确定中胚层、内胚层和中内胚层细胞命运的方法

专利名称：：确定中胚层、内胚层和中内胚层细胞命运的方法确定中胚层、内胚层和中内胚层细胞命运的方法
背景技术：
：在早期胚胎发生中，胚胎被分为两个主要的谱系(lineage):多能内细胞团(innercellmass)和滋养层(trophoblast)。多能内细胞团随后产生所有三胚层，其能够进一步分化成终末分化的组织特异性细胞。胚胎干细胞是来源于胚泡期胚胎的内细胞团、能自我更新的细胞，并且，胚胎干细胞具有分化为三胚谱系中任何一个的潜能(即，是多能的(pluripotent))。多能干细胞在临床环境，例如再生医学(再生药物，regenerativemedicine)和化学治疗领域中具有实际的应用。在本领域中需要能够调节多能干细胞的发育，特别是调节多能干细胞向特定的优选谱系分化的方法和组合物。进化保守的Wnt信号通路调控胚胎发生中的许多事件，而且在肿瘤发生中也起主要作用。Wnt信号通路是蛋白聚积的信号级联反应，其调节P-连环蛋白的磷酸化和降解，因此调节(3-连环蛋白依赖性基因的表达。Wnt基因属于原癌基因家族，其在从无脊椎动物到脊椎动物的不同物种中都有表达。这些基因编码多于20个富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，该分泌型糖蛋白通过与在靶细胞上发现的巻曲蛋白(Frizzled,Fz)受体结合来激活Wnt信号通路。Wnt配体与巻曲蛋白受体的结合激活散乱蛋白(Dishevelled,Dsh/Dvl1)，使得散乱蛋白抑制含有P-连环蛋白、大肠腺瘤息肉蛋白(Axin-adenomatouspolyposiscoli,APC)禾卩糖原合成酶激酶(glycogensynthasekinase,GSK)-3卩的多蛋白复合体的活性。(3-连环蛋白/APC/GSK-3P复合体的抑制通过GSK-3(3来阻断(3-连环蛋白的磷酸化。磷酸化的P-连环蛋白通过蛋白体靶向遍在蛋白介导的降解作用，因此与巻曲蛋白受体结合的Wnt导致(3-连环蛋白在细胞质中累积。稳定的(3-连环蛋白转移进入细胞核，并且与T细胞因子(T-cellfactor,Tcf)/淋巴增强因子(Lymphoidenhancingfactor,Lef)蛋白质家族的成员结合，从而引起Wnt靶基因的转录。Reya等于2003年在Nature423(6938):409-14上公开了Wnt信号在造血干细胞(非多能干细胞)的自我更新中的作用。因此，造血干细胞中Wnt信号通路的活化维持这些细胞的多能性。相反，现有技术中许多文献都认为非多能干细胞中Wnt信号的活化可以导致分化。因此，Lako等(2001MechanismsofDevelopment103,49-59)描述了Wnt信号在增强拟胚体(embryoidbodies)分化中的作用。拟胚体中的细胞是专能的(multipotent)，但不是多能的，例如，其不能产生所有三胚层。具体地说，Lako公开了通过过量表达Wnt3激活Wnt信号，从而导致拟胚体的造血分化。国际专利公布WO2004/113513描述了Wnt多肽在调控成体干细胞种群尤其是造血干细胞CD45+Scal+的增殖或者分化中的用途。WO2005/052141提供了许多用于诱导或者抑制胎儿肺干细胞分化的方法。WO2005/052141中公开了一种具体的方法，该方法包括体外上调胎儿肺干细胞中的Wnt通路，导致分化的抑制。尽管有Wnt信号在诱导专能干细胞分化中的作用的这些教导，但是Wnt信号看来在调控多能胚胎干细胞中多能性/分化作用之间的选择中具有相反的作用。因此，胚胎干细胞中Wnt信号的激活看来会导致多能状态的维持以及分化的抑制。因此，Sato等(2004NatureMedicine10:55-63)公开了人和小鼠胚胎干细胞中Wnt信号的激活导致这些干细胞多能性的维持以及分化的抑制。US2004/0014209Al支持上述公开，其公开了Wnt信号通路的抑制在刺激干细胞包括胚胎干细胞分化为心肌细胞(cardiaccell)中起作用。发明概要Sato等2004年的研究提出了Wnt通路参与维持多能性，与其相反，我们的资料确凿地证明了Wnt通路的持续活化会诱导ES细胞的分化。我们发现ES细胞中Wnt信号通路的激活引起或者诱导上述细胞向中内胚层、中胚层或者内胚层分化。我们己经培养细胞，经过多次传代，并且分析了各种标记。在此我们认为尽管上述细胞甚至在21天时仍保持多能性标记即Oct4和Nanog，但是上述细胞获得各种中胚层/内胚层标记，这些标记确定了中胚层和内胚层的诱导作用是对Wnt通路激活的反应。此外，我们没有获得外胚层的诱导作用。根据本发明第一方面，我们提供了用于从多能干细胞产生中胚层或者内胚层细胞的方法，该方法包括在多能干细胞中激活Wnt信号通路。根据本发明第二方面，提供了根据本发明第一方面所产生的中胚层或者内胚层细胞。根据本发明第三方面，我们提供了根据本发明第一方面所产生的中内胚层细胞。在第四方面，本发明提供了药用组合物，其包括上述中胚层或者内胚层细胞，或上述中内胚层细胞，以及药用可接受载体、赋形剂或者稀释剂。根据本发明第五方面，提供了上述中胚层或者内胚层细胞或者上述中内胚层细胞或者上述药用组合物在治疗中的用途，例如在再生药物中的用途。在第六方面，本发明提供了治疗个体疾病的方法，该方法包括将上述中胚层或者内胚层细胞或者上述药用组合物或者如根据本发明第一方面的方法所产生的物质引入到该个体中。在第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括多能干细胞、Wnt信号通路的激活剂、以及用于产生中胚层或者内胚层的说明书。根据本发明第八方面，我们提供了一种用于诱导中胚层特异标记表达的方法，其包括激活多能干细胞中的Wnt信号通路。根据本发明第九方面，我们提供了一种用于诱导内胚层特异标记表达的方法，其包括激活多能干细胞中的Wnt信号通路。图1.表示胚胎干细胞中的Wnt信号。图1A.未分化的小鼠和人类ES细胞中存在Wnt通路蛋白。采用抗散乱蛋白、P-连环蛋白、LPR和sFRP的抗体对ES细胞裂解液进行蛋白免疫印迹分析。图IB.E14细胞中存在巻曲蛋白受体。对未分化E14cDNA进行的RT-PCR分析结果表明存在巻曲蛋白受体2、5和7。底部所显示的是无RT对照。图1C.条件培养基(CM)中存在Wnt-3A蛋白。采用抗Wnt-3A抗体对25pL非浓縮对照和Wnt-3ACM进行蛋白免疫印迹分析。图ID.存在于CM中的Wnt-3A是有活性的。瞬时转染的293T细胞经指定的CM或者纯化的Wnt-3A(100ng/ml)处理，对获得的裂解液进行荧光素酶报告基因分析。图IE.存在于CM中的Wnt-3A增加胞质中(3-连环蛋白的水平。采用指定的CM或者iGSK-3(3处理Hl细胞，裂解液与抗活性P-连环蛋白抗体产生免疫印迹。图1F.荧光素酶报告基因分析证明iGSK-3p激活Wnt通路的特异性。根据上述图1D中所述的进行该分析。注意iGSK-3p比BIO更有效。图1G.E14细胞中Wnt通路的短期激活诱导分化。分别采用对照CM、Wnt-3ACM、iGSK-3p根据方法中所描述的处理E14细胞4-8天。示出了标记基因表达的实时PCR分析。图2.E14细胞中Wnt通路的长期激活诱导中内胚层的分化。分别采用对照CM、Wnt-3ACM、iGSK-3(3根据方法中所描述的处理E14细胞21天。图2A示出了处理10天后利用关键类群特异的标记基因引物(ABI)进行实时PCR分析。图2B示出了处理21天后利用关键类群特异的标记基因引物(ABI)进行实时PCR分析。图2C.分化中的E14细胞保持多能性标记。采用Oct4和Nanog抗体对指定日期的细胞裂解液进行蛋白免疫印迹分析。B-肌动蛋白作为上样对照。图2D.E14细胞(对照)以及用Wnt-3A和iGSK-3p处理14天的培养物的明视场图像。全时程实验重复三次，获得能可重现的结果。在此示出了其中一次实验的结果。图3.人类ES细胞中Wnt通路的持续激活诱导中内胚层的分化。分别采用对照CM、Wnt-3ACM、iGSK-3p根据方法中所描述的处理HI细胞21天。图3A表示处理8天后，利用关键类群特异的标记基因引物(ABI)对从分化中的Hl细胞提取的RNA进行实时PCR分析。图3B示出了处理15天后利用关键类群特异的标记基因引物(ABI)对从分化中的Hl细胞提取的RNA进行实时PCR分析。图3C.分化中的H1细胞保持多能性标记。采用Oct4和Nanog抗体对指定日期的细胞裂解液进行蛋白免疫印迹分析。B-肌动蛋白作为上样对照。图3D.Hl细胞(对照)以及采用Wnt-3A和iGSK-3p处理15天培养物的明视场图像。图4.H1细胞中Wnt通路的长期激活导致SSEA4不能被染色。分别采用对照CM、Wnt-3ACM、iGSK-3(3根据方法中所描述的处理Hl细胞21天。在第21天细胞经胰蛋白酶处理，并根据方法中所描述的用SSEA4抗体(DHSB)进行染色。利用FACS生物分析仪(BD)进行流式细胞术(FACS)分析。图5.示出了iGSK-3(3(EliLilly)的结构。图6.示出了BIO和MeBIO的结构。图7.示出了Wnt信号通路。图8.示出了mES克隆实时PCR分析的结果。图9.示出了采用mES克隆23对分化标记进行免疫染色的结果。图10.示出了对E14细胞以及向内皮分化的克隆的分化的分析结果。图11.示出了对内皮细胞系克隆#23和38的标记进行RT-PCR分析的结果。图12.示出了对E14细胞以及向心肌细胞系分化的克隆的分化的分析结果。发明详述本发明是以Wnt信号通路在胚胎干细胞的细胞命运的选择中发挥关键作用这一证明为根据的。具体的说，我们证明了Wnt信号通路对胚胎干细胞所能分化成的不同命运或者细胞系的选择进行调节，具体的说，上述选择是在三胚层中胚层、内胚层和外胚层之间的选择。因此，我们在实施例中指出，对于鼠胚胎干细胞和人类胚胎干细胞，当Wnt信号通路被不同方式激活，上述胚胎干细胞都会向两个特定的途径分化，它们是中胚层途径或者内胚层途径，但不是外胚层途径。因此，我们的方法通常与从多能干细胞生产分化的细胞有关，尤其是确定和限定细胞谱系的分化的干细胞。尤其是，我们提供了从多能干细胞中通过调节(例如激活)该细胞中Wnt信号通路来生产中胚层或者内胚层、或两者的分化细胞的方法。因此，我们主要提供了通过控制多能干细胞Wnt信号通路的活性来在中胚层/内胚层和外胚层谱系之间进行细胞命运选择的操作方法。我们还提供了由在此所述的方法产生的分化的和部分分化的细胞。Wnt信号通路中的任何组分(在下文中进一步详细描述)可以被依次激活以产生中胚层或者内胚层的分化。通过激活Wnt信号通路，我们指的是调节该通路中任何成员的活性，或者是调节Wnt信号通路的任何细胞或其它机制，从而引起TCF调节基因(g卩，启动子上含有Tcf/LEF共同结合位点的基因)，包括TCF1、TCF2、TCF3、LEF1和LEF2的转录激活。Tcf/LEF在CleversandvandeWetering，1997，TrendsGenet.1997Dec;13(12):485-9中有描述。然而在一些实施方案中，Wnt信号通路的激活导致Wnt耙基因的转录激活。Wnt靶基因在下文中进一步详细描述。在一些实施方案中，Wnt信号通路的激活导致|3-连环蛋白活性的增强，例如胞质中活性P-连环蛋白的累积，如胞质中磷酸化P-连环蛋白数量的增加。显然Wnt信号通路活性的控制可以用来引起或者诱导多能干细胞从头开始进入中胚层分化途径或者内胚层分化途径。这就是说，在此描述的Wnt信号的激活可以被用于使具有均等可能性采用三种细胞命运中任何一个的胚胎干细胞进入分化的中胚层或者内胚层途径。此外，除了改变干细胞的途径，Wnt信号活性的激活还可以用于强化干细胞命运的决定或者选择。这就是说，干细胞在向中胚层或者内胚层途径分化的过程中通过激活胚胎干细胞Wnt信号活性可以偏向于这些途径，而不是外胚层途径。可选地，Wnt信号通路的激活可以用于使仍然具有多能性但是已部分地向特定途径分化(例如，外胚层途径)的胚胎干细胞改为进入中胚层或者内胚层途径。此外，在具有多能性但是已经部分进行外胚层和中胚层谱系分化的胚胎干细胞中，可通过激活Wnt信号，从而向内胚层或者中胚层途径分化。在一些实施方案中，Wnt信号通路的活性增强到一定程度(或者保持在这一水平上)，则该胚胎干细胞会保持在中胚层或者内胚层的分化途径，即使是该胚胎干细胞己暴露在向另一途径如外胚层途径分化的信号中。Wnt信号通路活性的检测也可以用于确定胚胎干细胞的状态，即是否处于向中胚层或者内胚层途径分化的过程中或者是已经在向中胚层或者内胚层路径分化。根据本文所述的方法和组合物所处理的胚胎干细胞、分化中和分化的细胞可以用于多种目的，包括如下文进一步详述的医疗。可以采用任何增强Wnt信号活性的方法，包括直接和间接的调节作用两者。这些方法可以包括，例如在转录、翻译或者翻译后水平调节Wnt信号通路任一成员的任何内源基因的表达(在下文中进一步详细描述)，如调节Wnt信号通路成员的信使RNA的持续或者分解，调节蛋白质的持续或者分解等等。它们也可以包括调节Wnt信号通路成员的活性，例如通过利用其激动剂。此外，可以调节Wnt信号通路任一成员的激活剂的表达和/或活性来调节Wnt信号活性。这些在下文中进一步详细描述。在一些实施方案中，胚胎干细胞中Wnt信号的活性可以增强10%、20%、30%、40%、50%或者60%或者更多，从而影响干细胞向中胚层或者内胚层谱系分化。在一些实施方案中，Wnt信号活性可以增强大于50。/。，从而引起此类分化的发生。在此类实施方案例中，Wnt信号通路的活性或者激活可以根据下文"Wnt信号通路激活的分析"中所描述的进行分析。ES细胞中Wnt信号通路可以激活大于12h，例如大于24h。在一些实施方案中，Wnt信号通路激活2天或以上，例如3天或以上、4天或以上、5天或以上、6天或以上或者7天或以上。在一些实施方案中，ES细胞中Wnt信号通路激活8至10天。显然Wnt信号通路激活所必需的时间视其应用情况，例如根据需要为2周、3周、4周等等。在此类实施方案中，可以在上述时间内连续激活Wnt信号通路。特别是，我们提供了调节Wnt信号通路的Wnt信号激动剂的用途。而且上述Wnt信号的激动剂可以通过筛选或者分析进行鉴定，在下文中也有详细描述。除非另有说明，本发明的实施将要利用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。对这些技术的解释参见下列文献，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJamesO，D.McGee，1990,InSituHybridization:PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress;D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855,Lars-IngeLarsson"Immunocytochemistry:TheoryandPractice",CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed);"ImmunochemicalProtocols,vol80",intheseries:"MethodsinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Femandes(2001，NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3;andTheMerckManualofDiagnosisandTherapy(17thEdition,Beers,M.H.,andBerkow，R,Eds,ISBN:0911910107,JohnWiley&Sons)。这些原文中的每一个均以引用的方式并入本文中。Wnt信号通路可调节Wnt信号通路中的任何组分来激活该通路。Wnt信号通路的描述参见图7，该通路的组分以及其登录号列于附件B。因此，只要Wnt信号通路是激活的，可以根据本文的方法和组合物对图7或者附件B中所描述的任何蛋白或者组分的活性进行调节，以使胚胎干细胞向中胚层或者内胚层途径分化。确定Wnt信号通路是否被激活的方法在下文中有详细描述。在一些实施方案中，Wnt信号通路是"经典"的Wnt信号通路，即，包括从Wnt受体(巻曲蛋白)到P-连环蛋白的信号的通路(与非典型通路相反，非典型通路不涉及Wnt或者P-连环蛋白，这些内容在Veemanetal.,2003，DevCell.5(3):367画77禾QStruttD,2003,Development130(19):4501-13中进行了描述和评论)。Thorstensen等2003年在AtlasGenetCytogenetOncolHaematol.April2003(http:〃www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Deep/WntSignPathID20042.html)中对Wnt信号通路进行了描述。Logan和Nusse2004年的Annu.Rev.CellDev.Biol.20,781-810和WodarzandNusse(1998),Annu.Rev.CellDev.Biol.14,59-88中记载了对Wnt信号和行为的详细评论。后者还描述了Wnt信号的多种分析法。也可参见http:〃www.stanford.edu/rnusse/wntwindow.html。Wnt信号通路激活的分析胚胎干细胞中Wnt信号通路的激活可以采用本领域公知的多种方式进行分析。通常，这种分析将寻求检测靶标组分或者是作为激活靶标组分的下游组分的调节。在一些实施方案中，Wnt信号通路激活的分析法包括检测GSK-3P的活性降低。GSK-3P活性可以采用许多方式进行分析，例如在上文"GSK-3P激酶分析"中所详细描述的。当靶向抑制GSK-3(3的活性作为激活Wnt信号通路的方式时，上述分析法特别适合。可替代的方法或除此之外其它的方法是，分析Wnt信号通路的激活可包括检测胞质或者细胞核或者两者中P-连环蛋白的累积。因此，在上述任一位:置或者两个位置中P-连环蛋白数量的增加可以作为Wnt信号通路激活的指示。其可以利用本领域公知的方法制备所讨论的细胞，例如胚胎干细胞或者分化中的细胞的细胞核或者胞质提取物，并且通过抗体免疫印迹检测P-连环蛋白来实现。特别有效的分析法包括利用例如特异针对上述形式的抗体来检测活性P-连环蛋白或者其非磷酸化形式的分析法。VanNoort等2002年在JBiolChem.2002May17;277(20):17901-5中对能特异检测活性非磷酸化形式的p-连环蛋白的单克隆抗体进行了描述，上述单克隆抗体也可以从Upstate(Charlottesville,VA22卯3，USA)作为"Anti-卩-Catenin(纖-phospho),clone8E4，，购得，其目录编号为05-601。Wnt信号通路的激活也可以通过采用例如抗Axin2抗体利用免疫印迹检测Axin2表达的增强。Axin2位于17q23-q24，其登录号为AF205888、AF078165和NM—004655。可以对散乱蛋白的磷酸化或者LPR尾部的磷酸化(Tamai2004MolCell.2004Jan16;13(l):149-56)进行检测，作为测定Wnt信号通路激活的方法。在一些实施方案中，通过使用转染到感兴趣的细胞中的合适的报告基因质粒，检测Wnt信号通路的激活。由于例如包括响应元件的报告基因的启动子的结果，使报告基因的表达对Wnt信号的激活敏感。可以用于上述分析的一个报告基因就是TOPFlash,如Molenaaretal.(1996)Cell86(3):391-9中所描述的，而且可以从UpstateBiotech(Charlottesville,VA22903,USA,目录编号为21-170)获得。TOPFlash包含一个TCF报告基因质粒，其在胸苷激酶(thymidinekinase,TK)最小启动子和荧光素酶开放阅读架的上游含有两套三拷贝的TCF结合位点。对照质粒是FOP-Flash(目录编号21-169)，其含有突变的非活性TCF结合位点。通过使用合适的转染试剂例如Lipofectamine2000(Invitrogen)，将TOPFlash瞬时转染到合适的受体细胞中，例如胚胎干细胞。荧光素酶的表达可以通过使用例如本领域所公知的光度计来进行检测。可以用于上述分析的另一个报告基因是Super8XTOPFlash，其包含(3-连环蛋白介导的转录激活的荧光素酶报告基因。该报告基因在M.Veemanetal.,CurrentBiology13:680(2003)中有详细的描述。Super8XTOPFlash报告基因比TOPFlash报告基因具有较高的信噪比。在HEK细胞中，该报告基因的最大激活是100倍(Wnt激活)到1，000倍(P-连环蛋白的磷酸化突变体激活)。合适的对照质粒是克隆M51、Super8XFOPflash，其具有突变的TCF/LEF结合位点。Super8XTOPFlash的骨架是Clontech的pTA-Luc载体，其提供了驱动萤火虫荧光素酶基因表达的最小TA病毒启动子(详细内容参见公司出版物)。将8个TCF/LEF结合位点克隆到该载体的Mlul位点(8拷贝:AGATCAAAGGgggta，含有用大写字母表示的TCF/LEF结合位点，以及小写字母表示的用于分隔每个拷贝的TCF/LEF位点的间隔序列)。可以在经改造含有转基因报告基因的所有动物上对Wnt信号通路激活进行检测。这些报告基因基于多聚化的TCF结合位点，能够驱动LacZ(有时称为TOP-GAL)的表达。已经描述了两种转基因小鼠品系，其中一个是DasGupta和Fuchs于1999年的Development,126(20):4557-68描述的，另一个是由Maretto等于2003年的ProcNatlAcadSciUSA.100(6):3299-304描述的。Dorsky和Moon2002年产生了TOPdGFP斑马鱼品系，并且Hurlstone等2003年在Nature425(6958):633-7中对其也进行了描述。因为在许多组织中Axin2的表达受Wnt信号的控制，Jho等于2002年MolCellBiol.22(4):l172-83根据Axin2启动子和GFP所产生的转基因品系也是动物中有用的Wnt报告基因。相似地，Lustig等2002年MolCellBiol.22(4):1184-93将LacZ插入到内源性Axin2/Conductin基因中使动物中Wnt耙标的表达可见。全动物分析有助于检测Wnt信号通路的激活剂，其可以用于本文所述的方法和组合物中。Wnt受体的激活巻曲蛋白受体我们尤其是提供了通过激活Wnt信号的任一受体，例如Wnt受体，来激活Wnt信号通路。例如可以激活任何巻曲蛋白受体从而激活Wnt信号通路。巻曲蛋白受体的实例见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表.小鼠巻曲蛋白受体可以采用许多方法来实现受体的激活，例如通过上调该受体的表达。也可以通过例如将表达该受体的合适的表达载体转染到胚胎干细胞中来实现受体的激活。另外，可以通过向胚胎干细胞中引入组成型(constitutive)活性巻曲蛋白受体来实现受体的激活，例如通过转染至胚胎干细胞作为编码该组成型活性受体的表达载体。Wnt配体Wnt受体，例如巻曲蛋白受体也可以通过与Wnt配体的结合来激活。因此，可以通过增强Wnt配体的活性或者表达，或者通过降低Wnt或者巻曲蛋白的拮抗剂的活性或表达来激活Wnt信号通路。Wnt配体在本领域中是公知的，包括WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、額T3A、丽T4、濯T5A、酉T5B、額T6、丽T7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A(以前的WNT14)、WNT9B(以前的WNT15)、WNT10A、WNT10B、WNT11禾卩WNT16。示例性Wnt配体包括Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wntl0a、Wntl0b、Wntll禾口Wntl6。这些Wnt配体及其登录号列于附件A。其中任何一个或者多个可以用来激活胚胎干细胞中的Wnt信号。Wnt配体可以从R&DSystems(Minnesota,USA)以及PeproTech,Inc(NewJersey,USA)获得。在一些实施方案中，Wnt配体包括Wntl或者Wnt3A，例如Wnt3A。上述Wnt配体可以包括人WNT1(PALI)(ATCC57198/57199)、人WNT1(MGC30915522)、人WNT3(pHPl)(ATCCMBA-174)、小鼠Wnt3(ATCCMBA-175)或者小鼠Wnt3A(ATCCMBA-176)。另夕卜，Norrin酉己体(Xuetal.,2004,Vasculardevelopmentintheretinaandinnerear:controlbyNorrinandFrizzled-4，ahigh-affinityligand-receptorpair.Cell116(6):883-95)与巻曲蛋白高亲和力结合，可以用来激活Wnt信号通路。R-spondin2蛋白(Kazanskayaetal(2004)DevCell.7(4):525-34andKimetal.,(2005)Science309(5738):1256-9)也可以与巻曲蛋白受体结合，并且同样可以用于本文所述的方法和组合物中。胚胎干细胞可以暴露于任何已知的Wnt配体中，如纯化的多肽。Wnt配体可以从Calbiochem购得，也可以通过重组方式制备，例如通过在合适的宿主细胞中对含Wnt核酸的表达载体进行表达。可替代的方法或除此之外的其它方法是，可以通过将胚胎干细胞暴露于含Wnt配体的培养基中来激活Wnt信号通路。该培养基的实例是"条件培养基(conditionedmedium，CM)"，即Wnt分泌细胞如用Wnt表达载体转染的细胞所生长的培养基。可以通过公知的方法例如免疫印迹来确定条件培养基中存在合适的Wnt配体(参见图1C)。产生活性Wnt禾BWingless蛋白的细胞包括小鼠Wnt3A(ATCCCRL-2647)、小鼠Wnt5A(ATCCCRL國2814)和果蝇Wingless(DrosophilaGenomicsResourceCentre,DGRC165)。在一些实施方案中，使用Wnt3A条件培养基作为巻曲蛋白受体。其可以根据实施方案19禾nShibamoto等GeneCells3:659-670中所描述的进行制备。Lako等2001年也描述了Wnt3A和Wnt4条件培养基的制备。Wnt3A条件培养基制备Wnt3A和Wnt5条件培养基的实例方案，改编自Lakoetal,2001，方案如下采用下列引物对未分化的CGR8细胞进行扩增获得鼠Wnt3和Wnt5a的cDNA:Wnt3:50-ACCATGGAGCCCCACCTGCT-30;50-TGCAGGTGTGCACATCGTAG-30Wnt5a:50-ACCATGAAGAAGCCCATTGG-3050-TGCACACGAACTGATCCACA-30。根据厂商说明书将这些cDNAs克隆至ljpcDNA3.1/CT陽GFP画TOPO(Invitrogen)中，采用Qiagenmidiprep试剂盒制备DNA。对每个基因的三个克隆进行全基因测序，以确保在扩增步骤中没有发生核苷酸的改变。在具有5。/。C02、37匸潮湿的培养箱中，将COS7细胞培养于添加有10。/。胎牛血清的DMEM(GibcoBRL)中。为了产生条件培养基，利用Fugene转染试剂盒(Fugenetransfectionkit，BoehringerMannheim)根据厂商说明书用Wnt3禾nWnt5a表达构建体转染COS7细胞。也将含绿色荧光蛋白GFP并且处于CMV启动子的调控下的对照构建体转染到COS7细胞中。在不含任何DNA条件下进行模拟转染。来自每个转染的培养基72h后，3000xg离心并过滤除菌，制备条件培养基。为了证实Wnt-GFP融合蛋白的分泌，转染72h后从转染的COS7细胞中收集条件培养基(CM)，并用CytofluorMultiwellPlatereader(PerseptiveBiosystems)对其进行荧光领!j定石if究。Wnt配体的过量表达在其它实施方案中，通过增强Wnt配体的表达来激活Wnt信号通路。例如，在WO2004/0014209中详细描述了通过Wnt过量表达来激活Wnt信号通路。该文献中的教导可以用来从包含Wnt序列的表达载体和质粒中制备mRNA，用于注射入胚胎干细胞用来诱导分化。此外，可将表达载体瞬时或者永久转染到胚胎干细胞中以实现相同的目的。糖原合成酶激酶3P的抑制我们提出了通过对该通路中的任何拮抗剂或者负调控子或者组分进行下调来激活Wnt信号通路，例如糖原合成酶激酶3|3，上述下调可以是通过抑制酶活性也可以是降低蛋白浓度。通过采用例如RNAi来封闭Wnt信号的负调控子，例如Axin和APC，也可以激活Wnt通路。在具体的实施方案中，我们提出了通过抑制多能干细胞的激酶活性来激活Wnt信号通路，尤其是糖原合成酶激酶3(GSK3)的活性。在一些实施方案中，受抑制的激酶活性是GSK-3P激酶活性。通过抑制GSK-3P的酶促活性可以抑制其活性，例如采用如下文中所描述的化学抑制剂或者拮抗剂，它们可以是竞争性的或者是非竞争性的。这些抑制剂可以包括激酶抑制剂。另外，可以通过下调GSK-3f3蛋白的表达来下调其活性，例如使用反义RNA或者RNAi或者siRNA或者通过抑制GSK-3p从非活性形式转变为活性形式，或者通过增加GSK-3P的降解率。本文所述的方法和组合物也可以禾U用如Hedgepethetal.(1997)ActivationoftheWntsignalingpathway:amolecularmechanismforlithiumaction.DevBiol.185(1):82-91中描述的GSK-3P中功能和显性负突变(dominantnegativemutations)的缺失。例如可将CrowderandFreeman,2000,J.Biol.Chem.275(2000),pp.34266-34271中所描述的GSK-3(3激酶缺陷突变体转染到胚胎干细胞以实现中胚层/内胚层的分化。如Hashimotoetal.，2002,J.Biol.Chem.277(2002),pp.32985—32991中所描述的，暴露于成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)中可以激活Akt从而抑制GSK-3P。因此FGF可以用作Wnt信号的激活剂。也可以通过上调FRATl(GSK-3的负调控子)例如使其过量表达来激活Wnt信号。这描述于Crowder和Freeman2000,J.Biol.Chem.275(2000),pp.34266—34271以及Culbertetal.,2001,FEBSLett.507(2001),pp.288-294中。适宜抑制GSK-3P活性的方法和化合物在下文中详细记载。如在本文中所使用的术语"激酶抑制剂"，意指对于相关激酶例如GSK-3P，其ICso至多为约100iliM，通常至多约50或者更少的化合物，如下文所述。可以通过本文中所列的分析法对酶活性进行测量。"IC50"是将酶(例如GSK-3P)活性降低到最大水平的50%时抑制剂的浓度。已经发现的具有GSK-3J3抑制活性的化合物可以用于本文所述的方法和组合物中。有效的化合物可以对于相关激酶例如GSK-3P具有根据无细胞GSK-3(3激酶分析法所测定的至多大约lO(iM，例如至多大约5pM、至多大约l)LiM或者至多大约200nM的IC5Q。在一些实施方案中，所述化合物是对于GSK-3p具有至多约100nM、例如至多约50nM的IC5Q。在一些实施方案中，在此所使用的"GSK-3(3抑制剂"是指一种化合物，其对于GSK-3(3IC5。至多为约100pM，通常至多为约50|ii.M，其是根据在此所描述的GSK-3P抑制活性的无细胞分析法所测定的。可选地，或另外，该化合物能够抑制激酶活性如下文所记载的低于最大活性的50%、35%、25%或者15%。糖原合成酶激酶3(GSK-3P)糖原合成酶激酶3(GSK-3)是具有47kDa单体结构的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其也被称为zeste-white-3/shaggy。GSK-3是磷酸化糖原合成酶的几种蛋白激酶中的一种(Embi,etal.,1980,Eur.J.Biochem.,107:519-527;Hemmingsetal.,1982,Eur.J.Biochem.119:443-451)。根据其能够磷酸化蛋白磷酸酶FC(Vandenheedeetal.,1980,J.Biol.Chem.255:11768-11774)，GSK-3在所述文献中也被称为A因子(factorA,FA)。GSK-3及其同系物的其它名称包括zeste-white3/shaggy(zw3/sgg;黑腹果蝇同系物)、ATP-柠檬酸盐裂解酶激酶(ACLKorMFPK;Ramakrishnaetal.,1989，Biochem.28:856-860;Ramakrishnaetal.，1985,J.Biol.Chem.260:12280-12286)、GSLA(网柄菌属CD/c^o"e/^附)同系物；Harwoodetal.,1995,Cel80:139-48)和MDSI、MCK1及其它的名称(酵母同系物；Hunteretal.,1997，TIBS22:18-22)。编码GSK-3的基因在不同门(phyla)中高度保守。在脊椎动物中GSK-3存在两种亚型GSK-3a禾BGSK-3(3。在脊椎动物中，同系物之间氨基酸的同一性在GSK-3催化区中超过98%(Plyteetal.,1992,Biochim.Biophys.Acta1114:147-162)。据报道，在无脊椎动物中只有一种形式的GSK-3，其看上去比GSK-3a更为接近GSK-3(3。粘菌和裂殖酵母蛋白之间与人GSK-3(3催化区的氨基酸相似性(考虑到保守性替换)分别是81%和780/。(Plyteetal.,1992，supra)。系统发育谱(phylogeneticspectrum)之间显著高度的保守性表明，GSK-3在细胞过程中的基础作用。己经证明GSK-3在体外可以磷酸化多种蛋白，包括但不限于糖原合成酶、磷酸酶抑制剂I-2、cAMP依赖的蛋白激酶的II型亚基、磷酸酶-l的G亚基、ATP柠檬酸裂解酶、乙酰辅酶A羧化酶、髓鞘碱性蛋白(mydinbasicprotein)、微管相关蛋白、神经丝蛋白、N-CAM细胞粘附分子、神经生长因子受体、c-Jun转录因子、JunD转录因子、c-Myb转录因子、c-Myc转录因子、L-myc转录因子、腺瘤性结肠息肉肿瘤抑制蛋白、tau蛋白和P-连环蛋白(Plyteetal.,1992,Biochim.Biophys.Acta1114:147-162;Korineketal"1997，Science275:1784-1787;Milleretal"1996,Genes&Dev.10:2527-2539)。这些蛋白中已有一些已经确定了GSK-3所识别的磷酸化位点(Plyteetal.,1992，同上)。这些蛋白的多样性与GSK-3在细胞代谢、生长和发育的调控中所起的广泛作用不一致。GSK-3倾向于磷酸化处于富含脯氨酸环境中的丝氨酸和苏氨酸残基，但是没有表现出作为促细胞分裂剂激活性蛋白(mitogen-activatedprotein,MAP)激酶或者cdc2激酶家族成员的蛋白激酶所显示出的对这些氨基酸的绝对依赖性。在GSK-3磷酸化的蛋白中，c-Jun是c-jun原癌基因的表达产物以及鸟类肉瘤病毒v-jun癌基因的细胞同系物(Dentetal.，1989，FEBSLett.248:67-72)。Jun作为激活蛋白-l(activatorprotein-l，AP-1)转录因子复合物的组分，其与回文共有序列的结合位点(AP-1位点)结合。c-Jun对于诱导含有AP-l位点的基因的转录是充分且足够的(Angeletal.,1988,Nature332:166-171;Angeletal.，1988，Cell:55:875-885;Chiuetal.,1988，Cell54:541-552;Bohmannetal.,1989,Cell59:709-717;Abateetal.,19卯，Mol.Cell.Biol.10:5532-5535)。通过Fos-Jun异源二聚体或者Jun-Jun同源二聚体可以起始含有AP-1位点的基因的转录，尽管Fos-Jim异源二聚体与DNA的结合比Jun-Jun同源二聚体更加稳定，因而是更加有效的转录激活剂。Fos是另一原癌基因c-fos的表达产物(Schonthaletal.,1988,Cell54:325-334;Sassone画Corsi，1988,Nature334:314-319)。GSK-3对c-Jun的磷酸化显著降低了Jun-Jun同源二聚体与AP-1位点的结合亲和性(Boyleetal.,1991,Cell64:573-584;Plyteetal.,1992，同上)。GSK-3是wnt信号通路的负调控子。Wnt信号通路是脊椎和无脊椎动物中调控细胞命运决定的高度保守的信号通路(Perrimon,1994,Cell76:781-784;Perrimon,1996,Cell86:513-516;Milleretal"1996,Genes&Dev.10:2527-2539)。已经从果蝇详细的遗传分析中确定了该通路中的大部分。目前，该信号通路中所鉴定的组分包括wnts(分泌配体)、巻曲蛋白(wnt受体)和胞内中介体散乱蛋白(intracellularmediatorsdisheveled)、GSK-3(在果蝇中表示为zw3/sgg)以及P-连环蛋白(在果蝇属(Dnwo;Mfl)中表示为armadillo)。在10Tl/2细胞中，wnt信号抑制GSK-3p酶促活性(Cooketal.,1996，EMBOJ.15:4526-4536)。该结果与果蝇属上位性实验的结果一致，其表明GSK-3(3/zw3/sgg在wnt通路中起抑制作用。Wnt信号导致果蝇属(Peiferetal.,1994,Dev.,120:369-380;vanLeeuwen,etal.，1994,Nature368:342-344)以及非洲蟾蜍属(Xe"opw力(Yostetal.,1996,Genes&Dev.,10:1443-1454)中卩-连环蛋白的稳定。用LiCl处理果蝇属S2细胞导致armadillo蛋白的累积也得到了证明(Stambolicetal.,1996,Curr.Biol.6:1664-1668)。卩-连环蛋白的稳定与其对wnt信号作出反应而转运到细胞核有关(Funayamaetal.，1995,J.CellBiol.，128:959-968;Schneideretal.,1996,Mech.Dev.,57:191-198;Yostetal"1996,supra)。另外，保守基因包括wnts、散乱蛋白和P-连环蛋白基因的异位表达导致非洲蟾蜍属中第二轴(secondaxis)的形成。经锂处理后，在非洲蟾蜍属中也可以观察到第二轴的形成。尽管(3-连环蛋白最初是作为钙粘蛋白结合蛋白而发现的，但是最近已经证明当与DNA结合蛋白Tcf家族成员形成复合物时，其作为转录激活剂而发挥作用(Molenaaretal.，1996,Cell86:391;Behrensetal"1996,Nature382:638)。在上文和本文其它地方所使用的，下列术语具有如下文所定义的含义在本文中交替使用"糖原合成酶激酶3"和"GSK-3"，指与人GSK-3P氨基酸序列(GenbankAccessionNo.L33801)具有大于60%，例如大于70%、大于80%、大于90%或者95%的序列同源性的任何蛋白，例如与人GSK-3(3序列56和340位之间的氨基酸序列。GSK-3a和GSK-3J3的序列也已经得到公开，登录号分别是P49840和P49841，此外，术语"糖原合成酶激酶3"和"GSK-3"也可以用于表示与这两个序列具有大于60°/。及其它的序列同源性的序列。为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸序列的百分比同源性，根据最佳比对目的将序列进行比对(例如，为了与其它多肽或者核酸的最佳比对，在多肽或者核酸序列中可以引入空位)。然后比较相应氨基酸位置或者核苷酸位置的氨基酸残基或者核苷酸。当一条序列中某个位置被与其它序列中相应位置中相同的氨基酸残基或者核苷酸所占据时，那么在该位置上所述分子是同源的(S卩，如本文中所用的，氨基酸或者核酸"同源性"相当于氨基酸或者核酸的"一致性")。两个序列之间的同源性百分比是序列共同具有的相同位置数目的函数(即，％同源性=相同位置数/位置总数x100)。GSK-3-p激酶分析通常，通过下列步骤容易实现无细胞GSK-3激酶的分析(1)GSK-3与肽底物、放射性标记的ATP(例如，fP-或者y32P-ATP，都可以从Amersham,ArlingtonHeights,Illinois获得)、镁离子以及^f壬选的一个或多个候选抑制剂一起孵育；(2)将该混合物孵育一段时间来通过GSK-3活性将放射性标记的磷酸(phosphate)盐/酯并入到肽底物中；(3)将全部或者部分上述酶反应混合物转移到单独的容器中，通常是含有相同数量的能够与肽底物上的锚定配体相结合的捕获配体的微量滴定孔；(4)洗涤去掉未反应的放射性标记的ATP;然后(5)对每孔中剩余的"P或者，进行定量。该数量表示并入到肽底物中的放射性标记的磷酸盐/酯的量。抑制作用即观测放射性标记的磷酸并入到肽底物中的减少。适合在无细胞分析中所使用的肽底物可以是在适量ATP存在下能够被GSK-3p磷酸化的任何肽、多肽或者合成肽衍生物。合适的肽底物可以基于GSK-3或者其它酶的各种天然蛋白底物的部分序列，也可以包含N端或者C端的修饰或者延伸，包括间隔序列以及锚定配体。因此，所述肽底物可以存在于较大的多肽中，或者可以是为GSK-3P等的磷酸化作用所设计的单独肽。例如，可以根据DNA结合蛋白CREB的亚序列来设计肽底物，例如Wangetal.,Anal.Biochem.，220:397-402(1994)所描述的CREBDNA结合蛋白中SGSG连接的CREB肽序列，该文献以引用的方式并入本文中。在Wang等报道的分析中，通过cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)对CREB肽中SXXXS基序的C末端丝氨酸进行酶促预磷酸化，该步骤是使该基序中的N末端丝氨酸能够被GSK-3磷酸化所需要的。另一种可供选择的方案是利用修饰的CREB肽底物，其具有相同的SXXXS基序，并且也包含N末端锚定配体，但是在合成的时候其C末端丝氨酸被预磷酸化(该底物可以从ChironTechnologiesPTYLtd.,Clayton,Australia购买)。在肽合成过程中SXXXS基序中第二个丝氨酸的磷酸化不需要用PKA作为单独的步骤来磷酸化该残基，而且其与GSK-3反应后，锚定配体的并入促进了肽底物的捕获。通常，在激酶活性分析中所使用的肽底物可以包含一个或者多个GSK-3J3磷酸化的位点以及一个或者多个为其它激酶但不被相关激酶磷酸化的其它位点。因此，为了产生能被该激酶磷酸化的基序，可以对这些其它位点进行预磷酸化。在本文中术语"预磷酸化"是指利用该底物肽进行激酶分析之前，用非放射性标记的磷酸盐/酯对底物肽进行磷酸化。在肽底物合成中，可便利地进行上述磷酸化。SGSG连接的CREB肽能够与锚定配体例如生物素相结合，结合发生在P和Y之间靠近C末端的丝氨酸被预磷酸化的位置。如本文中所使用的，术语"锚定配体"是指一种配体，其能够与肽底物结合从而促进该肽底物在捕获配体上捕获，其在洗脱步骤中将肽底物保持在适当位置，而允许未反应的放射性标记的ATP洗脱掉。示例性的锚定配体是生物素。在本文中术语"捕获配体"是指能够与锚定配体以高度亲和性结合的分子，其被结合到固相结构上。结合的捕获配体的实例包括，例如抗生物素蛋白或者链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定孔或者琼脂糖珠。带有捕获配体的珠能够进一步与闪烁体结合来提供检测捕获的放射性标记底物肽的方法，或者在随后的步骤中将闪烁体加到捕获的肽中。采用已知的方法，能够对闪烁计数仪中的捕获的放射性标记肽底物进行定量。如果酶反应在只有有限部分(例如，小于20%)的肽底物被磷酸化的条件下进行，那么闪烁计数仪所检测的信号将与GSK-313激酶活性成比例。如果在反应中存在抑制剂，那么相关的激酶活性将会减少，因此较少量的放射性标记磷酸将会掺入到该肽底物中。因此将会检测到较低的闪烁信号。与反应中不存在抑制剂的阴性对照中所观察的相比较，GSK-313抑制活性将会检测为闪烁信号的降低。无细胞GSK-3P激酶活性分析通常利用能够表达GSK-3P和GSK-3p底物均的细胞，例如，转化有编码GSK-3P及其底物的基因，包括该基因表达的调控序列的细胞。在进行基于细胞的分析中，在化合物存在条件下对能够表达该基因的细胞进行孵育。裂解细胞并且通过例如在SDSPAGE上观察其相对于未磷酸化形式的迁移率，或者通过底物磷酸化形式的特异抗体所识别的底物量来确定磷酸化形式的底物的比例。底物磷酸化的量表明该化合物的抑制活性，即与不存在抑制剂所进行的分析相比，将抑制作用检测为磷酸化的减少。在无细胞分析中检测到的GSK-3抑制活性是由于例如GSK-3表达的抑制或者GSK-3激酶活性的抑制。GSK-3-p活性的化学抑制剂如上文中所提到的，可以通过抑制GSK-3(3活性来激活Wnt信号通路。在一些实施方案中，为了实现该通路的激活，将GSK-3(3暴露于其化学抑制剂中。GSK-3p活性的许多化学抑制剂在本领域中是已知的，例如，如在美国专利6,441,053中所描述的。该文件中也记载了用于鉴定GSK-3f3活性的抑制剂的方法。该方法通常包括提供含有GSK-3、磷酸盐/酯源以及GSK-3底物的混合物，在实验化合物存在或者不存在条件下孵育该混合物，而且评价混合物中GSK-3的活性。在实验化合物存在条件下对该混合物进行孵育后GSK-3活性降低表明该实验化合物是GSK-3的抑制剂。锂在一个实施方案中，我们的方法和组合物采用了锂及其盐，包括用于激活Wnt信号通路的氯化锂。在Hedgepethetal.(1997)ActivationoftheWntsignalingpathway:amolecularmechanismforlithiumaction.DevBiol.185(1):82-91以及Davies，etal.(2000),Biochem.J.351,pp.95—105和Pateletal"(2002),J.Mol.Biol.315(2002),pp.677—685中描述了锂在该方法中的应用。为了激活用于分化的Wnt信号，锂的使用浓度在1微摩尔和500毫摩尔之间。合适的浓度为大于10mM。靛玉红(Indirubins)在一些实施方案中，GSK-3P的化学抑制剂包括靛玉红(indimbins)，伊J女B在Meijeretal.，(2003).GSK-3-SelectiveInhibitorsDerivedfromTyrianPurpleIndirubins.Chemistry&Biology,Vol.10，1255—1266中详细描述的贝紫靛玉红(Tyrianpurpleindimbins)。特别是，我们提出了6-溴靛玉红(6-bromoindirubins)的应用，例如位置5或者位置6被取代的靛玉红的应用。靛玉红可以在位置6被取代。6-溴靛玉红-3，-肟(BI0)在一些实施方案中，GSK-3P抑制剂包括在图6中所描述的6-溴靛玉红-3'-肟(BIO)。为了实现向中胚层/内胚层途径分化，胚胎干细胞可以暴露于靛玉红，例如6-溴靛玉红-3，-肟(BI0)，浓度在lnM和lmM间，例如大于500nM、大于750nM、小于500pM、小于100pM、小于50|aM或者小于25pM。在一些实施方案中，该浓度在0.1^iM和10pM之间，例如lpM和10|iM之间，例如低于5pM，例如约1|liM或者2pM左右。在其它实施方案中，我们的方法和组合物利用了GSK-3P的化学抑制剂，其包括iGSK-3(3及其变异体。iGSK-3(3的使用浓度如上文中BIO所列举。GSK-3的其它抑制剂Coghlanetal，ChemBiol.2000Oct;7(10):793隱803描述了两种分子，SB-216763和SB-415286，作为GSK-3的抑制剂，它们是结构不同的顺丁烯二酰亚胺。Pai等在MolBiolCell.2004May;15(5):2156-63中报道了低浓度脱氧胆酸(DCA,5和50mM)增加p-连环蛋白的酪氨酸磷酸化，诱导尿、激酶型纤、溶酶、激活齐U(urokinase-typeplasminogenactivator,uPA)、uPA受体(uPAR)和细胞周期蛋白Dl的表达，并且增强结肠癌细胞的增殖和侵袭力。Park等在BiochemBiophysResCommun.2005Mar4;328(l):227-34中提出，栎皮酮在TCF水平抑制Wnt信号。Liu等在AngewChemIntEdEngl.2005Mar18;44(13):1987画90中报道了2誦氨基-4-[3,4画(亚甲二氧基)苄氨基]-6-(3-甲氧苯基)嘧啶作为Wnt信号的激动剂。因此这些化合物中的每一个均可以用来激活多能干细胞中的Wnt信号通路。在其它实施方案中，本文所述的方法和组合物采用了GSK-3p的抑制剂，例如，从Calbiochem(SanDiego，USA)获得的抑制剂。其包括1-Azakenpaullone(Calbiochem目录号191500)、Alsterpaullone(Calbiochem目录号126870)、FRATtide(Calbiochem目录号344265)、GSK-3b抑制剂VII(Calbiochem目录号361548)、GSK-3b抑制剂XI(Calbiochem目录号361553)、GSK-3b抑制剂I(Calbiochem目录号361540)、GSK-3b抑制剂II(Calbiochem目录号361541)、GSK-3b抑制剂III(Calbiochem目录号361542)、GSK-3抑制剂IX(Calbiochem目录号361550)。其它可以从Calbiochem获得的GSK-3P抑制剂包括InSolutionGSK-3抑制剂IX(Calbiochem目录号361552)、GSK-3抑制剂X(Calbiochem目录号361551、GSK-3抑制剂XIII(Calbiochem目录号361555)、GSK-3抑制剂XIV、Control、MeBIO(Calbiochem目录号361556)、GSK-3b抑制剂VI(Calbiochem目录号361547)、GSK-3b抑制剂XII，TWS119(Calbiochem目录号361554)、GSK-3b抑制剂VIII(Calbiochem目录号361549)、GSK-3b肽抑制剂(Calbiochem目录号361545)、GSK-3b肽抑制剂、细胞渗透性(Calbiochem目录号361546)、Indirubin-3'-monoxime(Calbiochem目录号402085)、Kenpaullone(Calbiochem目录号422000)。GSK-3卩抑制剂可以在任何有效浓度下使用，例如，通常在l(aM和lOiuM之间。在其它实施方案中，可以通过使用在Leclerc,etal.,(2001)，J.Biol.Chem.276(2001)，pp.251—260以及Knockaertetal.,(2002)，J.Biol.Chem.277(2002),pp.25493-25501中所描述的依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDK)抑制剂来激活Wnt信号。卩-连环蛋白如在本文中所用的术语，P-连环蛋白是指含有NCBIGeneID93703的序列。磷酸化形式的P-连环蛋白被靶向破坏，而非磷酸化形式是活性的。p-连环蛋白在胞质中的累积导致其在核内的累积，以及随后Wnt效应基因或者Wnt耙基因的转录激活。因此，我们提出通过p-连环蛋白的激活来激活Wnt信号，我们是指能最终导致细胞内P-连环蛋白活性减少的任何方法，例如活性(非磷酸化)的P-连环蛋白在细胞中的累积。上述方法可以包括任何增加P-连环蛋白的表达或者活性的方法，例如用表达P-连环蛋白(或者如下文中所描述的其组成型活性形式)的表达载体转染胚胎干细胞。上述方法也可以包括，替代地或者另外地包括，P-连环蛋白降解的抑制或者下调，例如通过利用激酶抑制剂或者磷酸酶等来下调P-连环蛋白的磷酸化。在本文中所描述的方法和组合物也可以利用P-连环蛋白来激活Wnt信号。该组成型活性P-连环蛋白的形式包括例如不能被降解如不能被磷酸化的P-连环蛋白。(3-连环蛋白的非磷酸化形式可以是缺失一个或者多个磷酸化所需位点的形式，不论是激酶结合位点，或者是磷酸结合位点。Mu腿itsu等1996年在MolCellBiol.16(8):4088-94以及Yost等1996年在GenesDev.10(12):1443-54中对其突变形式进行了描述。Reya等2003年在Nature423(6938):409-14上也描述了通过转染表达构建体来实现P-连环蛋白的过量表达。在一些实施方案中，(3-连环蛋白构建体是如Reya等所描述的N末端截短的形式。(3-连环蛋白的突变形式还包括突变体，其中有一个或者多个在Wnt信号和癌症中特异的残基(GenesDev2000Aug1;14(15):1837-51)被突变成另一个氨基酸，例如丙氨酸。上述突变体还包括缺失N端50-90氨基酸的缺失突变体，即被GSK-3b、APC、Dsh复合物磷酸化的残基。上述突变形式是Wnt无响应的，可以提供给胚胎干细胞(不论是在外部的培养基中还是作为内部的表达产物)来引起向中胚层或者内胚层途径的分化。构型在一些实施方案中，基本上将目的种群中的全部细胞都暴露于使Wnt信号通路同时激活的信号。上述细胞可以接受大体相同水平的信号，例如在大体上相同的时间内。在一些实施方案中，细胞相互之间而且相对于其培养的容器进行构型，通过上述方式来实现这些目标。例如，细胞可以排成二维构型来使其均匀暴露于该信号。因此，在某些实施方案中，多能干细胞在Wnt信号通路被激活的至少一部分时间内基本上内处于二维构型。在一些实施方案中，多能干细胞在Wnt信号通路被激活的基本上全部时间内都处于上述构型。对于二维构型，我们是指一种构型，其中细胞被允许沿二维方向生长，而基本上不向第三方向生长。在一些实施方案中，细胞基本上不会层层"堆积"。至少其中一些细胞，例如大部分或者全部细胞可以直接或者间接结合到底物上。该细胞可以与底物直接结合并且在底物上生长。该细胞可以通过间接结合到底物上的细胞而与底物间接结合。该细胞可以与底物相接触。上述底物可以包括容器或者饲养层(feederlayer)的表面。细胞可以结合到该底物上。在一些实施方案中，细胞可以处于平坦的构型。构型的实例包括单层细胞。在一些实施方案中，细胞没有按照拟胚体的形式进行排列。种群中至少有70%，例如至少80%的细胞可以沿相同的途径进行分化。胚胎干细胞和祖细胞(progenitorcells)本文所述的方法能够产生中胚层或者内胚层谱系的部分分化的祖细胞及其细胞系。胚胎干细胞在分化的过程中，它们通常重演了早期哺乳动物发育的复杂度，其中胚胎干细胞通过一系列谱系限制过渡，从而在最终产生代表所有三胚层的终末分化细胞之前产生谱系潜能减少的祖细胞(Wiles,MethodsinEnzymology.1993;225:900-918)。通常，干细胞在其达到完全分化的状态(被称为先祖(progenitor)或者祖细胞(progenitorcell))之前，产生一种或者多种中间细胞类型。胎儿或者成体组织中的先祖或者祖细胞是部分分化的细胞，其可以进行细胞分裂并产生分化的细胞。这些细胞通常被看作是"指定"向特定细胞发育途径分化的，因此祖细胞有时被称为"定向干细胞"。我们的方法能够产生各种类型的祖细胞及细胞系，尤其是中胚层或者内胚层类型。例如，我们公开了制备外周血祖细胞(peripheralbloodprogenitorcells,PBPC)、造血祖细胞、骨髓袓细胞、骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells)、骨骼肌祖细胞、胰岛祖细胞、间充质祖细胞、心脏中胚层干细胞、肺和肝脏祖细胞的方法。根据本文所述方法制备的中胚层或者内胚层类型的祖细胞，其可以应用于各种商业上重要的研究、诊断以及治疗的目的。这些应用在本领域通常是公知的，但是仍然将在本文中作简要的描述。例如，本文中述的方法和组合物可以应用于胚胎干细胞来产生用于再生治疗的中胚层或者内胚层祖细胞群。可以通过离体扩展(exvivoexpansion)或者直接施用于患者来制备祖细胞。其也可以用于创伤后损伤组织的再生(re-population)。因此，造血祖细胞可以用于骨髓替换，而心肌祖细胞可以用于心力衰竭(cardiacfailure)患者。皮肤祖细胞可以用于产生用于患者的皮肤移植物，内皮祖细胞用于人工修复再生，例如支架或者人造心脏。胚胎干细胞可以用作治疗退行性疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等的中胚层或者内胚层祖细胞的来源。胚胎干细胞可以用作免疫治疗癌症的NK细胞或者树突状细胞的中胚层或者内胚层先祖的来源，其中中胚层或者内胚层先袓可以通过本文所述的方法和组合物来制备。显然，本文所述的方法和组合物能够产生中胚层或者内胚层祖细胞，当然可以采用本领域的公知方法对其进一步分化产生终末分化的细胞类型。因此，终末分化细胞的任何应用都将同样归于作为其来源的那些中胚层或者内胚层祖细胞。通过本文所述的方法和组合物所产生的中胚层或者内胚层祖细胞可以用于疾病的治疗，或者是用于制备疾病治疗的药用组合物。上述疾病可以包括通过再生疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等以及癌症o祖细胞的特征本文所述的方法和组合物可以用于诱导胚胎干细胞分化成部分分化的中胚层或者内胚层祖细胞。在一些实施方案中，祖细胞和细胞系(或者来源于其的分化细胞)不显示胚胎干细胞的一个或者多个特征。这些特征包括OCW基因的表达和碱性磷酸酶的活性。祖细胞系可以表现出一个或者多个多能性特征性标记的表达降低。在下文中将对上述多能性标记作进一步详细描述，但是其包括A^wog、BM尸么FGF5、Oc"、5bx-2以及C/〖/7。通过本文所述的方法制备的祖细胞可以是非致瘤性的。与能引起肿瘤形成的亲本胚胎干细胞的植入相比，当上述祖细胞被植入免疫妥协或者免疫缺陷的宿主动物时不会引起肿瘤。免疫妥协或者免疫缺陷的宿主动物可以是SCID小鼠或者Ragl-/-小鼠。在一些实施方案中，上述祖细胞在移植的延长期例如大于2周或者大于2个月，例如大于9个月之后不形成肿瘤。通过本文所述方法制备的祖细胞也可以显示下列一种或者多种特征。当在细胞培养液中培养至少IO代时，其可以具有根据染色体数估计的大体上稳定的染色体组型。其也可以表现出代与代之间大体上稳定的基因表达模式。我们指的是所选定的一组基因中一个或者多个例如大体上所有的表达水平在每代的祖细胞之间没有显著的改变。该组基因可以包括下列一个或者多个，其子集或者是全部cerbems(GenBankAccessionnos:NM—009887,AF031896,AF035579)、FABP(GenBankAccessionnos:NM—007980,M65034,AY523818,AY523819)、Foxa2(GenBankAccession應NM—010446,X74937,L10409)、Gata-1(GenBankAccessionnos:雨—00織9,XI5763，BC052653)、Gata-4(GenBankAccessionnos:NM—008092、AF179424、U85046、M98339、AB075549)、Hesxl(GenBankAccessionnos:NM—010420、X80040、U40720、AK082831)、HNF4a(GenBankAccessionnos:NM_008261、D29015、BC039220)、c画kit(GenBankAccessionnos:画一021099、Y00864、AY536430、BC075716、AK047010、BC026713、BC052457、AK046795)、PDGFRa(NM—011058、M57683、M84607、BC053036)、Oct4(GenBankAccessionnos:NM—013633、X52437、M34381、BC068268)、R丽l(GenBankAccessionnos:NM—009821、D26532、BC069929、AK051758)、Soxl7(GenBankAccessionnos:NM011441、D49474、L29085、AK004781)、Sox2(GenBankAccession謹NM_011443、U31967、AB108673)、Brachyury(NM—009309、X51683)、TDGF1(GenBankAccessionnos:NM—011562、M87321)禾口Tie-2(GenBankAccessionnos:NM—013690、X67553、X71426、D13738、BC050824)。本文所述的方法能产生祖细胞和祖细胞系以及完全分化的细胞，其包括祖细胞的克隆子代。术语细胞的"克隆子代"是指基本上没有经过任何转化处理或者遗传改变的细胞的子代。上述克隆子代没有经过实质的基因组改变，其在遗传上大体上与亲本细胞或者袓先(ancestor)例如胚胎干细胞(保留减少的潜能)相同。术语"祖细胞"也可以包括祖细胞来源的细胞系，即祖细胞系，反之亦然。中胚层和内胚层中胚层和内胚层细胞，包括终末分化的细胞以及定向中胚层和内胚层途径的细胞，它们的鉴定在本领域中是公知的。中胚层分化或者定向的标记包括T-brachyury、Gata2、Nkx2.5、白蛋白、Flkl、Runxl、Runx2、Handl、2以及Tbx5。可以通过对这些标记中任何一个或者多个的表达进行检测来检测中胚层细胞。内胚层分化或者定向的记号包括Soxl7、Foxa2、Gata4-6、AFP、MixLl、Goosecoid、Sox7、IPF1。可以通过对这些标记中任何一个或者多个的表达进行检测来检测内胚层细胞。在一些方面中，本文所述的方法和组合物提供了通过激活Wnt信号通路来从ES细胞生产中胚层细胞。在解剖学上接近并且共同的信号网络连结最早的中胚层和内胚层细胞，从而形成有别于外胚层的最初的中内胚层(KimelmanandGriffin2001,RodawayandPatient2001)。最初的中内胚层具有一定程度的发育可塑性，其能够被用来对适当的诱导物作出反应而分成中胚层或者内胚层。对于"中内胚层"细胞，我们是指具有向中胚层或者内胚层途径发育的潜能的细胞。上述细胞可以是双潜能细胞。在一些实施方案中，上述细胞没有并且也不可能向外胚层途径分化。在一些实施方案中，中内胚层细胞表达一种或者多种如在本文其它地方所描述的中胚层和/或者内胚层的标记。分化的中胚层或者内胚层细胞分化的细胞，例如部分或者终末分化的细胞，可以来自根据所述方法制备的祖细胞或者细胞系。因此我们公开了产生分化的细胞的方法，该方法包括产生如所描述的祖细胞或者细胞系，以及从中产生分化的细胞。根据本文所描述的方法制备的分化的细胞可以包括下列中的任何一种或者全部i)脂肪细胞脂肪或者脂肪组织的功能细胞类型，其在整个机体都有发现，尤其在皮肤下。脂肪细胞存储并且合成用于能量、热量调控以及对于机械冲击缓冲的脂肪ii)心肌细胞心脏的功能性肌细胞类型，其能够连续并且有节律地搏动iii)软骨细胞功能性细胞类型，其能产生用于制造关节、耳道、气管、会厌、喉以及脊骨和末端肋骨之间的椎间盘的软骨iv)成纤维细胞在机体大部分组织中发现的连接或者支持细胞。成纤维细胞提供有益的支持来帮助特定器官的功能细胞类型正确发挥作用V)肝细胞肝脏的功能性细胞类型，其产生用于代谢废物解毒、消灭红细胞并且回收其组分以及合成血浆蛋白的酶Vi)造血细胞产生血液的功能细胞类型。造血细胞被发现存在于成年骨髓中。在胎儿中，造血细胞被发现存在于肝、脾、骨髓以及子宫中胎儿周围的支撑组织Vii)肌细胞肌肉的功能性细胞类型Viii)成骨细胞负责造骨的功能性细胞类型ix)胰岛细胞胰腺的功能细胞，其负责分泌胰岛素、胰高血糖素、胃泌激素和生长激素抑制素。这些分子共同调节许多过程，包括碳水化合物和脂肪代谢、血糖水平以及酸分泌到胃中。在一些实施方案中，Wnt激活的ES细胞的分化可在体外进行。我们发现利用本文所描述的方法和组合物所产生的Wnt激活的细胞能够产生中胚层和内胚层。因此，这些细胞提供了细胞的改良的来源，其可以产生在治疗上重要的中胚层和内胚层来源的细胞类型。感兴趣的内胚层来源的细胞包括胰脏和肝细胞类型。我们将从该谱系中产生具有中胚层潜力的细胞，包括例如心肌细胞、上皮细胞、软骨细胞和成骨细胞。与其它方法的组合在本文所述的多能细胞Wnt通路的激活方法可以单独使用，或者可以与产生中胚层和内胚层衍生物和/或分化的细胞的任何已知方法相组合，其实例的描述参见下文。Wnt通路可以在这些方法之前、之后或者是同时激活。具体地说，通过包括激活多能干细胞中Wnt信号通路的方法从多能干细胞产生中胚层或者内胚层细胞。接着，在下文中描述的任何公知的方法可以用来从作为结果的中胚层或者内胚层细胞的细胞中产生特定分化的细胞类型。因此，例如，Kania,Blyszczuketal.2003;Kania,Blyszczuketal.2004所描述的方法可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生肝细胞。另夕卜，Assady,Maoretal.2001;Segev,Fishmanetal.2004所描述的方法可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生胰脏细胞。另外，Yamashita，Itohetal.2000所描述的方法可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生上皮细胞。另夕卜，Mummery,Wardetal.2002;Xu,Policeetal.2002;Kehat，Amitetal.2003;Mummery,Ward-vanOostwaardetal.2003所描述的方、去可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生心肌细胞。另夕卜，Buttery,Bourneetal.2001;Cao，Hengetal.2005所描述的方法可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生骨原细胞。另外，Kramer,Bohrnsenetal.2006所描述的方法可以与本文中所描述的Wnt通路的激活组合使用来产生软骨细胞。这些确定的方法在小鼠和/或者人ES细胞的分化中已表现出潜能。然而，分化过程的效率有限。根据本文所描述的方法和组合物，可以如本文所描述的通过Wnt通路的激活来对衍生的祖细胞进行处理从而对这些确定方法进行改良。由于这些细胞定向中胚层和内胚层，所以它们在产生所需的细胞类型上可能具有改良的效率。祖细胞和分化的细胞的应用根据本文所描述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系和分化的细胞可以应用于各种商业上重要的研究、诊断以及治疗的目的。例如，分化的中胚层或者内胚层细胞群可以用于制备分化的表型特异的抗体禾口cDNA文库。HandbookofExperimentalImmunology(Weir&BIackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmunology(Coliganetal"eds.)禾口MethodsofImmunologicalAnalysis(Masseyeffetal.,eds.，Weinheim:VCHVerlagsGmbH)对在抗体的生产、纯化和修饰以及其在免疫分析和免疫分离方法的应用中所使用的常规技术进行了描述。RNAMethodologies:ALaboratoryGuideforIsolationandCharacterization(R.E.Farrell，AcademicPress,1998);cDNALibraryProtocols(Cowell&Austin,eds.,HumanaPress)禾口FunctionalGenomics(Hunt&Livesey，eds.,2000)对涉及mRNA和cDNA文库制备的常规技术进行了描述。相对均质的细胞群尤其适用于药物筛选和治疗应用。在下文或者本文其它地方将对中胚层或者内胚层祖细胞系以及中胚层或者内胚层分化细胞的上述以及其它应用进行进一步详细的描述。所述祖细胞系和分化的细胞尤其可以用于制备治疗疾病的药用组合物。上述疾病可以包括通过再生疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等等以及癌症。药物筛选根据本文所描述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系以及中胚层或者内胚层分化细胞也可以用来筛选影响分化细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸等)或者环境条件(例如培养条件或者处理方法)。在一些应用中，祖细胞系和分化的细胞被用来筛选在细胞的长期培养中促进其成熟或者促进其增殖和维持的因子。例如，通过将候选成熟因子或者生长因子加到不同孔中的祖细胞或者分化细胞中，然后根据进一步培养和细胞应用所需的标准来确定任何表型的改变，从而对候选成熟因子或者生长因子进行检测。另外，中胚层或者内胚层祖细胞系以及分化的中胚层或者内胚层细胞的基因表达谱可以用来对这些细胞中独有的或者是高表达的受体、转录因子和信号分子进行鉴定。受体、转录因子和信号分子的特定配体、小分子抑制剂或者激活剂可以用来调节分化以及调节祖细胞系和分化细胞的性质。特定的筛选应用涉及药物研究中药物化合物的检测。读者通常可以参考标准教禾斗书"InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch",AcademicPress,1997和U.S.Pat.No.5,030,015以及在本文其它地方对药物筛选所作的一般描述。对候选药用化合物活性的鉴定通常包括将分化细胞与候选化合物相组合，确定由于该化合物而在细胞的形态学、标记表型或者代谢活性中导致的任何变化(与未处理的细胞或者是用无活性化合物处理的细胞相比较)，然后将该化合物的效应与所观察到的变化相联系。例如，因为该化合物经设计对中胚层或者内胚层细胞类型具有药理效应，或者是因为该化合物经设计在其它方面具有出人意料的副作用，所以可以进行上述筛选。两个或者多个药物可以组合(通过同时或者连续地与细胞组合)进行试验来检测可能的药物-药物相互作用效应。在一些应用中，最初可以根据潜在毒性对化合物进行筛选(Castelletal.,pp.375-410in"InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,"AcademicPress,1997)。首先通过对细胞生存力、存活、形态和某些标记、受体或者酶的表达或者释放来确定细胞毒性。通过测量DNA合成或者修复可以确定药物对染色体DNA的效应。[3H]胸腺嘧啶或者5-溴脱氧尿苷的并入，尤其是在细胞周期中非程序时相(unscheduledtimes),或者是在细胞复制所需的水平之上，与药物的作用一致。不利作用可能也包括通过中期染色体涂片(metaphasespread)确定的异常的姊妹染色体单体交换率。读者要了解进一步的详尽阐述可以参考A.Vickers(PP375-410in"InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,"AcademicPress,1997)。组织再生根据本文所描述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系以及中胚层或者内胚层分化细胞也可以用于需要组织重建或者再生的人类患者的组织重建或者再生。所述细胞以允许其移植到预期的组织位点以及重建或者再生功能缺失区域的方式来施用。例如，本文所描述的方法和组合物可以用于调控干细胞分化成中胚层或者内胚层细胞类型。祖细胞系和分化细胞可以用于组织工程学，例如用于皮肤移植物的生长。干细胞分化的调控可以用于人造器官或者组织的生物工程学，或者用于修复学，例如支架。利用我们的方法制备的肝细胞和肝细胞先祖(hepatocyceprecursors)可以用于修复肝损伤。一个上述实例是通过腹腔注射D-半乳糖胺引起的损伤(Dabevaetal.,Am.J.Pathol.143:1606，1993)。通过对肝细胞标记的免疫组织化学染色、显微鉴定生长的组织中是否有小管结构形式、以及治疗以恢复肝特异性蛋白合成的能力来对确定治疗的有效性。肝细胞可以用于通过直接施用的治疗或者是作为受试者急性肝衰竭后其肝组织再生时提供暂时肝功能的部分生物辅助装置。另外，根据本文所描述的方法制备的心肌细胞可以用于心肌低温损伤的治疗，不经治疗其会引起55n/。的左侧心室壁组织成为瘢痕组织(Lietal.，Ann.Thorac.Surg.62:654,1996;Sakaietal.，Ann.Thorac.Surg.8:2074，1999,Sakaietal.，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118:715，1999)。成功的治疗将会减少瘢痕的区域，限制瘢痕的扩张，并且改善根据收縮压、舒张压以及产生的压力(systolic，diastolic,anddevelopedpressure)所确定的心脏功能。也可以利用左前降支(leftanteriordescendingartery)远侧部的栓塞旋管(embolizationcoil)对心肌损伤建立模型(Watanabeetal.,CellTransplant.7:239，1998)，并且可以通过组织学和心肌功能对治疗的功效进行评价。心肌细胞的制备可以治疗中用于再生心肌和治疗心脏功能不全(U.S.Pat.No.5,919,449andWO99/03973)。癌症通过本文所述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系以及分化细胞可以用于癌症的治疗。术语"癌症"和"癌性的"指的是或者描述了哺乳动物的生理状况，其典型特征是未调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。上述癌症更详细的实例包括鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞瘤例如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病(neurofibromatosis)、宫颈癌、卵巢'癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidneycancer)、肾癌(renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)以及各种头和颈癌。另外的实例是实体瘤癌(solidtumorcancer)，包括结肠癌、乳癌、肺癌和前列腺癌；造血系统恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、再生障碍性贫血；；皮肤癌和家族性腺瘤性息肉病(familiaradenomatouspolyposis)。另外的实例包括脑肿瘤、结肠直肠肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、眼肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、睾丸肿瘤、肿瘤、骨肿瘤、滋养细胞肿瘤、输卵管肿瘤、直肠肿瘤、结肠肿瘤、肾肿瘤、胃肿瘤、甲状旁腺肿瘤。乳癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、恶性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和胆管癌也包括在内。在一些实施方案中，通过本文所描述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系以及分化细胞可以用来治疗T细胞淋巴瘤、黑素瘤或肺癌。通过本文所描述的方法和组合物制备的中胚层或者内胚层祖细胞系以及分化细胞也可以与抗癌剂例如内皮他丁(endostatin)和血管他丁(angiostatin)或者细胞毒素剂(cytotoxicagent)或者化学治疗剂组合使用。例如，药物例如阿霉素(adriamycin)、道诺霉素(daunomycin)、顺钼(cis陽platinum)、依托泊武(etoposide)、泰素(taxol)、泰索帝(taxotere)以及生物碱例如长春新碱(vincristine)和抗代谢物例如甲氨蝶呤。本文所用的术语"细胞毒素剂"是指抑制或者阻止细胞功能和/或者引起细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化学治疗剂以及毒素，例如细菌、真菌、植物或者动物来源的酶促活性的毒素或者其片段。此外，该术语包括癌基因产物/酪氨酸激酶抑制剂，例如在WO94/22867中公开的双环安莎霉素(bicyclicansamycins)、EP600832中所公开的1,2-双(芳氨基)安息香酸衍生物(l,2-bis(arylamino)benzoicacidderivatives)、EP600831中所公开的6,7-二氨基-1-酞嗪酮衍生物(6,7-diamino-phthalazin-1-onederivatives)、EP516598中所公开的4,5-二(芳氨基)-酞嗪酮衍生物(4，5-bis(arylamino)-phthaIimidederivatives)或者抑制酪氨酸激酶与含SH2的底物蛋白结合的肽(例如参见WO94/07913)。"化学治疗剂"是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括阿霉素、多柔比星(Doxorubicin)、5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、阿糖胞苷(Cytosinearabinoside,Ara-C)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、塞替派(Thiotepa)、白消安(Busulfan)、环磷酰胺(Cytoxin)、泰素、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑(Melphalan)、长春碱(Vinblastine)、博来霉素(Bleomycin)、依托泊甙、异环磷酰胺(Ifosfamide)、丝裂霉素C(MitomycinC)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春新碱、依托泊甙(VP-16)、长春瑞滨(Vinorebine)、卡铂(Carboplatin)、替尼泊甙(Teniposide)、道诺霉素、洋红霉素(Carminomycin)、氨基嘌呤(Aminopterin)、放线菌素D(Dactinomycin)、丝裂霉素C(Mitomycins)、烟酰胺(Nicotinamide)、Esperamicins(参见美国专利号4,675,187)、美法仑及其它相关氮芥、以及内分泌疗法(例如己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)、他莫西芬，LHRH拮抗药物、孕激素、抗孕激素等等)。干细胞在本文所使用的，术语"干细胞"是指一种细胞，其在分化时面临两种发育选择子细胞可能与原始细胞相同(自我更新)或者它们可以是更专业的细胞类型的先祖(分化)。因此干细胞能够采用一种或者其它的途径(存在另一个途径，在该途径中可形成每种细胞类型)。干细胞因此不是终末分化的细胞，其能够产生其它类型的细胞。在本文中提到的干细胞可以包括全能干细胞、多能干细胞以及专能干细胞。全能干细胞术语"全能"细胞是指一种细胞，其具有成为成体中任何细胞类型或者胚外膜任何细胞(例如胚盘)的潜能。因此，唯一的全能细胞是受精卵和其分裂产生的最初的4个左右的细胞。多能干细胞"多能干细胞"是真正的干细胞，具有产生机体中任何分化细胞的潜能。然而，其不能产生源于滋养层的胚外膜。已经发现了多种类型的多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞包括胚胎干细胞。胚胎干细胞胚胎干细胞(EmbryonicStem,ES)可以从胚泡的内细胞团(innercellmass,ICM)分离，其是植入时胚胎发育的阶段。胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞(EmbryonicGerm，EG)可以从流产胎儿的生殖腺先祖中分离。胚胎癌细胞胚胎癌细胞(EmbryonicCarcinoma,EC)可以从畸胎癌中分离，其是胎儿生殖腺中偶尔产生的一种肿瘤。与前两种不同，它们通常是非整倍体。所有三种上述类型的多能干细胞只能从胚胎或者胎儿组织中分离，而且能够培养。阻止这些多能干细胞分化的方法在本领域中是公知的。成体干细胞成体干细胞包括多种类型，包括形成神经、皮肤和血液的干细胞，其是骨髓移植的活性组分。这些后面的干细胞类型也是脐带来源干细胞的主要特征。尽管所选的干细胞类型限制了确切的细胞类型数，但是成体干细胞在实验室和机体内都可以发育成功能性的更专业的细胞类型。专能干细胞专能干细胞是真正的干细胞，但是其只能分化成数量有限的类型。例如，骨髓含有可以产生所有血液细胞而不是其它类型细胞的专能干细胞。专能干细胞是在成体动物中发现的。人们认为机体中每个器官(脑、肝)都含有多能干细胞，其能够替换死亡或者损伤的细胞。表征干细胞的方法在本领域中是公知的，其包括使用标准分析方法例如克隆分析法、流式细胞术、长期培养和分子生物学技术例如PCR、RT-PCR以及DNA印迹法。除形态差异以外，人类和鼠多能干细胞在其许多细胞表面抗原(干细胞标记)的表达上都有所不同。可以通过购买，例如从ChemiconInternational,Inc(Temecula,CA,USA)，获得鉴定干细胞标记的抗体，千细胞标记包括阶段特异性胚胎抗原1禾B4(Stage-SpecifcicEmbryonicAntigens1and4,SSEA-1和SSEA-4)以及肿瘤排斥抗原1-60和1-81(TumorRejectinAntigen1-60and1-801,TRA-1-60,TRA-1-81)。禾U用单克隆抗体对这些抗原进行免疫检测已经广泛用于表征多能干细胞(ShamblottMJ.et.al.(1998)PNAS95:13726-13731;SchuldinerM.et.al.(2000).PNAS97:11307-11312;ThomsonJ.A.et.al.(1998).Science282:1145-1147;ReubinoffB.E.et.al.(2000).NatureBiotechnology18:399-404;HendersonJ.K.et.al.(2002).StemCells20:329-337;PeraM.et.al.(2000).J.CellScience113:5-10.)。多能干细胞的来源各种类型的多能干细胞，包括胚胎干细胞，其可以包括下列非限制性的实例，可以在本文所描述的方法和组合物中使用以产生中胚层或者内胚层祖细胞、中胚层或者内胚层祖细胞系以及中胚层或者内胚层分化细胞。可以使用任何脊椎动物物种的多能干细胞。包括来自人类以及非人类的灵长类、家畜(domesticanimals)、牲畜(livestock)以及其它非人类的哺乳动物。适合本发明使用的干细胞是来自怀孕后所形成的组织的灵长类多能干细胞(primatepluriopotentstem,pPS)，例如在怀孕期间任何时间所获得的胚泡或者胎儿或者胚胎组织。非限制性的实例是原代培养或者确定的胚胎干细胞系。培养基和饲养细胞分离和增值pPS细胞的培养基可以是多种不同配方中任何一种，只要获得的细胞具有所需的特征，并且能够进一步增殖。合适的来源如下Dulbecco改良的Eagle's培养基(Dulbecco'smodifiedEaglesmedium,DMEM)、Gibco#l1965-092;敲除Dulbecco改良的Eagle's培养基(KnockoutDulbecco，smodifiedEaglesmedium,KODMEM),Gibco#10829-018;200mML-谷氨酰胺、Gibco#15039-027;非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050;卩-巯基乙醇，Sigma#M7522;人类重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性含血清的ES培养基是用80%DMEM(通常是KODMEM)、20%特级胎牛血清(FBS)(没有加热灭活)、0.1mM非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺以及0.1mM(3-巯基乙醇制备而成的。上述培养基经过滤后在4"C保存不超过2周。无血清ES培养基是用80%KODMEM、20%血清替代品、O.lmM非必需氨基酸、lmML-谷氨酰胺以及0.1mMP-巯基乙醇制备而成的。有效的血清替代品是Gibco#10828-028。该培养基经过滤后可以在4。C保存不超过2周。仅在使用前，添加人bFGF至4ng/mL的终浓度(Bodnaretal.,GeronCorp,InternationalPatentPublicationWO99/20741)。饲养细胞(当使用时)在含90%DMEM(Gibco#11965-092)、10%FBS(Hyclone弁30071-03)以及2mM谷氨酰胺的mEF培养基上增值。mEF在T150培养瓶(Coming弁430825)中培养，每隔一天用胰蛋白酶裂解细胞1:2，保持细胞次融合状态。为了制备词养细胞层，细胞经一定剂量的辐照(大约4000mds的Y辐照)来抑制增殖但是允许支持人类胚胎干细胞的重要因子的合成。通过用每孔lmL0.5。/。明胶在37。C过夜孵育包被6孔培养板(例如Falcon#304)，并且每孔用375,000经辐照的mEFs涂布平板。饲养细胞层通常在涂布平板后5h至4天后使用。该培养基在接种pPS细胞之前用新鲜的人(humanembryonicstem,hES)培养基替换。培养其它干细胞的条件是公知的，并且可以根据细胞类型进行适当的优化。在所引证的参考中提供了上一节中所提到的特定细胞类型的培养基和培养技术。胚胎干细胞可以从灵长类成员的胚泡中分离胚胎干细胞(Thomsonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995)。可以利用Thomsonetal.(U.S.Pat.No.5,843,780;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff"1998)和Reubinoffetal，NatureBiotech.18:399,2000中所描述的技术从人类胚泡细胞制备人类胚胎干细胞(humanEmbryonicStem,hES)。简言之，可以通过人体内预先植入胚胎而获得人类胚泡。可选地，可以使用体外受精(invitrofertilized,IVF)胚胎，或者人类胚胎能够扩大到胚泡期的细胞(Bongsoetal"HumReprod4:706,1989)。将人类胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养到胚泡期(Gardneretal.,Fertil.Steril.69:84,1998)。选择发育的胚泡用于胚胎干细胞的分离。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)来从胚泡中除去透明带。通过免疫切除法分离内细胞团，其中胚泡暴露于1:50稀释的兔抗人脾细胞抗血清30分钟，然后用DMEM洗涤三次5分钟，暴露于1:5稀释的豚鼠补体(Gibco)3分钟(参见Solteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:5099,1975)。再用DMEM洗涤两次之后，通过轻轻吹打从完整的内细胞团(intactinnercellmass,ICM)中除去裂解的滋养外胚层细胞，并且将ICM铺在mEF滋养层上。9到15天后，通过暴露于添加有1mMEDTA、不含钙镁的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate-bufferedsaline,PBS)、通过暴露于分散酶或者胰蛋白酶或者通过用微量移液器机械分离，将内细胞团来源的生长晕(outgrowths)分散成团，然后用新鲜培养基重新铺于mEF上。游离细胞用新鲜ES培养基重新铺于mEF滋养层上，并且观察集落的形成。通过微量移液器逐个选择具有未分化形态的集落，机械分离成团并且重新铺板。胚胎干细胞样形态的特征是具有明显高的核质比以及明显核仁的紧凑型集落。然后，所产生的胚胎干细胞每1-2周进行常规分裂，其是通过短暂的胰蛋白酶消化、暴露于Dulbecco'sPBS(不含钙或者镁，含2mMEDTA)、暴露于IV型胶原酶(大约200U/mL;Gibco)或者通过微量移液器对单个集落进行选择而进行的。大约有5至100个细胞的细胞团大小是最佳的。自我更新和分化自我更新可以通过本领域所公知的各种方法分离自我更新的干细胞，例如，形态学、免疫组织化学、分子生物学等等。上述干细胞可以表现出Oct4和/或者SSEA-1表达增强。可以减少Flk-l、Tie-2和c-kit中任何一种或者多种的表达。自我更新的干细胞与非自我更新的干细胞相比可表现出縮短的细胞周期。例如，在二维的标准显微图像中，人类胚胎干细胞在平面图像中表现出高核质比、明显核仁以及形成没有明显细胞边界的紧凑型集落。利用标准G带显带技术(可以在许多提供常规染色体核型分析服务的临床诊断实验室获得，例如CytogeneticsLabatOaklandCalif)，可以对细胞系进行核型分析，并与已公布的人核型进行比较。人类胚胎干细胞和人类胚胎生殖细胞也可以由表达的细胞标记来表征。一般来说，可以采用合适的免疫技术，例如用于膜结合标记的流式细胞术、用于胞内标记的免疫组织化学以及用于分泌到培养基中的标记的酶联免疫测定，来对本公开中所讨论的组织特异性标记进行检测。利用标记特异引物通过反转录PCR，也可在mRNA水平对蛋白标记的表达进行检测。进一步的细节，参见U.S.Pat.No.5,843,780。阶段特异性胚胎抗原(State-specificembryonicangigens,SSEA)是某些胚胎细胞类型的特征。SSEA标记的抗体可以从DevelopmentalStudiesHybridomaBank(BethesdaMd.)获得。使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体，可检测其它有用的标记(Andrewsetal.,CellLinesfromHumanGemCellTumors,inE.J.Robertson,1987，同上)。人类胚胎干细胞通常是SSEA-1阴性和SSEA-4阳性的。hEG细胞通常是SSEA-1阳性的。pPS细胞的体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60禾BTra-1-81不表达以及SSEA-1的表达减少。pPS细胞也可以由碱性磷酸酶活性的存在来特征，其可以通过用4%多聚甲醛固定细胞，然后根据厂商所描述的以VectorRed作为底物进tf显影(VectorLaboratories,BurlingameCalif.)来检观U。胚胎干细胞通常也是端粒末端转移酶阳性和OCT-4阳性的。可以利用购买获得的试剂盒(TRAPeze.RTM.XKTelomeraseDetectionKit，Cat.s7707;IntergenCo.,PurchaseN.Y.;orTeloTAGGG.TM.TelomerasePCRELISAplus,Cat.2,013,89;RocheDiagnostics,Indianapolis)采用TRAP活性分析(Kimetal.,Science266:2011,1997)，可确定端粒末端转移酶的活性。通过RT-PCR，也可以在mRNA水平上对hTERT的表达进行评价。可以购得LightCyclerTeloTAGGG.TM.hTERT定量试剂盒(Cat.3,012,344;RocheDiagnostics),用于研究。分化分化中的细胞，包括祖细胞系以及源自祖细胞系的分化细胞，可以表现出4E-BP1和/或者S6K1增强的脱磷酸化作用。它们可以表现出Oct4禾口/或者SSEA-1的表达降低。可以增强Flk-l、Tie-2和c-kit中任何一个或者多个的表达。可以增强Brachyury、AFP、巢蛋白(Nestin)以及nurrl表达中任何一个或者多个的表达。自我更新的干细胞与非自我更新的干细胞相比可表现出延长的细胞周期。可以根据许多表型指标特别是包括转录变化来对分化中的干细胞，例如已开始分化、或者指定分化途径的细胞进行表征。上述指标包括但不限于形态学特征的表征、表达的细胞标记和酶促活性、基因表达的检测或者定量以及体内细胞的功能特性的确定。通常，分化中的干细胞会具有作为分化过程终产物的细胞类型即分化细胞的一个或者多个特征。例如，如果耙细胞类型是肌细胞，那么处在向该细胞的分化过程中的干细胞将会具有例如表达肌球蛋白的特征。因此，在许多方面该指标将依赖于分化中的干细胞的命运，下文提供了对各种细胞类型的一般描述。分化或者分化中的神经细胞感兴趣的标记包括P微管蛋白EIII或者作为神经元特征的神经丝；存在于星形胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP);作为少突神经胶质细胞特征的半乳糖脑苷脂(galactocerebroside,GaIC)或者髓磷脂碱性蛋白(mycelinbasicprotein,MBP);作为未分化的人类胚胎干细胞特征的OCT-4;作为神经先祖和其它细胞特征的巢蛋白。A2B5和NCAM分别是胶质祖细胞和神经先祖的特征。也可以对细胞的特征性生物学活性物质的分泌进行检测。例如，通过谷氨酸脱羧酶或者Y-氨基丁酸(GABA)的产生来鉴定分泌Y-氨基丁酸的神经元。可以通过多巴脱羧酶、多巴胺或者酪氨酸羟化酶的产生来鉴定多巴胺能神经元。分化或者分化中的肝细胞感兴趣的标记包括a-甲胎蛋白(肝先祖)、白蛋白、al抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素p450活性、转铁蛋白、唾液酸糖蛋白受体以及糖原贮积(肝细胞)、CK7、CK19以及Y-谷氨酞转移酶(胆管上皮细胞)。有报道指出肝细胞的分化需要转录因子BNF-4a(Lietal.,GenesDev.14:464,2000)。不依赖HNF-4a表达的标记包括al抗胰蛋白酶、a-甲胎蛋白、载脂蛋白E、葡萄糖激酶、胰岛素样生长因子1和2、IGF-1受体、胰岛素受体以及痩素。依赖HNF-4a表达的标记包括白蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白B、载脂蛋白cin、载脂蛋白cn、醛縮酶B、苯丙氨酸羟化酶、L型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白以及促红细胞生成素(EPO)。可以通过特征性形态及其所表达的标记对pPS细胞来源的混合细胞种群中的细胞类型进行鉴别。对于骨骼肌myoD、肌细胞生成素和myf-5。对于上皮细胞PECAM(血小板内皮细胞黏附分子)、Flk-l、tie-i、tie-2、血管内皮(vascularendothelial,VE)转粘蛋白、MECA-32和MEC-14.7。对于平滑肌细胞具体的肌球蛋白重链。对于心肌细胞GATA-4、Nkx2.5、心肌钙蛋白I、a-肌球蛋白重链以及心钠素(ANF)。对于胰腺细胞pdx和胰岛素的分泌。对于造血细胞及其先祖GATA-1、CD34、AC133、f3-主要球蛋白((3-majorglobulin)以及(3-主要球蛋白样基因PH1。可以通过免疫技术对本公开中所列的或者是本领域中公知的某些组织特异性标记进行检测，例如用于细胞表面标记的流式细胞术、用于胞内或者细胞表面标记的免疫组织化学(例如，对固定的细胞或者组织切片)、细胞提取液的免疫印迹分析以及用于分泌到培养基中的细胞提取液或者产物的酶联免疫测定。也可以通过RNA印迹分析、斑点印迹杂交分析或者通过在标准扩增方法中采用序列特异引物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)在mRNA水平对组织特异性基因产物的表达进行检测。本公开中所列的具体标记的序列资料可以从公共数据库例如GenBank(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)中获《导。实施例实施例1材料和方法细胞裂解产物的制备以及蛋白印迹用冷的PBS洗涤细胞两次，然后采用来自CellSignaling公司的添加有25mM氟化钠(NaF)、1mM原钒酸钠(Na3V04)、1%DOC、1%NP40和蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)的裂解缓冲液进行总蛋白质的提取。细胞裂解产物在冰上孵育20分钟，4°C13000rpm离心15分钟。对上清进行蛋白含量的预测。每个泳道上样40g的蛋白并且在12%的SDS-PAGE上进行溶解。溶解的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。该印迹与一抗、卩-肌动蛋白(Chemicon)、Oct4、Nanog、Wnt-3A(SantaCmzBiotechnology)、SSEA4(DHSB)、活性卩-连环蛋白(UBI)以及用5%脱脂牛奶稀释的合适的HRP轭合的二抗(Pierce)进行孵育。采用ECL免疫印迹检测试剂(Pierce)对印迹进行显影。RNA提取MESCs经胰蛋白酶处理并重悬于三唑(trizol)中。用trizol试剂(Gibco)提取总RNA。根据厂商说明书(Qiagen)采用离心柱对RNA做进一步纯化。根据厂商说明书采用含有缓冲溶液、随机引物、反转录酶和dNTPs(Promega)的Archive试剂盒将1g总RNA转变为cDNA。cDNA1:10稀释用于实时RCR。常规PCR如上文所述，将1gE14s总RNA转变为cDNA。采用E14cDNAs、10x缓冲液(Invitrogen)、2.5mMdNTPs(Promega)、1.5mMMgCl2(Invitrogen)、1M正反向引物(Proligos)以及Taq聚合酶，制备PCRmix。所采用的PCR热循环如下；1)95T10分钟，2)95DC1分钟30个循环，退火温度为55°C并且在72。C延伸1分钟，3)72°C分钟并且于4°。保持冷却。巻曲蛋白基因序列如下巻曲蛋白2正向序列是5'-ACATCGCCTACAACCAGACC-3，；巻曲蛋白2反向序列是5，-GAGATAGGACGGCACCTTGA-3，；巻曲蛋白5正向序列是5，-GGCATCTTCACCCTGCTCTA-3';巻曲蛋白5反向序列是5'-GCCTCCAGGCCTTCCTATAC-3，；巻曲蛋白7正向序列是5，-TCTGTCCCTCACTTGGTTCC-3，；巻曲单比7反向序列是5，-AAGTAGCAGGCCAACACGAT-3，。荧光素酶分析在293-T细胞和mES细胞中，进行荧光素酶分析。TOPFlash和FOPFlash质粒从UpstateBiotechInc购买。禾U用Lipofectamine2000(Invitrogen)以该质粒短暂转染细胞。用编码海肾荧光素酶的质粒(pRL-TK)来对转染效率进行标准化。根据厂商说明书采用Promega试剂盒进行荧光素酶分析。实时PCR根据厂商说明书通过混合稀释的cDNA(参见上文RNA提取)、mastermix(AppliedBiosystems)以及探针来制备PCRmix。用从未处理mES或者hES细胞在合适日期制备的cDNA作为处理细胞的对照。采用ABI7900HT序列检测仪(S叫uenceDetectionMachine)对样品进行处理。结果采用SDS2.2进行分析。结果表示为与未处理的小鼠或者人类ES细胞相比增加的倍数。荧光配套的细胞分选(Fluorescene-AssortedCellsSorting,FACS)将HESCs经胰蛋白酶处理并且按每个样品5X105个细胞分成等份。将细胞用FIX和PERMcell试剂盒(CaltagLaboratories)固定并进行渗透性处理。将细胞用抗SSEA-4抗体(DHSB)在室温(roomtemperature,RT)孵育15分钟。将细胞用溶于PBS的1。/。牛血清白蛋白(BSA)洗涤两次。将细胞用轭合FITC的羊抗小鼠二抗在室温(RT)下孵育15min。将细胞用含1%BSA的PBS再洗涤两次并且利用FACS分析仪(BD)对细胞进行分析。对照不加一抗，其余步骤按照早先所提及的。6-溴靛玉红-3，-肟(BIO)6-6-溴靛玉红-3，-肟(BIO)从AliBrivanlou(RockefellerUniversity)获得。实施例2小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞(MouseEmbryonicStemmCells,mESCs)-E14TG2a从ATCC获得。在包被有0.P/。明胶的培养皿上无饲养层培养(feederfreecultured)mESCs，培养皿上含有白血病抑制因子(LIF)以及含有DMEM、15%ESqualifiedFCS、ImM非必需氨基酸、O.lmM(3-巯基乙醇以及ImML-谷氨基酰胺(均来自Invitrogen)的生长培养基。实施例3人类胚胎干细胞从WiCellResearchInstitute,Madison,WI(Thomsonetal.1998)获得人类胚胎干细胞(HumanEmbryonicStemCells,hESCs)-Hl。HI细胞在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上培养并且在生长培养基中维持培养，所述生长培养基含有DMEM/F12培养基(其含20%敲除血清替代品)、lmML-谷氨酰胺、lmM非必需氨基酸、0.1mM卩-巯基乙醇以及4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)(均来自Invitrogen)。釆用DMEM和10。/。FCS(均来自Invitrogen)培养人类胚肾(293T)细胞。细胞培养于37。C、5。/。C02的条件下。实施例4Wnt3A条件培养基如Shibamoto等(Shibamotoetal.1998)所描述，利用过量表达并且分泌Wnt-3A的L细胞制备Wnt-3A条件培养基(CM)和对照CM。实施例5小鼠胚胎干细胞中Wnt信号的激活将小鼠ES细胞在0.1%明胶包被的培养皿上连续培养3周，培养皿内含有LIF以及仅有生长培养基(对照)或者有1UMGSK-3e抑制剂(iGSK-3p，EliLilly).或者有50°79的生长培养基和50°79的Wnt-3ACM。每两天采用0.25%的胰蛋白酶对细胞进行传代并且每隔一天更换培养基。实施例6人类胚胎干细胞中Wnt信号的激活同样地，将Hl细胞在经辐照的MEFs上连续培养3周，所述MEFs含有bFGF以及仅有生长培养基(对照)或者有MGSK-3e抑制剂(iGSK-3p,EliLilly)或者有50%的Wnt-3ACM和50%的生长培养基。每天更换培养基，并且采用IV型胶原蛋白酶(Gibco)，将细胞每周传代一次。实施例7未分化的小鼠和人类ES细胞中存在Wnt信号通路的组分未分化小鼠和人类ES细胞的综合转录谱(comprehensivetranscriptomeprofiling)表明，这些细胞表达Wnt信号通路的所有胞内组分，包含拮抗剂sFRP(Brandenbergeretal.2004)。该结果表明ES细胞随时准备对Wnt配体产生反应。我们利用未分化的小鼠和人类ES细胞裂解产物来进行蛋白免疫印迹分析，并且证实存在Wnt信号分子LRP受体、散乱蛋白和(3-连环蛋白以及拮抗剂sFRP(图1A)。对未分化的E14RNA进行的RTPCR分析证明，存在三种巻曲蛋白(Fz)受体即Fz2、Fz5和Fz7(图1B)。信号蛋白和拮抗剂的存在表明，ES细胞调节/抑制Wnt信号作为调控分化的方式。实施例8Wnt信号激活剂的活性我们对ES细胞响应Wnt通路的激活而分化进行了评价。以两种方式诱导Wnt信号通过加入活性Wnt-3A和通过加入GSK-3的选择性抑制剂。Wnt-3AWnt-3A条件培养基(CM)是由Wnt-3A过表达而且分泌的细胞L细胞制备而成的(Shibamotoetal.1998)。由L细胞制备而成的条件培养基用作对照CM。利用抗Wnt-3A抗体通过蛋白免疫印迹证实CM中存在Wnt-3A蛋白(图1C)。为了确定存在于CM中的Wnt-3A蛋白的生物活性，使用荧光素酶报告基因分析系统，其中荧光素酶的表达是在TCF结合位点(TOPflash)或者是突变的非反应性结合位点(FOPFlash)。当Wnt-3ACM加入293T细胞和小鼠ES细胞中时，其增强TOPFLASH分析中荧光素酶报告基因的活性(图lD)。Wnt-3ACM与从商业来源获得的纯化的Wnt-3A(100ng/ml)相比更有活性，并且来自L细胞的对照CM对荧光素酶分析不起任何作用(图1D)。iGSK-3(3我们采用来自EliLilly的GSK-3(3(称为iGSK-3(3)特异性抑制剂作为Wnt通路的胞内激活剂。利用我们的iGSK-3(3和BIO进行荧光素酶报告基因分析来比较这些化合物激活Wnt通路的特异性和潜能(Satoetal.2004)。在报告基因分析中iGSK-3p显著增强荧光素酶活性(图1E)，与采用同样浓度的BIO化合物(图1E)所获得的相比，提高了50%，表明iGSK-3(3比BIO具有更高的潜能。实施例9活性p-连环蛋白的累积Wnt通路的激活导致去磷酸化的P-连环蛋白在胞质中的累积(Shibamotoetal.1998)。利用抗活性/去磷酸化p-连环蛋白的抗体，通过蛋白免疫印迹分析，结果表明在小鼠和人类ES细胞中加入Wnt-3ACM和iGSK-3(3导致活性卩-连环蛋白的累积(图1F)。来自L细胞的对照CM对P-连环蛋白水平的提高不起任何作用(图1F)。这表明ES细胞中存在活性Wnt信号。实施例10Wnt信号通路的短期激活诱导小鼠胚胎干细胞中胚层/内胚层的分化为了分析ES细胞中Wnt信号的激活是否会诱导分化或者保持ES细胞的多能性，我们采用Wnt-3ACM、对照CM和iGSK-3p对E14细胞(小鼠胚胎干细胞)进行了短期(4-8天)分化。进行实时PCR分析来评价标记基因表达的变化。E14细胞中加入Wnt-3ACM和iGSK-3卩诱导细胞分化，其也被早在第四天的分化标记(Mixll、Foxa2、T-brachyury)的上调(5-100倍)所证明(图1G)。Mixll与内胚层的发育有关(Harteta1.2002)。由于分化中的细胞表达Foxa2和T-brachyury，因此它们能向双潜能中内胚层细胞分化(Kuboetal.2004)。甚至在第八天，对照CM对E14细胞的诱导分化不起任何作用，表明所观察到的E14细胞分化是由于CM中存在Wnt-3A。人类ES细胞的短期(4天)处理产生了相似的结果，而且对照CM对人类ES细胞的诱导分化再次不起任何作用。这些结果表明CM中存在的生物活性Wnt-3A诱导ES细胞中胚层/内胚层的分化，而且我们通过在小鼠和人类ES细胞中长期激活Wnt通路对其做了进一步探讨。实施例11Wnt信号通路的长期激活诱导小鼠胚胎干细胞中胚层/内胚层的分化(21天)为了确定未分化ES细胞中Wnt通路长期激活的效果，分别用Wnt-3A和lpMiGSK-3(3处理无饲养层E14细胞(feederfreeE14cells)(小鼠胚胎干细胞)3周。为了追踪这些经处理的细胞的分化状态，采用未处理的E14cDNA作为对照，进行实时PCR分析，标绘的数据与未处理E14细胞相比成倍增加。由于没有观察到巢蛋白、Sox4、Pax6的表达，我们没有获得向外胚层/神经外胚层的分化。在第10天和第21天都观察到许多中胚层(T-brachyury、Runxl、Pitx2)和内胚层(Gata4、Foxa2、Soxl7)特异转录因子表达的大幅增加(10-100倍)(图2A、B)。作为卩-连环蛋白的直接靶标，T-brachyury和Pitx220-200倍的上调表明，在两种处理的细胞中Wnt通路确实都得以激活。Pitx2的上调表明强大的中胚层潜能。在非洲爪蟾属(Xe"^^)中，VegT诱导Soxl7的表达，然后Soxl7和(3-连环蛋白共同调控内胚层基因例如Foxa2、Edd、Foxal的转录(SinnerDeta1.2004)。与该结果一致，对我们的细胞中Wnt的激活作出反应，T-brachyury(VegTortholog)能经由Soxl7调控内胚层基因例如Foxa2。在第10天，与Wnt-3A处理的细胞相比，iGSK-3p处理的细胞表现出标记基因表达水平明显提高(图2A)，然而，在第21天，两种细胞均表现出标记基因表达提高相当(图2B)。在第"天和第21天，Foxa2和Soxl7明显上调(IO-IOO倍)(图2A,B)，其是定形的内胚层标记，其也可通过腔内内胚层表达(Keller2005)。在相同细胞中T-brachyury(其在腔内内胚层中不表达)的20倍的上调(图2A和图2B)证明，该细胞正在向定形的内胚层分化(Keller2005)。LPF1没有诱导表明细胞没有向胰腺内胚层分化。分化早期的双潜能中内胚层祖细胞通常表达T-brachyury和GATA家族转录因子。这些祖细胞后来对合适的刺激作出反应通过分别表达T-brachyury、Nkx2.5和twist或者是Foxa2、Soxl7和GATA4-6来指定中胚层或者内胚层，这表明可以进一步将我们的处理细胞的最终命运处理成具体的细胞类型(参见Technau和Scholz2003的综述)。第21天，Wnt-3A和iGSK-3p处理的细胞表现出最初的中胚层内胚层的分化，然而，Wnt-3A处理的细胞与iGSK-3(3处理的细胞相比，T-brachyury的表达减少(5倍)并且Pitx2的表达增加(110倍)。因此，尽管在上述两种情况下，权威的Wnt通路都被激活，但是在细胞对不同激活物的反应方式上有细微的差别。在形态学上，经Wnt-3A和iGSK-3|3处理的E14细胞与未处理的细胞有差别。与未分化ES细胞的典型的紧凑型形态相比，处理的细胞更加平展和松散。iGSK-3[beta]处理的细胞表现出不同的分化迹象例如存在不同形状的单个细胞以及出现拟胚体样结构(图2C)。ES细胞的分化通常会引起多能标记Oct4和Nanog的下调。通过蛋白免疫印迹分析(图2D)和实时PCR，未分化的E14细胞高水平表达Oct4和Nanog，然而，当细胞对Wnt激活作出反应而发生分化，甚至在第21天它们都保持Oct4和Nanog(图2D)。分化中的细胞存在Nanog再次排除向腔内内胚层的分化(Mitsuietal.2004)。Oct4的存在可能会负责抑制胚月台夕卜分化(extraembryonicdifferentiation)(Hayetal.2004)。实施例llAWnt信号通路的长期激活诱导小鼠胚胎干细胞中胚层/内胚层的分化(30天)重复上文中实施例11所描述的实验，时间期限为30天。获得了相同的结果。多能性标记以及中胚层和内胚层标记的表达表明，持续的Wnt信号诱导未分化的E14细胞向指定中胚层/内胚层的多能种群分化。以前，Rathjen等1999年曾报道了当用HepG2CM诱导细胞分化时相似的结果。实施例12人类胚胎干细胞Wnt通路的持续激活诱导中胚层/内胚层的分化尽管小鼠和人类ES细胞在许多方面是相似的，但是它们具有许多重要的区别，包括人类ES细胞中没有活性LIF信号通路(Ginisetal.2004)。为了确定人类ES细胞中Wnt通路长期激活的作用，Hl细胞(Wi细胞)在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上培养，分别用Wnt-3A和iGSK-3卩处理21天。通过实时PCR、蛋白免疫印迹和FACS分析，对处理的细胞的分化状态进行分析。采用未处理的HlcDNA作为对照进行实时PCR，标绘的数据与未处理的Hl细胞相比成倍增加。第8天，H1细胞的标记基因在mRNA水平绝对增加(图3A)(达到500倍)与经相同化合物在相同时间点(图2A)处理的小鼠ES细胞相比(达到30倍)具有较强的增长，表明人类ES细胞对Wnt通路的激活具有更高的敏感性。Hl细胞对Wnt通路激活作出反应，甚至在第15天都不表达指示外胚层/神经外胚层的标记即Pax6、Sox4和巢蛋白(图3A和图3B)。T-brachyury、Gata2、Nkx2.5和Handl10-500倍的上调表明在第8天中胚层分化(图3A)。然而，分化中的细胞在第8天内胚层标记例如Foxa2、AFP、Gata4、Soxl7的水平(达到100倍)增加(图3B)，因此表明细胞正在向这两种谱系分化。Mixll通常在内胚层形成早期表达(Hartetal2002,Shivdasani2002)，其对于内胚层分化是最关键的。持续的Wnt激活在8天内诱导Hl细胞中Mixll的表达提高多达100倍，如预期的，该表达在第15天减小至5倍。分化中的Hl细胞保持多能性标记Oct4和Nanog(图3C)，因此排除了胚胎外或者内脏内胚层的分化(Hayetal2004,Mitsuietal2003)。尽管iGSK-3p处理的Hl细胞中Oct4的水平部分降低(图3C)，但是与对照Hl细胞相比Nanog的水平没有降低。多能性标记及其分化标记的存在再次表明持续的Wnt信号诱导Hl细胞向中胚层/内胚层分化。形态学上，Hl细胞表现出不同的分化迹象，例如没有了紧凑的集落形态以及集落中出现不同形状的细胞(图3D)。为了分析在第21天结束后剩余的多能干细胞的比例，我们对经抗多能特异的细胞表面标记SSEA4的抗体染色的细胞进行FACS分析。如图4所示，未处理的H1细胞显示出SSEA4染色细胞的不同峰(图4A)。然而，在Wnt激活方面，Wnt-3A中SSEA4染色的细胞显著丧失而在iGSK-3p处理的细胞中更强烈(分别见图4B和4C)。SSEA4染色细胞的缺乏再次证实Wnt通路的激活诱导ES细胞的分化。与Satoetal.2004的研究相反，其认为Wnt通路与维持多能性有关，我们的资料确凿地证明了Wnt通路的持续激活诱导ES细胞的分化。实施例13胚胎干细胞(ES)中组成型活性P-连环蛋白突变体的表达在各种人类癌中发现了多种具有组成型活性的(3-连环蛋白突变体。这些突变是特异的而且都位于该蛋白氨基端结构域的残基中。这些残基可以被磷酸化并且在该蛋白的去稳定中发挥作用。这些突变阻断磷酸化作用，因此导致p-连环蛋白稳定性的增加。Wnt信号和癌(GenesDev.2000Aug1;14(15):1837-51)显示了一个表格，其列出了(3-连环蛋白中点突变的频率和位置。Polakis(2000)的表中所列的每个氨基酸经定点突变成丙氨酸以产生组成型活性的(3-连环蛋白突变体。也构建了缺失N端50-卯氨基酸(例如缺失所有被GSK-3b、APC、Dsh复合物磷酸化的残基)的P-连环蛋白缺失突变体。将编码突变体的核酸构建体亚克隆到哺乳动物转染载体。利用脂质体例如Lipofectamine将所产生的构建体转染到哺乳动物、小鼠和人类细胞。也可以根据厂商的规程，采用电穿孔来进行转染。表达载体转染或者电穿孔的宿主细胞过量表达组成型的活性(3-连环蛋白突变体。也产生了仅表达突变形式的P-连环蛋白的稳定的ES细胞系。利用中胚层和内胚层分化的标记，评价和观察ES细胞向中胚层和内胚层途径的发育。ES细胞在再生医学中的希望在于其产生体内任何类型细胞的潜能。然而，由于ES细胞能够自发分化(例如拟胚体形成)成多种谱系，因此产生治疗用途的具体细胞类型的主要障碍是难以得到均一而且纯的分化的细胞谱系。在早期阶段了解谱系定向对ES细胞在再生医学中的用途是关键的。本文中，我们提供了Wnt通路在中胚层/内胚层发育中的作用的第一手确凿证据。由于通过激活具体的通路，这些中胚层/内胚层细胞能够塑造成中胚层或者内胚层，所以可精巧地改变这些细胞的最终命运，可产生用于再生医学中的所需的细胞类型特异的谱系。实施例14利用GSK-3b抑制剂从Wnt通路持续激活的mES细胞种群中分离单个细胞克隆在连续培养中用GSK3b抑制剂处理小鼠ES细胞从而激活Wnt通路。为了从该种群中分离单个细胞克隆，我们使用了BDFACSAriaCellSortero简言之，小鼠胚胎词养层接种于96孔培养皿。GSK3b抑制剂处理的小鼠ES细胞经胰蛋白酶处理获得单细胞悬液，利用FACSAriacellSorter进行单细胞分选。将单个mES细胞接种到96孔培养皿的每个孔中，其中已经制备了饲养细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)。细胞分选后，ES细胞在GSK3b抑制剂存在的条件下培养2周，并且从96孔培养皿进一步扩大培养到10cm平板，逐渐不含饲养层细胞。实施例15单个细胞克隆的分析从单个细胞克隆中提取RNA，通过Q-RT-PCR对其进行分析来确定各种中胚层/内胚层标记的上调。如图8所示，关键的中胚层/内胚层标记例如T-brachyury、Foxa2、Soxl7、goosecoid、Gata4、Gata6、AFP、Pitx2上调了400倍。我们进行免疫组织化学来确定这些分化标记中有一些上调(参见图9)。接着我们分析了这些克隆分化成中胚层细胞类型例如内皮、心肌、成骨以及软骨的潜能。实施例16内皮的分化Wnt通路激活的克隆经胰蛋白酶处理累积形成拟胚体(EB)，将其涂布于含有内皮细胞形成所需生长因子的甲基纤维素中11天(ChoiKetal1998,Development125:725-732;Balconietal2000，AtheriosclerThrombVaseBiol20:1443-1451)。在第11天，收集EB并且用含和不含生长因子的胶原凝胶进行重悬。在胶原凝胶中培养2-3天后，对内皮芽(endothelialsprout)的形态进行评价。我们发现克隆23和38与未处理的E14细胞对照相比具有更显著出芽的EB(图10)。3-4天后收集出芽的EB，提取RNA来证明关键内皮标记的上调(图11)。出芽的EB也可以接种到腔室玻片(chamberslides)上，并且用抗内皮细胞关键标记的抗体对其进行免疫染色。实施例17心肌细胞的分化克隆经胰蛋白酶处理并按每ml25,000个细胞重悬。利用Petri培养皿通过已确定的悬滴法用2天制备EB。2天后，收集EB并用培养基重悬3天。3天后，EB结合到明胶包被的培养皿上。根据对每个EB中3或者多个收縮区(beatingareas)的观察来对心肌谱系的潜能进行打分。克隆23和38与对照E14细胞相比收縮EBs(beatingEBs)的比例更高(图12)。实施例18成骨和软骨形成的分化克隆接种到包被有明胶的培养皿上，并且在如ZukPAd等(2001,TissueEngineeringVol7，number2,pg21l-227)所描述的成骨和软骨形成所需的各种生长因子存在的条件下培养3周。3周后，提取RNA并且利用如Zuketal所描述的RT-PCR和染色方案来确定其分化状态。实施例19微阵列分析我们利用从E14细胞和克隆中提取的RNA，采用Ilumina小鼠基因表达分析工具进行微阵列分析。采用GeneSpring软件对获得的数据进行分析，所采用的错误发现率(FalseDiscoveryRate,FDR)为0.03。采用Mann-WhitneyU检验对产生的数据进行统计学验证。通过与PANTHERgeneonology数据库(AppliedBiosystems)的比较来评价具有统计学意义的基因的功能和谱系关系。我们发现了700个基因，与起始未分化的ES细胞相比，其是克隆中具有统计学意义的变化(上调和下调)。对上调基因的分析表明它们其中大部分属于各种发育过程例如中胚层诱导、骨骼发育、ECM信号、生长因子信号、细胞粘附。(参见下表El)_<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表El.微阵列分析表A显示了与E14对照相比GSK3b抑制剂处理的克隆具有显著下调的不同通路和过程。参考文献1)AngererLM,AngererRC.2000Animal-vegetalaxispatterningmechanismsintheearlyseaurchinembryo.DevBiol.218:1-12.2)AubertJ,DunstanH，ChambersI,SmithA.2002FunctionalgenescreeninginembryonicstemcellsimplicatesWntantagonisminneuraldifferentiation.NatBiotechnol.20:1240-5.3)BrandenbergerR,WeiH,ZhangS,LeiS,MurageJ,FiskGJ,LiY,XuC,FangR,GueglerK，RaoMS，MandalamR，LebkowskiJ,StantonLW.2004TranscriptomecharacterizationelucidatessignalingnetworksthatcontrolhumanEScellgrowthanddifferentiation.NatBiotechnol.22:707-16.4)FehlingHJ,LacaudG，KuboA，KennedyM,RobertsonS，KellerG,KouskoffV.2003Trackingmesoderminductionanditsspecificationtothehemangioblastduringembryonicstemcelldifferentiation.Development130:4217-27.5)GinisI,LuoY,MiuraT,ThiesS，BrandenbergerR，Gerecht-NirS，AmitM,HokeA,CarpenterMK,Itskovitz-EldorJ,RaoMS,2004Differencesbetweenhumanandmouseembryonicstemcells.DevBiol.269:360-806)GregorieffA,CleversH.2005Wntsignalingintheintestinalepithelium:fromendodermtocancer.GenesDev.19:877-90.7)HartAH，HartleyL,SourrisK,StadlerES,LiR,StanleyEG，TamPP,ElefantyAG,RobbL.2002Mixllisrequiredforaxialmesendodermmorphogenesisandpatterninginthemurineembryo.Development129:3597-608.8)HayDC,SutherlandL，ClarkJ,BurdonT.2004Oct-4knockdowninducessimilarpatternsofendodermandtrophoblastdifferentiationmarkersinhumanandmouseembryonicstemcells.StemCells.22:225-35.9)KellerG.2005Embryonicstemcelldifferentiation:emergenceofanewerainbiologyandmedicine.GenesDev.l9:l129-55.10)KimelmanD,GriffinKJ.2000Vertebratemesendoderminductionandpatterning.CurrOpinGenetDev.l0:350-611)KuboA,ShinozakiK,ShannonJM,KouskoffV,KennedyM,WooS,FehlingHJ,KellerG.2004Developmentofdefinitiveendodermfromembryonicstemcellsinculture.Development131:1651-62.12)LiuP,WakamiyaM,SheaMJ，AlbrechtU,BehringerRR,BradleyA.1999RequirementforWnt3invertebrateaxisformation.NatGenet,22:361-513)MillerJR，MoonRT.1996Signaltransductionthroughbeta-cateninandspecificationofcellfateduringembryogenesis.GenesDev.10:2527-39.14)MitsuiK,TokuzawaY,ItohH,SegawaK，MurakamiM，TakahashiK，MaruyamaM,MaedaM，YamanakaS.2003ThehomeoproteinNanogisrequiredformaintenanceofpluripotencyinmouseepiblastandEScells.Cell113:631-42.15)NusseR.2005Wntsignalingindiseaseandindevelopment.CellRes.15:28-32..16)RathjenJ,LakeJA,BettessMD,WashingtonJM,ChapmanG,RathjenPD.1999Formationofaprimitiveectodermlikecellpopulation,EPLcells,fromEScellsinresponsetobiologicallyderivedfactors.JCellSci.112:601-12.17)RodawayA,PatientR.2001Mesendoderm.anancientgermlayerCell105:169-72.18)SatoN,MeijerL，SkaltsounisL,GreengardP，BrivanlouAH.2004MaintenanceofpluripotencyinhumanandmouseembryonicstemcellsthroughactivationofWntsignalingbyapharmacologicalGSK陽3-specificinhibitor.NatMed.10:55-63.19)Shib咖oto,S.K,Higano,R.Takada，F.Ito,M.Takeichi,andS.Takada.1998.CytoskeletalreorganizationbysoluableWnt-3aproteinsignaling.GeneCells3:659-67020)ShivdasaniRA.200Molecularregulationofvertebrateearlyendodermdevelopment.DevBiol.249:191-20321)SiegfriedE,PerrimonN.1994Drosophilawingless:aparadigmforthefunctionandmechanismofWntsignaling.Bioessays.16:395-404.22)TechnauU，ScholzCB2003Originandevolutionofendodermandmesoderm.IntJDevBiol.47:531-923)ThomsonJA，Itskovitz-EldorJ,ShapiroSS,WaknitzMA，SwiergielJJ,MarshallVS,JonesJM.1998Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282:1145-724)WillertK,NusseR.1998Beta-catenin:akeymediatorofWntsignaling.CurrOpinGenetDev.8:95-102.OgawaKetalBiochemBiophysResCommun.2006,343(1):159陽66.SynergisticactionofWntandLIFinmaintainingpluripotencyofmouseEScells.DravidG,etalStemCells.2005，23(10):1489-501DefmingtheroleofWnt/beta-cateninsignalinginthesurvival,proliferation,andself-renewalofhumanembryonicstemcells.SinglaDK,SchneiderDJ,LeWinterMM,SobelBE.Wnt3abutnotwntl1supportsself-renewalofembryonicstemcells.BiochemBiophysResCommun.2006，345(2):789-95LindsleyRC，GillJG，KybaM,MurphyTL,MurphyKM.CanonicalWntsignalingisrequiredfordevelopmentofembryonicstemcell-derivedmesoderm.Develo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xll。41.方法、细胞、药物组合物、应用或试剂盒，其主要如上文所述以及如附图中图1到7所示。全文摘要我们公开了从多能干细胞中产生中胚层或者内胚层细胞的方法，该方法包括在多能干细胞中激活Wnt信号通路。在一些实施方案中，在Wnt信号通路被激活的至少部分时间内，多能干细胞处于大体上二维构型的形式，例如单细胞层。文档编号A61K38/17GK101365784SQ200680048455公开日2009年2月11日申请日期2006年10月25日优先权日2005年10月24日发明者劳伦斯·W·斯坦顿,曼吉利·巴克里申请人:科学技术研究公司