专利名称：川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
中药川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMPz)，化学名为四甲基吡嗪，是从中药川芎的总生物碱中分离得到的一种有效活性生物碱，化学结构为1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚。我国在20世纪70年代初，由北京制药工业研究所从川芎提取物中分离出单体川芎嗪，现在已由人工合成。祖国传统医药认为它辛散温通，既可活血又可行气，适用于气滞血淤的病症。现代实验研究则认为川芎嗪具有扩张小动脉和小静脉，抗血小板聚集，改变血液流变性，改善微循环障碍，降低毛细血管通透性，增强机体耐缺氧能力，清除羟自由基，抗脂质氧化等作用。
由于川芎嗪具有扩张微血管，抗血小板聚集，改善微循环障碍和抗氧化损伤等作用，现在已被广泛用于治疗心血管疾病和脑缺血性疾病等，也有用川芎嗪来治疗非增殖期糖尿病视网膜病变的临床初步研究，如窦敬芳等(窦敬芳，翁孝刚。川芎嗪治疗非增殖期糖尿病视网膜病变临床研究。眼科新进展，1998，18(3)138～140.)报道了36例非增殖期糖尿病视网膜病患者，川芎嗪治疗后取得了较为满意的疗效，总有效率为68.69％。然而，非增殖期糖尿病不产生新生血管，不属于新生血管性视网膜疾病，其与新生血管性视网膜疾病的治疗机理、治疗手段存在很大的差异。另外，在体内研究方面，迄今为止尚未见到川芎嗪在新生血管性视网膜疾病方面的实验研究，较多的研究集中在缺血再灌注损伤模型等方面。
新生血管性视网膜疾病是一类常见的致盲眼病，包括增殖期糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病变、视网膜血管炎等。这类疾病的共同特点是新生血管生成，使疾病的治疗变得非常棘手，严重影响了患者的生存质量，给患者家庭及社会带来沉重的负担。
目前的研究认为，新生血管性视网膜疾病是由于各种原因导致机体内新生血管生成的刺激因子与抑制因子之间失去平衡而造成的。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor，VEGF)作为最主要的新生血管生成刺激因子，在其中发挥了重要的作用。缺氧诱导的视网膜新生血管形成(OIR)的动物模型是国际同行公认的成熟的新生血管性视网膜疾病的动物模型，并且已经被证实是由于在缺氧期眼内分泌过多的VEGF所引起的。
关于川芎嗪对视网膜病变的研究既往已有一些报道，如陈瑞华等(陈瑞华，陈少强，陈振彬等，糖尿病大鼠早期视网膜超微结构改变及药物治疗效果。福建医科大学学报，2001，35119)将川芎嗪用于治疗STZ诱导的糖尿病大鼠，川芎嗪100mg/Kg灌胃治疗12周和20周后，微血管瘤形成明显减少，视网膜组织结构改善，大鼠视网膜VEGF表达明显减弱。但是，由于STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜不产生新生血管，该模型仅模拟了部分背景期糖尿病视网膜病变而不能代表增殖期改变。另外，目前虽有报道川芎嗪对体外培养的人脐静脉内皮细胞的作用(徐晓玉，杨丽蓉，川芎嗪对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响，中草药，2004，35(10)1150-1152)，但由于人脐静脉内皮细胞和视网膜血管内皮细胞有很大的差异，尤其是后者具备内屏障的功能而前者无，川芎嗪对视网膜血管内皮细胞的作用直接关系到该药治疗新生血管性视网膜疾病的机理及其效应，因此有必要进行更进一步的研究。
综上所述，至今为止采用川芎嗪制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物未见任何报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用。
所述新生血管性视网膜疾病为增殖期糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性或视网膜中央静脉阻塞或早产儿视网膜病变或视网膜血管炎。
本发明研究川芎嗪对体外培养的人视网膜血管内皮细胞增殖的影响，实验表明川芎嗪对正常和缺氧条件下培养的人视网膜血管内皮细胞增殖有抑制作用，并阐明该抑制作用与川芎嗪促进细胞凋亡有关。体内实验发现川芎嗪对OIR模型中新生血管的形成有明显的抑制作用，明显降低了病变视网膜中VEGF的表达，能有效减轻视网膜的病变程度。从而为川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用提供了有力的实验基础，为治疗新生血管性视网膜疾病提供了一种新的可行的治疗方案。
图1是ELISA P14小鼠视网膜检测VEGF蛋白表达的示意图，其中，1为对照组；2为实验组1(川芎嗪100mg/Kg)；3为实验组2(川芎嗪200mg/Kg)；图2是RT-PCR检测P14小鼠视网膜VEGF mRNA表达的示意图，其中，1为对照组；2为实验组1(川芎嗪100mg/Kg)；3为实验组2(川芎嗪200mg/Kg)；图3是P17小鼠行荧光素心脏灌注视网膜铺片观察视网膜新生血管，其中，图3A中左上为正常P17小鼠；右上为对照组；左下为实验组1(川芎嗪100mg/Kg)；右下为实验组2(川芎嗪200mg/Kg)；图4是P17小鼠眼球行冰冻切片和GSA染色检测视网膜新生血管，其中图4A中，左上为正常小鼠视网膜；右上为对照组；左下为实验组1(川芎嗪100mg/Kg)；右下为实验组2(川芎嗪200mg/Kg)；图5是体外培养人视网膜血管内皮细胞并用VIII因子进行细胞鉴定的结果示意图；图6是MTT检测川芎嗪干预后第2、4、6天细胞增殖情况，其中，图6A是正常细胞组凋亡结果；图6B是缺氧细胞组凋亡结果示意图；图7是川芎嗪干预后48小时检测细胞凋亡情况，其中，图7A是正常细胞组凋亡结果；图7B是缺氧细胞组凋亡结果示意图。
具体实施例方式
药品与主要试剂盐酸川芎嗪注射液，无锡市第七制药有限公司产品，规格40mg/2ml，批号050112；MTT，DMSO。所有数据以x±s表示，输入SAS统计软件，采用方差分析方法进行比较，并作多样本均数间两两比较的q检验，两因素相关关系采用相关分析，以P＜0.05为差异有显著性。
实施例1体内实验1.氧诱导的血管增殖性视网膜病变小鼠模型的制备及给药将出生后第7天(P7)的C57/BL小鼠与母鼠放入含氧体积分数为75％±3％的饲养箱内连续饲养5天，饲养温度维持在(23±2)℃，每天照明12h，用自动氧气分析仪监测并调控箱内氧气含量。P12放回正常空气中饲养，这时小鼠视网膜处于相对缺氧状态，P17时视网膜内有大量新生血管形成。P12-P16每天一次给小鼠腹腔注射药物，分为三组，实验组1为腹腔注射川芎嗪100mg/Kg，实验组2为腹腔注射川芎嗪200mg/Kg，对照组为腹腔注射等量生理盐水。
2.ELISA检测P14小鼠视网膜VEGF蛋白的表达取P14实验小鼠每组各3只，水合氯醛过量麻醉处死小鼠，取出每组小鼠眼球各6只放入250ul细胞裂解液中，超声粉碎，12000G 4℃离心30min，收集上清液，置于-70℃冰箱中保存。用BCA法检测蛋白浓度，ELISA试剂盒检测视网膜蛋白提取液中VEGF表达每孔加入50ul Assay Diluent RDlN，向孔内加入50ul标准品、样品，轻轻拍打孔板1分钟，盖上胶带，室温下孵育2小时，吸去每孔的液体，加入400ulWash Buffer清洗，重复此步骤4次，每孔加入100ul Conjugate，盖上新的胶带，室温下孵育2小时，用Wash Buffer清洗每孔，清洗步骤同前，然后每孔加入100ul Subtrate Solution，室温下孵育30分钟，注意避光，最后每孔加入100ul Stop Solution，轻轻拍打孔板以充分混合，用酶标仪读取每孔450nm的光密度和570nm的光密度，用450nm的读数减去570nm的读数以校正。计算1mg/ml视网膜蛋白中VEGF的含量。
结果如图1所示，P14小鼠视网膜VEGF蛋白表达如下实验组1为232.4±13.75，实验组2为201.3±10.94，对照组为249.5±12.13。经统计学分析显示，实验组1和组2小鼠视网膜VEGF蛋白表达均比对照组减少(F＝19.94，P＝0.0002)。说明腹腔注射川芎嗪可以降低小鼠视网膜VEGF蛋白的表达。
3.RT-PCR检测P14小鼠视网膜VEGF mRNA的表达取P14实验小鼠每组各1只，水合氯醛过量麻醉处死小鼠，取出小鼠眼球2只，分离视网膜，迅速置于研钵中，倒入适量事先准备好的液氮，研磨组织至成粉末状，加入1mlTrizol，研磨至完全溶解。分别提取每组总RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度和含量。2％琼脂糖凝胶电泳检测所提mRNA完整性。以RNA为模板反转录成cDNA，以cDNA为模板，加入引物、2×Taq Platinμm PCR MasterMix等，主要循环反应条件如下小鼠β-actin预变性94℃5min，然后94℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min。VEGF预变性94℃5min，然后94℃10s，72℃2min，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统显带，拍照。显影结果经全自动图像分析系统Gel analyzer软件处理，计算每个目的条带的积光光密度值(OPTDI)，计算各个处理组VEGF与β-actinOPTDI的比值，得出VEGF mRNA相对于β-actin mRNA的表达量。
结果如图2所示，P14小鼠视网膜VEGF mRNA表达(VEGF/β-actin)如下实验组1为0.795±0.069，实验组2为0.638±0.082，对照组为1.056±0.085。经统计学分析显示，实验组1和组2小鼠视网膜VEGF mRNA表达均比对照组减少(P＜0.0001)。说明腹腔注射川芎嗪可以降低小鼠视网膜VEGF mRNA的表达。
4.P17小鼠行荧光素心脏灌注视网膜铺片观察视网膜新生血管在P17，用2.5％的水合氯醛(1.2ml/100g)腹腔麻醉小鼠，固定四肢。剪开腹壁，在肝上缘用止血钳夹住腹主动脉。剪开膈肌并暴露心脏，剪开右心耳，经左心室将50mg/ml荧光素标记的葡聚糖1ml快速注入。若小鼠心脏变大和舌尖、四肢变黄，则说明心脏灌注成功。取出眼球，在10％的甲醛中室温固定半小时。显微镜下去除角膜、虹膜和晶体，小心完整地剥离视网膜，从视网膜锯齿缘到4个象限的赤道部做放射状切开，视网膜平铺在玻片上，水溶性封片剂封口，加盖玻片。用荧光显微镜检测平铺的视网膜，Image-Pro Plus(Media Cybernetics，美国)软件测量视网膜新生血管的面积。
结果如图3所示，实验组1视网膜新生血管面积为0.748±0.061mm2，实验组2视网膜新生血管面积为0.535±0.057mm2，对照组的新生血管面积为0.954±0.051mm2。统计学分析显示，实验组1和组2视网膜新生血管面积比对照组明显减少(F＝105.29，P＜0.0001)。说明腹腔注射川芎嗪可以抑制小鼠视网膜新生血管形成。
5.P17行冰冻切片和GSA染色检测视网膜新生血管在P17，处死小鼠并迅速取下眼球，OCT包埋。整个眼球从一侧的虹膜根部开始到另一侧的虹膜根部切成10um的系列冰冻切片。相隔100um收集1张切片，连续收集14张。用生物素标记的凝集素(griffonia simplicifolia lectin B4，GSA，Vector Laboratories，美国)进行组织化学染色，GSA可以选择性结合到血管细胞上切片在体积分数10％正常牛血清中孵育30min，室温下用生物素标记的GSA孵育2h，冲洗，过氧化物酶/卵白素(Vector laboratories，美国)孵育45min，冲洗，最后用二氨基联苯胺孵育显色，用伊红作对比染色。同轴显微镜检查，Image-Pro Plus(Media Cybernetics，美国)软件测量视网膜表面的GSA染色阳性的细胞及其面积。14张切片GSA阳性细胞的总面积作为每只眼球新生血管的总量，用作一个单一的实验值。每鼠双眼新生血管的总量的均数用作统计分析的单一实验值。
结果如图4所示，实验组1视网膜新生血管面积为0.151±0.010mm2，实验组2视网膜新生血管面积为0.104±0.014mm2，对照组的新生血管面积为0.210±0.021mm2。统计学分析显示，实验组1和组2视网膜新生血管面积比对照组明显减少(F＝94.96，P＜0.0001)。说明腹腔注射川芎嗪可以抑制小鼠视网膜新生血管形成。
实施例2体外实验1.体外培养人视网膜血管内皮细胞并进行细胞鉴定眼球源自人角膜移植供体，离体后6-12h获得。在无菌条件下沿赤道部剪开眼球，去除眼前段组织，小心分离视网膜组织和玻璃体组织，取出视网膜神经层，用D-Hanks液漂洗2-3次后剪碎，去除肉眼可见的大血管组织。加入2％胰蛋白酶于室温中消化30分钟，终止消化后1500rpm离心5min，去上清。用0.067％II型胶原酶室温下消化15分钟，终止消化后1500rpm离心5min，去上清，加入含20％胎牛血清和0.5ng/ml的β-内皮细胞生长因子(β-Endothelial cellgrowth factor，β-ECGF)的内皮细胞培养液混匀，接种于预先涂上纤维连接蛋白的培养瓶。将培养瓶置于5％CO2，37℃培养箱内培养。每两天换1/2液，不断洗去崩解的细胞碎片及死亡的其他细胞，待细胞汇合成单细胞层后，按1∶2或1∶3传代。用细胞形态学观察和VIII因子相关抗原免疫组织化学染色进行鉴定。
结果如图5所示。图A为DAB染色，染色阳性细胞为血管内皮细胞。图B为荧光素染色鉴定，染色阳性细胞为血管内皮细胞。
2.在正常和缺氧条件下培养细胞并加干预正常条件下培养的细胞分为三组，实验组1为培养液中加入100ug/ml川芎嗪，实验组2为培养液中加入200ug/ml川芎嗪，对照组中加入的是D-Hank’s液。缺氧条件培养细胞用的是氯化钴致细胞化学缺氧，细胞的培养液中加入125umol/L氯化钴，也分三组加干预，分组情况同前。
3.MTT检测干预后第2、4、6天细胞增殖情况取2-4代近融合的内皮细胞，以每孔1*103的密度接种细胞于96孔板上。用含10％胎牛血清的人内皮细胞培养液在37℃、5％CO2环境中培养，24h后给予干预，分组如上。干预后第2、4、6天分别取每个处理组的6个平行孔内加入MTT溶液(5g/L)20ul，置于37℃培养箱中4小时，然后弃去上清液，每孔加入150ul二甲基亚砜，振荡10分钟，在酶联免疫仪上以490nm波长测定各孔的吸光度(OD)值。以时间为横轴，平均光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
结果如图6所示。在正常条件下培养的细胞，第4天对照组细胞OD值为0.059±0.002，实验组1 OD值为0.053±0.002，实验组3 OD值为0.040±0.005，经统计学分析显示，实验组1和组2细胞增殖分别比对照组减少了24.90％和66.73％(F＝44.05，P＜0.0001)。第6天对照组细胞OD值为0.085±0.005，实验组1 OD值为0.060±0.009，实验组2 OD值为0.048±0.009，经统计学分析显示，实验组1和组2细胞增殖分别比对照组减少了46.03％和66.46％(F＝30.28，P＜0.0001)。而在缺氧条件下培养的细胞，第4天对照组细胞OD值为0.075±0.014，实验组1 OD值为0.069±0.018，实验组2 OD值为0.048±0.008，经统计学分析显示，实验组1和组2细胞增殖分别比对照组减少了27.54％和77.30％(F＝6.79，P＝0.008)。第6天对照组细胞OD值为0.111±0.004，实验组1 OD值为0.073±0.005，实验组3 OD值为0.053±0.007，经统计学分析显示，实验组1和组2细胞增殖分别比对照组减少了50.13％和79.64％(F＝136.43，P＜0.0001)。说明川芎嗪对正常和缺氧条件下培养的人视网膜血管内皮细胞增殖有抑制作用。
4.干预后48小时检测细胞凋亡情况取2-4代细胞，将细胞以相同密度接种于培养瓶中，培养24h后加入干预分组如上。作用48h后，收集细胞并用70％冷乙醇固定，4℃冰箱过夜。用PBS洗涤2遍后将细胞重悬于200ul结合缓冲液中，加入10ul AnnexinV-FITC和5ul PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟，加入300ul结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488nm进行检测，每个样本检测30000个细胞。流式细胞仪测定结果输入计算机，应用分析程序软件进行处理，直接给出细胞直方图及凋亡百分比，其中左下象限代表正常细胞胞(An-/PI-)，右下象限代表早期凋亡细胞(An+/PI-)，右上象限代表晚期凋亡及坏死细胞(An+/PI+)。
如图7所示，在正常条件下培养的细胞中，对照组细胞凋亡比例为2.3％，实验组1凋亡比例为27.0％，实验组2凋亡比例为52.8％。在缺氧条件下培养的细胞，对照组凋亡比例为4.5％，实验组1凋亡比例为18.7％，实验组2凋亡比例为49.1％。说明在正常和缺氧条件下川芎嗪都可以促进体外培养的人视网膜血管内皮细胞的凋亡。
表1 表2本发明发现了川芎嗪对正常和缺氧条件下培养的人视网膜血管内皮细胞增殖的抑制作用，并阐明该抑制作用与川芎嗪促进细胞凋亡有关；体内实验发现川芎嗪对OIR模型中新生血管的形成有明显的抑制作用，降低病变视网膜中VEGF的表达，能有效减轻视网膜的病变程度。为川芎嗪在以新生血管生成为特点的各种新生血管性视网膜疾病的药物制备中提供了新的应用。
权利要求
1.川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用，其特征是所述新生血管性视网膜疾病为增殖期糖尿病视网膜病变。
3.根据权利要求1所述的川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用，其特征是所述新生血管性视网膜疾病为年龄相关性黄斑变性。
4.根据权利要求1所述的川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用，其特征是所述新生血管性视网膜疾病为视网膜中央静脉阻塞。
5.根据权利要求1所述的川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用，其特征是所述新生血管性视网膜疾病为早产儿视网膜病变。
6.根据权利要求1所述的川芎嗪在制备治疗新生血管性视网膜疾病的药物中的应用，其特征是所述新生血管性视网膜疾病为视网膜血管炎。
全文摘要
本发明公开了一种川芎嗪在制备治疗血管增殖性视网膜病变的药物中的应用，实验发现川芎嗪对正常和缺氧条件下培养的人视网膜血管内皮细胞增殖有抑制作用，并阐明该抑制作用与川芎嗪促进细胞凋亡有关；体内实验发现川芎嗪对OIR模型中新生血管的形成有明显的抑制作用，降低病变视网膜中VEGF的表达，能有效减轻视网膜的病变程度。从而提供川芎嗪在临床中新的应用，为治疗新生血管性视网膜病变提供了一种新的治疗途径。
文档编号A61P27/02GK101045057SQ200610132470
公开日2007年10月3日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者梁小玲, 谢素贞, 丁小燕 申请人:中山大学中山眼科中心