专利名称：：防治更年期综合症和骨质疏松症的组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明属医药
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种防治更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物、提取物及其制备方法。
背景技术：
：更年期综合征是一种发病率高、危害性大的常见病。在我国更年期人口中，更年期精神神经症状发生率高达75.1%,在绝经前己达高峰，持续7年左右；血管舒缩功能失调发生率为40.9%,高峰年龄50岁以后，持续6年左右。目前研究的资料表明，99%的妇女在更年期及更年期后可出现骨质疏松症，也称为原发性骨质疏松症。该症是一种以骨量减少、骨组织微细结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的全身性的骨骼疾病。随着世界人口趋于老龄化，骨质疏松症及骨质疏松性骨折的发病人口呈迅速上升的趋势。根据我国2000年人口普查的结果，预测我国患原发性骨质疏松症的人数约为0.88亿，约占全国总人口的6.97%,预计到2010年将达到1.14亿，占总人口的百分数8.2%。雌激素替代疗法(HormoneReplacementTherapy,HRT)是目前治疗更年期综合症及骨质疏松的主要手段，疗效较好，但临床结果表明，患者长期应用雌激素替代疗法后会引起严重的副作用，包括子宫出血，刺激乳腺细胞、子宫内膜增生，增加乳腺癌、子宫内膜癌发病率等严重不良反应。防治更年期综合症及骨质疏松已成为当代医药学研究的重点和热门领i或之一。
发明内容中医理论认为，更年期症状主要是由于肾气渐衰，冲任二脉虛惫，导致阴阳失调，气血两虚而引起，表现为头昏耳鸣、心悸失眠、烦躁易怒或抑郁焦虑，潮热汗出等症状。本发明用于防治更年期综合症和/或骨质疏松症，由传统复方当归补血汤加p未而成。当归补血汤是中医临床常用的补益气血的方剂，由金元四大家之一李东垣创立，首载于其医学名著《内外伤辩惑论》(公元1247年)，其功能是补气生血，广泛用于气血两虚之低热、面赤、面色萎黄、神疲乏力等症。李东垣道"该方可为益气生血之剂，称之有形之血，生于无形之气"。现代临床及药理研究表明，当归补血汤对心、肝等机体损伤有保护作用，能增强肌体免疫功能、抗贫血、改善血液流变学、提高机体应激水平等，用于免疫性全血细胞减少症、再生障碍性贫血、过敏性紫癜、血管神经性头痛、血虚便秘等，但迄今未见单用该方预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的研究报道和临床应用实例。本发明的发明人发现，在传统组合物当归补血汤的基础上，选用中药淫羊藎与当归补血汤组方，在预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症方面效果优异，可以有效促进MG-63骨细胞的增殖、分化，增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平，且不刺激乳癌细胞的增殖。此外，中药淫羊藿与当归补血汤组方，经过优化提取、浓缩、精制后，相比传统组合物，预防和治疗更年期综合症作用显著增强，作用机制明确，且具有剂型先进，给药剂量小，患者适应性好等特点。本发明的目的是利用我国传统中医药理论和中药材，研制开发一种疗效确切，副作用小，适合更年期妇女预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物及其提取物。一、药材成分与配比(重量)本发明涉及一种预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物，其特征在于制成该组合物所含药效成分的原料由当归、黄芪和淫羊藿组成，其重量比为当归150份，黄芪1~100份，淫羊藿O.l-lOO份。其中所用当归为伞形科植物当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根。淫羊藿为小檗科(Berberidaceae)才直物淫羊菱(￡^z>we<^WA77Zrevz'corwwwMaxim.)、箭叶淫羊藿(￡^/me<iz'wmsegzYtofww(Sitb.etZucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)、巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseMaxim.)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreammNakai)的干燥地上部分。有关伞形科、豆科、小檗科的科学定义和范畴，参见《中国高等植物科属词典》(修订版)(侯宽昭编，北京科学出版社，1984.12)。按照中医传统用药习惯，这些材料还包括经过酒制、蜜制等炮制方法制成的各种炮制品。除当归、黄荒、淫羊藿外，本发明的药用组合物还可以包含选自生地黄、葛根、赤芍和骨碎补等不影响疗效的其他成分。优选地，本发明的药用组合物由当归、黄芪、淫羊藿组成。优选地，本发明的药用组合物中当归、黄芪和淫羊愛的重量比为当归120份，黄芪20~100份，淫羊藿1100份。进一步优选地，本发明的药用组合物中所述原料的重量比为当归10份，黄芪50份，淫羊藿50份。本发明还涉及上述药用组合物的提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芪，以4~12倍水或4壬意比例乙醇水溶液提取1~3次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸膏I;(3)称取淫羊藿，以4~12倍5095°/。乙醇水溶液提取1~3次，每次0.5~2小时，合并提取液，浓缩得浸膏II;(4)取浸膏I、II,合并，混匀，干燥，得到所述药用组合物的提取物。本发明也涉及药用组合物的提取物的另一种制备方法，其特征在于步骤如下(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芪，淫羊藿，混合均匀，以412倍水或任意比例乙醇水溶液提取13次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得到浸膏；(3)取浸膏混匀，干燥，得到所述药用组合物的提取物。本发明还涉及药用组合物在制备一种药物中的应用，所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分4t,增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平，且不刺激乳癌细胞的增殖。本发明还涉及用本发明的方法制备的提取物在制备一种药物中的应用，所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分化，增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平，且不刺激乳癌细胞的增殖。本发明还涉及药用组合物在制备用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松药物中的应用。疗更年期综合症和/或骨质疏松药物中的应用。优选地，所述药物为胶嚢、片剂或软胶嚢剂型。本发明还涉及一种预防和治疗更年期综合症的药用组合物，其特征在于该药用组合物由当归、黄茂和淫羊藿提取物组成，其重量比为当归多糖120%;黄芪多糖20~60%;黄芪乙醇提取物卜20%;淫羊藿提取物20~80%。优选地，各组分的重量配比为当归多糖8%;黄芪多糖46%;黄芪乙醇提取物6%;淫羊藿提取物40%。本发明还涉及一种药用组合物的制备方法，其包括混合当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物。优选地，其中当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为当归多糖120%;黄芪多糖20~60%;黄芙乙醇提取物1~20%;淫羊藿提取物20~80%。进一步优选地，其中当归多糖、黄荒多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为8%:46%:6%:40%。在上述制备方法中，当归多糖的制备方法为取当归粉碎成粉末，以水提取，减压浓缩，将浓缩液加入乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到当归多糖；黄芪多糖和黄芪乙醇提取物的制备方法为取黄荒粉碎成粉末，以水提取，减压浓缩，将浓缩液加入乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芪多糖；剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔树脂柱，水洗，再用乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物；淫羊愛提取物的制备方法为取淫羊藿粉粹成粉末，以乙醇水溶液提取，，浓缩干燥后得淫羊藿提取物。本发明还涉及一种组合物，它包含淫羊藿提取物与当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物，用于预防和治疗更年期综合症，有效增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平、或者提高免疫水平。本发明进一步涉及所述药用组合物在制备用于预防和治疗更年期综合症药物中的应用。优选地，所述药物为胶嚢、片剂或其他剂型。二、制备方法1.组合物提取物的制备按照上述材料和配伍比例组成的当归补血汤及衍生方用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏术>症的目的时，可以直接用水煎法或酒浸法制成汤剂或酒剂直接服用，也可以先用水或用含量为1%~100%的醇类(曱醇、乙醇等)、酮类(丙酮等)或酯类(乙酸乙酯等)提取后，或以超临界C02流体萃取法提取后，再混入水或酒提物中，将其制成浸膏、膏滋、颗粒剂或胶嚢等制剂后服用。其中最优选的提取方法是水提取。具体方法如下(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芪，以412倍水或任意比例乙醇水溶液提取13次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸膏I;(3)称取淫羊藿，以4~12倍30~95%乙醇水溶液提取1~3次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸膏II;(4)取浸膏I、II，合并，混匀，干燥，得本发明提取物。或(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芪、淫羊藿粉末，混合均匀，以412倍水或任意比例乙醇水溶液提取13次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸骨；(3)取浸膏混勻，千燥，得本发明提取物。2.当归多糖的制备取当归药材粉碎成粉末，以4~12倍水提取1~3次，每次0.5~2小时，合并提取液，减压浓缩。将浓缩液加入2~6倍50~95%乙醇，收集所得沉淀，千燥后得到当归多糖。优选地，取当归药材lkg粉碎成粉末，以8倍水提取2次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到当归多糖。3.当归乙醇提取物取当归药材粉碎成粉末，以95%乙醇浸泡过夜，使其充分溶胀，再以95%乙醇渗漉至洗脱液无明显颜色(约3~6倍保留体积)，渗漉液减压浓缩后得当归乙醇提取物。4.黄芪多糖黄芪乙醇提取物的制备取黄芪药材粉石年成粉末，以412倍水或提取13次，每次0.52小时，合并提取液，减压浓缩。将浓缩液加入2~6倍5095%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芪多糖，产率大约9.2%。剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔树脂柱。水洗约24倍柱体积，再用50%~95%乙醇洗脱24倍柱体积，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。优选地，取黄芪药材lkg粉碎成粉末，以8倍水或提取2次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芪多糖；剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔初t脂柱，水洗约3倍柱体积，再用70%乙醇洗脱3倍柱体积，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。5.淫羊藿提取物的制备取淫羊藿药材4分粹成4分末，以412倍3095%乙醇水溶液提取1~3次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩干燥后得淫羊藿提取物。优选地，取淫羊藿药材lkg粉粹成粉末，以8倍70。/。乙醇水溶液提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥后得淫羊愛提取物。为得到优化后的提取物配比，根据更年期综合症特点，选择雌激素样作用和免疫活性两个药理指标，采用如下药效学实验进行筛选和活性才全测，包括测量MCF-7细胞ERE-Luc活性，测量T细胞增殖与巨谨细胞免疫活性等。图1显示黄芪和当归的组合物对MCF-7细胞生长的影响。图2显示当归、黄芪和淫羊藿的组合物对MCF-7细胞生长的影响。图3显示黄芙和当归的组合物对MG-63细胞生长的影响。图4显示当归、黄芪和淫羊藿的组合物对MG-63细胞生长的影响。图5显示当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的正交试验结果。图6显示加入不同量淫羊藿后对9号组合物的雌激素样作用的结果。图7显示含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的組合物的T淋巴细胞增殖试验的结果。图8显示含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的组合物的巨噬细胞吞噬活性试马佥结果。具体实施方式现结合实施例，对本发明作详细的描述实施例1:组合物提取物的制备处方当归200g黄芪1000g淫羊藿1000g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪两p未，置于20L提取器中，加水16kg,充分搅拌浸泡，加热提取l小时，趁热过滤，残渣再用8kg水加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液浓缩至1.05~1.1比重的稠浸膏，得浸膏I。再取淫羊藿粗粉1000g，置于10L提取器中，加入70。/。乙醇8L，充分浸泡后加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用6L70%乙醇加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液60。C减压回收浓缩至1.05-1.1比重的稠浸膏，得浸膏II。取浸膏I、II，合并，充分混匀后干燥，得本发明提取物l。实施例2:组合物提取物的制备处方当归200g黄芪1000g淫羊藿1000g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加水17.6kg，充分搅拌均匀，加热提取l小时，趁热过滤，残渣再用11kg水回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物2。实施例3:组合物提取物的制备处方当归200g黄芪1000g淫羊藿1000g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀，加热回流提取l小时，趁热过滤，残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物3。实施例4:组合物提取物的制备处方当归200g黄芪1000g淫羊藿lg制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于10L提取器中，加水7.2kg,充分搅拌均匀，加热提取1小时，趁热过滤，残渣再用6kg水加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收得稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物4。实施例5:组合物提取物的制备处方当归10g黄芪1000g淫羊愛1000g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇15L，充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用10L乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物5。实施例6:组合物提取物的制备处方当归50g黄芪100g淫羊藿1000g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊愛三味药材，混合均匀，置于50L提取器中，加70%乙醇24L,充分撹拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏，取浸膏充分混匀后喷雾干燥，得本发明提取物6。实施例7:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿500g制法以上3味，粉碎为粗粉。分置于IOL提取器中，分加70%乙醇1，5,5升，加热提取1小时，趁热过滤，残渣再用乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液滤液浓缩。三种提取物混合后干燥，得本发明提取物7。实施例8:组合物提取物的制备处方当归100g黄茂500g淫羊藿提取物10g制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪二味药材，混合均匀，置于50L提取器中，加70%乙醇24L，充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏，取浸膏充分混匀后喷雾干燥，得当归黄芪提取物。另取淫羊愛提取物，加入当归黄芪提取物，混匀，得本发明提取物8。实施例9:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿苷lg制法以上3味，粉碎为粗粉。取当归、黄茂二味药材，混合均匀，置于50L提取器中，加70%乙醇24L，充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用15L乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为稠浸膏，取浸膏充分混匀后喷雾干燥，得当归黄芪提取物。另取淫羊藿苷，加入当归黄芪提取物，混匀，得本发明提取物9。实施例10:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿500g赤芍100g制法以上4味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材,混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物10。实施例ll:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿500g葛根500g制法以上4味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物11。实施例12:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿500g生地黄100g制法以上4味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿四味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇12kg,充分搅拌均匀，加热回流提取1小时，趁热过滤，残渣再用8kg乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物13。实施例13:组合物提取物的制备处方当归100g黄芪500g淫羊藿500g葛根500g赤芍100g生地黄100g骨碎补100g制法以上7味，粉碎为粗粉。取当归、黄芪、淫羊藿三味药材，混合均匀，置于20L提取器中，加70%乙醇17.6kg,充分搅拌均匀，加热回流提取l小时，趁热过滤，残渣再用11kg乙醇回流加热提取1小时，趁热过滤，合并滤液。滤液减压回收浓缩为1.05-1.1比重的稠浸膏，取浸膏充分混匀后干燥，得本发明提取物13。实施例14:组合物胶嚢的制备处方实施例1-13中组合物提取物300g制法上述组合物提取物加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒，将所得颗粒装入1号硬明胶胶嚢中，每粒0.3g,分装100粒，即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶嚢剂项下的有关^见定。实施例15:组合物片剂的制备处方实施例1-13中组合物提取物100g制法上述组合物提取物加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒，将所得颗粒压片，每片0.2g,分装500片，即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年片剂项下的有关规定。实施例16:组合物软胶嚢的制备处方实施例1-13中组合物提取物100g制法上述组合物提取物粉未，加入植物油等辅料，混合、压成软胶嚢，每片0.5g,共分装500粒，即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年软胶嚢项下的有关规定。实施例17:药效学试马全本发明用于防治更年期综合症和/或骨质疏松，进行了如下药效学试验，包括测量MCF-7细胞增殖和ERE-Luc活性，测量MG-63细胞增殖与分化等。一、组合物的雌激素样作用1.细胞培养条件MCF-7(含有ERE基因)细胞培养在MEM培养基，含10%胎牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50|ug/ml、O.lmM氨基酸和l.OmM丙酮酸钠，培养箱温度37°C,含5%C02,95%空气。实验之前3天改变为无酚红MEMa培养基，含2%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清。2.对MCF-7细月包生长的影响细胞种在96孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA),细胞密度约lxl(^细胞/孔，过夜让细胞贴壁，从第二天开始加药，每24小时加药一次，加药之前更换培养液。加药三次后取样，样品进行MTT测定。每孔加0.02mgMTT,37。C培养4小时，每孔加150|ilDMSO溶解形成的吹喃结晶，在570nm用OpsysMicroplateReader(ThermoLabsystems,MA,USA)测定光密度。实4佥资^f以三次实马t的平均值，每次平刊-j故三个孔。试验结果见图1、2。3.对雌激素反应组件-荧光素酶(ERE-luciferase)活性的影响细胞接种在24孔板(Falcon，BDLabware,NJ,USA),细胞密度约5乂104细胞/孔，过夜让细胞贴壁，从第二天开始加药，每24小时加药一次，加药之前更换培养液。加药二次后取样，样品进行荧光素酶活性测定(FluostarOptima,BMGLabtechnology)。实验资料以三次实验的平均值，每次平行做三个孔。试验结果见图1、2。以上结果表明古方当归补血汤的雌激素样活性在当归:黄芪=1:5时表现最佳，使ERE-Luc活性显着增加(图1)。在当归补血汤配伍淫羊藿后，其雌激素样作用进一步显着加强，当归:黄芪:淫羊藿=1:5:5时效果与对照药P-雌二醇接近；但与P-雌二醇显著增加乳癌细胞增殖明显不同，三味中药配伍所得组合物对乳癌细胞几乎没有促增殖作用(图2)。以当归:黄芪:淫羊藿=1:5:5配伍，表现出良好的雌激素样活性和极低的癌细胞增殖副作用。二、组合物的抗骨质疏松作用1.细胞培养条件MG-63细胞培养在MEM培养基，含10%热失活牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50|ug/ml、O.lmM氨基酸和1.0mM丙酮酸钠，培养箱温度37。C，含5%032,95%空气。2.对MG-63细胞生长的影响试验方法同MCF-7细胞MTT试验，试验结果见图3、4。3.MG-63细胞碱性磷酸酶(ALP)活性测定细胞接种在24孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA),细胞密度约3xlOS细胞/孔，过夜让细胞贴壁，从第二天开始加药，加药之前更换培养液。每加药24小时后取样，所有样品用PBS洗二次，并保存在-80。C水箱。每孔在室温加200fi1细胞裂解緩冲液(0.1%TritonX-100inPBS),水冻裂解，收集细胞裂解液，14，000rpm离心5min,上清液用来测定蛋白浓度以及进行碱性磷酸酶活性测定。每100^1样品加100nl磷酸对硝基苯酯(p-nitro-phenylphosphate)底物溶液，37。C孵育30min，力。100til2NNaOH终止反应。在405nm用OpsysMicroplateReader(ThermoLabsystems,MA,USA)测定光密度。i式马t结果见图3、4:以上结果表明古方当归补血汤的促骨细胞增殖、分化作用在当归:黄芪=1:5时表现最佳，使MG-63细胞表现出显着的增殖、分化作用(图3)。在当归补血汤配伍淫羊藿后，其促进骨细胞增殖分化作用进一步显着加强(图4),当归:黄茂:淫羊藿=1:5:5时，在促进骨细胞增殖、分化方面均与对照药P-雌二醇接近，结果表明本组合物可以刺激骨细胞增殖和分化，而没有引致乳癌细胞增殖，表现出良好的抗骨质疏松作用。实施例18:含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物的制备U)当归多糖的制备取当归药材lkg粉碎成粉末，以8倍水提取2次，每次l小时，合并提取液，减压浓缩。将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到当归多糖。(2)黄芪多糖黄芪乙醇提取物的制备取黄芪药材lkg粉碎成粉末，以8倍水或提取2次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩。将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芘多糖。剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔树脂柱。水洗约3倍柱体积，再用70%乙醇洗脱3倍柱体积，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。(3)淫羊藿提取物的制备取淫羊藿药材lkg粉粹成粉末，以8倍70%乙醇水溶液提取2次，每次l小时，合并提取液，浓缩干燥后得淫羊釐提取物。(4)分别取当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物，按照重量比8%:46%:6%:40%充分混匀后干燥，得含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物1。实施例19:含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊度的药用组合物的制备按照实施例17所述方法分别提取当归多糖、黄荒多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿乙醇提取物，按照重量比1%:9%:20%:70%充分混匀后干燥，得含有当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的药用组合物2。实施例20:药用组合物胶嚢的制备取实施例17-18中组合物提取物300g,加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、千燥、制粒，将所得颗粒装入1号硬明胶胶嚢中，每粒0.3g,分装100粒，即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶嚢剂项下的有关规定。实施例21:药用组合物片剂的制备取实施例1-2中组合物提取物100g，加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、干燥、制粒，将所得颗粒装压片，每片0.2g,分装500片，即得。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下的有关M^定。实施例22:药效学试验一、组合物的雌激素样作用1.细胞培养条件MCF-7(含有ERE基因)细胞培养在MEM培养基，含10%胎牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50吗/ml、O.lmM氨基酸和l.OmM丙酮酸钠，培养箱温度37。C,含5%C02，95%空气。实验之前3天改变为无酚红MEMa培养基，含2%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清。2.对雌激素反应组件-荧光素酶(ERE-lucifemse)活性的影响细胞种在24孔板(Falcon,BDLabware,NJ,USA),细胞密度约5乂104细胞/孔，过夜让细胞贴壁，从第二天开始加药，每24小时加药一次，加药之前更换培养液。加药二次后取样，样品进行荧光素酶活性测定(FluostarOptima,BMGLabtechnology)。实验资料以三次实验的平均值，每次平行做三个孔。3.正交试-验i殳计首先对当归补血汤四个组分进行配伍考察，选择L16一4一5正交表，首先对当归补血汤中当归多糖(DP),当归乙醇提取物(DE),黄芪多糖(HP),黄芪乙醇提取物(HE)四个因素进行四水平考察。以当归补血汤原方当归黄芪1:5配伍时各组分含量为lx，四水平分别为0x,0.5x,lx，2x，试验结果见图5、表1和表2:表1.正交试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2.方差分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>从直观分析和方差分析结果中可以看出，黄荒乙醇提取物为影响当归补血汤活性最主要组分(p<0.05),对药效有显著影响，9号(当归多糖当归乙醇提取物黄芪多糖黄芪乙醇提取物淫羊藿提取物=":0x:lx:2x)和15号(当归多糖当归乙醇提取物黄芪多糖黄芪乙醇提取物淫羊藿提取物-2x:lx:0.5x:2x)组合物表现出最佳雌激素样作用。二者相比，9号组合物各组分所需药量更少，且根据传统中医理论和文献报道(Dongetat,2006)，当归乙醇提取物具有刺激作用，故选择9号组合物作为最优组合物进行进一步研究。5.淫羊藿用量选择以药材重量当归黄芪淫羊藿=1:5:1时提取各味药材所得当归多糖、当归乙醇提取物、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物、淫羊藿提取物含量为lx。9号组合物加入不同量淫羊楚后对雌激素样作用结果如以下表3所示<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以上结果表明古方当归补血汤的雌激素样活性在当归多糖黄荒多糖黄芪乙醇提取物淫羊藿提取物=1:1:2:4时效果最佳，按此比例，根据各组分产率折合成重量比为当归多糖黄芪多糖黄芪乙醇提取物淫羊藿提取物=8%:46%:6%:40%。实施例23:提取物防治去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究l.材料1.1实4全动物健康雌性SD大鼠卯只，4月龄，体重200-220g(由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号97A016)。随机分为6组，每组15只，分别为空白对照组、模型组、提取物高剂量组、提取物中剂量组、提取物低剂量组、尼尔雌醇组。灌胃给药容积为10ml/kg。1.2实验药物提取物中各组分的重量配比为当归多糖8%;黄芪多糖46%;黄芪乙醇提取物6%;淫羊藿提取物40%。提取物的施用剂量为高剂量10g/kg体重，中剂量5g/kg体重，低剂量2.5g/kg体重，相当于临床剂量的20倍、10倍、5倍。药物以蒸馏水定容至所需浓度。阴性对照品蒸馏水。阳性对照药尼尔雌醇(由上海华联制药有限公司生产，2mg/片，批号201001)。麻醉药3%戊巴比妥钠(佛山市化工实验厂生产，批号960001)。盐酸四环素为萸光标记物，上海新亚制药厂生产，0.25g/支，批号99124-18。Calcein(USA):为荧光才示i己物。甲基丙烯酸甲酯北京化工厂生产，批号990117。2.方法2.1造模方法[l]用3%戊巴比妥钠溶液按0.1ml/100g腹腔注射麻醉，空白对照组大白鼠行假手术，单纯取背部切口，切除少量脂肪组织后立即关闭；其余各组大白鼠，均采用背側入路双侧卵巢摘除手术造模。2.2给药方法术后第3天开始给药，连续给药至术后3个月时处死全部实验动物。各组灌胃给药，空白对照组、模型组灌服蒸馏水，给药组灌服相应药物，每日一次；尼尔雌醇组[2]给予尼尔雌醇lmg/kg灌胃，使用前配成混悬液(浓度为0.167mg/ml),1次/周，其余时间给予蒸馏水10ml/kg灌胃。全部大鼠在处死前10天和2天分别于其背部皮下注射盐酸四环素25mg/kg和Calcein5mg/kg。全部大鼠在处死前24小时禁食。2.3检测指标[3]实验过程中各组动物均有不同程度的死亡，剩余动物进行以下指标测定2.3.1骨密度测定术后3个月采用双能X线骨密度测量仪(美国HOLOGIC公司产品，QDR-2000型，变异系数(CV)0.1%)测定双侧胫骨干骺端骨密度。2.3.2骨生物力学测定术后3个月动物处死后取双侧股骨测生物力学指针(第一军医大学生物力学实验室协助。采用SWD-10型万能材料试验仪，长春试验仪器研究所生产)。2.3.3血清降钙素(CT)、骨钙素(BGP)测定分别于术前、术后3个月行眼底静脉丛取血，采用》丈免法测定。2.3.4血清雌二酵(E2)测定取血同上，采用放免法测定。2.3.5血清钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)、碱性磷酸酶(ALP)测定取血同2.3.6子宫湿重测定术后3个月，采用颈推脱位快速处死后，取子宫称重。3.结果3.1提取物对去势大白鼠骨面密度(bonemineraldensity,BMD)(表4)、骨矿含量(bonemineralcontant,BMC)(表5)变化的影响。表4.提取物对去卵巢大鼠BMD变化的影响(x±s)(g/cm2)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注与模型组比较，*P<0.05**P<0.01;与空白组比4交，#PO.05##P<0.01(下同)表5.提取物对去卵巢大鼠BMC变化的影响(x±"(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4、表5表明提取物灌胃3个月时各组大鼠在左、右側胫骨干骺端处的骨密度和骨矿含量均有显著差别，其中模型组最低；提取物高剂量组明显高于模型组，与阳性对照组无显著差异。说明提取物和尼尔雌醇均可显著提高胫骨干骺端处的BMD和BMC,二者作用相当，说明均能提高骨量。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6表明提取物灌胃3个月时各组大鼠左侧股骨扭转实验中最大扭矩(M)有明显差异，但扭转刚度(K)差异不显著。提取物中、高剂量组最大扭矩明显高于模型组，说明提取物能促进骨小梁重建，提高骨的力学性能，增加骨的韧度，使骨抗扭转强度增高，其中又以提取物高剂量组效果最好。阳性对照组M和K与模型组结果相似，仅略有增高，说明尼尔雌醇对骨的力学性能无明显影响，不能提高其抗骨折的效能。模型组扭转刚度差异不明显可能与实验时间较短，同时骨的类骨质增加较快，骨结构修复较慢有关。3.3血CT(表7)、BGP(表8)测定表7表明术前各组大鼠血清CT含量无明显差异；给药3个月后各组大鼠血清CT含量有明显差异，均明显高于模型组，提取物高、中、低剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组，阳性对照组又明显高于中药治疗组，说明提取物能提高血中降钙素的水平。表7.提取物对去卵巢大鼠降钙素(CT)的影响。±"(ng/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表8.提取物对去卵巢大鼠骨钙素(BGP)的影响。±0(ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表8表明术前各组大鼠血清BGP含量无明显差别；给药3个月后各组大鼠血清BGP含量有明显差异，均明显高于模型组，提取物高、中剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组，阳性对照组又明显高于提取物各治疗组，说明提取物有提高血中骨钓素含量的作用。3.4血清E2测定(表9):表9.提取物对去卵巢大鼠血清雌二醇(E2)含量的影响(;"(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表9表明术前各组大鼠血清E2含量无明显差异；给药3个月后各组大鼠血清E2含量有显著差异，均明显高于模型组，提取物高、中剂量组和阳性对照组均明显高于空白对照组，阳性对照组又明显高于中药各组，说明提取物能有效的提高体内E2含量，但不及尼尔雌醇；中药组中又以高剂量组E2含量最高，且有明显量效关系。同时，我们采用放免法对高、中、低三种不同浓度的提取物进行测定，发现各种剂量提取物中均含有雌激素样作用物质，且呈量效关系。3.5血清Ca(表10)、P(表11)、Mg(表12)、ALP(表13)测定:表10.提取物对大鼠血清Ca含量的影响(""(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表11.提取物对大鼠血清P含量的影响(；士"(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表12.提取物对大鼠血清Mg含量的影响(^")(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表13.提取物对大鼠血清ALP含量的影响。±^)(U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表10-13表明，各组大鼠在手术前、术后一周及给药3个月时血清Ca、P、ALP、Mg的含量经过组间和自身前后比较，发现均无显著差异和变化。说明本实验动物模型是通过切除卵巢引起的原发性骨质疏松症模型，而非由于其它原因影响骨代谢的疾病引起的继发性骨质疏松症模型。3.6子宫湿重测定表14.提取物对大鼠子宫湿重的影响(^土^(mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表14表明实验动物于3个月后处死时各组大鼠子宫重量有明显差异，其中模型组最低，空白对照组最高，提取物高、中、低剂量组均明显高于模型组，但明显低于阳性对照组。说明切除卵巢后由于大鼠体内雌激素水平下降，其对子宫内膜的刺激作用下降，故模型组子宫内膜明显萎缩；尼尔雌醇和提取物均有不同程度提高血内雌激素水平的作用，而使子宫内膜增生。4.讨论本研究通过切除卵巢诱发绝经后骨质疏松症的大鼠模型，运用随机对照分组原则，采用骨生物力学、DEXA扫描、放免、骨代谢等指标观察了提取物对实验动物的影响，并与尼尔雌醇进行对照，旨在观察提取物对绝经后骨质疏松症的疗效。本次实^r结果表明提取物能显著提高去势大鼠骨矿含量及骨密度、骨抗扭转力学性能，以及血清中E2、CT、BGP的含量。提取物可以提高血内雌激素水平的作用，使子宫内膜增生，减慢子宫萎缩。权利要求1.一种预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物，其特征在于制成该组合物所含药效成分的原料由当归、黄芪和淫羊藿组成，其重量比为当归1～50份，黄芪1～100份，淫羊藿0.1～100份。2.如权利要求l所述的药用组合物，其中当归、黄芪和淫羊藿的重量比为当归120份，黄芪20100份，淫羊愛1100份。3.如权利要求l所述的药用组合物，其特征在于所述原料的重量比为当归10份，黄芙50份，淫羊覆50份。4.如权利要求l所述的药用组合物，所述组合物还包含选自生地黄、葛根、赤芍和骨碎补等其他成分。5.如权利要求l-4中任一项所述的药用组合物的提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芘，以412倍水或任意比例乙醇水溶液提取13次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸膏I;(3)称取淫羊藿，以4~12倍5095%乙醇水溶液提取1~3次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得浸膏II;(4)取浸膏I、II,合并，混匀，干燥，得到所述药用组合物的提取物。6.如权利要求1-4中任一项所述的药用组合物的提取物的制备方法，其特征在于步骤如下(1)取当归、黄芪、淫羊藿粉碎成粉末；(2)称取当归、黄芪，淫羊藿，混合均匀，以412倍水或任意比例乙醇水溶液提取13次，每次0.52小时，合并提取液，浓缩得到浸膏；(3)取浸膏混匀，干燥，得到所述药用组合物的提取物。7.如权利要求l-4中任一项所述的药用组合物在制备一种药物中的应用，所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分化，增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平，且不刺激乳癌细胞的增殖。8.用权利要求5或6的方法制备的提取物在制备一种药物中的应用，所述药物可以有效促进MG-63人成骨细胞的增殖、分化，增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平，且不刺激乳癌细胞的增殖。9.如权利要求l-4中任一项所述的药用组合物在制备用于预防和治10.用权利要求5或6的方法制备的提取物在在制备用于预防和治疗更年期综合症和/或骨质疏松药物中的应用。11.如权利要求7-10中任一项的应用，其中所述药物为胶嚢、片剂或软胶嚢剂型。12.—种预防和治疗更年期综合症的药用组合物，其特征在于该药用组合物由当归、黄芪和淫羊藿提取物组成，其重量比为当归多糖120%;黄芪多糖2060%;黄芪乙醇提取物120%;淫羊藿提取物2080%。13.如权利要求12所述的药用组合物，其特征在于重量配比为当归多糖8%;黄芪多糖46%;黄芙乙醇提取物6%;淫羊藿提取物40%。14.如权利要求12或13所述的药用组合物的制备方法，其包括混合当归多糖、黄芪多糖、黄芘乙醇提取物和淫羊藿提取物。15.权利要求14的制备方法，其中当归多糖、黄芘多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为当归多糖120%;黄茂多糖20~60%;黄芪乙醇提取物1~20%;淫羊藿提取物20~80%。16.权利要求13的制备方法，其中当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物的重量比为8。/Q:46%:6%:40%。17.权利要求13的制备方法，其中当归多糖的制备方法为取当归药材粉碎成粉末，以412倍水提取13次，每次0.52小时，合并提取液，减压浓缩。将浓缩液加入26倍50~95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到当归多糖。18.权利要求17的制备方法，其中当归多糖的制备方法为取当归药材lkg粉碎成粉末，以8倍水提取2次，每次l小时，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到当归多糖。19.权利要求13的制备方法，其中黄芘多糖和黄荒乙醇提取物的制备方法为取黄芪药材粉碎成粉末，以412倍水或提取13次，每次0.52小时，合并提取液，减压浓缩；将浓缩液加入2~6倍50~95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芪多糖；剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔树脂柱，水洗约24倍柱体积，再用50%95%乙醇洗脱2~4倍柱体积，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芘乙醇提取物。20.权利要求19的制备方法，其中黄芪多糖和黄芪乙醇提取物的制备方法为取黄芪药材lkg粉碎成粉末，以8倍水或提取2次，每次l小时，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液加入4倍95%乙醇，收集所得沉淀，干燥后得到黄芪多糖；剩余醇液挥干乙醇后以水重新溶解，过大孔树脂柱，水洗约3倍柱体积，再用70%乙醇洗脱3倍柱体积，收集醇洗脱液，浓缩干燥后得到黄芪乙醇提取物。21.权利要求13的制备方法，其中淫羊藿提取物的制备方法为取淫羊藿药材粉粹成粉末，以412倍3095%乙醇水溶液提取13次，每次0.5~2小时，合并提取液，浓缩干燥后得淫羊藿提取物。22.权利要求21的制备方法，其中淫羊藿提取物的制备方法为取淫羊藿药材lkg粉粹成粉末，以8倍70%乙醇水溶液提取2次，每次l小时，合并提取液，浓缩干燥后得淫羊藿提取物。23.—种组合物，它包含淫羊藿提取物与当归多糖、黄芘多糖、黄芪乙醇提取物，用于预防和治疗更年期综合症，有效增加受雌激素影响的基因在MCF-7细胞的表达水平、或者提高免疫水平。24.按照权利要求12或13所述药用组合物在制备用于预防和治疗更年期综合症药物中的应用，其中所迷药物为胶嚢、片剂或其他剂型。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，提供了一种防治和治疗更年期综合症和/或骨质疏松症的药用组合物及其提取物的制备方法。所述组合物是由三味中药当归、黄芪和淫羊藿按照一定比例煎煮提取而成。所述组合物也可以是由当归多糖、黄芪多糖、黄芪乙醇提取物和淫羊藿提取物按照一定比例配伍而成。试验证明，所述组合物或提取物不仅具有良好的雌激素样作用和促成骨细胞增殖、分化作用，且安全无明显毒副作用，可进一步开发为防治更年期综合症和骨质疏松的中药新药。文档编号A61P19/10GK101129448SQ20061012623公开日2008年2月27日申请日期2006年8月21日优先权日2006年8月21日发明者董婷霞,詹华强申请人:香港科技大学