免疫原性组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包括来自脑膜炎奈瑟菌血清群X的荚膜多糖的一种免疫原性多糖蛋白质结合物，以及用来制备所述结合物的方法。本发明涉及由结合反应制备的脑膜炎奈瑟菌X糖-载体蛋白质结合物。因此，本发明涉及多价脑膜炎球菌多糖蛋白质结合组合物，其包括来自血清群X的荚膜糖和来自A、C、W135、Y中的至少一个荚膜糖，其中：i)多糖A C W135 X被机械地分级，而多糖Y被化学地分级；ii)，通过具有氰基化结合化学物质(cyanylation conjugation chemistry)的连接体(linker)将全部的糖都结合到载体蛋白；iii)在最终的结合物中所有的糖与蛋白质的比例为0.2-0.6；并且iv)使用选自TT、DT和CRM197至少两种不同的载体蛋白质。
【专利说明】免疫原性组合物
【背景技术】
[0001] 脑膜炎奈瑟菌（脑膜炎球菌）（Neisseriameningitidis(meningococcus))是革 兰氏阴性人类病原体。其寄生在咽部，引起脑膜炎并且偶尔在不引起脑膜炎的情况下引起 败血症。脑膜炎球菌与淋球菌（N.gonorrhoeae)非常相近，尽管脑膜炎球菌有别于淋球菌 的一个特征为存在多糖荚膜，这是一种在所有致病性脑膜炎球菌中都出现的多糖荚膜。基 于生物体的荚膜多糖，已经确定了脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis)的十二个血清群（A、B、 C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。
[0002] 血清群A("MenA"）是在非洲撒哈拉以南地区流行病的最常见的病因。血清群B&C 是造成发达国家的大多数病例的原因，其余的情况是由血清群W135&Y引起的。
[0003] 仅利用多糖（PS)的疫苗具有相对低的免疫原性。为了克服多糖的相对低的免疫 原性，将PS疫苗与蛋白质载体结合，以增加免疫原性，并提供对年幼儿童的长期保护。许多 脑膜炎球菌结合疫苗已经被批准并推向全世界市场。这种疫苗的例子，已知的被称为〃脑 膜炎奈瑟菌结合物"的为单价脑膜炎球菌A结合物（MenAfriVac)、单价脑膜炎球菌C结合 物（Meningitec)和四价ACYW脑膜炎球菌结合疫苗（Menveo&Menactra)。
[0004] 和用于分类一样，荚膜多糖已经被用于预防接种。一种来自血清群A、C、Y&W135的 荚膜多糖的可注射四价疫苗已公知多年，并且被获准使用于人类。虽然对青少年和成人是 有效的，但是其引起弱的免疫反应和短期的保护，并且不能用于婴儿。一旦MencevaxACWYtm 和Menomune?从它们的冻干形式中被重构，就都包含50yg的纯化多糖。血清群A、C、W135&Y 的荚膜糖也已经以结合物的形式被结合，获得四价疫苗，例如无佐剂的Menactra?产品。并 且，结合的血清群A多糖已经被批准作为MenAfriVac?供人类使用，血清群C低聚糖已经被 批准作为Menjugate?、Meningitec? 和NeisVac-C? 供人类使用。
[0005] 脑膜炎奈瑟菌血清群X菌株在二十世纪六十年代首次被描述，并且已经从北美、 欧洲、澳大利亚和中国的几例侵入性脑膜炎球菌病中分离出来。脑膜炎奈瑟菌血清群X 菌株的爆发已经在尼日尔、肯尼亚西部和北部加纳被报道。，在当中，脑膜炎奈瑟菌血清群 X菌株被报道能十分高效的寄生在英国的新兵中。参见=AbdullahKilic等，Neisseria meningitidisSerogroupXSequenceType767inTurkey;JournalOfClinical Microbiology，2010 年 11 月，第 4340 - 4341 页；第 48 期，第 11卷。。
[0006] 据报道，在许多非洲国家的重复大量的疫苗接种可能会促进血清群X菌株寄生和 由于血清群X血清群X菌株的脑膜炎球菌疾病，并可能导致脑膜炎球菌病的特点发生改变。 参见：Gagneux,S.P等，ProspectivestudyofaserogroupXNeisseriameningitidis outbreakinnorthernGhana.J.Infect.Dis. 185:618 - 626 ;2002〇
[0007] 血清群B、C、Y和W135脑膜炎球菌的荚膜多糖由唾液酸衍生物组成。血清群B 和C脑膜炎球菌分别表达（α2-8)_连接的和（α2-9239)连接的聚唾液酸，同时D-葡 萄糖或D-半乳糖与唾液酸的交错序列由血清群Y和W135脑膜炎奈瑟菌表达。与此相 反的是，血清群A脑膜炎球菌的荚膜由（α1-6)-连接的N-乙酰甘露糖胺6-磷酸组成， 同时脑膜炎奈瑟菌血清群X合成（α1-4)-连接的N-乙酰甘露糖胺1-磷酸的荚膜聚合 物° 参见：Yih-LingTzeng等；GeneticBasisforBiosynthesisofthe(134)-Linked N-Acetyl-D-Glucosamine1-PhosphateCapsuleofNeisseriameningitidisSerogroup X!InfectionAndImmunity, 2003 年 12 月，第 6712 - 6720 页；第 71 期，第 12 卷。
[0008] 现有的脑膜炎球菌结合疫苗基于ACYW135多糖。在过去5年里非洲脑膜炎地带中 MenX疾病的发生率的增长[1，4]使得在该地区的选定区域开发和引入MenX多糖结合疫苗 以防止并控制未来的流行变得必要。尽管在早些时候已经被报道。尽管全面的血清阳性率 和脑膜炎球菌X的结构数据是可获得的，但是由于在净化、结合与制剂稳定性方面的成功 是极其有限的，因此含有X多糖的商业上可行的结合疫苗仍待开发。这为成功地处理和控 制各项参数，尤其是当使用可扩展的结合方法用于大规模生产含有脑膜炎奈瑟菌X多糖的 脑膜炎奈瑟菌结合物提供了额外的挑战。
[0009] 本发明源自以下出乎意料的发现：通过利用可扩展的且高效的结合方法使得制备 基于来自血清群X的脑膜炎球菌多糖结合物的单价或多价免疫原性组合物成为可能。
【发明内容】
[0010] 本发明涉及由结合反应制备的脑膜炎奈瑟菌X糖载体蛋白结合物，所述结合反应 包括：i)对多糖进行分级；ii)对具有IOOKda至150Kda平均分子量的分级多糖，在9至9. 5 的pH下进行基于CPPT的活化；iii)在2-3分钟的持续时间后添加ADH，然后培养4-20小 时；iv)渗滤，以去除未反应的ADH;以及V)在MES缓冲液和EDAC存在下，将ADH活化的多 糖与纯化的未活化载体蛋白以0. 75-1. 5的比例进行反应，然后培养3-4小时，特征在于：所 述结合反应在2-8°C的温度下进行获得20%到约30%的结合物产量，并且在最终的结合物 中的糖与蛋白比例为0. 2到0. 6。
[0011] 另外，脑膜炎奈瑟菌糖载体蛋白结合物也可以通过以下的结合反应来制备：i)对 多糖进行分级；ii)对具有IOOKda至150Kda平均分子量的分级多糖，在9至9. 5的pH下 进行基于CPPT的活化；iii)在2-3分钟后以糖：蛋白质为0. 5-2的比例添加ADH活化的蛋 白质，然后培养2-20小时，特征在于：所述结合反应在22°C-25°C进行获得5 %到约10 %的 结合物产量。
[0012] 因此，本发明涉及多价脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物组合物，其包括来自血清群X 的荚膜糖和来自血清群A、C、W135、Y中的至少一个荚膜糖，其中：i)多糖ACW135X被机械 地分级，而多糖Y被化学地分级；ii)，通过具有氰基化结合化学物质的连接体将全部的糖 都结合到载体蛋白；iii)在最终的结合物中所有的糖与蛋白质的比例为〇. 2-0. 6 ;并且iv) 使用选自TT、DT和CRM197至少两种不同的载体蛋白质。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为在MenXPs(215KDa)结合到肼衍生的TT时的结合反应的叠加图；
[0014] 图2为在MenXPs(215KDa)结合到肼衍生的TT时的纯化结合物；
[0015] 图3为在MenXPs(326KDa)结合到ADH衍生的TT时结合反应的叠加图；
[0016] 图4为在MenXPs(326KDa)结合到ADH衍生的TT时的纯化结合物；
[0017] 图5为在MenXPs(120KDa)结合到ADH衍生的TT时结合反应的叠加图；
[0018] 图6为在MenXPs(120KDa)结合到ADH衍生的TT时的纯化结合物；
[0019] 图7为本地脑膜炎球菌X多糖的色谱图；
[0020] 图8为在用ADH活化的MenXPs(510KDa)结合到纯化的TT时结合反应的叠加 图；
[0021] 图9为在用ADH活化的MenXPs(510KDa)结合到纯化的TT时的纯化结合物；
[0022] 图10为在用ADH活化的MenXPs(250KDa)结合到纯化的TT时结合反应的叠加 图；
[0023] 图11为在用ADH活化的MenXPs(250KDa)结合到纯化的TT时的纯化结合物。
【具体实施方式】
[0024] "多价免疫原性组合物"是指：
[0025] 组合物1包括：(a) (i)血清群A脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的 结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；（c) (i)血 清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)白喉类毒素的结合物；(d) (i)血清群W135脑膜炎奈 瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜 糖与（ii)破伤风类毒素的结合物。
[0026] 组合物2包括：(a) (i)血清群A脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的 结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c) (i)血清群 Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟 菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物。
[0027] 组合物3包括：（a) (i)血清群A脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物； (b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c) (i)血清群Y脑膜炎 奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜 糖与（ii)CRM197的结合物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类 毒素的结合物，其特征在于：含有破伤风类毒素作为载体蛋白质的结合物被发现能够增强 含有CRM197作为载体蛋白质的结合物的免疫原性。
[0028] 组合物4包括：(a) (i)血清群A脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的 结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c) (i)血清群Y 脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜 糖与（ii)CRM197的结合物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类 毒素的结合物。
[0029] 组合物5包括：（a) (i)血清群A脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物； (b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c) (i)血清群Y脑膜炎奈 瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结 合物。
[0030] 因此在第一实施例中，所述组合物可以包括，含量为每0.5毫升剂量中 0· 5-10μg、0. 5-5μg或 0· 5-2μg的血清群A、C、Y、W135 以及X糖。
[0031] 第一实施例的另一个方面为，所述组合物可以包括：1〇μg的血清群A糖、5μg的 血清群C糖、5μg的血清群Wl35糖、5μg的血清群Y糖以及5μg的血清群X糖。
[0032] 替换的，所述多价免疫原性组合物可以包括：5μg的血清群A糖、5μg的血清群C 糖、5μg的血清群Wl35糖、5μg的血清群Y糖以及5μg的血清群X糖。
[0033] 因此在第二实施例中，所述一个或多个脑膜炎奈瑟菌糖结合物可以被选择性地吸 附到氢氧化铝、磷酸铝或二者的混合物上，或者不被吸附到佐剂上。
[0034] 第二实施例的一个方面为，所述铝盐佐剂可以每0. 5毫升剂量中Al+++为 20-300μg、20-200μg、25-150μg的量添加。
[0035] 第二实施例的另一个方面为，所述铝盐佐剂可以每0. 5毫升剂量中Al+++为 25-125μg的量添加。
[0036] 本发明的第三实施例为，所述组合物可以包括选自硫柳汞和2-苯氧基乙醇的防 腐剂。
[0037] 第三实施例的一个方面为，所述组合物可以进一步包括：磷酸钠、氯化钠或或其组 合。
[0038] 本发明的第四实施例为，所述多价免疫原性组合物可以为缓冲液体的形式或冻干 的形式。
[0039] 第四实施例的一个方面为，所述冻干免疫原性组合物可以包含选自以下的稳定 剂组合：a) 2至5% (w/v)的海藻糖、0.25至0.75 %的朽1檬酸钠；b) 2至5% (w/v)的鹿糖 和0· 25至0· 75%的柠檬酸钠；c)2至5% (w/v)的蔗糖、2至5% (w/v)的乳糖和0· 25至 0. 75%的柠檬酸钠；以及d) 2至5% (w/v)的海藻糖、2至5% (w/v)的乳糖和0. 25至0. 75% 柠檬酸钠。
[0040] 第四实施例的另一个方面为，所述冻干免疫原性组合物可以进一步包含选自三羟 甲基氨基甲烷和磷酸盐中的缓冲剂。
[0041] 因此，在第五实施例中，所述多糖ACW和X可以被机械地分级，从而具有 100-600Kda、100-400Kda、优选100-200Kda、最优选100-150Kda的平均分子量。优选诸如均 质化、高压微射流细胞粉碎的机械分级方法。
[0042] 在第五实施例的另一个方面中，可以通过选自酸水解、碱性降解、高碘酸盐氧 化、臭氧分解、酶促水解、超声处理、电子光束破裂的方法，来将所述多糖Y分级为具有 90-110KDa的平均分子量。优选地，化学分级是通过利用温度为从60°C到80°C的醋酸钠进 行的。
[0043] 在第六实施例中，通过具有氰基化结合化学物质的异源或同源双功能连接体，将 每种脑膜炎奈瑟菌糖结合到载体蛋白上。
[0044] 在第六实施例的一个方面中，通过利用选自以下、但不限制于以下的氰基化试剂 来活化所述分级的多糖：1_氰基-4-(二甲氨基）_吡啶四氟硼酸盐（"CDAP"）、p_硝基苯 基氰酸盐和N-氰基三乙胺四氟硼酸盐（"CTEA"）。在优选的结合方法中，除了⑶PA的氰 基化试剂可以从以下中选择：1_氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸盐（CPPT)、1-氰基-咪唑 (I-Cl)、1-氰基苯并三唑（I-CBT)、或2-氰基哒嗪-3 (2H)-酮（2-CP0)，及其功能性衍生物 或或修饰物。
[0045] 在第六实施例的另一个方面中，将所述活化多糖或载体蛋白，尤其是多糖，与酰 肼、碳酰肼、酰肼氯化物、二酰肼及其混合物进行反应，优选与己二酸二酰肼进行反应。
[0046] 可以使用碳化二亚胺反应，通过蛋白质上的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基基团来 将酰肼基团引入到蛋白质中，例如，在存在EDC的情况下，通过与酰肼、碳酰肼、琥珀二酰 肼、己二酸二酰肼、酰肼氯化物（例如，二盐酸肼）或任何其他二酰肼进行反应。使用EDC 作为催化剂来活化并修饰具有酰肼或二酰肼的蛋白质反应物。任何水溶性碳化二亚胺，包 括EDC都可以用作催化剂。EDC催化蛋白质通常具有聚合和沉淀的倾向。参见：Schneerson 等，Infect.Immun.，1986,80, 519-528;Shafer等，Vaccine，2000,18 (13) : 1273-1281 ;以及 Inman等，Biochemistry,1969 ;8:4074-4082。
[0047] 在第七实施例中，所述多价脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物组合物包含：分别结合 到两种或更多种不同类型的载体蛋白的来自A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、Y和Z的多糖。 所述荚膜糖选自脑膜炎球菌血清群A、C、W135Y和X，使得所述组合物包括来自1、2、3、4或 5这五个血清群的糖。具体的组合物包括来自以下的糖：血清群A&X;血清群X&W135 ;血清 群X&Y;血清群C&X;血清群AY&X;血清群C、X&W135 ;血清群X、Y&W135 ;血清群A、C&X;血 清群Y、C&X;血清群A、W&X;血清群Y&W135&C&X;血清群Y&W135&A&X;血清群C&W135&A&X; 血清群Y&C&A&X;血清群A&C&Y&W135&X。优选至少包含血清群X的组合物，并且最优选包含 来自所有五个血清群的糖的组合物。
[0048] 在第七实施例的一个方面中，可以从以下、但不限于以下中选择所述载体蛋白：CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素百日咳类毒素、大肠杆菌（E.coli)LT、E:coliST、以 及来自绿脓杆菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白质、转铁结合蛋白、肺炎球菌溶血 素、肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附蛋白（PsaA)、肺炎链球菌表面蛋白BVH-3 和BVH-11、炭疽杆菌的保护性抗原（PA)、炭疽杆菌的脱毒水肿因子（EF)和致死因子（LF)、 卵清蛋白、锁孔血蓝蛋白（KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白（BSA)以及结核菌素（PPD)的 纯化蛋白衍生物。优选地，所要利用的蛋白质载体的组合包括：破伤风类毒素&白喉类毒 素、CRM197&破伤风类毒素。
[0049] 在第三实施例的一个方面中，结合反应利用选自己二酸二酰肼、氨基己酸、氯 己醇二甲缩醛、D-葡醛内酯、胱胺以及P-硝基苯基氰酸盐的连接体。
[0050] 在结合后，可以通过以下任何标准的技术将结合物从未反应的蛋白质纯化和多糖 中纯化，所述技术包括：尤其是，尺寸排阻色谱法、密度梯度离心法、超滤法、疏水作用色谱 法或硫酸铵分级分离法。参见：例如，Ρ.W.Anderson等，（1986)，Immunol, 137 :1181-1186, 进一步参见：H.J.Jennings和C.Lugowski(1981),Immunol, 127 :1011_1018。
[0051]在第八实施例中，本发明的所述免疫原性组合物可以进一步包括额外的非脑膜 炎球菌多糖蛋白结合物，其中，用于使用的所述多糖和低聚糖选自，但不局限于：血清群1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F以及 33F的肺炎球菌多糖；b型流感嗜血杆菌磷酸多核核糖（Haemophilusinfluenzaetypeb polysaccharidepolyribosylribitolphosphate)、血清型III和V的B群链球菌多糖以 及伤寒杆菌Vi多糖。肺炎球菌和B群链球菌血清型的其它多糖也适合用于本发明，不依赖 T的多糖和低聚糖抗原也一样适用，例如，来自A群链球菌、葡萄球菌、肠球菌、克雷伯氏肺 炎杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌的多糖或低聚糖。虽然特别优选的是细菌多糖和低 聚糖，但是也可以使用革兰氏（_)细菌脂多糖和脂寡醣体及它们的多糖和低聚糖衍生物、 以及病毒多糖（viralpolysaccharides)和低聚糖。
[0052] 可以以各种方式呈现并组装发明的组合物。可以将所述组合物放置在瓶（vials) 中，或者可以将它们放置在方便填充的注射器（ready-filledsyringes)中。注射器可以提 供针头或不提供针头。一支注射器可包括单次剂量的组合物，而一个瓶可以包括单次或多 次剂量。可注射的组合物通常是液体溶液或悬浮液。替换的，它们也可以以固体形式存在 (例如，冻干），用于在注射前在液态载体中溶解或悬浮。
[0053] 实施例：
[0054] 实施例1 :
[0055] 脑膜炎球菌X多糖的制备
[0056] a)脑膜炎球菌X多糖的发酵和纯化
[0057] 在最佳发酵条件下的连续分批补料发酵模式中利用合适的发酵培养基来从脑膜 炎奈瑟菌菌株（8210&9601)中获取脑膜炎球菌X多糖。进一步的，脑膜炎球菌X多糖通常 由包含以下步骤的方法来制备：基于CTAB的沉淀、乙醇（96% )处理然后深层过滤、碳滤、 CaCl2沉淀、乙醇（96% )处理以及超滤。
[0058] b)脑膜炎球菌X多糖的分级
[0059] 将纯化的脑膜炎球菌X多糖在大约30_40kpsi的压力下在WFI中进行1-2遍的机 械分级（定常系统细胞破碎仪）。
[0060] 实施例2 :
[0061] 将脑膜炎球菌X多糖结合到载体蛋白质
[0062] a)将平均分子量变化的脑膜炎球菌X多糖结合到肼衍生的破伤风类毒素（TT)
[0063] 第一，利用90mg的CDAP(以100mg/ml溶解在氰化甲烧中）来活化（30mg/ml) 45mg 的在SECHPLC上的平均分子量为215kD的均质化的X(菌株9601)多糖，利用IM氢氧化钠 将混合物的pH值调整到9. 5。3分钟后向反应中加入67. 5的肼活化的TT(30mg/ml，在IM氯 化钠中）。在HPLC上监测反应并且反应一直持续到18小时。18小时后，通过加入甘氨酸对 反应进行淬灭，并且通过在IOmMPH7. 2的三羟甲基氨基甲烷（Tris)中用300kDTFF膜进 行渗滤以对粗结合物进行纯化。使用PBS作为流动相以Iml/分钟流速的连续流过Shodex 柱SB-804HQ和SB-805HQ。通过磷分析法和改良的Lowry分析法分别测定多糖浓度和蛋白 质浓度。
[0064] 第二，利用150mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲烧中）来活化（24mg/ml，在 2M氯化钠中）60mg的在SECHPLC上的平均分子量为326kD的X(菌株8210)多糖，并且利 用2. 5M氢氧化钠将混合物的pH值调整到9. 5。3分钟后向反应中加入37. 5mg的ADH活化 的TT(37mg/ml，在2M氯化钠中），并且在HPLC上监测反应并且反应一直持续到5小时。5 小时后，通过加入甘氨酸对反应进行淬灭，并且在IOmMPBS中使用500kDTFF膜进行渗滤、 随后使用IOmMpH7. 2三羟甲基氨基甲烷（Tris)，对粗结合物进行纯化。
[0065] 进一步的，利用400mg的CPIP(以114mg/ml溶解在氰化甲烧中）来活化（20mg/ ml，在IM氯化钠中）200mg的在SECHPLC上具有120kD平均分子量的X(菌株8210)多糖， 并且利用IM氢氧化钠将混合物的pH值调整到9. 5。3分钟后向反应中加入150mg的ADH 活化的TT(30mg/ml)。在HPLC上监测反应并且反应一直持续到4小时。4小时后，通过加 入甘氨酸对反应进行淬灭，并且通过在IOmMPBS中使用300kDTFF膜进行渗滤、随后使用 IOmMpH7. 2三羟甲基氨基甲烷（Tris)，对粗结合物进行纯化。
[0066]b)利用ADH活化具有变化的平均分子量的脑膜炎球菌X多糖并将其结合到非活化 的破伤风类毒素（TT)上
[0067] 第一，利用400mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲烷中）来活化（27mg/ml，在 2M氯化钠中）200mg的在SECHPLC上具有平均分子量为5IOkD的X(菌株8210)多糖，并且 利用2. 5M氢氧化钠将混合物的pH值调整到9. 5。3分钟后加入I. 5g的ADH(100mg/ml，在 碳酸盐缓冲液中），并且反应一直持续到4小时。4小时后，加入甘氨酸并且在8kDTFF膜 上对反应混合物进行渗滤。进一步的，浓缩ADH-脑膜炎球菌X多糖。向44mg的这种多糖 (7.511^/1111)加入纯化的1'1'(37.511^/1111，在0.9%氯化钠中）和1^3?!16.0缓冲液，使得最 终MES的缓冲剂强度为IOOmM,接着加入37. 5mg的EDAC(溶解于IOOmMMES，pH6. 0)。在 HPLC上监测反应并且反应一直持续到4小时。通过在Akta色谱系统（GEAmersham)上使 用ToyopearlHW65树脂，由凝胶过滤色谱法移除未结合的多糖。基于峰形和糖-蛋白质比 率收集并集中馈分（fractions)。
[0068] 第二，将具有在SECHPLC上的平均分子量为250kD的X(菌株8210)多糖浓缩为 18mg/ml，在2M氯化钠中。利用296mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲烷中）来活化 200mg质量的这种多糖，并且利用2. 5M氢氧化钠将混合物的pH值调整到9. 5。3分钟后加 入I. 12g的ADH(100mg/ml，在碳酸盐缓冲剂中），并且反应一直持续到4小时。4小时后，力口 入甘氨酸并且在8kDTFF膜上渗滤反应混合物。然后浓缩ADH-脑膜炎球菌X多糖。进一 步向20〇11^的这种多糖（7.511^/1111)加入纯化1'1'(36.711^/1111，在0.9%氯化钠中）和1^3?!1 6. 0缓冲液，使得最终MES的缓冲液的强度为IOOmM,接着加入200mg的EDAC(溶解于IOOmM MES，pH6. 0)。在HPLC上监测反应并且反应一直持续到4小时。通过在IOmMPBS中使用 500kDTFF膜渗滤、随后使用IOmMpH7. 2三羟甲基氨基甲烷，对粗结合物进行纯化。
[0069] 表1脑膜炎球菌X多糖-蛋白质结合
[0070]
【权利要求】
1. 一种免疫原性组合物，包括脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis) X多糖-蛋白质结合物， 其中，所述荚膜X糖源于选自8210和9601的脑膜炎奈瑟菌X菌株。
2. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，至少一种额外的糖结合物源于血清 群A、B、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟菌荚膜糖。
3. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述脑膜炎奈瑟菌X菌株选自8210、 9601、9592、9554 和 2526。
4. 根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，通过使用至少两种不同的载体蛋白 质来结合全部5种多糖，所述组合物包括脑膜炎奈瑟菌血清群A、C、W-135、Y&X的每种荚膜 多糖。
5. 根据权利要求1或4所述的免疫原性组合物，其中，将每种脑膜炎奈瑟菌糖结合到载 体蛋白质上，所述载体蛋白质选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白质D、OMPC以及肺炎球 菌溶血素。
6. 根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中，将每种脑膜炎奈瑟菌糖结合到选自 TT、DT、CRM197的载体蛋白质上。
7. 根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，将每种脑膜炎奈瑟菌糖结合到选自 TT和DT的载体蛋白质上。
8. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：(a) (i)血清群A脑 膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚 膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；（c) (i)血清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)白喉 类毒素的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合 物；以及（d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物。
9. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：(a) (i)血清群A脑 膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与 (ii)CRM197的结合物；(c) (i)血清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结 合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物；以及（d) (i)血 清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物，其特征在于：含有破伤风类 毒素作为载体蛋白质的结合物被发现能够增强含有CRM197作为载体蛋白质的结合物的免 疫原性。
10. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：(a)(i)血清群A 脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的 荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c) (i)血清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类 毒素的结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物；以及 (d) (i)血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物。
11. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：(a)(i)血清群A 脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的 荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；（c)⑴血清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的 结合物；（d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；以及（d) (i) 血清群X脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物。
12. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：(a)(i)血清群A 脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii) CRM197的结合物；(b) (i)血清群C脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖 与（ii)CRM197的结合物；（c)⑴血清群Y脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物； (d) (i)血清群W135脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)CRM197的结合物；以及（d) (i)血清群X 脑膜炎奈瑟菌的荚膜糖与（ii)破伤风类毒素的结合物。
13. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，每种荚膜多糖具有100到600Kda的 平均分子量大小。
14. 根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中，每种荚膜多糖具有100到300Kda 的平均分子量大小。
15. 根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其中，每种荚膜多糖具有100到200Kda 的平均分子量大小。
16. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，来自血清群A、C、W135和X的至少 三种的脑膜炎奈瑟菌多糖在分级后（post-sizing)具有在100到150Kda之间的平均大小。
17. 根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述分级是通过使用高压细胞粉 碎系统进行的。
18. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，来自血清群Y的脑膜炎奈瑟菌多糖 在化学分级后（post-chemical sizing)具有在90到llOKda之间的平均大小。
19. 根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其中，所述化学分级是通过使用温度为 从60°C到80°C的醋酸钠进行的。
20. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，通过具有氰基化结合化学物质的异 源或同源双功能连接体，来将每种脑膜炎奈瑟菌糖结合到载体蛋白上。
21. 根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中，所述连接体为ADH。
22. 根据前述任一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中，所述氰基化试剂选自： 1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸盐（CPPT)、1-氰基-咪唑（1-C1)、1-氰基苯并三唑 (1-CBT)、或2-氰基哒嗪-3 (2H)-酮（2-CP0)，及其功能性衍生物或修饰物。
23. 根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中，所述脑膜炎奈瑟菌X糖-破伤风类 毒素结合物通过结合反应制备，所述结合反应包括：i)对多糖进行分级；ii)对具有lOOKda 至150Kda平均分子量的分级多糖，在9至9. 5的pH下进行基于CPPT的活化；iii)在2-3 分钟的持续时间后添加 ADH，然后培养4-20小时；iv)渗滤，以去除未反应的ADH ;以及v) 在MES缓冲液和EDAC存在下，将ADH活化的多糖与纯化的未活化载体蛋白以0. 75-1. 5的 比例进行反应，然后培养3-4小时，其特征在于：所述结合反应在2-8°C的温度下进行，并且 在最终的结合物中的糖与蛋白比例为〇. 2到0. 6。
24. 根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中，所述脑膜炎奈瑟菌X糖-破伤风 类毒素结合物由结合反应制备，所述结合反应包括：i)对多糖进行分级；ii)对具有lOOKda 至150Kda平均分子量的分级多糖，在9至9. 5的pH下进行基于CPPT的活化；iii)在2-3 分钟后，以糖：蛋白质为〇. 5-2的比例添加 ADH活化的蛋白质，然后培养2-20小时，其特征 在于：所述结合反应在22°C _25°C进行，并且在最终的结合物中的糖与蛋白比例为0. 2到 0· 6〇
25. 根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，包括：含量为每0. 5毫升剂量中 0· 5-10 μ g、0. 5-5 μ g 或 0· 5-2 μ g 的血清群 A、C、Y、W135 和 X 糖。
26. 根据权利要求25所述的免疫原性组合物，包括：10 μ g的血清群A糖、5 μ g的血清 群C糖、5 μ g的血清群W135糖、5 μ g的血清群Y糖以及5 μ g的血清群X糖。
27. 根据权利要求25所述的免疫原性组合物，包括：5 μ g的血清群A糖、5 μ g的血清 群C糖、5 μ g的血清群W135糖、5 μ g的血清群Y糖以及5 μ g的血清群X糖。
28. 根据权利要求25所述的免疫原性组合物，其中，所述一个或多个脑膜炎奈瑟菌糖 结合物可以被选择性地吸附到氢氧化铝、磷酸铝或二者的混合物上，或者不被吸附到佐剂 上。
29. 根据权利要求28所述的免疫原性组合物，包括以每0. 5毫升剂量中A1+++为 20-300 μ g、20-200 μ g、25-150 μ g的量添加铝盐佐剂的步骤。
30. 根据权利要求29所述的免疫原性组合物，包括以每0. 5毫升中A1+++为25-125 μ g 的量添加铝盐佐剂的步骤。
31. 根据权利要求28所述的免疫原性组合物，进一步包括选自从硫柳汞和2-苯氧基乙 醇的防腐剂。
32. 根据权利要求31所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包括：磷酸钠、氯化钠 或其组合。
33. 根据前述权利要求任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述糖结合物为缓冲液体 的形式。
34. 根据前述权利要求任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述糖结合物为冻干的形 式。
35. 根据权利要求34所述的冻干免疫原性组合物，其中，稳定剂组合选自：a)2至5% (w/v)的海藻糖、0.25至0.75%的柠檬酸钠；b) 2至5% (w/v)的蔗糖和0.25至0.75%的 柠檬酸钠；c) 2至5 % (w/v)的蔗糖，2至5 % (w/v)的乳糖和0· 25至0· 75 %的柠檬酸钠； 以及d) 2至5% (w/v)的海藻糖，2至5% (w/v)的乳糖和0.25至0.75%朽1檬酸钠。
36. 根据权利要求35所述的冻干免疫原性组合物，进一步包含选自三羟甲基氨基甲烷 和磷酸盐中的缓冲剂。
37. -种使人类宿主对由脑膜炎奈瑟菌感染引起的疾病具有免疫力的方法，包括对所 述宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-36所述的免疫原性组合物或疫苗。
【文档编号】A61K39/116GK104302315SQ201380017781
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2012年1月30日
【发明者】苏布哈什·维纳亚克·卡普雷, 萨姆哈吉·尚卡尔·皮萨尔 申请人:印度血清研究所公司