，单层细胞达密度饱和，即可使用。向培养基内加入受试药物海嘧啶处理48小时，去除培养基，PBS洗三次后加入荧光染料(PBS液内含Lucifer Yellow，LY和Rhodamine-Dextran、RD，浓度均为0.05％)约2ml，用锐刀刃轻轻划痕数条，计时，标记3分钟，去除染液，PBS洗三次，细胞浸在PBS液内直接在落射荧光显微镜下观察记录。
(五)海嘧啶对人胃癌BGC-823细胞基因表达的影响1.Northern印记杂交分析实验 细胞RNA提取采用酸性酚——异硫氰酸胍一步法提取。培养瓶中加入Solution D液2.5ml变性裂解细胞，振摇5分钟，移至10ml塑料离心管中，加入350μl 0.2M NaOAc/0.1mMATA，pH4.0混匀，加入3.5ml酸性酚混匀，再加700μl氯仿/异戊醇混匀，冰浴15分钟，10000rpm离心20分钟，1体积异丙醇-20℃，沉淀1小时以上，10000rpm离心10分钟，将沉淀溶于适量RNA Denaturing buffer。取RNA样品，采用甲醛/甲酰胺变性，1％琼脂糖/2.2M甲醛变性凝胶电泳4-5小时，电压50V，Northern transfer法将RNA转移至Hybond-N膜。UV cross-linked，(1000 millijoules/cm2)固定后，采用随机引物标记技术，以[α-32P]dCTP标记探针，42℃预杂交2小时，杂交过夜，洗膜后压X-光片，-70℃下加增感屏曝光96小时。
2.Western印迹杂交分析实验采用Lysis方法，分别提取细胞总蛋白，具体操作用PBS漂洗细胞二次，在直径100mm培养皿中加入100-200μl预热至85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液(含50mmol/L Tris·Cl(pH6.8)，100mmol/L二硫苏糖醇，2％SDS。0.1％溴酚兰、10％甘油)，溶解细胞，用刮棒收集细胞裂解液，沸水浴加热10分钟，超声处理仪剪切DNA，室温10000rpm离心10分钟，取上清液，定量，取100μg细胞总蛋白经15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液(10mM Tris，250mM甘氨酸(pH8.3)，0.1％ SDS)。电转浊将蛋白转移至PVDF膜。3％BSA和0.25％正常马血清封闭膜2小时，抗P21ras(-抗)反应过夜，连接生物素的抗鼠IgG(二抗)反应1小时，AEC染色，密度扫描仪测定各条带密度值。
(六)海嘧啶对裸鼠致瘤性的影响将生长状态良好的细胞以胰酶消化，计数。培养液洗涤2次后用0.1ml无血清培养液悬浮。取BALB/c裸鼠(雌性，6周龄)，双侧背部皮下注射6×105细胞，左侧注射用海嘧啶处理过的人胃癌BGC-823细胞，右侧注射人胃癌BGC-823细胞作对照，连续观察肿瘤出现的时间和体积。本发明的技术效果在于，利用LSCM法、Northern印迹法、Western印迹分析法详细研究海嘧啶对肿瘤细胞DNA形态、含量及、P53、P21、C-myc、H-ras、K-ras基因表达的影响。实验结果表明海嘧啶在抗肿瘤作用方面明显优于同等剂量得化疗药物5-氟脲嘧啶，而毒性作用方面却明显低于5-氟脲嘧啶。
实现本发明得实施例如下所述海藻30g、昆布30g、郁金20g、黄芪20g、苦参15g、5-Fu 0.25g，水针剂，10ml/支，制成海嘧啶注射剂，分别做以下实验，对BGC-823胃癌细胞增殖能力的影响、对BGC-823人胃癌细胞形态及对人胃癌细胞间通讯的影响、对SGC-823人胃癌细胞基因表达的培养，毒性实验等来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
权利要求
1.海嘧啶药物组成特征是，海藻、昆布、半夏、郁金、黄芪、苦参、5-氟脲嘧啶(5-Fu)，制成水针注射剂。
2.海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究其特征是，通过对BGC-823胃癌细胞增殖能力的影响来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
3.海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究其特征是通过对BGC-823人胃癌细胞形态来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
4.海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究其特征是通过对人胃癌细胞间通讯的影响来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
5.海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究其特征是通过对SGC-823人胃癌细胞基因表达的培养来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
6.海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究其特征是通过毒性实验来研究海嘧啶抗肿瘤实验研究。
全文摘要
本发明为抗癌新药的实验方法研究，从整体、细胞、分子、基因水平探讨了海嘧啶的抗肿瘤作用机制。利用LSCM法、Northern印迹法、Western印迹分析法详细研究海嘧啶对肿瘤细胞DNA形态、含量及、P
文档编号A61P35/00GK1399988SQ01124528
公开日2003年3月5日 申请日期2001年7月31日 优先权日2001年7月31日
发明者季宇彬 申请人:季宇彬