阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂及其用途的制作方法

专利名称：阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。
技术背景腺相关病毒简称AAV，属于细小病毒科，是一种线性单链DNA病毒，外包二十面 体衣壳蛋白，直径20nm,是动物病毒中最小的一种。可分多种不同的血清型，其中 AAV2是基因治疗中最常用的--种。AAV病毒具有如下特性第--，AAV无明显致病性。 据报道，尽管人群中8W的个体呈现AAV血清阳性，但未见其与任何一种疾病有明显 相关性。第二， AAV是一种缺陷型病毒，不能独立复制。在无辅助病毒(如腺病毒、 疱疹病毒等)感染时，AAV呈"潜伏"状态。第三，位点特异性整合。MV是唯一一 种以位点特异性的方式整合在人类染色体上的真核病毒，现已明确整合位点为19号 染色体长臂。机理尚不清楚，可能与病毒的ITRs和r印蛋白有关。第四，宿主范围广。 AAV可感染多种类型的组织和细胞，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞(如神 经元、肌细胞、造血干细胞等)也较敏感。第五，用于基因治疗的AAV载体为重组AAV (称rAAV)，由于MV的基因组容量较小，约5kb，其中ITR是AAV包装必须的。基因 治疗用rAAV载体只保留了ITR，去除了腺相关病毒所有的编码基因，给外源基因约 4. 7kb的容量。故当重组的腺相关病毒感染细胞后仅有所携带的外源基因表达，不伴 随任何病毒基因表达，免疫原性很弱，几乎不引起免疫排斥反应。第六，能介导治 疗基因较长时间稳定表达。因此，被认为是遗传性疾病较好的基因传递载体。目前 国际上有38个方案使用rAAV作为载体。但是，单独使用rAAV时，其感染和转导效率不高，表现在rAAV感染后治疗基因 开始表达的时间较晚、表达水平较低，故治疗效果不够理想，故目前仍然是基因治 疗临床试验中应用较少的一种病毒载体。由于rAAV具有其他病毒载体不具备的优点，
如果能够改善rAAV的感染和转导效率，将明显改善rAAV的治疗效果，并拓展rAAV的 应用范围。那么，如何才能改善rAAV的感染和转导效率呢？ AAV成功感染是以病毒附着在 细胞表面为第一步的多步骤的过程。随后病毒被细胞摄取，然后在胞内被运输，转 运到细胞核内，或潜伏在核内或在某些辅助因子的作用下在细胞核内复制产生新的 病毒基因组，类似大多数病毒感染宿主细胞的过程。以最常用的II型重组腺相关病 毒(rAAV2)为例，rAAV2首先与硫酸乙酰肝素(heparinsulfate proteoglycans, HSPG) 结合，由于所有粘附细胞表面都表达葡萄糖胺聚糖，这也为rAAV2广泛的趋向性或亲 嗜性提供了一个简单的解释。另外，还有两种受体已被发现与rAAV2感染有关，它们 是a v e5整合素和成纤维细胞生长因子l(FGFRl)。而针对a v e 5整合素的抗体不 能干扰病毒与细胞的结合但却抑制了细胞对病毒的内吞作用，故推测a v 0 5整合素 似乎是AAV2被细胞内吞所必需的，但具体的内吞过程和接下来的步骤目前仍然不太 清楚。Sanlioglu等证明细胞内氧化还原调控蛋白Racl的活性能增强AAV2的内吞,他 们的研究表明，经过毗咯垸二硫代碳酸盐(pyrrolidinedithiocarbonate, PDTC)和 具有遗传毒性的因素(UV或H202)协同处理后,细胞对于rAAV的内吞和吸收明显增加， 但每一种试剂单独处理细胞对rAAV的内吞作用无明显提升。rMV是一种单链DNA病毒(ssDNA病毒)，它所携带的基因要表达需要经过单 链转换成双链(duble-stranded DNA dsDNA)的过程。只有双链DNA才具有转录能力。 有研究结果表明，rAAV进入靶细胞后，游离的单链状态的rAAV基因组只能存在很短 时间，其中大部分被靶细胞的酶识为受损伤的DNA而被降解。在某些情况下，AAV脱 衣壳后其单链DNA可转变成双链DNA。单链DNA转变成双链DNA可能有以下二条途径。 一条是以单链AAV DNA为模版合成另--条链，有研究报告腺病毒的E40RF6基因、UV 照射以及基因毒性化学药品等可增强这个过程；另一条是来自两个AAV病毒颗粒、极 性相反的单链退火形成双链。由于AAV是单链DNA病毒，末端的ITR折叠形成发夹样的 结构，复制是从AAV基因组折叠的3'端以AAV基因组自身作为模版合成双链DNA。双 链DNA再解链，正、负链以同等的效率被包装成新的病毒颗粒。故感染细胞后正、负
链可通过退火形成双链。rAAV在细胞内的这些特点导致了其转导的延迟和偶然发生 的无效转导。最近有研究表明细胞内一称为FKBP52的蛋白和热休克蛋白90 (HSP90) 可以改变AAV的转导效率。前者的磷酸化形式与病毒末端反向重复D-序列相互作用， 抑制病毒第二链的合成，限制转基因的表达。后者在AAV转导中表现为FKBP52-AAV D-序列复合物的一部分，但其本身不与D-序列结合。所以KBP52和HSP90均能通过改变 AAV的第二链合成从而达到改变AAV转导效率的作用。阿糖胞苷是一种抗肿瘤药物，又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，阿糖胞甙，阿糖胞嘧 啶(外文縮写为CAR， CA， Ara-C),为一类作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢 药物，化学名1-e-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮盐酸盐。分子式 C9H13N305 "HC1。分子量279.68。阿糖胞苷不存在于自然界，与生理性类似物胞 核苷(Cytidine)的区别在于其2'糖分子的位置上有OH基。Ara-C在细胞内先经 脱氧胞苷酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷酸(Ara-CMP)，再转化为二磷酸 阿糖胞苷(Ara-CDP)及三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)而起作用。后者与三磷酸脱氧 胞苷竞争，竞争性抑制DNA多聚酶，并插入到DNA链内，阻止DNA链的延长，并引 起链断裂，从而抑制DNA合成。前者能抑制核苷酸还原酵，阻止核苷酸转变为脱氧 核苷酸，抑制细胞DNA聚合及合成，但对RNA和蛋白质合成无显著作用，Ara-CTP 还可以改变细胞内磷脂和糖蛋白的代谢，而致细胞毒性作用。Ara为细胞周期特异 性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，对抑制RNA及蛋白质合成的作用较 弱。临床上主要用于治疗恶性肿瘤。但Ara在提高AAV介导的基因转导效率和表达 水平方面未曾被发现和报道。也没有人尝试在基因治疗时特别是对变性和遗传性疾 病基因治疗时使用Ara以提高AAV介导的转导效率、基因表达水平和持续时间。发明内容本发明的目的是提供一种新的用于基因治疗的复合制剂，具体涉及阿糖胞苷与 腺相关病毒的复合制剂及其用途。包括一定浓度的阿糖胞苷与腺相关病毒组成的复 合制剂，及复合制剂的基质；以及在眼病、遗传病及恶性肿瘤基因治疗时联合(同
时或先后)使用阿糖胞苷与腺相关病毒，包括系统给予阿糖胞苷和腺相关病毒或系 统给予阿糖胞苷局部使用腺相关病毒或局部使用阿糖胞苷与腺相关病毒，以增强腺 相关病毒介导的基因的转导效率、表达水平和持续时间的方法和用途；以及阿糖胞 苷在提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表达水平与持续时间、改善腺相关病毒 载体基因治疗效果的新的药用用途。本发明实验证实阿糖胞苷与腺相关病毒组成的的复合制剂,或在给予腺相关病 毒时联合使用阿糖胞苷可显著提高腺相关病毒载体的治疗效果。本发明所述的复合制剂，它含以下物质作为活性成分(1) 抗肿瘤药物阿糖胞苷；(2) 腺相关病毒，AAV1、 AAV2、 AAV5或其他血清型如MV3、 AAV4、 AAV6、 MV7、 或AAV8。上述活性成分的剂量如下述(1) 抗肿瘤药物阿糖胞苷的剂量为0. 001-10 ii g;(2) 在复合制剂中腺相关病毒的剂量为1X10e9-lX10el2病毒颗粒。 所述的复合制剂的基质可以是生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基。所述的复合制剂可以是冻干形式或液体形式。本发明所述的复合制剂可以采用局部注射或静脉注射方式。其中局部注射方式包括视网膜下注射、玻璃体腔内注射或前房注射；肌肉注射；腹腔注射；关节腔注 射；经导管肝内、肾内、心脏内灌注或肿瘤内注射方式。还包括局部给予腺相关病 毒，同时或先后静脉注射抗肿瘤药物阿糖胞苷方式等。本发明提供的上述复合制剂及其中抗肿瘤药物阿糖胞苷与腺相关病毒联合使 用的方法可显著改善腺相关病毒作为基因传递载体治疗疾病的疗效。联合使用一定 剂量的抗肿瘤药物阿糖胞苷，能明显增加腺相关病毒对正常和肿瘤细胞的转导效率， 使腺相关病毒介导的外源基因的表达时间明显提前、阳性率明显增加、表达水平明 显提高，同时又没有明显的毒副作用，有助于改善以腺相关病毒作为载体的基因治 疗效果。本发明尤其适用在眼病、遗传病以及肿瘤等疾病基因治疗中的应用。阿糖 胞苷的这一新的药用用途对于提升腺相关病毒介导的基因治疗的效果具有十分重要 的意义，有广阔的应用前景。本发明的目的通过下述步骤实现(1 )体外细胞培养实验证实阿糖胞苷可明显提高腺相关病毒对视网膜细胞和肿瘤 细胞的转导效率和基因表达水平。A阿糖胞苷显著提高腺相关病毒对体外培养的视网膜细胞的转导效率和基因表 达水平RPE细胞(APRE-19或原代培养的RPE)培养采用6孔细胞培养板，每孔接种2X 1()5RPE细胞，或2X1(T成人视网膜神经细胞。在6孔细胞培养板中联合加入阿糖胞苷和rAAV2—GFP。rAAV2—GFP用量均为每一 个细胞1乂104病毒颗粒。阿糖胞苷浓度范围为O. 0028-4. 2 ug/ml (终浓度)。对于感染rAAV2-GFP的细胞，通过GFP的表达反映rAAV2的转导和表达效率。根 据GFP荧光出现的时间、表达GFP荧光的细胞数量、以及GFP荧光强度来判断rAAV2载 体的转导效率和所携带基因的表达水平。GFP阳性细胞数量及GFP荧光强度的检测通 过荧光显微镜观察及流式细胞仪分析完成。单独应用1X101 rAAV:.—GFP感染人RPE细胞，到感染后第5天(120小时)观察 到少量细胞表达GFP荧光，并且荧光很弱。随感染时间的延长，GFP阳性细胞数量增 加但较缓慢，荧光强度增强不明显。结果表明，单独用rAAV2—GFP时GFP阳性细胞数 量少，荧光弱。若在使用rAAV2—GFP感染人RPE细胞时，同时加入阿糖胞苷，GFP的表达明显提 前、表达量也明显增加。当阿糖胞苷终浓度为0.0028ug/ml(0.0028yg)、 0, 014 ug/ml (0.014 u g) 、 0. 028 "g/ml (0.028 u g) 、 0. 14 y g/ml (0. 14 u g)、 0.28ixg/ml(0.28ug)、0. 56 u g/ml (0. 56 u g)、1.4u g/ml (1. 4u g)、 2.8 w g/ml (2. 8 u g) 、 4. 2 u g/ml (4. 2 u g)时，均能使GFP在RPE细胞的表达时间提前， 并且表达量增加。阿糖胞苷浓度越高，GFP阳性细胞数量越多，荧光越亮。随感染时 间延长，表达GFP的细胞数量明显增多，荧光强度显著增强。显微镜下观察细胞形态 好，未见细胞病变，Tunel检测细胞凋亡与对照无明显差异。Western blot分析以上各组GFP蛋白表达量，单独应用rAAV广GFP感染人RPE细 胞时，GFP阳性信号很弱。联合应用阿糖胞苷后细胞内GFP蛋白含量明显增加，而且 增加的程度与阿糖胞苷的剂量有关。当联合应用的阿糖胞苷浓度为1.4ug/ml、 2. 8u g/ml和4. 2u g/ml时，细胞内GFP蛋白含量髙,所述三个浓度的条带差别不明显。 其中条带最弱的是当阿糖胞苷浓度为O. 0028u g/ml (0. 0028y g)、 0. 014 u g/ml (0. 014 w g)时，但即便此时也明显好于单独应用rAAV2感染RPE细胞时的 结果。上述结果表明，所采用的9个不同浓度的阿糖胞苷均可不同程度的提高和加快 rAAV对RPE细胞的转导效率和基因表达水平，其中以O. 028y g/ml到4. 2u g/ml的浓度 最为有效，在感染后第7天可使GFP阳性率上升到98.5%,平均亮度达到137.7，远远 高于单独应用rAAV时的效率，阿糖胞苷显示出强大的加快和提高rAAV2所携带的基因 表达效率的作用。同时，在rMV感染细胞后第7天，各浓度间对提高rAAV转导效率的 作用差别不明显，细胞也都表现出很好的生长状况和形态，未见细胞数量较少、变 圆及凋亡等现象。证明了采用阿糖胞苷提高rAAV对RPE细胞转导效率时，其安全有效 剂量范围较广，这--特点将在临床实际应用时成为一种优势。除了上述建株的RPE细胞外本发明单独使用rAA^—GFP或联合阿糖胞苷感染原 代培养的成人RPE细胞、虹膜色素上皮细胞和人视网膜神经细胞均获得了与建株的 RPE细胞相同的结果。B阿糖胞苷显著提离腺相关病毒对体外细胞培养的肿痏细胞的转导效率和基因表 达水平。对于多种肿瘤细胞阿糖胞苷也显示相同的作用，将rAA^—GFP单独或联合终浓 度为0.56ug/ml (0.56ug)、 1.4ug /ml (1.4ug)、 2.8ug/ml (2.8ug)阿糖胞 苷分别感染人非小细胞肺癌细胞NCIH446 、人小细胞肺癌细胞株NCIH460、人肝癌细 胞株SMMC7721、人胃癌细胞株SGC7901和人肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜观察表达 GFP荧光的细胞数量及荧光亮度，并拍照记录。结果表明，当阿糖胞苷与rAAV2-GFP 共同感染5种肿瘤细胞时，可以不同程度的提高rAAV2-GFP对每一种肿瘤细胞的转导 效率及基因表达水平，其中以SMMC7721、 SGC7901和NCIH446效果最为明显，这可能 与rAAV2-GFP本身对所述的3种肿瘤细胞的亲嗜性高有关，阿糖胞苷在此基础上进一 步提升了外源基因在细胞内的表达速度和表达水平。同时，阿糖胞苷还对肿瘤细胞 产生了明显的凋亡作用。结果提示，根据阿糖胞苷这一特点，可以在肿瘤治疗过程 中，将化学治疗与基因治疗相结合，同时发挥阿糖胞苷的抗肿瘤作用，又充分利用 其提高基因治疗载体转导效率的特性，从而改善恶性肿瘤的治疗效果。本发明实验证实抗肿瘤药物阿糖胞苷在一定剂量浓度时可显著加快和提高 rAAV所介导的外源基因在视网膜细胞和RPE细胞内的表达,对细胞无明显毒、副作用。对于改善眼底病基因治疗的效果有明显作用。此外，阿糖胞苷在促进肿瘤细胞凋亡 的同时，还可以明显提高rAAV2所介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平。对于提高恶性肿瘤的治疗效果有明显作用。(2 )体内实验证实阿糖胞苷可明显提高腺相关病毒对活体视网膜细胞、肿瘤细胞及 多种组织的转导效率和基因表达水平。A阿糖胞苷显著提髙腺相关病毒对活体视网膜细胞的转导效率和基因表达水平，提 高治疗效果选取8周龄Balb/c小鼠，麻醉后分别在视网膜下腔注射AAV2-Luc和AAV厂Luc+ Ara-c。于注射后24、 48、 72小时和6天、9天、21天、28天后将小鼠麻醉经小动 物活体成像观察报告基因Uc在小鼠视网膜内的表达。结果表明单独应用AAVfLuc 进行视网膜下注射时，直到第6天才可见视网膜内Luc的表达；而联合应用化疗药 物Ara-c，在注射24小时后便可通过Luc生物素荧光判断视网膜内己有Luc基因的 表达，随着感染时间的延长，报告基因Luc在视网膜内的表达增强，而联合应用化 疗药物Ara-c的眼内荧光始终比单独应用AAV,.-GFP的眼内荧光强、范围大。HE切片 观察视网膜内细胞，未见明显坏死、凋亡及炎症反应。取3周齡RCS大鼠随机分成3组，分别在视网膜下注射生理盐水、AAV2-CNTF、 AAV「CNTF+Ara-c 。注射后5周取眼球制成HE切片后OLYMPAS显微镜下观察计数 RCS大鼠外核层细胞数量。视网膜下注射生理盐水组外核层细胞仅剩一层甚至消 失，单纯注射AAV2-CNTF组外核层细胞层数大约有3-4层，联合应用AAV厂CNTF和 Ara-c时外核层细胞层数在5-6层。B阿糖胞苷显著提高腺相关病毒对活体内的多种组织和肿瘤中的转导效率和基因 表达水平。将阿糖胞苷与腺相关病毒联合注射到小鼠腹腔内，，腺相关病毒为MVfLuc， 用量为l-3Xl(T个病毒颗粒，阿糖胞苷用量分别为lug和10ug。活体成像显示阿 糖胞苷可明显增加腺相关病毒在腹腔内的表达效率和持续时间。肿瘤模型选用人肺癌NCIH460裸小鼠模型，先将人肺癌NCIH460细胞接种到 Balb/c裸小鼠后肢皮下，4周后肿瘤生长至8-10mm直径。分别将AAV厂Luc lX10'n 或3X10'Q个病毒颗粒与0.01ug、 0. lug、 lug、 2ug、 5ug及10ug阿糖胞苷 混合后，用PBS调整体积至50ul，然后直接注射到肿瘤内，或分别将AAV厂Luc注射 到肿瘤内，lwg、 2ug、 5ug、 10ug、 50yg及100ixg阿糖胞苷注射到腹腔内。 f注射后48小时、96小时活体荧光成像检测肿瘤内荧光强度。检测结果表明阿糖 胞苷可明显增加腺相关病毒在肿瘤内的表达效率。本发明所涉及的病毒与药物的来源如下 1带GFP报告基因的2型腺相关病毒AAV2—GFP和带Luc报告基因的2型腺相关病毒AAV「Luc，由本元正阳基因技术有限公司提供。 2抗肿瘤药物阿糖胞苷为哈尔滨博莱制药有限公司生产的注射用盐酸阿糖胞苷，生产批号为06010702。本发明所涉及的各种细胞的来源和培养方法如下 所涉及的各种细胞有成人RPE细胞(APRE-19)为ATCC产品。 原代培养的成人RPE细胞、原代培养的成人视网膜神经细胞具体培养方法如下: 角膜移植后废弃眼球用75%酒精消毒，庆大霉素及PBS反复冲洗。然后仔细修剪去除 眼球周围的脂肪组织，从赤道部将眼球剪成两部分。弃去含有角膜的部分眼球；另 外一部分含有视网膜，小心剪除玻璃体腔中的玻璃体；在解剖镜下将视网膜小心取 出放入盛有PBS的刻度离心管中，PBS洗3次，加入一倍体积的0.25WTry-EDTA37C消 化60分钟。成人RPE细胞直接在眼杯内用0.25WTry-EDTA消化60分钟。然后分别吸出 ().25WTry-EDTA后加入含有15XFBS的DMEM/F12培养基(Invitrogen Inc)吹打细 胞成细胞悬液。显微镜下计数。以每孔2X105的细胞数量分至6孔板中。在37'C、 C02 体积分数为5%的培养箱内培养。每天观察一次。神经细胞7天换液一次，RPE细胞3 天换液一次。还涉及多种肿瘤细胞株，包括人非小细胞肺癌细胞株NCIH446、人小细胞肺癌细 胞株NCIH460、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC7721和人胃癌细胞株 SGC7901。


图1一3:突光显微镜照相，分别被MV2—GFP或AAV2—GFP联合不同浓度的阿糖胞 苷感染的RPE细胞中GFP表达情况，其中，图l单独应用AAV「GFP 1X10e9感染RPE细胞后第5天，细胞生长良好，荧 光显微镜下可见表达GFP的细胞数量少，散在分布，GFP荧光强度弱。A和B为同一视 野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片 和黑白照片，xioo。图2 AAV2 — GFP 1X10e9与0.0028ug/mi阿糖胞苷同时感染RPE细胞后第5 天，细胞生长形态好，部分细胞表达GFP荧光。A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照 片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X100。图3 AAV2—GFP 1X 10e9与l. 4n g/ml阿糖胞苷同时感染RPE细胞后第5天，绝 大部分细胞表达GFP， (;FP荧光强。细胞形态好，未见凋亡细胞存在。A和B为同一视 野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片 和黑白照片，xioo。
图4:荧光显微镜照相，分别被AAV2—GFP或AAV2—GFP联合O. 56ug/ml阿糖胞苷感 染的肿瘤细胞SGC7901中GFP表达情况，其中，AAV2—GFP 1X 10e9与0. 56 u g/ml阿糖胞苷同时感染7901细胞后48小时， 绝大部分细胞表达GFP， GFP荧光强。但部分细胞变圆凋亡，漂浮。A和B为同一视野 下7901细胞的荧光照片和黑白照片，X50; C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和 黑白照片，X400。图5:流式细胞仪分析，AAV2—GFP单独或AAV2—GFP联合不同浓度阿糖胞苷感染的 KPE细胞7天后GFP表达情况。图6:流式细胞仪分析，AAVa—GFP单独或AA、一GFP联合0. 54 u g/ml阿糖胞苷 感染肿瘤细胞72小时后GFP表达情况。图7: Westernblot检测，被AAV2—GFP单独或AAV2—GFP联合不同浓度阿糖胞苷感 染RPE细胞后GFP表达情况，其中，AAV2-GFP lX10e9联合不同浓度的阿糖胞苷同时感染RPE细胞后第7天， Westernblot检测细胞内GFP表达量。随着阿糖胞苷浓度的增加，细胞内GFP含量也在 逐渐增高。阿糖胞苷浓度为1.4ug/ml、 2.8118/1111和4.2118/1111时，细胞内GFP蛋白 含量髙，各浓度间条带大小差别不明显。然后是阿糖胞苷浓度为0.56wg/ml时，再 次为阿糖胞苷浓度分别为O. 28u g/ml、 0. 14y g/ml和0. 028u g/ral时，这三个浓度的 条带差别也不明显。条带最弱的是当阿糖胞苷浓度为O. 0028u g/ml(0. 0028n g)、 ().014lig/ml(0.014ug)时。单独应用AAV2-GFP时因条带微弱，以至于无法观察到。图8小动物活体成像观察MV2—Luc (右眼)或MV2—Luc联合0.1 ix g/ml阿糖胞 苷(左眼)视网膜下注射后对视网膜细胞的感染情况， 其中，联合应用阿糖胞苷显著增加AAV2—Luc对视网膜细胞的感染效率。图9单独应用AAV2—CNTF lxlOe-10或联合应用AAV2—CNTF lxl0e10与阿糖 胞苷1 y g，经内路法注射入3周龄RCS大鼠视网膜下间隙后第5周，HE切片观察联 合应用AAV2—CNTF lxlOelO与阿糖胞苷时视网膜内外核层存留的细胞数目较单独应 用AAV2—CNTF lxlOelO时多，其中，A未经治疗时RCS大鼠视网膜外核层细胞几乎全部发生凋亡，丧失；X400，B视网膜下注射生理盐水时RCS大鼠视网膜外核层细胞几乎全部发生凋亡，丧失；X400C单独应用AAV2—CNTF lxl0e10时RCS大鼠视网膜内可见有3-4层外核层 细胞存留；X400D联合应用AAV2—CNTF lxl0e10与阿糖胞苷1 W g时RCS大鼠视网膜内可见 有5-6层外核层细胞存留；X400具体实施方式
实施例l阿糖胞苷加快和提高rAAV-GFP对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平按每孔2X1()5将RPE (APRE-19， ATCC)细胞接种在6孔细胞培养板中，24小时 后细胞贴壁，分别将1X10" rAAVrGFP单独或联合O. 0028 u g/ml (0. 0028 u g)、 0. 014 y g/ml (0. 014 y g) 、 0. 028 " g/ml (0. 028 w g) 、 0. 14 " g/ml (0.14 y g)、 0. 28u g/ral (0, 28u g)、0. 56u g/ml (0. 56u g)、1. 4y g/ml (1. 4u g)、 2.8 ii g/ml (2. 8 u g) 、 4. 2 y g/ml (4. 2 w g)浓度的阿糖胞苷加入到培养的细胞中。然 后每天用荧光显微镜观察并照相记录被感染的细胞GFP荧光的亮度、细胞形态与病变 状态。7天后胰蛋白酶消化，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数及GFP荧光强度、Western blot检测GFP表达量。上述检测结果如下，若单独使用rAAVa—GFP感染细胞，第5天(120小时)起 才能观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，7天时细胞计数， 细胞数量为2.25乂10'\流式细胞仪检测GFP阳性率为13.594,平均亮度2.75见图1。 若同时加入 0. 028 u g/ml (0. 028 u g) 、0.14 y g/ml (0.14 n g) 、 0.28ug/ml(0.28"g)、0. 56 u g/ml (0. 56 u g)、1.4u g/ml(1. g)、 2,8ug/ml(2.8iig) 、 4.2ug/ml(4,2ug)浓度的阿糖胞苷，GFP表达时间明显提前， 表达量显著增加。感染后18小时便可观察到有较多的RPE细胞表达GFP荧光，并且此 时表达GFP荧光的细胞数量和荧光强度明显髙于单独应用rAAV2—GFP感染细胞时第7 天的情况。随感染时间的延长，被感染细胞内GFP阳性细胞数继续增加，GFP的平均 亮度也随之增高，同时细胞生长形态好，无变圆及凋亡的细胞。感染后7天计数细胞，
细胞数量按上述阿糖胞苷的浓度次序分别为2. 17X 10s、 2. 21X 10s、 2. 05X 105、 2. 09 X105、2. 12X105、2. 18Xl()5和2. 03X 10%流式细胞仪分析显示GFP阳性率分别为97. 1 %、 97. 3%、 97. 3%、 98. 0%、 97. 9%、 98. 2%、 98. 5%。 GFP的平均亮度分别为94. 8、 93.6 、 98.6、 104.3、 110.5、 126.6、 137,2。当联合使用的阿糖胞苷浓度为 0. 0028 u g/ml (0. 0028 u g) 、 0. 014 y g/ml (0. 014 u g)时，rAAV厂GFP感染细胞后24小 时，可通过荧光显微镜观察到少量GFP荧光。7天时计数细胞，细胞数量分别为2.21 X1(T和2.20X105。流式细胞仪检测结果GFP阳性率分别为70.3X和74.51)4。 GFP 的平均亮度分别为44. 1和49. 7。此时，细胞形态好，无变圆及凋亡的细胞。见图2、 3、 5、 7。实施例2阿糖胞苷加快和提髙rAAV-GFP对多种肿瘤细胞的转导效率和基因表达水平按每孔1X1()5将肿瘤细胞(7721、 7901、 NCIH446、 NCIH460、 A549)接种在24 孔细胞培养板中，24小时后细胞贴壁，分别将lXl(^rAAVfGFP单独或与终浓度为 0.56ng/ml (0.56ng)、 1.4ug /ml (1.4ug)、 2.8wg/ml (2.8ug)的阿糖胞苷 同时加入到培养的细胞中。感染后24小时荧光显微镜观察，感染后24小时，单独应 用rAAV2-GFP感染的5种肿瘤细胞内均未见明显荧光；在联合应用不同浓度阿糖胞苷 的肿瘤细胞中，SMMC7721、SGC7901和NCIH446内部分细胞出现GFP突光，细胞形态好， 未见细胞变圆。48小时后，单独使用rAAV厂GFP感染的SGC7901、 NCIH446和SMMC7721 细胞内可见有少量表达GFP突光的细胞，其余2种肿瘤细胞内仍未见明显荧光，5种肿 瘤细胞形态好，未见细胞变圆。而在r AAVrGFP与阿糖胞苷共同感染的细胞中， SGC7901和NCIH446中GFP阳性细胞进一步增多，荧光更亮，并且GFP阳性细胞数量和 荧光强度随着使用阿糖胞苷浓度增高而增加。另外2种肿瘤细胞NCIH460和A549内也 可见少量细胞出现GFP突光。此外，凡是加入阿糖胞苷的肿瘤细胞在感染后48小时观 察，均见到有部分细胞变圆，阿糖胞苷的浓度越髙，变圆细胞的数量越多。其中以 联合加入2.81^/1111 (2.8ng)阿糖胞苷的SMMC7721细胞最为明显。感染后72小时， 与单独使用r AAV2-GFP感染的肿瘤细胞相比，'5种联合应用0. 56 n g/ml阿糖胞苷感染
的肿瘤细胞内表达GFP荧光的细胞数量明显多且亮。但加入阿糖胞苷的肿瘤细胞均有 不同程度的凋亡和漂浮，而单独应用rAAVfGFP感染的肿瘤细胞则生长状态良好，无 凋亡和漂浮现象。流式细胞检测结果如下单独应用rAAV2-GFP感染NCIH446、 NCIH460、 SGC7901、 SMMC7721和A549细胞72小时后，GFP阳性率分别为30. 1%、 26. 1%、 31.8%、 34.4%和23.6%，平均亮度分别为21.4、 12.9、 28.1、 27.2和16.3;联合应用 0.56lig/ml阿糖胞苷后GFP阳性率分别为72.31)()、 52.5%、 80.5%、 85.1%和47. 4%，平 均亮度为57.4、48.1、62. 5、60. 5和31. 5。当阿糖胞苷的浓度为l. 4 u g /m1(1. " g)、 2.8ng/ml (2.8ug)时，因细胞变圆、漂浮严重，无法测得流式结果。按照GFP阳 性率和荧光亮度来反映rAAV2的转导效率，则单独用rAAV2-GFP感染肿瘤细胞时，r AAV2在SGC7901细胞内转导效率较其他4种肿瘤细胞略高一些，总体上来看，都偏低。 当rAAV2"GFP与0. 56u g/ral阿糖胞苷共同感染细胞后，5种肿瘤细胞内GFP阳性细胞数 量及亮度明显提高，最为明显的是SMMC7721细胞和SGC7901细胞，GFP阳性率分别由 34. 4條高至ij85.1%、 31， 8先提髙至ij80. 5%，平均亮度分别由27. 2上升至60. 5、 28. l上 升至62.5。然后依次是NCIH446、 NCIH460和A549细胞。见图4、 6。上述实验结果表明，单独应用rAAV2作为基因传递载体对视网膜和肿瘤等细胞的 转导效率较低，基因表达水平也较低，而且基因开始表达所需要的时间较长。抗肿 瘤药物阿糖胞苷在一定剂量范围内可以安全有效地加快和提高rAAV2在视网膜细胞 内的转导效率和基因表达水平。当阿糖胞苷浓度为0.028 ii g/m1(0. 028 ug)、 0. 14 w g/ml (0. 14 u g) 、 0. 28 " g/ml (0. 28 U g) 、 0. 56 y g/ml (0. 56 u g)、 1.4ug/ml(1.4iig) 、 2.8wg/ml(2.8ug) 、 4. 2jx g/ml(4. 2u g)时，既可以显著加 快和提髙GFP的表达，又不产生明显的抑制细胞生长，诱导细胞凋亡等副作用。因此, 对于采用阿糖胞苷来提高rAAV2在视网膜细胞内转导效率这一新方法来说,阿糖胞苷 的安全有效剂量范围比较广泛。此外，阿糖胞苷在使肿瘤细胞凋亡的同时，也能显 著提高rAAV2在肿瘤细胞内的转导效率和基因表达。实施例3体内实验证实阿糖胞苷可明显提高腺相关病毒对活体视网膜细胞的转导效率和基因
表达水平，提高治疗效果A阿糖胞苷提高AAV介导的基因在活体视网膜细胞内的表达水平选取8周龄Balb/c小鼠，麻醉后分别在视网膜下腔注射AAVfLuc和AAV2-Luc+ Ara-c各2ul。具体剂量左眼AAV厂GFP 2X10" (2ul)个病毒颗粒，右眼AAV厂GFP 2X10"个病毒颗粒联合Ara-c0.001ug。分别于视网膜下注射24、 48、 72小时和6 天、9天、21天、28天后将小鼠麻醉经小动物活体成像观察报告基因Luc在小鼠视 网膜内的表达。结果表明单独应用AAV2-Luc进行视网膜下注射时，直到第6天才可 见视网膜内Luc的表达;而联合应用化疗药物Ara-c，在注射24小时后便可通过Luc 生物素突光判断视网膜内已有Luc基因的表达，随着感染时间的延长，报告基因Luc 在视网膜内的表达增强，而联合应用化疗药物Ara-c的眼内荧光始终比单独应用 AAV2-GFP的眼内荧光强、范围大。视网膜下注射1周和2周后多聚甲醛灌注后取眼 球，5%冰醋酸后固定24小时，石蜡包埋后连续切片，切片厚度约6um， HE染色后 观察视网膜内细胞，未见明显坏死、凋亡及炎症反应。见图8。B.腺病毒提髙AAV介导的基因转移的治疗效果取3周龄RCS大鼠，雌雄不限，随机分成3组，分别在视网膜下注射生理盐水 (2ul)、 AAV2-CNTF 1X10'" (2ul)个病毒颗粒、AAV厂CNTF 1乂10'°个病毒颗粒+ Ara-c O,OOlug (共2ul)。注射后5周多聚甲醛灌注后取眼球，5%冰醋酸后固定， 石蜡包埋，HE染色后观察切片。OLYMPAS显微镜下观察计数RCS大鼠外核层细胞数 量。视网膜下注射生理盐水组外核层细胞仅剩一层甚至消失，单纯注射AAV2-CNTF 组外核层细胞层数大约有3-4层，联合应用AAV2-CNTF和Ara-c lug时外核层细 胞层数在5-6层，三组之间p值均小于0.05,差异有统计学意义。见图9。
权利要求
1、一种阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质(1)抗肿瘤药物阿糖胞苷；(2)腺相关病毒，包括AAV1、AAV2、AAV5或其他血清型如AAV3、AAV4、AAV6、AAV7和/或AAV8。
2、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的腺相关病毒的用量为IX 109 1 X1013 AAV病毒颗粒。
3、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的阿糖胞苷的用量为0.001~ 10ug。
4、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的复合制剂中的基质是注射 用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基。
5、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征所述的制剂是冻干形式或液体形式。
6、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是其给药方式采用局部注射或静脉 注射方式。
7、 根据权利要求6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式是阿糖胞苷与腺 相关病毒混合后以混合物形式给药，或分别给予阿糖胞苷与腺相关病毒包括在 局部分别注射阿糖胞苷与腺相关病毒，或同时静脉注射阿糖胞苷与腺相关病毒； 或局部注射腺相关病毒或静脉注射阿糖胞苷。
8、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式其中给药的 时间顺序是提前注射阿糖胞苷然后再注射腺相关病毒，或同时注射阿糖胞苷与腺 相关病毒，或先注射腺相关病毒后再注射阿糖胞苷。
9、 权利要求1所述的复合制剂在制备提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表 达水平与持续时间和/或改善腺相关病毒载体基因治疗效果药物中的用途。
10、 按权利要求1的用途，其特征是所述的用途是制备眼病基因治疗、遗传病基 因治疗、恶性肿瘤基因治疗、治疗各种类型的关节炎、治疗各种类型的心脏病、 治疗肝脏的各种代谢性疾病和/或治疗肌肉或神经系统退性变药物中的用途。
11、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中眼病基因治疗，其剂量为0.001-1 Hg阿糖胞苷1X10MX10。AAV病毒颗粒；采用视网膜下注射、玻璃体腔内 注射或前房注射方式。
12、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中遗传病基因治疗，其剂量为 0.01-10Ug阿糖胞苷1X10IQ-1X1013 AAV病毒颗粒；采用肌肉注射腹腔注 射或经导管肝内、肾内灌注方式。
13、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中恶性肿瘤基因治疗，其剂量为 O.Ol-lOlig阿糖胞苷1X10IQ-1X1013 AAV病毒颗粒；采用肿瘤内注射或腹腔 注射方式。
14、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中治疗各种类型的关节炎，其剂 量为O.OO卜lug阿糖胞苷；1X1(T-1X1(^AAV病毒颗粒；采用关节腔内或其 周围注射方式。
15、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中治疗各种类型的心脏病，其剂 量为0.01-10ug阿糖胞苷；1X10'、1X1()UAAV病毒颗粒；采用经导管心脏内 灌注方式。
16、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中治疗肝脏的各种代谢性疾病， 其剂量为0.01-10 ii g阿糖胞苷；1X1(^-1X10"AAV病毒颗粒；采用经导管肝 内灌注方式。
17、 根据权利要求10所述的用途，其特征是其中治疗肌肉或神经系统退性变， 其剂量为0.01-10ug阿糖胞苷；1X10'G-1X10UAAV病毒颗粒；采用肿瘤内注 射方式。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。公开了在使用腺相关病毒作为基因传递载体时，联合使用一定剂量的阿糖胞苷，可以明显增加腺相关病毒对正常和肿瘤细胞的转导效率，使腺相关病毒介导的外源基因的表达时间明显提前、阳性率明显增加、表达水平明显提高，从而改善以腺相关病毒作为载体的基因治疗效果，特别是在眼底病、遗传病以及肿瘤等疾病基因治疗中的应用。在肿瘤基因治疗中具有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，和明显增加腺相关病毒介导的基因转导效率和表达水平的作用。
文档编号A61K31/7068GK101116747SQ20061002966
公开日2008年2月6日 申请日期2006年8月1日 优先权日2006年8月1日
发明者吴小兵, 吴继红, 张圣海, 李川源, 董小岩, 倩 黄 申请人:上海市第一人民医院