专利名称：鲨鱼软骨萃取物及其制法的制作方法
技术领域：
本发明是有关动物软骨萃取物，尤指一种含8KDa至25Kda的鲨鱼软骨萃取组成物及其制法及用途。
鲨鱼软骨萃取组成物对多种疾病具有疗效为已知知识，例如参见美国第3895103、5075112、5562535、5618925、5843920、5888514号专利。其中用于抗新生血管作用及／或抑制肿瘤的为第5075112、5618925、5843920号专利，其中第5075112号专利是以鲨鱼软骨切细后，直接使用，并未萃取其有效成份；第5618925号专利是萃取后的固态有效成份，其分子量分别为1～2．5KDa，5．3～6．25KDa，7．29～7．94KDa，29KDa，35KDa，48KDa，60KDa，60～70KDa，70～120KDa等有效成份或其组合；而第5843920号专利是以鲨鱼软骨的蛋白质和外加的寡醣(oligosaccharide)所形成的复合物(complex)作为有效成份；其均和本发明是以鲨鱼软骨萃取物中分子量为约10KDa和约14KDa作为有效成份不同。此外，涉及鲨鱼软骨的处理或萃取的专利有第5562535、5618925和5843920号专利，其中第5562535号专利是单纯取用鲨鱼软骨，但在干燥脱水时以声波(sound waves)取代加热，其未萃取或分离鲨鱼软骨的有效成份；第5618925号专利在约4℃的低温下萃取鲨鱼软骨，得萃取后固态物和粗萃液，再由该粗萃液中分离分子量为1～2．5KDa，5．3～6．25KDa、7．29～7．94KDa、29KDa、35KDa、48KDa、60KDa、60～70KDa和70～120Kda的有效成份，该方法必须在约4℃下进行萃取，较适用于实验室，并不适合工业化生产；第5843920号专利，是以寡醣和鲨鱼软骨形成错合物，必要时，再以无机盐自该错合物中分离抗新生血管作用的蛋白质。
本发明的目的之一，在于提供一种鲨鱼软骨萃取组成物。
本发明的另一目的，在于提供一种鲨鱼软骨萃取组成物的制法。
本发明的再一目的，在于提供一种可以用抗新生血管作用的鲨鱼软骨萃取组成物。
本发明的又一目的，在于提供一种可用于抑制肿瘤的鲨鱼软骨萃取组成物。
本发明是在室温条件下萃取鲨鱼软骨，去除固态物，得粗萃液，再由粗萃液中分离含8KDa～25Kda的有效成份，其有效成份不同于上述目前技术的有效成份，其萃取方法也不同上述目前技术。
本发明鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其包括(a)以不致使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨碎片数小时至数天，分离固态物，得粗萃液；(b)由粗萃液中分离分子量为8KDa至25Kda的有效成份；其特征在于步骤(a)的萃取温度为室温。
步骤(a)可使用任意不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液，例如含胍(guanidine)的水溶液，含MES[即2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]的水溶液，其混合物或组成物的水溶液，其个别衍生物的水溶液，其个别盐类(例如胍·HCl)的水溶液，或其衍生物及或盐类的混合物或组成物的水溶液。即胍衍生物的水溶液、胍的酸式盐的水溶液、MES衍生物的水溶液或MES碱金属盐的水溶液，或其混合物或组成物的水溶液；含胍或其衍生物或盐类，及MES或其衍生物或盐类的水溶液。
为了使步骤(a)能在室温下进行萃取，以采用含胍和MES的水溶液萃取鲨鱼软骨为较佳，以含0．1M以上胍和0．005M至0．1M的MES的水溶液为更佳。而所谓室温，意指萃取时无需刻意加温或冷却下的环境温度，或相近的温度。当然步骤(a)也能在低温冷却或加热升温下进行，但温度降低将使萃取速度变慢，而过度加热，将使鲨鱼软骨变性，一般而言，以10℃至40℃为较佳。由于本制法过程可在室温下进行萃取，使得本制法过程的产量大幅提高。
上述步骤(a)之后，宜以超滤法滤除该粗萃液中的杂质，再以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物。其中该无机酸可为任意适用的无机酸，以硫酸、盐酸为较佳，而酸化后的pH值以1．0至3．0为较佳。
上述酸化并去除杂质后的粗萃液，宜以无机碱中和，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，使其pH值为6．0至9．0，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液，其中该无机碱可为任意适用的无机碱，以碱金属的氢氧化物为较佳。
上述中和后并去除杂质后的粗萃液，宜加铵盐，使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物，至铵盐成30wt％(重量百分比)的低饱和度，弃置固体，继续加入该铵盐至铵盐成30wt％以上的高饱和度(以35wt％以上为较佳，以40wt％以上为更佳)，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，取其固体，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中，其中该铵盐以硫酸铵或氯化铵为较佳。
以不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液使上述经铵盐处理后的固体溶解，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或盐类以水溶液为较佳，以含胍的水溶液为更佳，以含胍和Tris-HCl pH为6．0至9．0的缓冲液为较佳。
上述步骤(b)的分离方法，可采用层析法，电泳法(electrophoresis)或凝胶过滤法(gel filtration)，或类似的分离方法，或其组合方法，以层析法为较佳。
本发明由鲨鱼软骨萃取的有效成份，有别于传统已知分子量分别为1～2．5KDa，5．3～6．25KDa、7．29～7．94KDa、29KDa、35KDa、48KDa、60KDa、60～70KDa和70～120Kda的有效成份。本发明鲨鱼软骨萃取组成物的有效成份，其分子量为8KDa至25KDa，以含分子量约10KDa及／或14Kda的有效成份为较佳。
本发明含分子量8KDa至25KDa有效成份的鲨鱼软骨萃取组成物，其是将以不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨所得的粗萃液，是利用层析法分离所得；具有抗新生血管作用及／或抑制肿瘤功能，必要时，可取有效量的上述有效成份，配成抗新生血管作用及／或抑制肿瘤的组成物。该抗新生血管作用及／或抑制肿瘤组成物的有效成份，以含分子量约10KDa和约14Kda的有效成份为较佳。
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述，这些较佳实施例并非用以限制本发明的申请专利范围。
图1为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的SDS／PAGE图。
图2为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的抑制HUVEC移动效益图。
图3为本发明鲨鱼软骨萃取组成物抑制HUVEC增生的效益图。
图4为本发明鲨鱼软骨萃取组成物抑制胶原分解活性的作用图。
图5为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的抗新生血管作用图。
图6为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的抑制肿瘤细胞生长的效益图。
图7为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的抑制肿瘤细胞转移的效益图。
图8为本发明鲨鱼软骨萃取组成物的抑制肿瘤细胞转移的效益图。
SDS／PAGE(Sodium dodecyl sulfate／polyacrylamide gel-electrophoresis)是以聚丙烯醯胺凝胶(polyacrylamide gel)，配合标准蛋白质来评断本发明产物的分子量。其于电泳后，以10％(重量／体积比)的戊二醛预固定(pre-fixed)凝胶30分钟，并以CBB(Coomassie Brilliant Blue)染色1小时，而后使之脱色。并以标准蛋白质评断本发明产物的分子量。
细胞培养由台北疾病防治研究所(Institute of Preventive Medicine)取得B16-F10老鼠黑瘤细胞，使其在含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1％L-谷醯胺(glutamine)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，经Dulbecco改良过的Eagle介质)中生长。在融合前，将细胞转种并取出供实验使用。Sacoma-180(肉瘤-180)，一种老鼠肉瘤，其是以腹膜(ip)转种方式移种于ICR老鼠。为了测得抗肿瘤活性，将sarcoma-180细胞以皮下移种方式移种于ICR老鼠背部。
细胞移动分析(cell migration assay)
其是依Leavesley DI，Ferguson GD，Wayner EA和Cheresh DA等人在J．CellBio1．，117，1101-1107(1992)所述方法稍作改变用6．5mm，8．0mm孔隙(pore size)的穿源嵌体(Transwell inert，购自Costar公司)进行细胞转移分析，但稍作修正如下将可溶性纤维结合素(fibronectin)加于20Mm Hepes(购自Sigma公司)pH7．45，150mM NaCl，1．8mM CaCl2，1．8Mm MgCl2，5mM KCl，和5mM葡萄糖(HBS)中予以稀释，并置于含24凹孔板(24-well plate)的穿源嵌体中，并按在置入细胞前，于37℃放置30分钟。以胰蛋白(trypsin)／EDTA收取稍早通过的HUVEC，流涤，并使悬浮于1*106细胞／毫升的附着缓冲液中。在37°下，于不同培养时间测其细胞移动。-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取以10ng／ml肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNFα，购自Sigma公司)，配合或不加本发明产物，于24凹孔板培育HUVEC48小时和72小时，在最后8小时，每孔加入5μCi的[甲基-3H]胸腺嘧啶脱氧核苷，分离细胞，并以磷酸盐缓冲的食盐水PBS洗涤3次，测[甲基-3H]胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量。
CAM(chicken chorioallentoic membrane，鸡胚胎绒毛尿囊膜)分析在37℃和60％温度下培育10天大的鸡胚胎，在蛋的气囊处，打一穿透壳的孔，在宽边打第二个孔，施负压于原孔，将CAM由壳膜取出，再制一伪气囊，并有一个1．0cm*1．0cm方孔，以便存取CAM。注射200μl的TNFα(5ng／ml)于CAM中。24小时后，注射100μl含或不含本发明产物的HBSS(Hank’s balanced salt solution)100μl。二天后，以Olympus公司的SZ-PT型显微镜观察。
胶原酶抑制剂分析(collagenase inhibitor assay)依Van Wart HE and steinbrink DR，Anal．Biochem．113，356～365，1981．所述方法稍加修正使100mg FALGPA(购自Sigma公司)溶于2ml甲醇中。检验缓冲液含0．05M Tricine，0．4M NaCl，0．01M CaCl2和0．02％NaN3，pH为7．5。分析基质是加10μl FALGPA于990μl的FALGPA缓冲液。检验时，加入胶原酶(50μg／ml)，媒介溶液(vehicle solution，PBS)、及待测物，于25℃培育3小时。再以岛津(Shimadzu)公司的UV-1601分光光度计，于25℃测345nm(0．D．345)的光强度(optical density)。
肿瘤细胞生长分析将Sarcoma-180细胞(4×106)植入老鼠背部，于肿瘤移植3天后，口服或注射本发明产物或PBS，分别为每天一次(QD)、每天二次(BID)和每天四次(QID)，20天期间测其肿瘤直径。
肿瘤细胞转移分析将4×105黑色素肿瘤细胞(B16-F10老鼠)缓慢地注射到C57BL／6老鼠(6～7周大)的侧静脉，而后，口服或注射本发明产物或PBS(每天一次)，14天后，杀鼠取肺，并置于10％甲醛中，以Olympus公司的SZ-PT显微镜，计算表面的黑色素肿瘤集落。实施例1将鲨鱼鳍切成小片状，并在32℃下，以含1M胍和0．02M的MES的水溶液萃取3天，并微微搅拌。取800克萃取液在4℃下离心4小时，取上浮液。以Millipore公司的PSAC薄膜进行3-KDa切除(cutoff)超滤，去除胍-HCl(guanidine-HCl，胍的盐酸盐)。再逐滴加入1N盐酸至pH=2．0，于20000xg下离心30分钟，去除固体，再逐滴加入1N氢氧化钠至pH=7．6，于20000xg下离心30分钟，去除固体。加硫酸铵于该萃液中，至饱和度为25wt％，于1800xg下离心30分钟，去除固体后，继续加入硫酸铵至60wt％饱和度为止。使所得固体溶于0．01M Tris-HCl(三羟甲基胺基甲烷-盐酸缓冲液，trihydroxymethyl-amino-methane-HCl buffer)，并含2M胍-HCl，0．001M氯化钙和0．02％叠氮化钠的水溶液中。以默克(Merck)公司的Fractogel TSK HW-50管柱进行层析分离。其中该管柱预先以0．1M氯化钠水溶液达成平衡，并以0．1MNaCl溶液冲提，以每管4毫升方式收集。在5℃下，以LKB UVicord仪器连续监控280nm。以CAM(chicken chorioallantoic membrane，鸡胚胎绒毛尿囊膜)检验方式监测初步纯化期间的抗新生血管作用活性，结果发现第14至25管确具抗新生血管作用活性。实施例2收集实施例1中第14至15管的冲提份，并在导入瑞典Pharmacia公司的Sephadex G-75管柱中，以蒸馏水冲提使其去盐。使这些抗新生血管作用冲提份低压冻干后，用Merck公司的CM-Sephadex C-50管柱，在下述条件下以醋酸铵进行三段式梯度冲提(gradient elution)(1)0．05M醋酸铵(pH=5．0)，250ml(2)0．05M酸酸铵(pH=5．0)至0．5M醋酸铵(pH=6．8)，500ml。
(3)0．6M醋酸铵(pH=8．0)，700ml。
在4℃下以每管3ml收集冲提物(eluate)。将第78至85管冻干并除盐，而后以Sephadex G-75进行层析分离；以0．01M碳酸氢铵溶于4℃下进行冲提，以每管3ml方式收集冲提物，其中第12至18管(终产物)在SDS／PAGE(SDS十二烷基碳酸钠，sodium dodecyl sulfate，PAGE聚丙烯醯胺凝胶电泳，polyacrylamide gel-electrophoresis)下显示其含10KDa和14KDa肽带(peptide band)，参见图1。图1中，第1栏(1ane 1)、第2栏、第3栏分别表示第12至18管冲提物在15％聚丙烯醯胺凝胶(polyacrylamide gel)、还原系统(reduced system)和非还原系统(nonreduced system)中的SDS／PAGE图，第1栏中显示其含10KDa和14KDa的肽带。实施例3～5使实施例2的终产物分别依表1条件溶于磷酸盐缓冲的食盐水PBS(phosphate-buffered saline)中，测其HUVEC移动，结果如图2所示，显示该终产物在离体实验中确能有效抑制HUVEC移动。表1
实施例6～9使实施例2的终产物分别依表2条件溶于PBS中，并测其对HUVEC摄取[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷的影响，结果如图3所示，显示该终产物对HUVEC具有抗增生效果(anti-proliferation effect)表2
实施例10～13以PBS为溶剂，实施例2的终产物对抑制胶原蛋白的作用活性依表3浓度配制溶液，利用在0．D．345nm读数的降低，监测FALGPA的水解，每30分钟测定一次至3小时为止，结果如图4，显示该终产物具有抑制胶原蛋白酶活性。表3浓度单位ug／ml
实施例14～16以200ml购自Sigma化工公司(Sigma Chem．Co．)的TNFa(tumor necrosisfactor-α)注入10天大的鸡胚胎绒毛尿囊膜中，24小时后(a)注入HBSS缓冲液(实施例14，对照组)，而(b)和(c)分别注入实施例2的终产物30μg／ml(实施例15)和50μg／ml(实施例16)，结果分别如图5(a)、5(b)、5(c)所示，显示该终产物确具抗新生血管作用能力，且无毒性。μg／ml实施例17～20以实施例2的终产物依表4方式进行sarcoma-180肿瘤细胞生长药效试验，结果如图6所示，显示注射该终产物能有效抑制肿瘤细胞的生长(参见实施例21～24)，而口服则效果较差。
表4(每次200)
实施例21～24同实施例17至20，但口服改注射，结果如图6，显示该终产物对抑制肿瘤有效，其减少肿瘤细胞的体积分别为34％(QD)，68％(实施例23)和85％(实施例24)。实施例25～27将B16-F10老鼠黑色素肿瘤细胞(melanoma cells)经静脉注入C57BL／6老鼠体内，依下表方式观测黑色素肿瘤细胞转移现象，结果如图7和图8所示，显示口服效果较差，而注射效果则明显有效。
表权利要求
1．一种鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其包括(a)以不致使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨碎片数小时至数天，分离固态物，得粗萃液；(b)由粗萃液中分离分子量为8KDa至25Kda的有效成份；其特征在于步骤(a)的萃取温度为室温。
2．如权利要求1所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍的水溶液、胍衍生物的水溶液、胍的酸式盐的水溶液、MES的水溶液、MES衍生物的水溶液或MES碱金属盐的水溶液，或其混合物或组成物的水溶液。
3．如权利要求2所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或盐类，及MES或其衍生物或盐类的水溶液。
4．如权利要求3所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍和MES的水溶液。
5．如权利要求4所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含0．1M以上胍和0．005M至0．1M的MES的水溶液。
6．如权利要求1、2、3、4、或5所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于步骤(a)后，以超滤法去除该粗萃液中部分杂质。
7．如权利要求6所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于超滤后，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
8．如权利要求7所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
9．如权利要求8所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
10．如权利要求9所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
11．如权利要求10所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
12．如权利要求11所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
13．如权利要求7所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
14．如权利要求10所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
15．如权利要求11所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
16．如权利要求12所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
17．如权利要求1，2，3，4或5所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于超滤后，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
18．如权利要求17所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
19．如权利要求18所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
20．如权利要求19所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
21．如权利要求20所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
22．如权利要求21所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
23．如权利要求17所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
24．如权利要求20所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
25．如权利要求21所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
26．如权利要求22所述的鲨鱼软骨萃取组成物的制法，其中步骤(b)是以层析法分离该含8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取物。
27．一种含有效成份分子量为8KDa～25Kda的鲨鱼软骨萃取组成物，其是将以不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨所得的粗萃液，利用层析法分离所得者。
28．如权利要求27所述的组成物，其中该鲨鱼软骨萃取组成物所含的有效成份是分子量为10KDa及／或分子量为14Kda的有效成份。
29．如权利要求28所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍的水溶液、胍衍生物的水溶液、胍的酸式盐的水溶液、MES的水溶液、MES衍生物的水溶液或MES碱金属盐的水溶液，或其混合物或组成物的水溶液。
30．如权利要求29所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或盐类，及MES或其衍生物或盐类的水溶液。
31．如权利要求30所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍和MES的水溶液。
32．如权利要求31所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含0．1M以上胍和0．005M至0．1M的MES的水溶液。
33．如权利要求28、29、30、31或32所述的组成物，其于层析分离前，先以超滤法去除该粗萃液中部分杂质。
34．如权利要求33所述的组成物，其于超滤后，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
35．如权利要求31所述的组成物，其该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
36．如权利要求35所述的组成物，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
37．如权利要求36所述的组成物，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
38．如权利要求37所述的组成物，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
39．如权利要求38所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
40．如权利要求28、29、30、31或32所述的组成物，其于层析分离前，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
41．如权利要求40所述的组成物，其中该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
42．如权利要求41所述的组成物，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
43．如权利要求42所述的组成物，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
44．如权利要求43所述的组成物，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
45．如权利要求44所述组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
46．一种抗新生血管作用及／或抑制肿瘤的组成物，其是含有效量的鲨鱼软骨萃取组成物，其特征在于该鲨鱼软骨萃取组成物是以不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨所得的粗萃液，分离分子量为8KDA～25KDA的有效成份。
47．如权利要求46所述的组成物，其中该分离方法为层析法。
48．如权利要求47所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍的水溶液、胍衍生物的水溶液、胍的酸式盐的水溶液、MES的水溶液、MES衍生物的水溶液或MES碱金属盐的水溶液，或其混合物或组成物的水溶液。
49．如权利要求48所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或盐类，及MES或其衍生物或盐类的水溶液。
50．如权利要求49所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍和MES的水溶液。
51．如权利要求50所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含0．1M以上胍和0．005M至0．1M的EMS的水溶液。
52．如权利要求47、48、49、50或51所述的组成物，其于层析分离前，先以超滤法去除该粗萃液中部分杂质。
53．如权利要求52所述的组成物，其于层析分离前，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
54．如权利要求53所述的组成物，其该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
55．如权利要求54所述的组成物，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
56．如权利要求55所述的组成物，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
57．如权利要求56所述的组成物，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
58．如权利要求57所述的组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
59．如权利要求47、48、49、50或51所述的组成物，其于层析分离前，先以无机酸酸化，并去除酸化后产生的固态物，再以无机碱中和酸化后的粗萃液，并去除固态物，得实质上为中性的粗萃液。
60．如权利要求59所述的组成物，其中该无机酸为硫酸或盐酸，酸化后的pH值为1．0至3．0，而该无机碱为MOH，其中M为碱金属，而中和后的pH值为6．0至9．0。
61．如权利要求60所述的组成物，其于该实质上中性的粗萃液，再加铵盐使其成低饱和度的铵盐溶液，并去除固态物。
62．如权利要求61所述的组成物，其中该铵盐为硫酸铵或氯化铵，而低饱和度为30wt％以下。
63．如权利要求62所述的组成物，其于低饱和度的铵盐溶液中，进一步加入该铵盐，形成高饱和度的铵盐溶液和固态物，分离该固态物，并使该固态物溶于不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液中。
64．如权利要求63所述组成物，其中该不致于使鲨鱼软骨变性的水溶液为含胍或其衍生物或其盐类的水溶液。
全文摘要
本发明是有关动物软骨萃取物,尤指一种含8KDa至25Kda的鲨鱼软骨萃取组成物及其制法及用途。其包括:(a)以不致使鲨鱼软骨变性的水溶液萃取鲨鱼软骨碎片数小时至数天,分离固态物,得粗萃液;(b)由粗萃液中分离分子量为8KDa至25Kda的有效成份;其特征在于:步骤(a)的萃取温度为室温。具有抗新生血管作用及/或抑制肿瘤功能,或取有效量的上述有效成份,配成抗新生血管作用及/或抑制肿瘤的组成物。该抗新生血管作用及/或抑制肿瘤组成物的有效成份,以含分子量约10KDa和约14Kda的有效成份为较佳。
文档编号C07K1/14GK1283628SQ9911126
公开日2001年2月14日 申请日期1999年8月4日 优先权日1999年8月4日
发明者张家福, 许准榕, 庄伟哲, 蔡美丽 申请人:国强药品股份有限公司