免疫原性组合物的制作方法

专利名称：：免疫原性组合物的制作方法免疫原性组合物发明领域本发明涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白上的细菌荚膜糖，尤其是那些脑膜炎奈瑟氏球菌wem力g"Wz;O糖。其还涉及包含这样的糖缀合物的疫苗和疫苗试剂盒、制备所述免疫原性组合物和疫苗的方法以及本发明疫苗和免疫原性组合物在治疗中的用途。其还涉及使用糖缀合物抗感染的免疫方法以及糖缀合物在制备药物方面的用途。脑膜炎奈瑟氏球菌是革兰氏阴性人感染性病原体，其能够引起细菌性脑膜炎。以有机体的荚膜多糖为基础，脑膜炎奈瑟氏球菌的十二个血清群已经得到了鉴定(A,B,C,H,I,K,L,29E,W135,X,Y和Z)。血清群A(MenA)是导致撒哈拉以南非洲地区的流行病的最常见原因。血清群B和C是导致发展中国家的大多数情况的原因，剩余的情况是由W135和Y引起的。包含缀合到载体蛋白上的脑膜炎奈瑟氏球菌糖的免疫原性组合物是本领域已知的；载体蛋白具有将T细胞非依赖型多糖抗原转化为能够引发免疫记忆应答的T细胞依赖型抗原的已知作用。例如WO02/58737公开了一种含有纯化的荚膜多糖的疫苗，所述纯化的荚膜多糖来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y，并且是缀合到载体蛋白上的。然而，该申请教导所有的多糖必须基本上以同样的方式(通过相同的连接基连接到相同的蛋白载体上)进行缀合。仍存在对开发改善的抗奈瑟氏脑膜炎缀合疫苗的需要。本发明涉及提供一种脑膜炎球菌多糖缀合疫苗，其中可以设计每种多糖的缀合方式(而不是统一的)以获得有效的组合疫苗。特别地，将某些脑膜炎球菌糖以高的糖蛋白比例缀合到它们的蛋白载体上而其它的糖以低比例缀合是有利的。因此，在本发明的一个方面中提供了一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在l:2-l:5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1:1.99之间。在MenW疫苗中，MenW糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1:1-1:1.7,1:1.2-1:1.6或1:1.4-1:1.5(w/w)之间。在MenY疫苗中，MenY糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.9,1:1-1:1.8,1:1.1-1:1.6或1:1.3-1:1.4(w/w)之间。在MenA疫苗中，MenA糖与载体蛋白的比例可以在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间。在MenC疫苗中，MenC糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间，或者在1:2-1:5,1:2.5-1:4.5,1:2.7-1:4.3,1:3-1:4或1:3.3-1:3.5(w/w)之间。缀合物中糖与载体蛋白的比例(w/w)是使用灭菌后的缀合物确定的。蛋白的量是使用Lowry试验(例如Lowry等人(1951)J.Biol.Chem.193,265-275或Peterson等人AnalyticalBiochemistry100,201-220(1979))确定的，糖的量对于MenA来说是使用ICP-OES(感应耦合等离子体发射光谱)确定的，对于MenC来说是使用DMAP试验确定的而对于MenW和MenY来说是使用间苯二酚试验(Resorcmolassay)确定的(Monsigny等人(1988)Anal.Biochem.175,525-530)。通过连接物缀合的糖通常比直接缀合到载体蛋白上时具有更高的载体蛋白结合。例如，在本发明的MenAC疫苗中，MenA糖可以通过连接物缀合到载体蛋白上而MenC直接地缀合。在MenCY疫苗中，MenC可以通过连4妻物缀合而MenY直接地缀合。在MenACWY疫苗中，MenA可以通过连接物缀合而MenCWY直接地缀合，或者MenAC可以通过连接物缀合而MenWY直接地缀合。在本发明进一步的方面中，提供了包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白(例如DT,CRM197,蛋白D或TT)上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是在以l:2-l:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。例如，在MenAC疫苗中，可以将MenA以在1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenC以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。在MenCY疫苗中，可以将MenC以在1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenY以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。在MenACWY疫苗中，可以将MenAC以在1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenWY以在5:l-l:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上，或者可以将MenA以在1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenCWY以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。根据本发明进一步的方面，提供了一种使人宿主对由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病具有免疫性的方法，其包括向宿主给药以免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗。根据本发明更进一步的方面，提供了一种用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的本发明免疫原性组合物。根据本发明更进一步的方面，提供了本发明免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病的药物方面的用途。附图描述图1-A-条形图显示了在抗-MenYELISA中的GMC应答。ENYTT012是由天然MenY多糖制备的MenY-TT缀合物。ENYTT014是由微流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了40个周期的微流化作用。ENYTT015bis是由^^流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了20个周期的微流化作用。-B-条形图显示了在抗-MenYSBA试验中的GMT应答。ENYTT012是由天然MenY多糖制备的MenY-TT缀合物。ENYTT014是由微流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了40个周期的微流化作用。ENYTT015bis是由微流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了20个周期的孩i流化作用。详细描述本发明的一个方面提供了一种包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖)、MenC(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖)、MenY(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖)和MenW(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖)组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1:2-1:5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1:1.99之间。更具体地说是，所述组合物包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1:2-1:5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1:1.99之间。在一个方面中，免疫原性组合物含有MenW糖，其中MenW糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99，1.5:1-1:1.8,1:1-1:1.7,1:1.2-1:1.6或1:1.4-1:1.5(w/w)之间。在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenY糖，其中MenY糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.9,1:1-1:1.8,1:1.1-1:1.6或1:1.3-1:1.4(w/w)之间。在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenA糖，其中MenA糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间或者在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间。在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenC糖，其中MenC糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或l.l:l画1:1.2(w/w)之间，或者在1:2-1:5,1:2.5-1:4.5,1:2.7-1:4.3,1:3-1:4或1:3.3-1:3.5(w/w)之间。更具体地说是，第一组可以由MenA和MenC组成，第二组由MenC、MenY和MenW组成。本发明的一个具体实施方案是下述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含MenA荚膜糖，其中MenA糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenC荚膜糖，其中MenC糖与载体蛋白的比例在5:1-1丄99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6，1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上];MenC荚膜糖，其中MenC糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenY荚膜糖，其中MenY糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上];MenA和MenC荚膜糖，其中MenA和C糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenY和MenW荚膜糖，其中MenY和W糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上];MenA荚膜糖，其中MenA糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间[其可以任选地通过连"^妄物缀合到载体蛋白上]和MenC、MenY和MenW荚膜糖，其中MenY和W和C糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99，2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上]。在这些实施方案的任何一种中，还可以包含Hib缀合物，其直4妻地或通过连接物连4妄到载体蛋白(参见上文或下文中的载体列表，例如TT，和糖蛋白的比例)上。在整个本说明书中，术语"糖"可以表示多糖或低聚糖，或者两者都包含。多糖是从细菌中分离出来的，或者是从细菌中分离出来并通过已知方法(参见例如EP497524和EP497525)以及任选地通过微流化作用将尺寸调整到某一程度的。可以调整多糖的尺寸从而减少多糖样品的粘度和/或改善缀合产品的过滤性。低聚糖的重复单元数少(一般地具有5-30个重复单元)，其一般是水解的多糖。各脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖可以缀合到独立地选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上。可用于本发明缀合物的蛋白载体的更加全面的列表呈现于下文中。虽然可以将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖缀合到与其它糖不同的载体蛋白上，但是在一个实施方案中它们是全部缀合到相同的载体蛋白上的。例如可以将它们全部缀合到相同的选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上。由于CRM197与DT的区别仅在于一个氨基酸，因此在本文的上下文中认为它们是相同的载体蛋白。在一个实施方案中，将存在的所有脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖都缀合到TT上。如果组合物中2种或2种以上糖的蛋白载体是相同的，则可以将所述糖缀合到蛋白载体的相同分子上(有2种以上的不同的糖缀合在载体分子上)[参见例如WO04/0S3251;例如可以向单一的载体蛋白上缀合MenA和MenC;MenA和MenW;MenA和MenY;MenC和MenW;MenC和MenY;MenW和MenY;MenA、MenC和MenW;MenA、MenC和MenY;MenA、MenW和MenY;MenC、MenW和MenY;MenA、MenC、MenW和MenY;Hib和MenA;Hib和MenC;Hib和MenW;或Hib和MenY]。或者可以将各糖分别缀合到蛋白载体的不同分子上(蛋白载体的每种分子仅有一类糖缀合在其上面)。本申请第一方面的免疫原性组合物还可以具有本发明第二方面的任意或全部附加特征，反之亦然。本发明的第二方面提供了一种包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是以在1:2-1:5之间[高比例]的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以在5:1-1:1.99之间[低比例]的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。"分别缀合到同类载体蛋白上"的意思是指将糖各自地缀合到相同的载体上(即，不同的糖不是缀合到相同蛋白载体的相同分子上的)。荚膜糖可以是缀合到同类载体蛋白上，所述载体蛋白独立地选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。下文中给出了可用于本发明缀合物中的蛋白载体的更全面的列表。由于CRM197和DT的区别仅在于一个氨基酸，所以在本文的上下文中认为它们是相同的载体蛋白。在一个实施方案中，存在的所有荚膜糖都是缀合到TT上的。高比例(1:2-1:5)和低比例(5:1-1:1.99)的糖可以选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W荚膜糖(MenW)、b型流感嗜血杆菌(//.z"/Z認"zae)荚膜糖(Hib)、B群链球菌(Streptococcus)I群荚膜糖、B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌III群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B群链球菌V群荚膜糖、金黄色葡萄球菌(5Vt^/zy/ococcz^awre^)5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杀门氏菌(&/moe〃a0^&)的Vi糖、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS(例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(Mc"to"/2"fe)LPS、流感嗜血杆菌LPS和来自任意荚膜肺炎球菌糖的糖例如来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是由来自同属细菌(例如，奈瑟氏球菌属、链球菌属、葡萄球菌属或嗜血杆菌属)的两种或两种以上的不同的糖组成的，或者包含来自同属细菌的两种或两种以上的不同的糖。在一个实施方案中，MenA是高比例的糖；在另一个中MenW是低比例的糖；在另一个中MenY是低比例的糖；在另一个中MenC是高比例的糖；在另一个中MenC是低比例的糖；在另一个中Hib是高比例的糖。包含MenA/C的疫苗可以分别是高/低比例，包含MenC/Y的疫苗可以分别是高/低比例，包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分别是高/高/低/低比例，而包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分别是高/低/低/低比例。本发明各方面的概述将包含在本发明药物(免疫)组合物中的本发明的糖(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib荚膜糖)是缀合到载体蛋白上的，所述载体蛋白例如是破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素片段C、破伤风类毒素的无毒突变抹[注意，为了本发明的目的，所有这样的TT变形株均被认为是同一类载体蛋白]、白喉类毒素(DT)、CRM197、白喉类毒素的其它无毒突变林[例如RM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等人，J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel，MaecelDekkerInc.1992中描述的其它突变抹；Glu-148到Asp的缺失或突变、Gin或Ser和/或Ala158到Gly的突变以及US470卯17或US4950740中公开的其它突变；残基Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中的至少一或多种的突变以及US5917017或US6455673中公开的其它突变；或US5843"1中公开的片段](注意，为了本发明的目的，所有这样的DT变形林均被认为是同一类载体蛋白)、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995)InfectImmun63;2706-13)、OMPC(脑膜炎球菌的外膜蛋白一通常提取自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B—EP0372501)、合成肽(EP0378881,EP0427347)、热休克蛋白(WO93/17712,WO94/03208)、百日咳蛋白(WO98/58668,EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO91/01146)、包含多个人类CD4+T细胞抗原表位的人工蛋白，其中所述人工蛋白来自由抗原衍生的多种病原体(Falugi等人(2001)EurJImmunol31;3816-3824)例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)InfectImmun72;4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)、铁吸收蛋白(WO01/72337)、难辨梭状芽孢杆菌毒素A或B(WO00/61761)或蛋白D(EP594610和WO00/56360)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在其所含有的至少两种、三种、四种或每种糖(例如脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖和/或Hib)中(独立地)使用了同一类型的载体蛋白。在一个含有Hib和脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的实施方案中，可以将Hib缀合到与至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖所缀合的载体蛋白相同类型的载体蛋白上。例如，将2、3、或4种脑膜炎奈瑟氏球菌糖(MenA、C、Y、W)独立地缀合到破伤风类毒素上以制备2、3或4缀合物，并且任选地将Hib也缀合到TT上。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上的脑膜炎奈瑟氏球菌糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上的Hib糖。本发明的免疫原性组合物任选地包含至少一种脑膜炎球菌糖(例如，MenA;MenC;MenW;MenY;MenA和MenC;MenA和MenW;MenA和MenY;MenC和MenW;MenC和MenY;MenW和MenY;MenA、MenC和MenW;MenA、MenC和MenY;MenA、MenW和MenY;MenC、MenW和MenY或MenA、MenC、MenW和MenY)缀合物，所述缀合物的Men糖与载体蛋白的比例在1:5至5:1，1:2至5:1,1:0.5至1:2.5或1:1.25至1:2.5(w/w)之间。本发明免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物，所述缀合物的Hib与载体蛋白的比例在1:5至5:1;1:2至2:1;1:1至1:4;1:2至1:3.5之间；或者在1:2.5或1:3左右，或刚好为1:2.5或1:3(w/w)。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所包含的脑膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib糖缀合物是通过连接物，例如双官能连接物，缀合到载体蛋白上的。连接物任选地是异双官能的或同双官能的，其具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者两个反应性羧酸基团。连接物具有例如4到20，4到12,5到10个碳原子。可能的连接物是ADH。其它连接物包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣代烷基卣化物(US4057685)、糖苷键(US4673574,US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。存在于本发明免疫原性组合物中的糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术制备。缀合方法可以借助用l-氰基-4-二曱基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。这样，活化的糖就可以直接地或通过间隔(连接)基团被偶合到载体蛋白的氨基上。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化糖，所述硫醇化糖能够通过硫醚键偶合到载体上，所述硫醚键是在与马来酰亚胺-活化载体蛋白(例如使用GMBS)或卣代乙酰化载体蛋白(例如使用碘代乙酰亚胺或溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯)反应后获得的。任选地，将氰酸酯(任选地是通过CDPA化学制得的)与己二胺或ADH偶合，并将氨基-衍生化的糖用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白载体上的羧基缀合到载体蛋白上。这样的缀合物描述于PCT公开申请WO93/15760UniformedServicesUniversity和WO96/08348和WO96/29094中。其它合适的技术使用了碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯曱酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于W098/42721中。缀合可以使用羰基连接物，其可以通过使糖的游离羟基基团与CDI反应(Bethell等人J.Biol.Chem.1979,254;2572-4，Hearn等人J.Chromatogr.1981.218;509-18)后接着与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接而形成。其可以包括将异头端基还原为伯羟基；任选地进行伯羟基基团的保护/脱保护反应，所述反应为使伯羟基与CDI反应以形成氨基甲酸CDI酯中间体以及使氨基曱酸CDI酯中间体与蛋白上的氨基偶合。缀合物也可以如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中所描述的那样通过直接还原氨化的方法来制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。进一步的方法包括将溴化氰(或CDAP)活化的糖通过碳二亚胺缩合作用(ChuC.等人Infect.Immunity,1983245256)，例如使用EDAC,偶合到蛋白载体上，其中所述糖是用己二酸二酰肼(ADH)衍生化的。在一个实施方案中，将糖上的羟基(任选地为活化的羟基，例如用氰酸酯活化的羟基)直接地或间接地(通过连接物)连接到蛋白上的氨基或羧基上。当存在连接物时，将糖上的羟基任选地连接到连接物上的氨基上，例如通过使用CDAP缀合。可以将连接物(例如ADH)中的其它氨基基团缀合到蛋白上的羧酸基团上，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，在将连接物缀合到载体蛋白上之前，先将Hib或脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)缀合到第一连接物上。或者在缀合到糖上之前，可以先将连接物缀合到载体上。通常，蛋白载体上可以用于偶合/缀合的化合物基团的类型如下A)羧基(例如通过天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的氨基基团上，或者用碳二亚氨化学例如用EDAC连接到连接物上的氨基基团上。B)氨基(例如通过赖氨酸)。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的羧基基团上，或者用碳二亚氨化学例如用EDAC连接到连接物上的羧基基团上。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的用CDAP或CNBr活化的羟基上，或者连接到连接物上的这样的基团上；连接到具有醛基的糖或连接物上；连接到具有琥珀酰亚胺酯基的糖或连接物上。C)巯基(例如通过半胱氨酸)。在一个实施方案中将该基团连接到溴或氯乙酰化的糖上，或者用马来酰亚胺化学连接到连接物上。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺(bisdiazobenzidine)活化/改性的。D)羟基(例如通过酪氨酸)。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺活化/改性的。E)咪唑基(例如通过组氨酸)。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺活化/改性的。F)胍基(例如通过精氨酸)。G)p引咮基(例如通过色氨酸)。在糖上，能够用于偶合的通常是以下基团OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如用高碘酸盐、酸解、过氧化氢等。凝偶合法糖-OH+CNBr或CDAP——〉氰酸酯+NH2-Prot——>缀合物糖-醛+NH2-Prot—->西佛碱+NaCNBH3-——〉缀合物糖-COOH+NH2-Prot+EDAC—-—>缀合物糖-NH2+COOH-Prot+EDAC—-—>缀合物遞i^/《腐參f遽^參J糖-OH+CNBr或CDAP-——〉氰酸酯+NH2——NH2-——>糖画-画隱NH2+COOH-Prot+EDAC……>缀合物糖画OH+CNBr或CDAP——〉氰酸酯+NH2——SH——〉糖-——SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)---〉糖-S-S-Prot糖-OH+CNBr或CDAP—…〉氰酸酯+NH2…-SH——>糖——SH+马来酰亚胺-Prot(氨基的改性物)——〉缀合物糖-COOH+EDAC+NH2——NH2—-—〉糖——NH2+EDAC+COOH-Prot—…>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2-—SH——>糖—-—SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)一--〉糖-S-S-Prot糖-COOH+EDAC+NH2——SH-——>糖——SH+马来酰亚胺-Prot(氨基的改性物)一…〉缀合物糖-醛+NH2-画—NH2-——>糖一誦NH2+EDAC+COOH-Prot缀合物注意除了以上的EDAC,还可以使用任何合适的石灰二亚胺。总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如赖氨酸残基上的)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的)和SH基团(如果能够获得的话)(例如半胱氨酸残基上的)。在一个实施方案中，将Hib糖，当存在时，用CNBr、或CDAP、或CDAP与碳二亚胺化学(例如EDAC)的结合、或CNBr与碳二亚胺化学(例如EDAC)的结合来缀合到载体蛋白上。任选地Hib是用CNBr和碳二亚胺化学缀合的，其中所述碳二亚胺化学任选地为EDAC。例如，用CNBr连接糖和连接物，接着用碳二亚胺化学连接连接物和蛋白载体。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少一种是直接缀合到载体蛋白上的；任选地将MenW和/或MenY和/或MenC糖直接缀合到载体蛋白上。例如将MenW;MenY;MenC;MenW和MenY;MenW和MenC;MenY和MenC;或MenW、MenY和MenC直接连接到载体蛋白上。任选地，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖中的至少一种是通过CDAP直接缀合的。例如将MenW;MenY;MenC;MenW和MenY;MenW和MenC;MenY禾口MenC;或MenW、MenY禾口MenC通过CDAP直接连接到载体蛋白上(参见WO95/08348和WO96/29094)。在一个实施方案中，将所有的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均缀合到破伤风类毒素上。任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:2(w/w)之间，和/或MenC糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:4或1:0.5到1:1.5(w/w)之间，尤其是当这些糖是直接连接到所述蛋白上的时，其中所述连接任选地使用了CDAP。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少一种是通过连接物，例如双官能连接物，缀合到载体蛋白上的。所述连接物任选地是异双官能的或是同双官能的，其具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者2个反应性羧酸基团。连接物具有例如4到20，4到12，5到10个碳原子。可能的连接物是ADH。在一个实施方案中，MenA;MenC;或MenA和MenC是通过连接物缀合到载体蛋白(例如破伤风类毒素)上的。在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是通过连接物使用CDAP和EDAC缀合到载体蛋白上的。例如，如上所述地将MenA;MenC;或MenA和MenC通过连纟妄物(例如那些在其端基上具有两个肼基的连接物如ADH)用CDAP和EDAC缀合到蛋白上。例如，用CDAP将糖缀合到连接物上，用EDAC将连接物缀合到蛋白上。任选地，对于MenA;MenC;或MenA和MenC来i兌，通过连4妄物的缀合导致糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:6;1:1到1:5或1:2到1:4之间。对于含有缀合到相同载体上的多种糖的组合疫苗来说，一个值得考虑的问题是载体的免疫抑制作用可能使用了太多的载体从而可能抑制了免疫应答。用统一的方法缀合载体将向免疫系统呈现相似的B-和T-细胞抗原表位的混合。然而，如果一种糖和另一种糖的缀合发生在载体蛋白内不同化学基团上，则蛋白载体在怎样将它们自身呈现给免疫系统方面可能会有某种程度的不同。因此，对于本发明的所有方面来说，本文中还提供了包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白(例如破伤风类毒素)上的不同糖的免疫原型组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种糖是通过蛋白载体上的第二类(不同的)化学基团缀合到载体蛋白上的。第一和第二类化学基团可以存在于蛋白载体中在蛋白载体的相互排斥的第一和第二系列氨基酸(例如一个系列中的某些天冬氨酸/谷胺酸残基和第二系列中的某些赖氨酸/精氨酸残基)上。例如可以将一种糖缀合到载体上的羧基上，将另一种缀合到氨基上。这样的缀合可以包括每种不同缀合物的在单独的B-和/或T-细胞抗原表位上的缀合例如在MenAC疫苗中，可以将MenA连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenC连接到第二基团(例如氨基)上。在MenCY疫苗中，可以将MenC连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenY连接到第二基团(例如氨基)上。在MenACWY疫苗中，可以将MenAC连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenWY连接到第二基团(例如氨基)上，或者可以将MenA连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenCWY连接到第二基团(例如氨基)上。在一个实施方案中，2缀合物可以包括连接到同类载体上的同类糖，但是其是通过不同缀合化学进行的。在其它的实施方案中，将2种不同的糖缀合到蛋白载体上的不同基团上。"分别缀合到同类载体蛋白上"的意思是指将糖各自缀合到相同的载体上(即，不一起使用蛋白载体相同分子上的第一和第二化学基团两者来缀合糖的片段，而考虑用蛋白载体第一部分上的第一化学基团来缀合第一个糖，考虑用蛋白载体第二部分上的第二化学基团来缀合第二个糖)。在一个实施方案中，蛋白载体上的第一和第二类化学基团是存在于载体蛋白上的单独的B-和/或T-细胞抗原表位上的。也就是说，它们彼此存在于不同系列的B-和/或T-细胞抗原表位上。可以使用已知的方法例如以下两种方法中的一种或两种来预测载体的B-细胞抗原表位2D-结构预测和/或抗原指数预测。2D-结构预测可以使用PSIPRED程序进行(来自DavidJones,BruneiBioinformaticsGroup,Dept.BiologicalSciences,BruneiUniversity,UxbridgeUB83PH,UK)。抗原指数可以以Jameson和Wolf所描述的方法(CABIOS4:181-186[1988])为基础进行计算。该程序中使用的参数是抗原指数和抗原肽的最小长度。在该程序中可以使用对于最少5个连续氨基酸的0.9的抗原指数作为初始值。T-辅助细胞抗原表位是结合在HLA类II型分子上的肽，并且其能够被T-辅助细胞识别。对有效T-辅助细胞抗原表位的预测可以基于已知技术进行，所述已知技术例如Sturniolo等人描述的TEPITOPE法。(NatureBiotech.17:555-561[1999])。存在于蛋白载体上的第一和第二化学基团任选地是彼此不同的，并且理想地是易于用于缀合目的的天然化学基团。它们可以独立地选自羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基、胍基和吲哚基。在一个实施方案中，第一化学基团是羧基，第二基团是氨基，或者为相反。对于这些基团在上文中有更加详细的解释。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含至少2中不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种选自由MenA和MenC组成的第一组，其中所述MenA和MenC是通过蛋白载体上的第一类化学基团(例如羧基)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖选自由MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中所述MenC、MenY和MenW是通过蛋白载体上的第二类化学基团(例如氨基)缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA,和通过第二类化学基团(例如氨基)缀合的MenC。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenC,和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenY。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA,和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenC、MenY和MenW。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA和MenC,和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenY和MenW。在任意以上的实施例中，还可以存在缀合到同类蛋白载体上的Hib。可以将Hib通过第一或第二类化学基团缀合到载体上。在一个实施方案中，其是通过羧基缀合的。在一个实施方案中，MenA荚膜糖，当存在时其至少是部分O-乙酰化的，从而使得至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一个位置上是o-乙酰化的。o-乙酰化例如出现在至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元的至少0-3位置上。在一个实施方案中，MenC荚膜糖，当存在时其至少是部分O-乙酰化的，从而使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的(oc2—9)-连接NeuNAc重复单元在至少一或两个位置上是0-乙酰化的。O-乙酰化例如出现在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的重复单元的0-7和/或0-8位置上。在一个实施方案中，MenW荚膜糖，当存在时，其至少是部分O-乙酰化的，从而使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一或两个位置上是O-乙酰化的。O-乙酰化例如出现在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元的0-7和/或0-9位置上。在一个实施方案中，MenY荚膜糖，当存在时，其至少是部分O-乙酰化的，从而使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一或两个位置上是O-乙酰化的。O-乙酰化出现在至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、95%或98。/。的重复单元的7和/或9位上。O-乙酰化的百分比是指含有o-乙酰化基团的重复单元的百分比。可以在缀合前和/或缀合后在糖中对其进行测量。在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物中所存在的糖或者所存在的各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是缀合到TT上的。在进一步的实施方案中，各类脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是分别缀合到不同类型的载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物的糖:载体比是1:5-5:1或1:1-1:4(w/w)。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物是直接缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，MenW和/或MenY、MenW和/或MenC、MenY和/或MenC、或者MenW和MenC和MenY是直接缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物是通过CDAP化学直接缀合的。在进一步的实施方案中，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:2(w/w)之间。在进一步的实施方案中，MenC糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:2(w/w)之间。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过连接物(其可以是双官能的具有两个反应性氨基(例如ADH)或两个反应性羧基或者一端具有反应性氨基而另一端具有反应性羧基)缀合到载体蛋白上的。连接物能够具有4到12个碳原子。在进一步的实施方案中，所述的或每种通过连接物缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖都是用CDAP化学缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，所述的或每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，MenA是通过连接物缀合到载体蛋白上的(MenA糖与载体蛋白的比例可以在l:2到1:5(w/w)之间)。在进一步的实施方案中，MenC是通过连接物缀合到载体蛋白上的(MenC糖与载体蛋白的比例可以在1:2到1:5(w/w)之间)。本发明的免疫原性组合物任选地包含一或多种糖缀合物，其中各糖在缀合前的平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa。在一个实施方案中，缀合后的缀合物能够容易地过滤通过0.2微米的过滤器使得与过滤前的样品相比，过滤后能够获得大于50、60、70、80、90或95%的收率。特別是，本发明的免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在50kDa、60kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。免疫原性组合物可以包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然糖，或者是相对于天然多糖重量平均分子量用最高达x1.5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子调整过尺寸的。为了本发明的目的，"天然多糖"是指已经经历过以减小糖的尺寸为目的的方法的糖。在通常的纯化过程中，多糖的尺寸会稍微地减小。这样的糖仍然是天然的。只有当多糖已经用调整尺寸的技术调整过尺寸后才认为所述多糖不再是天然的。为了本发明的目的，"用最高达x2的因子调整尺寸"的意思是指用下述方法处理过的糖，所述方法试图减小糖的尺寸但却将其尺寸保持在天然多糖尺寸的一半以上。x3、x4等也是以同样的方式解释的，即，糖是用下述方法处理过的，所述方法试图减小多糖的尺寸但却将其尺寸保持在天然多糖尺寸的三分之一、四分之一以上等。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是用最高达x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xl0的因子调整过尺寸的。本发明的免疫原性组合物任选地包含缀合物脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、血清群A荚膜糖(MenA)、血清群W135荚膜糖(MenW)、血清群Y荚膜糖(MenY)、血清群C和Y荚膜糖(MenCY)、血清群C和A荚膜糖(MenCA)、血清群C和W荚膜糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜糖(MenAY)、血清群A和W荚膜糖(MenAW)、血清群W和Y荚膜糖(MenWY)、血清群A、C和W荚膜糖(MenACW)、血清群A、C和Y荚膜糖(MenACY)、血清群A、W135和Y荚膜糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y荚膜糖(MenCWY);或血清群A、C、W135和Y荚膜糖(MenACWY)。这是本文所提到的"一种、两种、三种或四种"，或血清群A、C、W和Y中，或各脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的"至少一种"的定义。在一个实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖的通过MALLS确定的平均尺寸在50kDa到1500kDa、50kDa到500kDa、50kDa到300kDa、101kDa到1500kDa、101kDa到500kDa、101kDa到300kDa之间。在一个实施方案中，MenA糖，如果存在，其分子量通过MALLS为50-500kDa、50-100kDa、100-500kDa、55-90kDa、60-70kDa或70-80kDa或60-80kDa。在一个实施方案中，MenC糖，如果存在，其分子量通过MALLS为100-200kDa、50-100kDa、100-150kDa、101-130KDa、150-210kDa或180-210kDa。在一个实施方案中，MenY糖，如果存在，其分子量通过MALLS为60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa、50画100kDa、100-140kDa、140-170kDa或150-160kDa。在一个实施方案中，MenW糖，如果存在，其分子量通过MALLS为60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa、50-100kDa、120-140kDa。本文中糖的分子量或平均分子量是指在缀合之前测量的糖的重均分子量，其是通过MALLS测量的。MALLS技术是本领域所熟知的，其一般是如实施例2中所描述的那样进行的。对于脑膜炎双球菌糖的MALLS分析，可以联合使用两个塔(TSKG6000和5000PWxl)，并且糖是在水中洗脱的。糖是使用光散射检测器(例如装有488nm的10mW氩激光器的WyattDawnDSP)和干涉测量折光计(例如装有P100管和498nm的红色滤光片的WyattOtilabDSP)检测的。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖，或者是在通常的提取过程中减小了尺寸的天然多糖。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是通过机械切割，例如通过微流化作用或超生处理调整过尺寸的。微流化作用和超生处理具有能够将较大的天然多糖的尺寸减小到足以提供可过滤缀合物的优势。尺寸调整是通过不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因子进行的。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物，所述缀合物是由天然多糖和用不超过x20的因子调整过尺寸的糖的混合物制成的。例如，来自MenC和/或MenA的糖是天然的。例如，来自MenY和/或MenW的糖是用不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因子调整过尺寸的。例如，免疫原性组合物含有由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA制成的缀合物，其中所述MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA是用不超过x10的因子调整过尺寸的和/或是微流化的。例如，免疫原性组合物含有由天然MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和用不超过x10的因子调整过尺寸的和/或微流化的MenA制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和用不超过x10的因子调整过尺寸的和/或微流化的MenY制成的缀合物。在一个实施方案中，糖的多分散性是1-1.5,1-1.3,1-1.2,1-1.1或1-1.05，在缀合到载体蛋白上以后，缀合物的多分散性是1.0-2.5,1.0-2.0.1.0-1.5,1.0-1.2,1.5-2.5,1.7-2.2或1.5-2.0。所有的多分散性都是通过MAIXS测量的。任选地调整糖的尺寸直到其是从细菌中分离出的多糖尺寸的1.5、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20倍。在一个实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌糖或者是天然多糖，或者是用不超过x10的因子调整过尺寸的。在一个实施方案中，每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖均是天然多糖。在进一步的实施方案中，至少一种、两种、三种或四种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过微流化作用调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用不超过xIO的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物是由天然多糖和用不超过x10的因子调整过尺寸的糖的混合物制成的。在进一步的实施方案中，来自血清群Y的荚膜糖是用不超过x10的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，来自血清群A和C的荚膜糖是天然的多糖，而来自血清群W135和Y的糖是用不超过x10的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的平均尺寸在50kDa到300KDa或50kDa到200kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenA荚膜糖，其中所述MenA荚膜糖的平均尺寸大于50kDa,75kDa,100kDa,或者其平均尺寸在50-100kDa或55-90kDa或60-80kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenC荚膜糖，其中所述MenC荚膜糖的平均尺寸大于50kDa,75kDa,100kDa,或者在100-200kDa,100-150kDa,80-120kDa,90-110kDa,150-200kDa,120-240kDa,140-220kDa,160-200kDa或190-200kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenY荚膜糖，其中所述MenY荚膜糖的平均尺寸大于50kDa,75kDa,100kDa，或者在60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa、110-150kDa、110-145kDa或120-140kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenW荚膜糖，其中所述MenW荚膜糖的平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa,或者在60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa,140-180kDa,150-170kDa或110-140kDa之间。本发明的免疫原性组合物可以包含缀合到载体蛋白上的b型流感嗜血杆菌(//.m/7we"zae)荚膜糖(Hib)。其可以缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上，例如缀合到TT上。可以将Hib糖缀合到与至少一种、两种、三种或全部脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物相同的载体蛋白上，例如缀合到TT上。在Hib荚膜糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例可以在1:5到5:1(w/w)之间，例如在1:1到1:4、1:2到1:3.5之间，或者在1:3(w/w)左右。Hib荚膜糖可以是通过连接物(参见上面)缀合到载体蛋白上的。连接物可以是双官能的(具有两个反应性氨基，例如ADH,或者具有两个反应性羧酸基团，或者一端具有反应性氨基另一端具有反应性羧酸基团)。其可以具有4到12各碳原子。可以将Hib糖缀合到载体蛋白上，或者使用CNBr或CDAP缀合到连接物上。载体蛋白可以通过连接物用包含碳二亚胺化学，任选地为EDAC化学(因此使用载体上的羧基化学基团)的方法缀合到Hib糖上。Hib糖缀合物的剂量可以在0.1到9jiig、1到5昭或2到3吗糖之间。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含Hib糖缀合物和至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，其中所述H1b缀合物以比所述至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的平均糖剂量低的糖剂量存在。或者，所述Hib缀合物以比所述至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物中的每一种的糖剂量低的糖剂量存在。例如，Hib缀合物的剂量可以比所述至少两种其它脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的平均或最低糖剂量<氐至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%。平均剂量是通过将所有的其它糖的剂量相加再除以其它糖的数目而确定的。所述其它糖是指免疫原性组合物中除Hib以外的所有的糖，其能够包括脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。"剂量"是向人给予的免疫原性组合物或疫苗的量。Hib糖是b型流感嗜血杆菌的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP)荚膜糖，或者是由其衍生的低聚糖。"至少两种其它细菌糖缀合物"意思是指除Hib缀合物以外的两种其它细菌糖缀合物。所述的两种其它细菌缀合物可以包括脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物。菌、A组链球菌、B组链球菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌中的一种或多种衍生的其它糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含由脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y中的一种或多种衍生的荚膜糖。一个进一步的实施方案包含由肺炎链球菌衍生的荚膜糖。所述肺炎球菌荚膜糖抗原任选地选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(任选地选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。一个进一步的实施方案包含金黄色葡萄球菌的5型、8型或336荚膜糖。一个进一步的实施方案包含表皮葡萄球菌的I型、ii型或m型荚膜糖。一个进一步的实施方案包含来自伤寒沙门氏菌的Vi糖。一个进一步的实施方案包括B组链球菌的Ia型、Ic型、II型、III型或V型荚膜糖。一个进一步的实施方案包含A组链球菌的荚膜糖，任选地进一步包含至少一种M蛋白和更任选地多种类型的M蛋白。本发明的免疫原性组合物还可以包含DTPa或DTPw疫苗(例如一种含有DT、TT以及全细胞百日咳(Pw)疫苗或无细胞百日咳(Pa)疫苗(包含例如百日咳类毒素、FHA、pertactin以及任选地agglutinogins2和3)的疫苗)。这样的组合物还可以包含抗乙型肝炎的疫苗(例如其可以包含乙型肝炎表面抗原[HepB],其任选地是吸附在磷酸铝上的)。在疫苗，其中的MenAC组分是如入上所述的。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任选地是来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B(MenB)或调整过尺寸的多糖或由其衍生的低聚糖的荚膜多糖，所述荚膜多糖可以是缀合在蛋白载体上的。所述抗原任选地是如EP301992、WO01/09350、WO04/14417、WO04/14418和WO04/14419中所描述的那些来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜嚢制备物。通常，本发明免疫原性组合物所包含的每种糖缀合物的剂量可以在2到20叱、3到10叱或4到7貼糖之间。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所包含的每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的剂量可以在0.1-20叱；1-10叱；2-10jug;2.5-5)tig之间，或者在5pg左右或恰好为5]Lig;或者在2.5jug左右或恰好为2.5(ig。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量可以在0.1到9昭；l到5昭或2到3叱之间，或者在2.5昭左右或恰好为2.5pg。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如在0.1到91到5g或2到3)ig之间，或者在2.5昭左右或恰好为2.5昭，和所含有的每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖缀合物的糖剂量在2到20吗、3到10jxg或4到7pg之间，或者恰好为5pg。为了本发明的目的，"左右"或"大约"被定义为在所给出范围的10%上下以内。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如小于至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物平均糖剂量的90%,80%,75%,70%,60%,50%,40%,30%,20%或10%。Hib糖的糖剂量例如是至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物平均糖剂量的20%到60%、30%到60%、40%到60%或者50%左右或恰好为50%。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如小于至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物最低糖剂量的90%,80%,75%,70%,60%,50%,40%,30%,20%或10%。Hib糖的糖剂量例如是至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物最低糖剂量的20%到60%、30%到60%、40%到60%或者50%左右或恰好50%。在本发明的一个实施方案中，所述至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物中的每一种的糖剂量任选地是相同的或近似相同的。的组合物Hib缀合物和MenA缀合物和MenC缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2,1:2:1,1:4:2,1:6:3,1:3:3,1:4:4,1:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenC的糖剂量。Hib缀合物和MenC缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2,1:2:1,1:4:2,1:4:1,1:8:4,1:6:3,1:3:3,1:4:4,1:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenC缀合物和MenW缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2,1:2:1,1:4:2,1:4:1,1:8:4,1:6:3，1:3:3,1:4:4,1:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenW缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2,1:2:1,1:4:2,1:4:1,1:8:4,1:6:3,1:3:3,1:4:4,1:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2，1:2:1,1:4:2,1:4:1,1:8:4,1:6:3，1:3:3,1:4:4,1:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenW缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1:2:2,1:2:1,1:1:2,1:4:2,1:2:4.1:4:1,1:1:4,1:3:6,1:1:3,1:6:3,1:3:3,1:4:41:5:5,1:6:6(w/w)。任选地，MenY的糖剂量大于MenW的糖剂量。MenA、MenC、MenW和MenY，其糖剂量比为1:1:1:1或2:1:1:1或1:2:1:1或2:2:1:1或1:3:1:1或1:4:1:1(w/w)。本发明进一步的方面是包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。在一个实施方案中，将本发明的免疫原性组合物緩冲到或调节到pH7.0到8.0或pH7.2到7.6之间，或pH7.4左右或恰好为pH7.4。本发明的免疫原性组合物或疫苗任选地是在稳定剂例如多元醇如蔗糖或海藻糖的存在下冻干的。疫应答加强的量的助剂::适的助剂包;舌:但不限于,、、铝盐(;酸铝或氯氧化铝)、角望烯混合物(SAF-1)、胞壁肽、皂草苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、QmlA、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及其衍生物、和免疫刺激复合物(ISCOMs)例如Takahashi等人，(1990)Nature344:873-875中所描述的那些免疫刺激复合物。对于以上所讨论的脑膜炎奈瑟氏球菌或HibMen组合物，不使用任何铝盐助剂，或者根本不使用任何助剂是有利的。对于所有的免疫原性组合物或疫苗来说，免疫原的免疫有效量必须是凭经验确定的。所考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否将会被复合到或共价附着到助剂或载体蛋白或其它载体上，给药途径和给药的致免疫剂量的数量。本发明的药物组合物或疫苗中可以存在不同浓度的活化剂。一般地，物质的最低浓度是获得其使用目所必须的量，而最高浓度是能够保留在溶液中的最大量，或者是能够保持均匀地悬浮在初始混合物内的最大量。例如，治疗剂的最小量任选地是能够提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质来说，其最低浓度是在重组过程中具有生物活性所必需的量，最高浓度是不能够再保持均匀悬浮的点处的浓度。在单剂单位的情况下，所述量即为单一治疗使用量。通常，可以预期每种制剂能够包含l-100]ig的蛋白抗原，任选地为5-50昭或5-25吗。例如，缀合物中细菌糖的剂量是10-20叱、5-10吗、2.5-5貼或l-2.5]Lig糖。通过对所述疫苗进行全身或粘膜途径的给药，本发明的疫苗制品可以用于保护或治疗易受感染的哺乳动物(例如人类患者)。所述人类患者任选地是婴儿(12个月以下)、初学走路的孩子(12-24、12-16或12-14个月)、儿童(2-10、3-8或3-5岁)、青少年(21-21、14-20或15-19岁)或成人。这些给药可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下路线的注射；或者通过粘膜给药到达口腔/消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统处。疫苗的产期内给药对于治疗肺炎或中耳炎来说是优选的(因为这样能够更有效地预防鼻咽部携带肺炎球菌，并因此能够在其最初阶段减少感染)。虽然本发明的疫苗可以作为单剂给药，但也可以将其各组分一起进行同时或不同时的共同给药(例如如果疫苗中存在糖，则可以同时对这些糖进行分别给药，或者是在给药以细菌蛋白疫苗l-2周后再对这些糖进行给药以彼此获得免疫应答的最佳协调)。除了单一的给药途径以外，还可以使用2种不同的给药途径。例如，可以对病毒抗原进4亍ID(皮内)给药，而对细菌蛋白进行IM(肌内)或IN(产期内)给药。如果存在糖，则可以对它们进行IM(或ID)给药，并对细菌蛋白进行IN(或ID)给药。此外，对于初种制剂，本发明的疫苗可以用IM的方式给药，对于加强制剂可以用IN的方式。疫苗制品通常描述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.&NewmanM.J.编辑)(1995)PlenumPressNewYork)中。脂质体内部的胶嚢化描述于Fullerton，美国专利4,235,877中。本发明进一步的方面是一种用于伴随或顺序给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物以用于在宿主内提供保护作用从而抵抗由百日咳#干菌(Borafefe〃a/e/Yww's)、破4另风4干菌(C7oy/W<^wwf""w')、白p使#奉4干菌(Cof^/7eZ)(3c/^力wwfi^//^/zehae)和月亩月莫炎奈瑟氏5求菌(iVe^w'e〃'(2附ew^7g/〃(i^)以及4壬选i也;^感p耆血^f菌(//aewo//7z7wsz"/72ie^ae)所引起的疾病。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中包含一种或多种破伤风类毒素(TT),白喉类毒素(DT),和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。本发明进一步的方面是一种用于伴随或连续给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物以用于在宿主内提供保护作用从而抵抗由月^炎《连5求菌(5V"/7,OCOCCW/"ewwo"/"5)和月卤月菱炎奈瑟氏J求菌以及4壬选地流感嗜血杆菌引起的疾病。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中包含载体蛋白与来自肺炎链球菌的荚膜糖[其中所述荚膜糖任选地来自选自1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F和33F的肺炎球菌血清型]的一种或多种缀合物。和第二容器，所述容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。Hib缀合物和脑膜炎奈瑟氏球菌多糖缀合物的例子如上所述。一般地，本发明免疫试剂盒中的(或者任意以上所描述的本发明免疫原性组合物中的)肺炎链球菌疫苗将包含糖抗原(任选地是缀合的)，其中所述糖衍生自选自1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F和33F的肺炎球菌血清型中的至少四种。任选地，所述的四种血清型包括6B，14,19F和23F。任选地，组合物中包括至少7种血清型，例如那些衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的。任选地，组合物中包括大于7种的血清型，例如包括至少10、11、12、13或14种血清型。例如一个实施方案中的组合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F和任选地3(所有均任选地是缀合的)的10或11荚膜糖。在本发明的一个实施方案中包含了至少13种糖抗原(任选地是缀合的)，虽然其它的糖抗原，例如23元(例如血清型1,2,3,4,5,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20，22F,23F和33F)也能够通过本发明预期到。能够将肺炎球菌糖独立地缀合到任何已知的载体蛋白上，所述载体蛋白例如CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D或以上所提到的任何其它载体蛋白。任选地，本发明的免疫试剂盒还包含第三部分。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中含有一种或多种破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT),和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含载体蛋白与来自肺炎链球菌的荚膜糖[其中所述荚膜糖任选地来自选自1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F，18C,19A,19F，20,22F,23F和33F的肺炎球菌血清型]的一种或多种缀合物。和第三容器，所述容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。本发明进一步的方面是一种本发明免疫原性组合物或疫苗的的制备方法，其包括将本发明的糖进行混合的步骤，例如将脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖与药学上可接受的赋形剂进行混合，所述脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或全部四种。本发明进一步的方面是一种对人类宿主进行免疫以抵抗由脑膜炎奈瑟氏球菌以及任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病的方法，所述方法包括向宿主给药以免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒，任选地使用单剂。本发明的一个独立的方面是一种用免疫原性组合物使人类宿主免疫的方法，所述免疫原性组合物包含至少2种选自血清群A、C、W和Y(任选地为MenA、C、W和Y)的不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物，其中单一剂量的给药(任选地是对少年、成人或孩子的给药)导致在给药一个月后进行的血液检查中给出在测量对MenA、MenC、MenW和/或MenY的应答水平的SBA试验中应答者超过50%、60%、70%、80%、90%或95%的结果。任选地SBA试验是如实施例9中所描述的，并如实施例9中所描述的那样对应答者进行评价。本发明一个进一步独立的方面是一种包含MenA、MenC、MenW和/或MenY缀合物的免疫原性组合物，其能够在单剂使用后引发免疫应答，从而使得超过50%、60%、70%、80%、90%或95%的接种人类受试者(儿童、少年或成人)在对接种后一个月时抽取的血液进行的SBA试验中能够归为应答者一类(任选地使用实施例9中所描述的标准)。这样的免疫原性组合物任选地具有本文所描述的进一步的结构特征。防由脑膜炎奈瑟氏球菌和任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病方面的用途。本发明的一个进一步的方面是本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌和任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病的药物方面的用途。根据发明人的意图，在所有情况中，本文中的术语"包含"、"含有"和"包括"是分别与术语"由…组成"、"由…组成的"和"由…组成地"可任选地替换的。为参考。所附的实施例解释说明了本发明。除另外详细描述的那些以外，以下实施例均是采用标准技术进行的，其对于本领域技术人员来说是熟知的并且是常规的。实施例是解释说明性的，其不用于限定本发明。实施例实施例1-多糖缀合物的制备通过由Chu等人开发的偶合化学方法(InfectionandImmunity1983,40(1);245-256)实现流感嗜血杆菌(Hib)PRP多糖到TT上的共价键合。通过加入CNBr并在pH10.5下培养6分钟对HibPRP多糖进行活化。将pH降低到pH8.75并加入己二酸二酰肼(ADH),继续培养90分钟。通过使用l-乙基-3-(3-二曱基-氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)的碳二亚胺缩合将活化的PRP连接到纯化的破伤风类毒素上。向活化的PRP中加入EDAC以达到0.6mgEDAC/mg活化PRP的最终比例。将pH调节到5.0并加入纯化的石皮伤风类毒素以达到2mgTT/mg活化PRP。在温和的搅拌下将所产生的溶液放置三天。在通过0.45pm膜的过滤之后，将缀合物在用在0.2MNaCl中平衡过的sephacrylS500HR(Pharmacia,瑞典)柱上进行纯化。MenC-TT缀合物是4吏用天然多糖(通过MALLS测量超过150kDa的)制备的或者是被轻微微流化过的。MenA-TT缀合物是用超过60kDa的天然多糖或轻微微流化多糖制备的，所述超过60kDa是通过实施例2中的MALLS法测量的。MenW和MenY-TT缀合物是用100-200kDa左右的调整过尺寸的多糖制备的，其中所述100-200kDa左右是通过MALLS(参见实施例2)测量的。通过使用匀浆器EmulsiflexC-50装置的微流化作用来调整尺寸。然后将多糖通过0.2过滤器进行过滤。活化和偶合是如WO96/29094和WO00/56360中所描述的那样进行的。简单地说是，将2MNaCl中的pH5.5-6.0且浓度为10-20mg/ml的多糖与CDAP溶液(100mg/ml，在乙腈/WFI,50/50中新制备的)进行混合以达到0.75/1或1.5/1的最终CDAP/多糖比例。1.5分钟后，用氢氧化钠将pH升高到pH10.0。三分钟后，加入破伤风类毒素以达到以下蛋白/多糖比例，所述比例对MenW来说为1.5/1，对MenY来说为1.2/1,对MenA来说为1.5/1或者对MenC来说为1.5/1。继续反应一到两个小时。偶合步骤之后，加入甘氨酸以达到7.5/1的最终甘氨酸/PS(w/w)比例，并将pH调节到pH9.0。将混合物;改置30分钟。使用10pm的Kleenpak过滤器澄清缀合物，然后将其装载到SephacrylS400HR柱上，所述柱子使用的洗脱緩冲液是的150mMNaCl、10mM或5mMTrispH7.5。将临床批次在Opticap4灭菌膜上过滤。所产生的缀合物具有1:1-1:5(w/w)的平均糖:蛋白比例。实施例la-本发明MenA和MenC多糖缀合物的制备MenC-TT缀合物是使用天然多糖(通过MALLS测量超过150kDa的)制备的，或者是被轻微微流化过的。MenA-TT缀合物是使用超过60kDa的天然多糖或轻微樣丈流化过的多糖制备的，其中所述超过60kDa是通过实施例2中的MALLS法测量的。通过使用匀浆器EmulsiflexC-50装置的微流化作用来调整尺寸。然后将多糖通过0.2iim的过滤器进行过滤。为了将MenA荚膜多糖通过间隔物缀合到破伤风类毒素上，使用了以下的方法。通过偶合化学方法来实现多糖与间隔物(ADH)的共价键合，所述偶合化学方法使多糖在控制条件下通过氰基化试剂，1-氰基-4-二曱氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)得到活化。间隔物通过其肼基来与氰基化的PS进行反应，从而在间隔物与多糖之间形成稳定的异脲连接。用新制备的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(v/v))溶液处理10mg/ml的MenA溶液(pH6.0)[3.5g]以获得0.75(w/w)的CDAP/MenA比例。1.5分钟后，将pH升高到pHlO.O。三分钟后，加入ADH以获得8.9的ADH/MenA比例。将溶液的pH降低到8.75并且保持该pH继续反应2小时(温度保持在25°C)。将PSAAH溶液浓缩到其初始体积的四分之一，然后使用截点为10kDa的FiltronOmega膜用30体积的0.2MNaCl进行渗滤(diafiltered)，过滤滞留物。在缀合(碳二亚胺缩合)反应之前，对纯化TT溶液和PSAAH溶液进行稀释以达到10mg/ml的PSAAH浓度和10mg/ml的TT浓度。为了达到0.9mgEDAC/mgPSAAH的最终比例，向PSAH溶液(2g糖)中加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)。将pH调节到5.0。用蠕动泵(在60分钟内)加入纯化的破伤风类毒素以达到2mgTT/mgPSAAH。在+25。C在搅拌下将所产生的溶液;故置60分钟以达到120分钟的最终偶合时间。通过加入pH7.5的1MTris-Hcl(最终体积的1/10)对溶液进^f亍中和并在+25。C下;^置30分钟，然后在+2。C到+8'C下放置过夜。使用10]Lim的过滤器澄清缀合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,瑞典)进行纯化。该柱是在10mMTris-HCl(pH7.0)中平4軒过的，将0.075MNaCl和缀合物(大约660mL)载样到所述柱子上(+2。C到+8。C)。洗脱池(elutionpool)是作为280nm下光密度的函数选择的。当吸光度增加到0.05时开始收集。持续收集直到Kd达到0.30。将缀合物在+20。C下过滤消毒，然后在+2。C到+8。C下储存。所产生的缀合物具有1:2-1:4(w/w)的糖:蛋白比例。为了将MenC荚膜多糖通过间隔物缀合到破伤风类毒素上，使用了以下的方法。通过偶合化学方法来实现多糖与间隔物(ADH)的共价键合，所述偶合化学方法使多糖在控制条件下通过氰基化试剂，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)得到活化。间隔物通过其肼基与氰基化的PS进行反应，从而在间隔物与多糖之间形成了稳定的异脲连接。用新制备的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(v/v))溶液处理20mg/ml的MenC溶液(pH6.0)[3.5g]以获得1.5(w/w)的CDAP/MenC比例。1.5分钟后，将pH升高到pH10.0。在活化过程中加入pH5MNaCl以荻得2MNaCl的最终浓度。三分钟后，加入ADH以获得8.9的ADH/MenC比例。将溶液的pH降低到8.75并且保持该pH继续反应2小时(温度保持在2VC)。将PSCAH溶液浓缩到150mL的最小体积，然后使用截点为10kDa的FiltronOmega膜用30体积的0.2MNaCl进4亍;参滤，过滤滞留物。在缀合反应之前，将纯化TT溶液和PSCAH溶液(2g规模的)在0.2MNaCl中进行稀释以达到15mg/ml的PSCAH浓度和20mg/ml的TT浓度。为了达到2mgTT/mgPSCAH,向PSCAH溶液中加入纯化的破伤风类毒素。将pH调节到5.0。用蠕动泵(在IO分钟内)加入EDAC(l6.7mg/mlTris0.1MpH7.5中的)以达到0.5mgEDAC/mgPSCAH的最终比例。在+25。C，在搅拌和pH调节下将所产生的溶液放置IIO分钟以达到120分钟的最终偶合时间。然后通过加入pH9.0的1MTris-Hcl(最终体积的1/10)对溶液进行中和并在+25。C下放置30分钟，然后在+2。C到+8。C下放置过夜。使用10|Lim的过滤器澄清缀合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,瑞典)进行纯化。该柱是在10mMTris-HCl(pH7.0)中平衡过的，将0.075MNaCl和缀合物(大约460mL)载样到所述柱子上(+2。C到+8。C)。洗脱池是作为280nm下光密度的函数选择的。当吸光度增加到0.05时开始收集。持续收集直到Kd达到0.20。将缀合物在+20°(:下过滤消毒，然后在+2。C到+8。C下储存。所产生的缀合物具有1:2-1:4(w/w)的糖:蛋白比例。实施例2-使用MALLS确定分子量将检测器与HPLC排阻柱连接，样品从所述排阻柱中得到洗脱。一方面，激光散射检测器测量了大分子溶液在16度角散射的光强度，另一方面，在线i殳置的干涉测量4斤光^十(interferometricrefractometer)才是供了对洗脱样品的量的测量。由此可以确定溶液中大分子的密度、尺寸和形状。重均分子量(Mw)的定义是所有物质重量与它们各自分子量的乘积的总和，再除以所有物质的重量和。a)重均分子量<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>b)数均分子量-Mn-w。c)均方4艮半径-11\￥-和112\￥是如下定义的方4艮半径:R2w或(一》w=V''(-m广是散射中心i的质量，介是散射中心i和大分子重心之间的距离)。d)多分散性被定义为-Mw/Mn-的比。脑膜炎球菌多糖是用MALLS法通过载样到联合使用的两个HPLC柱(TSKG6000和5000PWxl)上进行分析的。将25)il多糖载样到柱子上并用0.75ml过滤水进行洗脱。使用光散射检测器(装有10mW488nm氩气激光的WyattDawnDSP)和干涉测量折光计(装有P100管和498nm红色滤光片的WyattOtilabDSP)来检测多糖。通过德拜法(Debyemethod)使用Astra4.72软件的多项拟合命令来计算分子量的多分散性和所有样品的回收性。实施例3-用Memngitec或较大尺寸的MenC-TT缀合物免疫的临床试验比较进行II期、开放式、控制研究以比较GSKBiological的脑膜炎球菌血清群C缀合疫苗(MenC)和GSKBiological的b型流感嗜血杆菌-脑膜炎球菌血清群C缀合疫苗(Hib-MenC)或Meningitec⑧。每剂Meningitec⑧含有10缀合到15昭CRM197上的脑膜炎球菌血清群C低聚糖，并且所述Meningitec⑧是由Wyeth生产的。GSKMenC缀合物含有约200kDa的缀合到破伤风类毒素(TT)上的天然多糖。研究由五个组组成，每个组计划含有IOO名受试者，将受试者如下地分配到两个平4亍队列中在本研究中，使两个队列中的所有受试者在12-15个月大(第O研究月份)时接受五分之一(1/5)剂量的MencevaxTMACWY和伴随剂量的Infanrixhexa。对所有受试者均收集两份血样(第O研究月份的和第l研究月份l的)。队列1由来自初种免疫研究的四个组组成，其中受试者在它们3、4和5个月大时初种了如下疫苗K组MenC(10昭)，没有吸附到铝盐上的，破伤风类毒素(TT)缀合物和Infanrixhexa(MenC10-TT+InfanrixTMhexa)L组Hib(10jag)-MenC(10|iig)，没有吸附到TT缀合物上和InfanrixTMpenta(Hib10-MenC10-TT+InfanrixTMpenta)*M组Hib(5jug)-MenC(5吗)，无吸附的，TT缀合物和Infanrixpenta(Hib5-MenC5-TT+InfanrixTMpenta)*N组Meningitec和Infanrixhexa(MeningitecTM+InfanrixTMhexa)在加强免疫研究中使两个Hib-MenC-TT疫苗组(L组和M组)保持盲试状态以选出候选疫苗的准确配方。队列2(O组)由之前没有接种过脑膜炎球菌血清群C疫苗(天然)的年龄匹配的受试者组成，但他们接受过根据GermanPermanentCommissiononImmunization的常夫见儿牙牛疫苗。评价标准免疫原性通过杀菌力试验(截点1:8的稀释度)确定抗脑膜炎球菌C的灭菌抗体滴度(SBA-MenC)，用ELISA法来测量血样中抗脑膜炎球菌血清群C(试验截点0.3pg/ml)、Hib多糖PRP(试验截点0.15昭/ml)和破伤风类毒素(试验截点0.1IU/ml)的抗体，其中所述血样是在接种疫苗前和接种疫苗后大约一个月时从所有受试者处获得的。统计方法入t7分有确定ATP和总接种人群的平均年龄，按月计算(包括中值、范围和标方差[SD]),以及种族和性别组成。以用于测量免疫原性的ATP人群(为了分析免疫记忆和加强免疫反应)或用于测量安全性的ATP人群(为了分析持续性)为基础进行了两个免疫原性分析。其包括7在用1/5剂量的^f"通多糖疫苗给药前或给药一个月后)*测定95%置信区间内(95%C1)的几何平均滴度和浓度(GMTs和GMCs)*测定恰好95。/。Cl内的抗体滴度/浓度大于所设定截点的受试者的百分比*使用反向累积曲线研究接种疫苗后的抗体滴度/浓度*对初种组(K、L、M和N组)与未接种组(组O)之间的血清阳性/血清保护性抗体阳性比值的差进行标准化的趋近95%Cl的计算*确定SBA-MenC滴度比抗-PSC浓度单个比例的95%C1内的几何平均数*使用ANOVA模型测定K、L、M组和对照组N之间对于抗-PRP和抗-石皮伤风的以及各初种组(K、L、M和N组)和未4妻种组(0组)之间对于SBA-MenC和抗-PSC的95%Cl内的接种后GMT/C比结果表1、加强免疫接种后的SBA-MenC滴度和抗-PSC抗体浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>组K:用MenC10-TT+Infanrix.hexa初种的受试者；L组用Hib10画MenC10-TT+Infanrix.penta初种的受试者；M组用Hib5-MenC5-TT+Infanrix.penta一刀种的受i式者；N纟且用Meningitec.+Infanrix.hexa初种的受试者；O组对照受试者(即，没有用MenC缀合疫苗接种的受试者)N:具有有效结果的受试者的数量与Memngitec低聚糖缀合疫苗相比，用较大尺寸的MenC多糖缀合疫苗进行初种(K、L和M组)获得了较高的抗MenC抗体滴度和较高的SBA滴度。表2:SBAMenC滴度/抗-PSC浓度的几何平均数比<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>在全部四个初种组(K、L、M和N组)中，从力口强免疫4妄种前到加强免疫接种后GMR存在明显地提高，这表明了抗体成熟和官能性的存在。M组(用Hib5-MenC5-T初种的)中的GMR比N组(用Meningitec初种的)中的高。表3:在12-15个月大刚好在给予加强免疫接种之前时的残余量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>组K:用MenC10-TT+InfanrixTMhexa初种的受试者；L组用Hib10-MenC10-TT+InfanrixTMpenta初种的受试者；M组用Hib5-MenC5-TT+InfanrixTMpenta初种的受试者；N组用MeningitecTM+InfanrixTMhexa初种的受试者；N:具有有效结果的受试者的数量与用MenC-低聚糖缀合物Meningitec进行初种相比，用较大尺寸的MenC初种(K、L和M组)获得了较高的抗MenCSBA滴度。免疫记忆(用于测定免疫原性的ATP人群)用1/5剂普通多糖ACWY疫苗进行的给药在全部四个初种组中均获得了非常高的SBA-MenC滴度，其中在用候选疫苗方案初种的受试者中分别有98.7-100%和97.5-100%的受试者显示出^1:8和^1:128的滴度。在用MenmgitecTM方案初种的组中，存在滴度^1:128的受试者的百分比较低(91.8%)的趋势。在比较中，17.6%的未接种的受试者具有^1:8和2l:128的SBAMenC滴度。实施例4对与DTPw-HepB混合的HibMenAC-TT缀合疫苗的II期临床试验研究设计对五个组进行开放式、随机(1:1:1:1:1)、单中心的研究。所述的五个组在6、10和14周大时分别接受了如下的疫苗接种方案。*TritanrixTM-HepB/Hib-MenAC2.5/2.5/2.5:以后一皮称为2.5/2.5/2.5*TntanrixTM-HepB/Hib-MenAC2.5/5/5:以后被称为2.5/5/5*TntanrixTM-HepB/Hib-MenAC5/5/5:以后被称为5/5/5*TritanrixTM-HepB+HibenxTM:以后被称为Hiberix*Tritanrix,HepB/HiberixTM+MeningitecTM:以后#皮-尔为Meningitec在第一剂疫苗时(前)和在第三剂疫苗后的一个月(后-剂3)时采集血样。Tritanrix是GlaxoSmithKlmeBiologicalsS.A.上市的一种DTPw疫苗。五个组中的每个组中均使用了105名受试者，研究中共使用了525名受试者。表4GSK疫苗制剂的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*2.5/2.5/2.5疫苗是GSKBiologicals的Hib-MenAC5/5/5疫苗的稀释剂，其含有2.5|ug的每种PRP-TT、MenA-TT和MenC-TT。将Hib-MenAC疫苗制剂就地与Tntanrix-HepB混合。GSKBiologicals的联合白喉-石皮伤风-全细胞百日咳杆菌-乙型肝炎(DTPw-HB)疫苗(Tntanrix-HepB)含有不少于30国际单位(IU)的白喉类毒素，不少于60IU的破伤风类毒素，不少于4IU的灭活百曰咳杆菌和10|ig的重组乙型肝炎表面抗原。参考治疗、剂量、给药方式，批号接种时间安排/位置一组在6、10和14周大时在左股处通过肌内注射接种了Tntanrix-HepB疫苗，在右股处通过肌内注射接种了Hiberix疫苗。另一组在6、10和14周大时在左股处通过肌内注射接种了Tritanrix-HepB/Hiberix.疫苗，在右股处通过肌内注射接种了Meningitec.疫苗。瘦劳/邀成'/游量/批f:所使用的TritanrixTM-HepB如上所述。一剂(0.5ml)GSKBiologicals的b型流感嗜血杆菌缀合疫苗HibenxTM含有10昭缀合到破伤风类毒素上的PRP。在HiberixTM组中，将其与无菌稀释剂混合，而在Meningitec组中，将其与TritanrixTM-HepB混合。一剂(0.5ml)WyethLederle的MENINGITECTMTM疫苗，其含有10昭缀合到15昭白喉杆菌CRM197蛋白上的脑膜炎球菌群C群荚膜低聚糖和铝作为盐。结果-对Hib、MenA和MenC产生的免疫应答表5a抗-PRP(收/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表5bSBA-MenC<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表5cSBAMenA<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>originaldocumentpage50</column></row><table>表5d抗-PSP(ug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表5e抗-PSA(ug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>结论比较通过使用低聚糖MenC-CRM197缀合疫苗和含有多糖MenA-TT和MenC-TT缀合物的三种GSK制剂所获得的免疫结果，比较结果显示，多糖Men缀合物能够产生与使用低聚糖缀合物疫苗Meningitec所获得的免疫应答相似的良好的免疫应答。所有试验制剂均在100%的患者中给出了对MenC的应答。实施例5-按照2、3和4个月的时间安排进行伴随有Infanrixpenta的HibMenCY给药II期临床试验研究设计对5个组进行II期、开放式(部分地双盲*)随机的受控多中心研究，所述5个组接受了三剂使用如下疫苗进行的初种计划Hib-MenCY2.5/5/5组Hib陽MenCY(2.5/5/5)+InfanrixTMpentaHib-MenCY5/10/10组Hib-MenCY(5/10/10)+InfanrixTMpentaHib-MenCY5/5/5组Hib-MenCY(5/5/5)+InfanrixTMpentaHib-MenC组Hib-MenC(5/5)+InfanrixTMpentaMenjugate组MenjugateTM**+InfanrixTMhexa(对照)*Hib-MenCY2.5/5/5、Hib-MenCY5/10/10和Hib-MenC是以双盲的方式给药的，而Hib-MenCY5/5/5组和Menjugate组是开放式的。Hib-MenCY的2.5/5/5、5/10/10和5/5/5制剂含有MenC天然多糖和微流化的MenY多糖。"MenjugateTM每剂含有10昭的缀合到12.5-25(igCRM197上的MenC低聚糖，并且其是由Chiron制造的。在+/-2、3、4个月大(第0研究月份、第l研究月份和第2研究月份)时接种疫苗，在初种之前和初种后一个月时(第0研究月份和第3研究月份)采集所有受试者的血样(3.5ml)研究的疫苗、剂量、给药方式、批号如下所示，在大约2、3和4个月大时以一个月为间隔肌内注射三剂表6:给予的疫苗(研究和对照)、组、时间安排/位置和剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>免疫原性测量对每种疫苗抗原的抗体滴度/浓度在第一剂(第O月份)前和第三剂后大约一个月(第3月份)时在对于SBA-MenC和SBA-MenY、抗-PSC和抗-PSY、抗-PRP、抗-T、抗-FHA、抗-PRN和抗-PT的所有受试者中。利用对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y(SBA-MenC和SBA-MenY截点1:8和1:128)的血清灭菌活性；进行ELISA试验，试验的截点对于抗-脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y多糖(抗-PSClgG和抗-PSYlgG)为^0.3pg/ml和^2pg/ml;对于Hib多糖磷酸聚核糖基核糖醇(抗-PRPlgG)为^0.15pg/ml和>1.0叱/ml;对于抗-FHA、抗-PRN、抗-PT为5EL.U/ml;对于抗破伤风类毒素(抗-TT)为SO.lIU/ml。仅在第三剂后的一个月时(第3月份)对于抗-D、抗-HBs和抗-脊髓灰质炎1、2和3的所有受试者中。使用ELISA试验，试验的截止点对于抗-白喉(抗-D)为0.1IU/ml;对于抗乙型肝炎(抗-HBs)为^10mlU/ml;和微量中和试验，截止点为对于抗隱脊髓灰质炎l、2和3型(抗-脊髓灰质炎l、2和3)为1:8。统计方法对于SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY、抗-PRP、抗-破伤风、抗-PT、抗-FHA和抗-PRN在4妄种疫苗前以及在4妄种疫苗后一个月时；对于抗-白喉、抗-HBs、抗-脊髓灰质炎1、抗-脊髓灰质炎2和抗-脊髓灰质炎3在接种疫苗后一个月时计算每组的95%的置信区间(95%Cl)内的血清保护性抗体阳性/血清阳性比和几何平均数浓度/滴度(GMCs/GMTs)。对抗-PT、抗-PRN和抗-FHA的95%CI内的免疫应答(在最初为血清阴性的受试者中出现抗体，或者至少在最初为血清阳性的受试者中保持了抗体的浓度)也是在接种疫苗后一个月时计算的。还提供了每个抗体在第3月份时的反向累积曲线。对除SBA-MenY和抗-PSY以外的每种抗体均以探索性的方式评价了与MenjugateTM对照组相比，Hib-MenCY组和Hib-MenC组之间的差异，评价的依据是(1)用MenjugateTM组中超过指定截点或在其标准渐进95%CI内具有免疫应答的受试者的百分比(减去)Hib-MenCY组和Hib-MenC组中的上述受试者的百分比，所得结果之间的差异，(2)在它们的95%CI内，MenjugateTM组比Hib-MenCY组和Hib-MenC组的GMC或GMT比。对于抗-PRP、SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY和抗-TT抗体进行了同样的比较以评价每对Hib-MenCY制剂之间的差异。根据症状类型、其强度和与疫苗接种的关系，按组计算了局部和全身引发症状的总发病率(所述发病率为在疫苗接种后8天内并且在它们的精确95%CI内报告具有全身、局部或任何引发症状的受试者的百分比)。计算每组中未引发症状的发生率。对于3级症状，提供了S48小时的发病情况、治疗情况、持续时间、与免疫接种的关系和结果。对严重的不利事件进行了充分地描述。血清保护性抗体阳性/血清阳性比&GMC/Ts(用于检测免疫原性的ATP人群)表7a抗-PRP(收/ml)组ULGMCHibMenCY2.5/5/567100.094.6100.098.592.0100.09.017,25".21HibMenCY5/10/1067100.094.6100.098.592.0100.09.497.7211.S5H'bMenCY5/5/570100.094.9100.098.692.3100.08.086.539.98HibMenG74100,095.1100.098.692,7100.010.448,4912.83M0njugateTM71100.094.9100.080.369.1肪.82.601,973.43表7bSBA-MenC(滴度)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表7f抗-破伤风(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>Hib-MenCY2.5/5/5组Hib-MenCY(2.5/5/5)+InfanrixpentaHib-MenCY5/10/10组Hib画MenCY(5/10/10)+InfanrixpentaHib-MenCY5/5/5组Hib-MenCY(5/5/5)+InfanrixTMpentaHib-MenC纟且Hib-Men(5/5)+InfanrixTMhexaMenjugate组MenjugateTM+InfanrixpentaN二具有有效结果的受试者的数目。％=浓度/滴度在指定范围内的受试者的百分比GMC/T:浓度/滴度的几何平均数95%01=95%的置信区间；LL=最低值；UL-最高值结论MenC和Y多糖缀合物在所有受试者中产生了良好的免疫应答，其中100%的受试者对MenC和MenY产生了大于0.3昭/ml的应答。实施例6-比较三种MenACWY-TT制剂与MeningitecMenC-CRM197低聚糖-缀合疫苗的II期临床试验本实施例报导了II期、开放式(部分盲试的)、随机、控制剂量-范围的研究以评价当向12-14个月大的儿童给予一剂时，与MenC低聚糖-CRM197缀合疫苗(Meningitec)相比，GlaxoSmithKlineBiological的脑膜炎球菌血清群A、C、W-135、Y破伤风类毒素缀合(MenACWY-TT)疫苗三种不同制剂的免疫原性。临床试验是开放式(部分双盲*)、受控、多中心的研究，其中将12-14个月大的合格受试者随机(1:1:1:1)地分配到四个平行组中的一个中，每个组有50名受试者，所述受试者在1次就诊时如下所示地接受了一剂初种FormIT:MenACWY-TT，其剂量为2.5吗缀合到破伤风类毒素(TT)上的MenA多糖、2.5吗缀合到TT上的MenC多糖、2.5吗缀合到TT上的MenW多糖和2.5pg缀合到TT上的MenY多糖。Form2T:MenACWY-TT,其剂量为5pg缀合到TT上的MenA多糖、5昭缀合到TT上的MenC多糖、5)tig缀合到TT上的MenW多糖和5|tig缀合到TT上的MenY多糖。Form3T:MenACWY-TT，其剂量为2.5|iig缀合到TT上的MenA多糖、10pg缀合到TT上的MenC多糖、2.5|tig缀合到TT上的MenW多糖和2.5pg缀合到TT上的MenY多糖。CtrlT:lOjig缀合到12.5-25pgCRM197上的MenC低聚糖(Meningitec)。*三种不同的MenACWY-TT制剂是以双盲的方式^^药的。瘦,凝#秒/^安#/在置在第1次就诊时(第0研究月)根据随机分配在左三角肌上通过肌内注射给药以一剂疫苗。所有候选疫苗均以装在一剂小瓶中的冻干丸剂(与所提供的盐水稀释剂混合后为0.5ml)的形式提供。^#:测定血样中抗脑膜炎球菌菌苗抗原组分抗体的滴度/浓度，所述血样是在给予研究疫苗制剂之前和给予研究疫苗制剂后大约一个月时从所有受试者处获得的。通过杀菌力试验(试验截点1:8和1:128的稀释度)测定抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的灭菌抗体滴度(SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW和SBA-MenY),通过ELISA法测定抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的抗体(抗-PSA、抗-PSC、抗-PSW和抗-PSY，试验截点为20.3lag/ml和22昭/ml)和抗破伤风类毒素的抗体(抗-破伤风，试验截点为0.1IU/ml)。结果表8中以接种疫苗后一个月(初种的终点)时SBA-MenA、SBA-MenC,SBA-MenW和SBA-MenY应答者的百分比的形式显示了抗体应答。应答被定义为大于或等于4-倍的血清阳性受试者的增加或接种疫苗前为血清阴性的受试者的血清转化。或CDAP与碳二亚胺化学(例如EDAC)的结合、或CNBr与碳二亚胺化学(例如EDAC)的结合来缀合到载体蛋白上。任选地Hib是用CNBr和碳二亚胺化学缀合的，其中所述碳二亚胺化学任选地为EDAC。例如，用CNBr连接糖和连接物，接着用碳二亚胺化学连接连接物和蛋白载体。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少一种是直接缀合到载体蛋白上的；任选地将MenW和/或MenY和/或MenC糖直接缀合到载体蛋白上。例如将MenW;MenY;MenC;MenW和MenY;MenW和MenC;MenY和MenC;或MenW、MenY和MenC直接连接到载体蛋白上。任选地，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖中的至少一种是通过CDAP直接缀合的。例如将MenW;MenY;MenC;MenW和MenY;MenW和MenC;MenY禾口MenC;或MenW、MenY禾口MenC通过CDAP直接连接到载体蛋白上(参见WO95/08348和WO96/29094)。在一个实施方案中，将所有的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均缀合到破伤风类毒素上。任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:2(w/w)之间，和/或MenC糖与载体蛋白的比例在1:0.5到1:4或1:0.5到1:1.5(w/w)之间，尤其是当这些糖是直接连接到所述蛋白上的时，其中所述连接任选地使用了CDAP。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少一种是通过连接物，例如双官能连接物，缀合到载体蛋白上的。所述连接物任选地是异双官能的或是同双官能的，其具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者2个反应性羧酸基团。连接物具有例如4到20，4到12，5到10个碳原子。可能的连接物是ADH。在一个实施方案中，MenA;MenC;或MenA和MenC是通过连接物缀合到载体蛋白(例如破伤风类毒素)上的。在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是通过连接物使用CDAP和EDAC缀合到载体蛋白上的。例如，如上所述地将MenA;MenC;或MenA和MenC通过连纟妄物(例如那些在其端基上具有两个肼基的连接物如ADH)用CDAP和EDAC缀合到蛋白上。例如，用CDAP将糖缀合到连接物上，用EDAC将连接物缀合到蛋白上。任选地，对于用ACWY-T多糖缀合物的三种制剂进行的疫苗接种全部导致了对MenA、MenC、MenW和MenY的良好SBA应答，其中95-100%的受试者具有大于1:8的滴度。特别是，通过滴度大于1:128的受试者的较高比例和GMT读数可以看出，多糖缀合物的5/5/5/5和2.5/10/2.5/2.5制剂产生了比MeningiticTM疫苗高的抗MenC应答。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>ACWY-TT多糖缀合疫苗的全部三种制剂均产生了抗MenA、MenC、MenW和MenY的良好的免疫应答，其中93%到100%的受试者获得了大于0.3pg/ml的滴度。与Meningitec相比，使用ACWY-TT多糖缀合疫苗的5/5/5/5和2/5/10/2.5/2.5制剂时获得了较高的GMC读数。实施例7-比较天然的和调整过尺寸的MenY多糖缀合物的免疫原性通过皮下途径对小鼠(6-8周的雌性DBA/2)进行两次PSY-TT注射，间隔为2周。在第二次注射后的第14天采集血样以使用S1975menY抹进行抗-PSYELISA和SBA。在每次注射中，小鼠均接受了lpg的PSY-TT(可溶的无吸附制剂)。使用了表11中所描述的缀合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>结果结果(图1)显示用调整过尺寸的PSY制备的缀合物倾向于具有较高的免疫原性。图1A显示了在对抗血清的ELISA试验中所获得的GMC结果，所述抗血清是为抵抗由天然MenY(ENYTT012)、微流化MenY-40周期(ENYTT014)和微流化MenY-20周期(ENYTT015bis)制成的缀合物而产生的。当MenY-TT是由微流化MenY制成的时，获得了较高的GMCs。当通过SBA试验(图IB)评价抗血清时也获得了类似的结果。同样当使用由微流化MenY制成的缀合物时，获得了较高的GMT值。实施例8-评价MenACWY缀合疫苗中的MenA中的连接物的作用的临床试验在一个1:1:1:1:1的随机试验中，向15-19岁的青少年给药以MenACWY疫苗不同制剂的单剂，所述青少年被分为5个组，每组25名受试者。被试验的制剂是Fl-缀合到破伤风类毒素上的MenACWY，其中MenA缀合物含有AH间隔物-5/5/5/5(igF2-缀合到破伤风类毒素上的MenACWY，其中MenA缀合物含有AH间隔物-2.5/5/2.5/2.5昭F3-缀合到破伤风类毒素上的MenACWY，其中MenA缀合物含有AH间隔物-5/5/2.5/2.5|igF4-缀合到破伤风类毒素上的MenACWY,其中任何缀合物中均没有间P鬲物—5/5/5/5对照组-MencevaxACWY在接种后的第30天，从患者中采集血样。将所述血样用于评价在接种一剂疫苗后一个月时SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW135和SBA-MenY应答者的百分比。疫苗应答被定义为1)对于最初为血清阴性的受试者-在一个月时的接种后抗体滴度^1/32或者2)对于最初为血清阳性的受试者-抗体滴度^4倍的接种前抗体滴度。结果如表13中所显示的，在MenA缀合物中使用间隔物导致抗MenA的免疫应答的增加。当加入了AH间隔物时，应答者所占的百分比由66%增加到90-95%。这反映在SBAGMT由4335增加到10000以及GMC从5增加到20-40上。预想不到的是，AH间隔物的使用还导致了抗MenC的免疫应答的增加，这能够从应答者所占百分比的增加和SBAGMT的增加看出。当引入了间隔物时，还能够看到抗MenY(6742-7122)和抗MenW(4621-5418)的SBA-GMT的增加。60合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1:1.99之间。在MenW疫苗中，MenW糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1:1-1:1.7,1:1.2-1:1.6或1:1.4-1:1.5(w/w)之间。在MenY疫苗中，MenY糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.9,1:1-1:1.8,1:1.1-1:1.6或1:1.3-1:1.4(w/w)之间。在MenA疫苗中，MenA糖与载体蛋白的比例可以在1:2-1:5,1:2.4-1:4,1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间。在MenC疫苗中，MenC糖与载体蛋白的比例可以在5:1-1:1.99,2:1-1:1.99,1.5:1-1:1.8,1.3:1-1:1.6,1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间，或者在1:2-1:5,1:2.5-1:4.5,1:2.7-1:4.3,1:3-1:4或1:3.3-1:3.5(w/w)之间。缀合物中糖与载体蛋白的比例(w/w)是使用灭菌后的缀合物确定的。蛋白的量是使用Lowry试验(例如Lowry等人(1951)J.Biol.Chem.193,265-275或Peterson等人AnalyticalBiochemistry100,201-220(1979))确定的，糖的量对于MenA来说是使用ICP-OES(感应耦合等离子体发射光谱)确定的，对于MenC来说是使用DMAP试验确定的而对于MenW和MenY来说是使用间苯二酚试验(Resorcmolassay)确定的(Monsigny等人(1988)Anal.Biochem.175,525-530)。通过连接物缀合的糖通常比直接缀合到载体蛋白上时具有更高的载体蛋白结合。例如，在本发明的MenAC疫苗中，MenA糖可以通过连接物缀合到载体蛋白上而MenC直接地缀合。在MenCY疫苗中，MenC可以通过连4妻物缀合而MenY直接地缀合。在MenACWY疫苗中，MenA可以通过连接物缀合而MenCWY直接地缀合，或者MenAC可以通过连接物缀合而MenWY直接地缀合。在本发明进一步的方面中，提供了包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白(例如DT,CRM197,蛋白D或TT)上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是在以l:2-l:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。例如，在MenAC疫苗中，可以将MenA以在1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenC以在5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。在MenCY疫苗中，可以将MenC单位组成实施例1的提取物200mg白蜂蜡15mg大豆卵磷脂20mg大豆油215mg实施例5.油性悬液中的提取物的软明皿囊制剂单位组成实施例2的提取物200mg大豆卵磷脂240mg白蜂蜡6mg月见草油215mg实施例6.提取物的硬明M嚢制剂单位组成实施例1的提取物200mg孩t晶纤维素200mg乳糖卯mg二氧化珪5mg硬脂酸镁5mg实施例7.提取物的硬明皿嚢制剂单位组成实施例3的提取物200mgL-半胱氨酸lOOmg微晶纤维素150mg乳糖卯mg二氧化硅5mg<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>权利要求1、一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1∶2-1∶5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5∶1-1∶1.99之间。2、如权利要求1中所述的包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1:2-1:5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1:1.99之间。3、如权利要求1或权利要求2中所述的免疫原性组合物，其中存在MenW并且MenW糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.8、1:1-1:1.7、1:1.2-1:1.6或1:1.4-1:1.5(w/w)之间。4、如权利要求1-3中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenY并且MenY糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.9、1:1-1:1.8、1:1.1-1:1.6或1:1.3-1:1.4(w/w)之间。5、如权利要求1-4中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenA并且MenA糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5、1:2.4-1:4、1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间。6、如权利要求1-5中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenC并且MenC糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.8、1.3:1-1:1.6、1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间。7、如权利要求1-5中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenC并且MenC糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5、1:2.5-1:4.5、1:2.7-1:4.3、1:3-1:4或1:3.3-1:3.5(w/w)之间。8、如权利要求1-7中任意一项所述的包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，而一种或多种不同的糖选自由直接缀合到载体蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组。9、如权利要求8中所述的包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA和MenC组成的第一组，一种或多种不同的糖选自由直接缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW组成的第二组。10、如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenC荚膜糖。11、如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的MenC荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenY荚膜糖。12、如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA和MenC荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenY和MenW荚膜糖。13、如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW荚膜糖。14、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是缀合到载体蛋白上的，所述载体蛋白独立地选自TT、DT、CRM197、TT的C片,殳和蛋白D。15、如前述^又利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是缀合到相同载体蛋白上的，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的C片H和蛋白D。16、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是缀合到TT上的。17、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是分别缀合到单独的载体蛋白上的。18、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物是直接缀合到载体蛋白上的。19、如^又利要求18中所述的免疫原性组合物，其中MenW和/或MenY,MenW和/或MenC,MenY和/或MenC,或者MenW和MenC和MenY是直接缀合到载体蛋白上的。20、如权利要求18或19中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物是通过CDAP化学直接缀合的。21、如权利要求l-20任意一项中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过连接物缀合到载体蛋白上的。22、如权利要求21中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。23、如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。24、如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。25、如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具有反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。26、如权利要求21-25中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。27、如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。28、如权利要求21-27任意一项中所述的免疫原性组合物，其中通过连接物缀合的所述或各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用CDAP化学缀合到连接物上的。29、如权利要求21-28中所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC,缀合到连接物上的。30、如权利要求21-29任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述或各每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连4妻物上的。31、如权利要求21-30任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenA是通过连接物缀合到载体蛋白上的。32、如权利要求21-31任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC是通过连接物缀合到载体蛋白上的。33、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含来自血清群A、C、W135和Y中至少两种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，将所述荚膜糖缀合到载体蛋白上以产生脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸均在50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。34.如权利要求33中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者是用不超过x10的因子调整过尺寸的。35.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种、三种或四种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过微流化调整过尺寸的。36.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是天然多糖。37.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用不超过x10的因子调整过尺寸的。38.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物是由一些天然多糖与用不超过x10的因子调整过尺寸的其它糖的混合物制备的。39.如权利要求38中所述的免疫原性组合物，其中来自血清群Y的荚膜糖是用不超过x10的因子调整过尺寸的。40.如权利要求38或39中所述的免疫原性组合物，其中来自血清群A和C的荚膜糖是天然多糖，而来自血清群W135和Y的糖是用不超过x10的因子调整过尺寸的。41.如权利要求33-40中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的平均尺寸在50kDa到300kDa或者50kDa到200kDa之间。42.如权利要求33-41中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa或者平均尺寸在50-100kDa或55-90kDa或60-80kDa之间的MenA荚膜糖。43.如权利要求33-42中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa或者在100-200kDa、100-150kDa、80-120kDa、90-110kDa、150-200kDa、120-240kDa、140-220kDa、160-200kDa或190-200kDa之间的MenC荚膜糖。44.如权利要求33-43中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa或者在60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa、110-145kDa或120-140kDa之间的MenY荚膜糖。45、如权利要求33-44中所述的免疫原性组合物，其包平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa或者在60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa、140-180kDa、150-170kDa或110-140kDa之间的MenW荚膜糖。46、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各糖缀合物的剂量在2到20昭、3到10pg、4到7貼的糖之间，或者大约(或恰好)为5pg的糖。47、如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其进一步包含缀合到载体蛋白上的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(Hib)。48、如权利要求47中所述的免疫原性组合物，其中所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖是缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上的。49、如权利要求47或48中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是缀合到与至少一种、两种、三种或全部脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物相同的载体蛋白上的。50、如权利要求47-49中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是缀合到TT上的。51、如权利要求47-50中所述的免疫原性组合物，其中在Hib荚膜糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例在l:5到5:1(w/w)之间。52、如权利要求5中l所述的免疫原性组合物，其中在Hib荚膜糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例在1:1到1:4、1:2到1:3.5之间，或者在1:3(w/w)左右。53、如权利要求47-52中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib荚膜糖是通过连接物缀合到载体蛋白上的。54、如权利要求53中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。55、如权利要求53或54中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。56、如权利要求53或54中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。57、如权利要求53或54中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具有反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。58、如权利要求53-57中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。59、如权利要求53或54中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。60、如权利要求47-59任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是使用CNBr或CDAP缀合到载体蛋白或连接物上的。61、如权利要求53-60中所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是使用包含碳二亚胺化学，任选地EDAC化学的方法通过连接物缀合到Hib糖上的。62、如权利要求47-61任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物和至少两种其它的细菌糖缀合物，其中Hib缀合物以比所述至少两种其它细菌糖缀合物的平均剂量低的剂量存在。63、如权利要求62中所述的免疫原性组合物，其中Hib缀合物以比所述至少两种其它细菌糖缀合物中的每一种的剂量低的剂量存在。64、如权利要求62或63中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)缀合物。65、如权利要求62-64任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)缀合物。66、如权利要求62-65任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜#唐(MenA)缀合物。67、如权利要求62-66任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW)缀合物。68、如权利要求62-67任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含衍生自以下菌抹的肺炎球菌荚膜糖，所述菌抹选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。69、如权利要求62-68任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含伤寒杀门氏菌Vi(S.K)荚膜糖。70、如权利要求62-69任意一项中所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的剂量在0.1到91到5jug或2到3pg的糖之间。71、如权利要求62-70任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它糖缀合物中的每一种的剂量在2到20jag、3到10pg或4到7pg糖之间，或者在5pg糖左右或恰好为5pg糖。72、如权利要求62-71任意一项中所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于90%、75%或60%，或者在20%到60%之间或者是50%左右的所述至少两种其它糖缀合物的平均糖剂量。73、如权利要求62-72任意一项所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于90%、75%或60%,或者在20-60%之间或者是50%左右的所述至少两种其它糖缀合物中每一种的糖剂量。74、如权利要求62-73任意一项中所述的免疫原性组合物，其中在Hib缀合物和在两种或两种以上的所述至少两种其它细菌糖缀合物中使用了相同的载体蛋白。75、如权利要求l-74任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制备物或荚膜糖。76、一种疫苗，其包含如权利要求l-75任意一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。77、一种用于伴随或顺序给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫风杆菌、白喉棒杆菌、流感嗜血杆菌以及脑膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病，所述试剂盒包含第一容器，所述第一容器中包含破伤风类毒素(TT),白喉类毒素(DT),和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含如权利要求1-75任意一项所述的免疫原性组合物。78、一种如权利要求76中所述的疫苗的制备方法，其包括将权利要求1-75任意一项所述的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂相混合的步骤。79、一种使人宿主对由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病具有免疫力的方法，其包括向宿主给药以免疫保护剂量的如权利要求1-77所述的免疫原性组合物或疫苗。80、用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病的如权利要求1-75中所述的免疫原性组合物。81、如权利要求1-75中所述的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起疾病的药物中的用途。82、一种包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是在以1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。83、如权利要求82中所述的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，而一种或多种糖是通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上。84、如权利要求83中所述的免疫原性组合物，其中通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖与通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖不同。85、如权利要求83或84中所述的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的羧基基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种糖通过蛋白载体上的氨基基团缀合到载体蛋白上的。86、如权利要求83-85中所述的免疫原性组合物，其中蛋白载体上的第一和第二类化学基团存在于载体蛋白上的单独的B和/或T细胞抗原表位上。87、如权利要求82-86中所述的免疫原性组合物，其中所述糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W荚膜糖(MenW)、B群链球菌I群荚膜糖、B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌m群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B群链球菌V群荚膜糖、金黄色葡萄球菌5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杀门氏菌的Vi糖、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS(例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血杆菌LPS和来自任意荚膜肺炎球菌糖的糖例如来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。88、如权利要求82-87中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。89、如权利要求82-88中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白是TT。90、如权利要求82-89中所述的免疫原性组合物，其包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种所述糖选自由缀合到载体蛋白上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1:2-1:5之间，而一种或多种不同的糖选自由缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5:1-1丄99之间。91、如权利要求90中所述的免疫原性组合物，其中MenW糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.8、1:1-1:1.7、1:1.2-1:1.6或1:1.4-1:1.5(w/w)之间。92、如权利要求90或91中所述的免疫原性组合物，其中MenY糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.9、1:1-1:1.8、1:1.1陽1:1.6或1:1.3-1:1.4(w/w)之间。93、如权利要求90-92任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenA糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5、1:2.4-1:4、1:2.7-1:3.5或1:2.9-1:3.1(w/w)之间。94、如权利要求90-93任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例在5:1-1:1.99、2:1-1:1.99、1.5:1-1:1.8、1.3:1-1:1.6、1.2:1-1:1.4或1.1:1-1:1.2(w/w)之间。95、如权利要求90-94任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例在1:2-1:5、1:2.5-1:4.5、1:2.7-1:4.3、1:3-1:4或1:3.3-1:3.5(w/w)之间。96、如权利要求90-95中所述的免疫原性组合物，其包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种糖选自由MenA和MenC组成的第一组，其中所述MenA和MenC是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖选自由MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中所述MenC、MenY和MenW是通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上的。97、如权利要求96中所述的免疫原性组合物，其中第一类化学基团是蛋白载体上的羧基基团，第二类化学基团是蛋白载体上的氨基基团。98、如权利要求96或97中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的MenA和通过第二类化学基团缀合的MenC。99、如权利要求96-98中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的MenC和通过第二化类学基团缀合的MenY。100、如权利要求96-99中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的MenA和通过第二类化学基团缀合的MenC、MenY和MenW。101、如权利要求96-99中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的MenA和MenC以及通过第二类化学基团缀合的MenY和MenW。102、如权利要求96-101中所述的免疫原性组合物，其进一步包含缀合到载体蛋白上的来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖(Hib)。103、如权利要求102中所述的免疫原性组合物，其中Hib是缀合到与脑膜炎奈瑟氏球菌糖同类的载体蛋白上的。104、如权利要求10中所述的免疫原性组合物，其中Hib是通过第一或第二类化学基团缀合到载体蛋白上的。105、如权利要求82-104中所述的免疫原性组合物，其中以1:2-1:5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的一种或多种糖(例如MenA和/或MenC)是通过连接物缀合的。106、如权利要求105中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。107、如权利要求105或106中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。108、如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。109、如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。110、如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。111、如权利要求105-108中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。112、如权利要求105-111中所述的免疫原性组合物，其中通过连接物缀合的各荚膜糖是用CDAP化学缀合到连接物上的。113、如权利要求105-112中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC,缀合到连接物上的。114、如权利要求105-113中所述的免疫原性组合物，其中所述或各荚膜糖是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连接物上的，或者所述连接物是在其缀合到载体蛋白上之前缀合到糖上的。115、如权利要求82-1]4中所述的免疫原性组合物，其中以5:1-1:1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的一种或多种糖(例如MenY、MenW和/或MenC)是直接缀合的。116、如权利要求82-115中所述的免疫原性组合物，其是如权利要求1-75所述的免疫原性组合物。全文摘要本申请公开了一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在1∶2-1∶5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在5∶1-1∶1.99之间。文档编号A61K39/095GK101222935SQ200680023149公开日2008年7月16日申请日期2006年6月23日优先权日2005年6月27日发明者C·卡皮奥,D·布特里奥,J·普尔曼,P·德内尔,P·迪维维耶,R·L·比曼斯申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司