专利名称：：从忍冬茎中提取和纯化活性成分的方法、其在抗炎和止痛药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从忍冬(忍冬)中提取和纯化活性成分的方法及其应用。更具体的说，本发明涉及从忍冬茎(除去了叶的忍冬茎)中提取和纯化包括当药甙在内的活性成分的方法，通过除去单宁、难溶性类黄酮、皂草苷等来进行。由此获得的活性成分比从忍冬花或忍冬叶中获得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更为安全且更为稳定，且包括为抗炎和止痛药的有效活性组分的当药甙。
背景技术：
：忍冬(忍冬)是半常绿配体藤状灌木，它天然生长在日本、中国和韩国海拔50-600米范围的山或大堤脚下。其花蕾(金银花)和茎(忍冬茎)用作促进排尿、解毒、止血、血液纯化、治疗肿瘤、治疗水肿、感冒、腹泻、呕吐等的草药。[韩国植物教科书中解释，Chang-BokLee，709，1989，HangmunPublishingCo.，Seoul；《韩国药典未包括的草药(草药)标准》(StandardforHerbs(HerbMedicines)NotCoveredbyKoreanPharmacopoeia)，Hyung-JoonChi，Sang-InLee，87，305，1988，KoreaMedicalIndexCo.，Seoul；《韩国植物资源》(ResourcePlantsinKorea)，Tae-KyungKim，vol.4，148-149，1996，SNUPress，Seoul]。此外，许多传统的中药书籍，包括SasangConstitutionalMedicine和GwangjeBigeup中教导了它可以很好地治疗各种人体内外的炎性脓肿[SasangConstitutionalMedicineforChosunPeople，YenbenChosunMedicalInstitute，276，1991，YeogangPublishingCo.，Seoul；GwangjeBigeup，Kyung-HwaLee，349-351，1991，YeogangPublishingCo.，Seoul]。因其抗炎止痛活性长期用作治疗诸如感冒、扁桃体炎和神经痛这类上呼吸道感染的民间药。近来，已经通过各种实验动物模型证实了忍冬的抗炎和止痛活性且已经在学术范围内分离和报导了其有效的生理活性成分[“植物抗炎药的研发忍冬提取物抗炎和止痛作用的比较”(Developmentofthevegetableanti-inflammatorymedicineComparisonofanti-inflammatoryandanalgesicactionsofthehoneysuckleextract)，Song-JinLee等，《韩国生药学杂志》(KoreanJournalofPharmacognosy)，363-367，25，1994；“来自忍冬地上部分的类黄酮”(FlavonoidsfromtheaerialpartsofLonicerajaponica)，Son等，《药物研究学报》(Arch.Pharm.Res.)，365-370，15，1992；“忍冬的抗炎活性”(AntiinflammatoryactivityofLonicerajaponica)，Lee等，《植物疗法研究》(Phytother.Res.)，445-447，12，1998；“来自忍冬地上部分的三萜系化合物皂草苷类”(TriterpenoidsaponinsfromtheaerialpartsofLoiiiceiajaponica)，Son等，《植物化学》(Phytochem.)，1005-1008，35，1994；“忍冬主要成分的抗炎活性”(Anti-inflammatoryactivityofthemajorconstituentsofLonicerajaponica)，Lee等，《药物研究学报》(Arch.Pharm.Res.)，133-135，18，1995]。相关领域的描述迄今为止，诸如绿原酸、咖啡酸甲酯、绿原酸和异绿原酸这类可水解的单宁和诸如番木鳖苷、当药甙、vogeloside和epi-vogeloside这类环烯醚萜苷类称作忍冬茎中含有的有效活性成分。大部分常规研究集中在忍冬花和忍冬叶上。应注意忍冬茎具有不同于忍冬叶或忍冬花的成分分布。即不同于忍冬茎，忍冬叶或忍冬花的主要成分为类黄酮，诸如忍冬苷、野漆树苷和链木黄酮；带有常春配基或齐墩果酸作为非糖成分的三萜皂草苷；和各种可水解的单宁。难以将这些成分制成注射剂。如果注射剂富含聚合物单宁，那么它们可以与其它成分结合而产生共沉淀且可以结合血液中的血清蛋白而形成难溶性沉淀，这可能是血管狭窄的原因。此外，由于忍冬中包括的类黄酮一般不溶于水，所以必不可少的是以作为溶解介体的相当大量的有机溶剂或其它试剂将它们溶解至高于有效浓度的水平。此外，富含类黄酮的活性成分极难溶于注射用生理盐水溶液且如果在碱性缓冲溶液中长期储存，那么可能会变得不稳定。最后，已知获自忍冬的皂草苷、特别是单皂苷(monodesmosides)具有强溶血作用。因此，不能将它们不经纯化而直接注入静脉[“有关忍冬皂草苷的研究”(StudiesonthesaponinsofLonicerajaponicaThunb.)，Kawai等，《药物化学简报》(Chem.Pharm.Bull.)，4769-4775，36(12)，1988]。忍冬叶和忍冬花的单宁和难溶性类黄酮含量高于忍冬茎。在注射用急性毒性试验中，它们在低含量下也会产生更多的毒性且提供的止痛和抗炎作用较差。忍冬、日本当药、龙胆、三花龙胆、条叶龙胆、坚龙胆、点花滇龙胆用于减轻发热或解毒已经有许多年。然而，并未清楚地理解哪些成分可提供这类作用且大部分研究集中于鉴定忍冬茎的主要药用成分番木鳖苷的活性[《天然产物杂志》(J.Nat.Prod.)，54(4)，1102-1104，1991《植物药》(PlantaMed.)，60，232-234，1994《植物疗法研究》(PhytotherapyRes.)，12，405-408，1998]。此外，认为当药甙仅有效地保肝并抑制细菌活性[《民族药物学杂志》(Ethnopharmacol.)，42，183-191，1994《(药物化学简报》(Chem.Pharm.Bull.)，45(11)，1823-1827，1997YakugakuZasshi，102(8)，755-759，1982]，而迄今为止尚未报导其抗炎和止痛作用。
发明内容本发明者确定除去了单宁、难溶性类黄酮、皂草苷等的忍冬茎的活性成分(除去了叶的忍冬茎)和所述活性组分中的有效活性成分当药甙具有优良的抗炎和止痛作用。因此，本发明的一个目的是提供从忍冬茎中制备具有优良抗炎和止痛活性、安全性和稳定性的活性成分的方法。本发明的另一个目的是提供包括所述活性成分的抗炎和止痛药。本发明的另一个目的是提供包括当药甙的抗炎和止痛药。附图简述附图1是表示随含量改变的活性成分药物作用的示意图。优选实施方案的详细描述本发明提供了从忍冬茎中制备具有优良抗炎和止痛活性、安全性和稳定性的活性成分的方法。本发明还提供了包括所述活性成分的抗炎和止痛药。本发明还提供了包括所述当药甙的抗炎和止痛药。下文给出了本发明的详细描述。本发明涉及从忍冬中提取和纯化活性成分和当药甙的方法，通过除去单宁、难溶性类黄酮、皂草苷等来进行。由此获得的活性成分比从忍冬花或忍冬叶中获得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更为安全且更为稳定且包括为抗炎和止痛药的有效活性组分的当药甙。从忍冬茎中提取活性成分和当药甙并通过下列方法纯化。用约7-10个体积的蒸馏水将忍冬茎样品回流提取2-3小时且然后过滤。收集残余物并用约5-7个体积的蒸馏水回流提取2-3小时。过滤由此获得的液体并与上述滤液合并、在减压条件下浓缩并再次过滤，使得其体积约为草药重量的1-3倍(v/w)。在用蒸馏水提取的过程中，如果使用的蒸馏水过少，那么搅拌就会变得困难且提取效率就会降低，因为提取物的溶解性变差。相反，如果使用过量蒸馏水，那么需要的时间和成本就会过高。因此，加入等量水饱和的低级醇并在30-50rpm下搅拌约10-20分钟。层分离后，过滤水饱和的低级醇层并在减压条件下浓缩而得到初级活性成分。在本文中通过将蒸馏水加入到诸如丙醇和丁醇这类低级醇中并搅拌、随后沉降来制备水饱和的低级醇。使层分离过程进行2-3次。在获得低级醇溶剂级分的过程中，如果使用的低级醇过少，那么纯化效率就会降低，由此提取产率和有效成分含量降低。相反，如果使用过多的低级醇，那么会使成本增加。因此，建议使用体积(v/w)为1-3倍草药重量的低级醇。使用聚酰胺树脂、聚乙烯吡咯烷酮树脂等对初级活性成分进行柱色谱以除去不需要的物质并检测有效组分。在1-10个体积(w/w)的水饱和的低级醇层中使用填料。洗脱2-3个体积的50％(v/v)甲醇和甲醇与填料体积且然后通过分步梯度法洗脱蒸馏水溶剂。通过用蒸馏水洗脱活性成分得到的二次活性成分含有更少的芳族有机酸、单宁和类黄酮且表现出较好的药物作用、显著降低的毒性、增加的溶解性和改善的血液稳定性。使用(十八烷基硅烷)树脂对二次活性成分再进行柱色谱。从10％(v/v)甲醇开始，通过分步梯度法洗脱2-3个体积的溶剂树脂体积，同时将甲醇含量增加10％(v/v)。使用为纯化的初级活性成分重量20-50倍体积的聚酰胺或聚乙烯吡咯烷酮树脂。通过洗脱20-30％(v/v)甲醇得到的活性成分表现出最佳抗炎和止痛活性。对这些活性成分的分析揭示出环烯醚萜类物质、诸如当药甙和番木鳖苷为主要活性组分。当药甙含量为15.1-72.1wt％且番木鳖苷含量为13.9-41.4wt％。通过洗脱20-30％(v/v)甲醇得到的活性成分具有最高当药甙含量。再对这些活性成分进行柱色谱以分离由下列化学通式1表示的当药甙对由此得到的活性成分和当药甙进行花生四烯酸诱发的耳水肿试验和巴豆油诱发的耳水肿试验以测定抗炎作用。并进行乙酸诱发的扭体试验以测定止痛作用。结果发现它们具有远优于获自忍冬花或忍冬叶的常用活性成分的抗炎和止痛活性。可以通过制药领域中公知的方法将通过本发明获得的当药甙制备成治疗药。还可以将其单独或与药物上可接受的载体、成形剂、稀释剂等一起经口服或非肠道给药。特别可以将其制成粉剂、颗粒、片剂、胶囊、糖浆剂、皮肤软膏或注射药物形式。可以根据活性组分在体内的吸收性、失活率和排泄率、受试者的年龄、性别和身体状况、所治疗疾病的严重程度等选择本发明活性成分或当药甙的人体剂量。优选对成年人给予1-200mg的活性成分或当药甙。按照指定方法给药，如果需要，根据专家的建议来决定。可以将药物每天在固定间隔给药几次，优选每天1-3次。可以通过口服或非口服的方式给予所述的药物组合物。当经非肠道给药时，可以将其通过静脉、肌肉、直肠或皮肤给药。因为忍冬茎的活性成分具有优良的抗炎和止痛作用以及理想的溶解性、急性毒性和血液稳定性，所以它们非常适合于注射药物。下文通过下面的实施例更具体地描述了本发明。然而，下列实施例仅用于理解本发明且不应将它们看作限定本发明的范围。实施例实施例1忍冬各部位的药物作用于1999年7月在韩国的Yeongcheon、Gyeongsangbuk-do采集忍冬全草(带茎和叶的忍冬)、忍冬叶和忍冬茎的样品。将样品阴干并用7个体积的蒸馏水回流提取2.5小时且然后过滤。随后收集残余物并用7个体积的蒸馏水回流提取2.5小时。过滤由此得到的液体并于上述滤液合并、在减压条件下浓缩并再次过滤，使得其体积约为草药重量的2倍(v/w)。然后加入等体积的水饱和的正丁醇并将该混合物以约30rpm搅拌15分钟。在层分离后，过滤醇层并在减压条件下浓缩而得到初级活性成分。随后使用聚酰胺树脂(CASNO.63428-83-1)进行柱色谱以得到纯化级分。树脂量为5个体积的样品。洗脱2个体积的50％(v/v)甲醇和甲醇且然后通过分步梯度法洗脱蒸馏水溶剂而得到二次活性成分。通过将忍冬全草、忍冬茎和忍冬叶的二次活性成分给药入已经禁食4小时的6-周龄ICR小鼠(体重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾静脉进行巴豆油诱发的耳水肿试验。15分钟后，用2.5％巴豆油诱发炎症。4小时后，使用刻度厚度计测定小鼠左耳和右耳的厚度。通过下列等式1计算炎症率且结果如表1中所示。等式1炎症率(％)＝[发炎(右)耳的厚度-正常(左)耳的厚度]/[正常耳的厚度]×100表1正如表1中所示，忍冬茎的活性成分显示最佳抗炎和止痛活性。实施例2获自忍冬茎的活性成分的药物作用比较如实施例1中所述进行巴豆油诱发的耳水肿试验。此外，通过将药物(marobiven，忍冬茎的初级成分和忍冬茎的二次活性成分)给药入已经禁食4小时的6-周龄ICR小鼠(体重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾静脉进行花生四烯酸诱发的耳水肿试验。15分钟后，用0.05％花生四烯酸诱发炎症。约1小时后，测定小鼠左耳和右耳的厚度并通过等式1计算抑制率且结果如表2中所示。表2正如表2中所示，获自忍冬茎的二次活性成分不包括如芳族有机酸、单宁和类黄酮这类化合物且具有高于初级活性成分的活性成分含量。实施例3获自忍冬茎的活性成分的药物作用比较通过用聚乙烯吡咯烷酮树脂(CASNO.25249-54-1)取代聚酰胺进行表3实施例4最终活性成分的制备和药物作用试验在减压条件下浓缩实施例1中制备的忍冬茎的二次活性成分而得到粉末。使用ODS树脂(YMC*GELODS-A12nm，S-150m或ODS-AM12nm，S-50m或ODS-AQ12nm，S-50m)对所述粉末再进行柱色谱。使用3个体积的树脂并洗脱20％(v/v)甲醇而得到最终活性成分。如实施例1中所述进行巴豆油诱发的耳水肿试验。此外，通过将药物(marobiven，和忍冬茎的最后活性成分)给药入已经禁食1天的ICR小鼠(体重20-30g，n＝8，SLC，日本)尾静脉进行乙酸诱发的扭体试验。20分钟后，经腹膜内注射0.7％乙酸。15分钟后，对10分钟内扭体的次数进行计数以计算炎症抑制率。结果如表4中所示。表4实施例5活性组分含量和药物作用试验从对实施例1和4中制备的最终活性成分进行的高效液相色谱(HPLC)中鉴定了活性组分含量当药甙＝15.1-72.1wt％和番木鳖苷＝13.9-41.4wt％。各样品的当药甙和番木鳖苷含量如表5中所示。随产地和采集时间不同而改变的最终活性成分的药物作用如表6中所示。表5随产地和采集时间不同而改变的当药甙和番木鳖苷含量Lo番木鳖苷；Sw当药甙表6*巴豆油诱发的耳水肿试验结果**乙酸诱发的扭体试验结果实施例6最终活性成分的溶血试验使用用肝素处理的注射器从家兔心脏中采集20mL血液。将血液离心约10分钟。滗析上清液并用10个体积的注射用生理盐水溶液稀释残余物。在通过缓慢振摇混合后，将0.5mL稀释的血液和0.5mL实施例1的各药物(忍冬茎的最终活性成分和忍冬茎、忍冬叶和忍冬全草的初级活性成分)以及实施例4的最终活性成分放入试管(还制备了生理盐水溶液和蒸馏水(100％溶血)对照组)。将试管在保持在37℃下的浴中保温15分钟且然后置于室温下45分钟。最终在以2500rpm离心2分钟后，在540nm处分析上层。表7实施例7当药甙的制备使用十八烷基硅烷树脂对实施例4中制备的最终活性成分进行柱色谱以分离由如下化学通式1表示的当药甙实施例8当药甙抗炎作用的测定通过将当药甙给药入已经禁食4小时的6-周龄ICR小鼠(体重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾静脉进行巴豆油诱发的耳水肿试验。15分钟后，用2.5％巴豆油诱发炎症。4小时后，使用刻度厚度计测定小鼠左耳和右耳的厚度。通过等式1计算炎症率且结果如表8中所示。口服给药的药物作用如表9中所示。表8表9此外，通过将当药甙给药入已经禁食4小时的6-周龄ICR小鼠(体重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾静脉进行花生四烯酸诱发的耳水肿试验。15分钟后，用0.05％花生四烯酸诱发炎症。1小时后，测定小鼠左耳和右耳的厚度并通过等式1计算抑制率且结果如表10中所示。口服给药的药物作用如表9中所示。表10表11实施例9当药甙止痛作用的测定通过将当药甙给药入已经禁食1天的ICR小鼠(体重20-30g，n＝8，SLC，日本)尾静脉进行乙酸诱发的扭体试验。20分钟后，经腹膜内注射0.7％乙酸。15分钟后，对10分钟内扭体的次数进行计数以计算炎症抑制率。结果如表12中所示。口服给药的药物作用如表13中所示。表12表13实施例10毒性试验分别将1.0g/kg、1.5g/kg和2.0g/kg用量的忍冬茎活性成分和当药甙通过已经禁食4小时的SD大鼠的尾静脉给药(体重120-170g，每次给药剂量有5只雄性和雌性大鼠，SLC，日本)。首先对大鼠观察30分钟且然后间隔30分钟用肉眼观察。给药后将死亡率、一般症状和体重改变观察2周。进行实体解剖以鉴定存在的任何器官异常。忍冬茎活性成分和当药甙的口服给药致死剂量均超过5.0g/kg(没有观察到死亡的大鼠)，而静脉内注射致死剂量均超过2.0g/kg(没有观察到死亡的大鼠)。当静脉内注射2.0g/kg时，大鼠表现出呼吸计数增加且活动减少，持续约10分钟，迅速恢复。没有观察到其它症状且没有因给药而发生体重的改变。实体解剖结果没有显示出异常，与对照组的情况相同。分别在50、100和150mg/kg剂量下的局部毒性试验没有显示出与给予生理盐水溶液的组的差异。没有观察到诸如组织坏死或炎症这类毒性。制备实施例1片剂的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的片剂活性组分160mg轻体无水硅酸20mg玉米淀粉87mg结晶纤维素72mg羟基乙酸(glyconate)淀粉钠60mg硬脂酸镁6mg总计672mg制备实施例2糖浆剂的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的糖浆剂活性组分4,000mg对羟基苯甲酸甲酯(5％乙醇溶液)60mg对羟基苯甲酸丙酯(5％乙醇溶液)40mg苯甲酸钠(5％溶液)100mg香蕉粉(10％溶液)600mgD-山梨醇140,000mg蒸馏水196mL制备实施例3注射剂的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的注射剂注射安瓿活性组分20mg甘露糖醇60mg相应的溶剂样品注射用生理盐水溶液2000mg总计2080mg制备实施例4注射剂的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的注射剂注射安瓿活性组分50mgKH2(PO4)8.5mg注射用生理盐水溶液3000mg总计3058.5mg制备实施例5注射剂的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的注射剂注射安瓿活性组分100mg甘露糖醇300mgKH2(PO4)17mg注射用生理盐水溶液3000mg总计3417mg制备实施例6软膏药的制备将忍冬茎活性成分或当药甙制成具有如下组成的软膏药活性组分5g液体石蜡10g硬铅9g乙醇8g失水山梨糖醇单油酸酯2g聚山梨醇酯4g对羟基苯甲酸丙酯0.05g对羟基苯甲酸甲酯0.1g浓甘油10g纯水足量如上所述，本发明获自忍冬茎的活性成分比那些常用的活性成分具有显著增加的溶解性和血液稳定性。此外，证实它们具有优良的止痛和抗炎作用、安全性和稳定性。此外，本发明获自忍冬茎的当药甙具有极为优良的药物作用且几乎没有显示出毒性，由此特别适合于抗炎和止痛药。尽管参照优选实施方案具体描述了本发明，但是本领域技术人员会理解可以对其进行各种修改和替换而不会脱离如待批权利要求确定的本发明的实质和范围。权利要求1.抗炎和止痛药，包括如下化学通式1表示的当药甙全文摘要本发明公开了从忍冬(忍冬)中提取和纯化活性成分的方法及其应用。更具体的说，本发明涉及从忍冬茎(除去了叶的忍冬茎)中提取和纯化包括当药甙在内的活性成分的方法，通过除去单宁、难溶性类黄酮、皂草苷等来进行。由此获得的活性成分比从忍冬花或忍冬叶中获得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更为安全且更为稳定且包括为抗炎和止痛药的有效活性组分的当药甙。文档编号A61P29/00GK1951395SQ20061013204公开日2007年4月25日申请日期2003年9月8日优先权日2002年9月11日发明者郭义宗,赵龙白,韩昌均,慎希縡,柳根镐,柳宪升,李海仁申请人:Sk化学株式会社