用α-7烟碱受体抗体治疗炎性疾病的制作方法

专利名称：：用α-7烟碱受体抗体治疗炎性疾病的制作方法用a-7烟》咸受体抗体治疗炎性疾病相关申请本申请要求2005年11月15日提交的美国临时申请第60/737,045号的权益。上述申请的全文公开通过引用结合到本文中。
背景技术：
：哺乳动物部分地通过中枢神经系统的调节对炎症作出反应。一组反应是通过传出迷走神经传导信号，这称为"胆碱能抗炎通路"(Borovikovaetal.,Vagusnervestimulationattenuatesthesystemicinflammatoryresponsetoendotoxin(迷走神经刺激^)夺削弱只于内毒素的全身炎症反应).Nature:405:458-462(2000))。传出迷走神经的刺激或通过对a-银环蛇毒素敏感的烟碱乙酰胆碱受体(通过例如乙酰胆碱)R.etal.Pharmacologicalstimulationofthecholinergicanti-inflammatorypathway(胆碱能抗炎通路的药理学刺激)，J.Exp.Med.195:781-788(2002);Traceyetal.Mindoverimmunity(心理对免疫的影响)FASEBJ.15:1575-1576(2001);美国专利申i貪09/855,446)。烟碱乙酰胆碱受体属于配体门控五聚体离子通道家族。已经确定，在人体中，16个不同的亚基(al-7，a9-10，pi-4，5，s和力形成大量具有独特结构和药理学性质的均和杂五聚体受体(Lindstrom,1995;LeonardandBertrand，2001;LeNovereandChangeux，1995)。该受体家族的主要已知功能是为神经肌肉接点处以及中枢和周围神经系统中的神经递质乙酰胆石威传导信号(Lindstrom,J.M.Nicotinicacetylcholinereceptors(^因石咸乙酰月旦石咸受体)."HandBookofReceptorsAndChannels:Ligand-andVoltage-GatedIonChannels(受体和通道手册配体和电压门控离子通道)"，R.AlanNorth编辑，CRCPress,Inc.(1995);Leonard,S.andBertrand,D.NeuronalNicotinicreceptors:fromstructuretofunction(神经元烟碱受体从结构到功能).Nicotine&TobaccoRes.3:203-223(2001);LeNovere，N.&Changeux,J-P.Molecularevolutionofthenicotinicacetylcholinereceptor:anexampleofmultigenefamilyinexcitablecells(烟石咸乙酰胆石威受体的分子进化可兴奋细胞中的多基因家族实例)，J.Mol.Evol.40:155-172(1995);Marubio,L.M.andChangeux,J-P.Nicotinicacetylcholinereceptorknockoutmiceasanimalmodelsforstudyingreceptorfunction(以烟械乙酰胆碱受体基因剔除鼠作为动物模型对受体功能的研究)，Eur.J.Pharmacol.393:113-121(2000);Steinlein,O.NewFunctionsfornicotineacetylcholinereceptors(烟石威乙酰胆石威受体的新功能)，BehaviouralBrainRes.95:31-35(1998))。在共同未决的已公开美国专利申请2004/0204355中公开了对炎症反应的削弱起主要作用的乙酰胆碱受体亚基的身份是a7亚基。但a7起作用的机制以及将促进新型抗炎药剂设计的机制仍是未知的。因此继续需要能通过以类型特异性方式以及最小的副作用激活乙酰胆碱受体而开拓胆碱能抗炎通路的药学活性剂。发明概述本发明基于的是胆碱能抗炎通路可通过与烟碱受体的a7亚基的特定肽段结合而激活的发现。具体而言，本申请人已发现，通过与某些受体片段同源的抗体与(x7烟碱受体的结合(实施例4-7)，胆碱能抗炎通路即被激活。基于该发现，本文公开了对炎性疾病的治疗同样有用的新型抗体和药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性地与由至少有80%与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合的单离抗体(isolatedantibody)或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列组成的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供了特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:3相同的氨基酸序列组成的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供了特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:4相同的氨基酸序列组成的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供了特异性地与具有SEQIDNO:2氨基酸序列或其片段的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供了特异性地与具有SEQIDNO:3氨基酸序列或其片段的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供了特异性地与具有SEQIDNO:4氨基酸序列或其片段的肽结合的单离抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由至少有80%与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由SEQIDNO:2或其片段组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗炎性疾病患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段特异性地与由至少有80%与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合。在另一实施方案中，本发明提供了一种治疗炎性疾病患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段特异性地与由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段组成的肽结合。7)。"、-、附图简述图l示意了GenBank中登记号为P36544的烟碱乙酰胆碱受体人(x7亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。图2示意了用作免疫原以产生a7亚基抗体的肽(SEQIDNO:2，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)。图3为焚光显微照片，其表明a-银环蛇毒素-结合烟碱受体簇集于巨噬细胞表面上。初代人类巨噬细胞用FITC-标记的a-银环蛇毒素(a-bgt,1.5(ig/ml)染色并用荧光共聚焦显微镜观察。图A和B给出了较低放大倍数的显微照片。图A:细胞单用a-银环蛇毒素染色。图B:在加入a-银环蛇毒素之前先加入500pM的烟石咸。图C和D给出了较高放大倍数的显微照片以显示受体簇。图C:聚焦面位于靠近中央(三个下方细胞)或靠近细胞表面(上方细胞)的内层上。图D:聚焦面位于细l包的上表面上。图4为凝胶和蛋白印迹照片，给出了初代人类巨噬细胞中al和a7烟碱受体的mRNA和蛋白表达。图A给出了使用a7-特异性引物的RT-PCR结果，产生了843bpa7条带。PCR产物通过测序验证(数据未示出)。MAC1和MAC2:源自两个无关供体的巨噬细胞。图B给出了蛋白印迹。来自PC12细胞或人类巨噬细胞(MAC)的细胞裂解物或用对照的Sepharose珠或用与a-银环蛇毒素结合的Sepharose珠孵育。结合蛋白然后用所示的a7-特异性多克隆和单克隆抗体分析。图5为蛋白印迹照片，示意了大量针对SEQIDNO:l的各种片l爻的兔多克隆抗体的结合特异性。抗体1973-1981为SEQIDNO:l的位置范围为23-250的各种片段的抗体。抗体1918为SEQIDNO:2的肽的抗体；抗体1921为SEQIDNO:3的肽的抗体。图6为蛋白印迹照片，示意了所示细胞系中a7亚基的表达。所用原发抗体为具有SEQIDNO:2序列的肽的抗体1918。图7A-D为条形图，示意了本发明的选定抗体在不同浓度下的活性。活性以自LPS-刺激的初代人类巨噬细胞释放细胞因子的抑制百分数表示。图7A:抗体浓度为40|ig/ml时TNF释》文的抑制。图7B:抗体浓度为40|ag/ml时IL-8释放的抑制。图7C:抗体浓度为5ng/ml时TNF释放的抑制。图7D:抗体浓度为5ng/ml时IL-8释》文的抑制。图8为条形图，示意了抗涵盖在SEQIDNO:2内的烟碱受体(SEQIDNO:l)人a7亚基片段的1918抗体的激动活性。活性以自LPS-刺激的RAW细胞释放TNF的抑制百分数表示。图9A和B示意了抗涵盖在SEQIDNO:2内的烟碱受体(SEQIDNO:l)人(x7亚基片段的a7抗体1918抑制巨噬细胞中TNFa(图9A)和HMGB-1(图9B)的释放的剂量依赖关系。图9A为TNFa释放抑制百分数与抗体浓度的关系图。图9B为蛋白印迹照片，示意了HMGB-1条带强度的剂量依赖性减弱。图10为行盲肠结扎穿孔(CLP)术的小鼠的存活率与CLP后天数的关系图。示意了两组小鼠用抗体1918(SEQIDNO:2的肽的抗体)处理的组和用无关IgG(对照)处理的组。图IIA给出了经用LPS进行TNF诱导后用Abl918或用无关IgG细胞处理的RAW264.7细胞中TNF的产生的免疫染色显孩i照片。图11B示意了用LPS处理的RAW264.7细胞中Abl918对TNF的产生的剂量依赖性抑制。图12A示意了用LPS处理的RAW264.7细胞中Abl918对HMGB1的产生的剂量依赖性抑制。图12B给出了经用LPS进行HMGB1诱导后用Abl918或用无关IgG细胞处理的RAW264.7细胞中HMGB1的产生的免疫染色显微照片。图13为条形图，示意了对乙酰胆碱受体的不同亚基用反义寡核苷酸处理后初代人类巨噬细胞中LPS-诱导的TNF的产生(以相对于对照组的百分数给出)。图14A为条形图，示意了用Abl918处理后小鼠中LPS-诱导的TNF血清水平。图14B给出了经用LPS进行TNF诱导后用Abl918或用无关IgG细胞处理的小鼠中脾组织切片的免疫染色显微照片。图15A为条形图，示意了用Abl918处理后行盲肠结扎穿孔术的小鼠中LPS-诱导的HMGB-1血清水平。图15B中比较了用Abl918或用无关IgG处理后行盲肠结扎穿孔术的小鼠的存活率。发明详述本发明基于的是a7亚基的特定肽段的发现，其一与同源抗体结合即刺激a7烟碱乙酰胆碱受体。这种刺激又抑制促进炎性疾病的信号传导通路。对a7烟碱受体具有这类刺激效应的抗体为a7受体激动剂(也参见下文)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗病人炎性疾病的方法。所述方法包括给予患者有效量的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段刺激a7烟碱受体。本文中用到的"a7烟碱受体"为包含a7亚基的烟碱受体。所述受体可仅包含a7亚基；或者所述受体包含a亚基和来自其他烟石威受体亚型的亚基。所述受体可为均五聚体。或者，所述受体可为杂五聚体。"a7亚基"意在包括所有a7亚基异构体和/或变异体，包括但不限于Villigeretal"JournalofImmunology126:86-98(2002)和Gaultetal"Genomics52:173-85(1998)中所述的a7双重烟碱乙酰胆碱受体("dupa7")、US20040152160中所述的剪接变异体a7-2和美国专利6,875,606中所述的a7烟碱受体的启动子变异体。这些出版物的相关公开通过引用结合到本文中。本文中用到的"a7烟碱受体激动剂"和"a7受体激动剂"为在体内或体外与包含a7亚基的受体结合从而诱导受体执行其生理机能的化合物(包括抗体)。该诱导的结果是，烟碱受体激动剂抑制促炎信号传导通路，从而减轻或消除发炎并治疗或治愈炎性疾病。抗体和抗体产生细胞图1示意了人a7烟碱受体亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:l)。优选本发明的抗体为a7烟石威受体的筛选性激动剂。本发明的抗体可为多克隆或单克隆的，术语"抗体"意在涵盖多克隆和单克隆抗体。术语多克隆和单克隆指抗体制剂的同质程度，不限于特定的生产方法。本文中用到的术语"抗体"也涵盖抗体的功能片段，包括嵌合、人源化、灵长源化、杂合或单链抗体片段。功能片段包括与哺乳动物a7烟碱受体结合的抗原结合片段。例如，抗体可为IgG或IgG的抗原结合片段。能与哺乳动物a7烟碱受体或其片段结合的抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段。这样的片段可通过酶裂解或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分别产生Fab或F(ab，)2片段。也可用其他具有所需底物特异性的蛋白酶来产生Fab或F(ab，)2片段。抗体也可用其中在天然终止位点上游已引入一个或多个终止密码子的抗体基因生产为多种截短形式。例如，F(ab，)2重链片段嵌合基因可设计为包括CH1域的DNA序列和重链的铰链区。包含源自不同物种的片段的单链抗体和嵌合、人源化或灵长源化(CDR-移植)或杂合抗体以及嵌合、CDR-移植或杂合单链抗体等也涵盖在本发明和术语"抗体"的范围内。这些抗体的各种片段可通过常规技术结合于一起，或可作为相邻的蛋白采用基因工程技术制备。例如，嵌合或人源化链核酸可表达为产生相邻的蛋白。参见例如Cabilly等的美国专利4,816,567;Cabilly等的欧洲专利0,125,023Bl;Boss等的美国专利4,816,397;Boss等的欧洲专利0,120,694Bl;Neu贝格尔氏，M.S.等的WO86/01533;Neu贝格尔氏，M.S.等的欧洲专利0,194,276Bl;Winter的美国专利5,225,539;Winter的欧洲专利0,239,400Bl;Queen等的欧洲专利0451216Bl;和Padlan，E.A.等的EP0519596Al。也参见Newman，R.etal.,BioTechnology，10:1455-1460(1992)关于灵长源化抗体的文献、Ladner等的美国专利4,946,778以及Bird,R.E.etal"Science,242:423-426(1988))关于单链抗体的文献。人源化抗体可用合成或重组DNA技术使用标准方法或其他适宜技术生产。人源化可变区核酸(如cDNA)序列也可用PCR诱变方法构建以改变人或人源化链DNA序列，如来自先前人源化可变区的DNA模板(参见例如Kamman，M.,eral.,Nucl.AcidsRes.，17:5404(1989);Santo，K.，etal"CancerResearch,53:851-856(1993》Daugherty，B.L.etal.,BucleicAcidsRes"19(9):2471-2476(1991)和Lewis,A.P.andJ.S.Crowe，Gene，101:297-302(1991))。使用这些或其他适宜方法，也可容易地产生变异体。在一个实施方案中，克隆的可变区可变异并可筛选具有所需特异性的变异体序列(例如自噬菌体抗体库；参见例如Krebber等的美国专利5,514，548;1993年4月1日公开的Hoogenboom等的WO93/06213)。对哺乳动物(如人)a7烟石咸受体具有特异性的抗体可用适宜的免疫原得到，例如SEQIDNO:l或其片段(包括合成分子如合成肽)的单离和/或重组人蛋白。抗体也可通过使具有表达a7烟碱受体的细胞(如巨噬细胞)的适宜宿主(如老鼠)免疫得到。此外，表达重组哺乳动物a7烟碱受体的细胞如转染细胞可用作免疫原或用在结合受体的抗体的筛选中(参见例^口Chuntharapaietal.，J.Immunol"152:1783-1789(1994);Chuntharapai等的美国专利5,440,021)。免疫抗原的制备及多克隆和单克隆抗体的生产可用任何适宜技术进行。文献中已描述了多种方法(参见例如Kohleretal.,Nature,256:495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6:511-519(1976);Milsteinetal"Nature266:550-552(1977);Kop雨ski等的美国专利4,172,124;Harlow，E.andD.Lane,1988，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体实验手册)，(ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,N.Y.);CurrentProtocolsInMolecularBiology(分子生物学实验手册)，第2巻(增刊27，1994年夏)，A腸bel,F.M.etal"Eds"(JohnWiley&Sons:NewYork,N.Y.)，第11章，(1991))。一般来说，杂种细胞通过将适宜的永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系如SP2/0、P3X63Ag8.653或杂合骨髓瘤)与抗体产生细胞融合产生。抗体产生细胞可自用所关心的抗体免疫的人或其他适宜动物的周围血或优选自脾或淋巴结获得。融合细胞(杂种细胞)可用筛选性培养条件分离并采用极限稀释法克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可通过适宜的检测法(如ELISA)筛选。可使用产生或分离具有所需特异性的抗体(如人抗体或抗原结合片段)的其他适宜方法，包括例如自库(如噬菌体展示库)筛选重组抗体的方法或基于能产生人抗体镨的转基因动物(如小鼠)的免疫的方法(参见例如Jakobovitsetal.,Pro"Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-2555(1993);Jakobovitsetal.，Nature,362:255-258(1993);Lonberg等的美国专利5，545，806;Surani等的美国专利5，545，807;Lonberg等的W097/13852)。本发明也涉及双特异性抗体或其功能片段(如F(ab，)2),其与哺乳动物a7烟碱受体以及至少一种其他抗原结合(参见例如美国专利5,141,736(Iwasa等)、美国专利4,444,878、5,292,668、5，523，210(均授予Paulus等)和美国专利5,496,549(Yamazaki等))。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性地与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的片段结合(图2示意了人烟碱受体的a7亚基内这些序列的相对位置)。所述片段可为5-10个氨基酸长、10-15个氨基酸长或15-19个氨基酸长。或者，所述抗体或抗原结合片段特异性地与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4结合。表1列出了上述氨基酸序列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与如下所定义的SEQIDNO:l功能变异体或其片段结合。例如，所述抗体或抗原结合片段可与具有与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的肽相同的序列的肽结合。将与所述抗体结合的肽可与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的肽或其片4爻具有至少约80%的氨基酸序列相似度，优选具有至少约90%的氨基酸序列相似度，更优选具有至少约95%的氨基酸序列相似度。可用来探知序列相似度的方法在下文描述。本发明的抗体可通过多种适宜的方法识别。例如，这样的抗体可基于与任何上述抗体竟争与哺乳动物a7烟碱受体的结合的能力识别。在另一实施例中，这样的抗体的结合以及具有相同或相似的表五到约五十个氨基酸。优选所述肽包含十到约二十一个氨基酸。在又一实施例中，与上述抗体具有相同或相似表位特异性的抗体可用嵌合受体识别(参见例如Ruckeretal.,Cell87:437-446(1996))。在一个特定的实施方案中，所述双特异性抗体或其功能片段与和SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的肽以及至少一种其他抗体结合的抗体具有相同或相似的表位特异性。产生cx7烟碱受体抗体的方法的一个非限制性实例是用a7受体或其片段使适宜的实验动物免疫并分离免疫诱导的与a7亚基结合的抗体。免疫和分离程序是本领域技术人员熟知的。a7烟碱受体的选择性可通过筛查与至少一种其他烟碱或胆;威能受体的结合评估。发现为a7受体的选择性激动剂的抗体可再进一步评估其在抑制细胞因子释放和/或治疗一种或多种本文所述炎性疾病中的功效，如动物模型中另外的体外试验或体内试验。为激动剂的抗体可通过本文所公开的程序识别，例如通过合并单离抗体与已经刺激以释放促炎细胞因子的巨噬细胞，或任何其他适宜的评估a7受体活性的方法。细胞因子释放的抑制是激动剂活性的指标。识别抗一般烟碱受体、特别是抗a7受体激动剂抗体的方法将在下文描述。在优选的方法中，激动剂抗a7抗体的结合活性通过给予激动剂后表达a7受体亚型或另一受体亚型(如a4p2)的爪蟾卵母细胞的活性(电流响应)度量。导致更大地激活a7受体亚型的激动剂被确定为a7选4奪性激动剂。功能检测包含哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体的组合物可用在结合测定中以检测和/或识别可与受体结合的试剂，包括本发明的抗体。适用于结合测定中的组合物包括例如天然表达哺乳动物a7烟石威受体或其功能变异体的细胞和表达哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体的的重组细胞。适用于结合测定中的组合物也包括包含哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体的膜制剂。这样的膜制剂可含天然(如质膜)或合成膜。优选所述膜制剂为表达哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体的细胞的膜部分。本文中用到的"哺乳动物a7烟碱受体"指包含烟石咸受体的a7亚基的天然存在或内生性的哺乳动物蛋白以及具有与天然存在或内生性的相应哺乳动物a7亚基蛋白相同的氨基酸序列的蛋白(如重组蛋白、合成蛋白(即用合成有机化学产生的蛋白))。因此，如本文中所定义的，该术语涵盖成熟受体蛋白、多态或等位变异体、和哺乳动物a7亚基的其他异构体(如选择性剪接或其他细胞过程所产生的)以及前述的改性或未改性形式(如脂化、糖基化、非糖基化)。天然存在或内生性的哺乳动物a7亚基蛋白包括野生型蛋白如成熟的a7烟碱受体、多态或等位变异体和哺乳动物(如人、非人灵长类动物)中天然存在的其他异构体。这类蛋白可自例如天然产生哺乳动物a7亚基的源回收和分离。哺乳动物a7烟碱受体的"功能变异体"包括可用适宜的方法(如诱变(如化学诱变、辐射诱变)、重组DNA技术)产生的功能片段、功能突变蛋白和/或功能融合蛋白。"功能变异体"为具有如本文中所述哺乳动物a7烟碱受体蛋白的至少一种功能特征(如结合活性、信号传导活性和/或刺激细胞反应的能力)的蛋白或多肽。优选的功能变异体可结合配体(即一种或多种配体，如乙酰胆石咸或本发明的抗体)。一般来说，哺乳动物a7烟碱受体的片段包括相对于成熟的哺乳动物a7烟碱受体而言具有氨基酸(即一种或多种氨基酸)缺失(即一个或多个缺失)的那些(如N-端、C-端或内部缺失)。也涵盖相对于成熟的哺乳动物a7烟碱受体而言其中仅相邻的氨基酸发生缺失或其中非相邻的氨基酸发生缺失的片段。突变体哺乳动物a7烟;威受体包括哺乳动物a7烟;威受体的天然或人工变异体，其因一个或多个相邻或不相邻氨基酸残基的加合、缺失和/或取代而不同(如受体嵌合体)。这类突变可发生在蛋白上的一个或多个位点处，例如保守区或非保守区(好比其他趋化因子受体或G-蛋白结合受体)、细胞外区、细胞质区或跨膜区。融合蛋白涵盖包含哺乳动物a7亚基或其变异体作为第一部分、该第一部分通过共价键(如肽键)与哺乳动物a7亚基或天然发现的a7烟碱受体中不存在的第二部分相连的多肽。因此，所述第二部分可为氨基酸、寡肽或多肽。所述第二部分可在适宜的位置上如N-端、C-端或内部与所述第一部分相连。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含亲和配体(如酶、抗原、附加表位、结合域)作为第一部分，第二部分包含连接子序列和人a7亚基或其片段。其他(如第三、第四)部分可酌情存在。在一个实施方案中，哺乳动物a7烟碱受体亚基的功能变异体(如配体连接变异体)与所述a7亚基(如人a7亚基(如SEQIDNO:l))具有至少约80%的氨基酸序列相似度，优选至少约90%的氨基酸序列相似度，更优选与所述a7亚基具有至少约95%的氨基酸序列相似度。在另一实施方案中，功能融合蛋白包含与哺乳动物a7亚基具有至少约85%的序列相似度、优选至少约90%的序列相似度、更优选与哺乳动物a7亚基具有至少约95%的序列相似度的第一部分。在另一实施方案中，功能哺乳动物a7亚基或哺乳动物a7亚基的功能变异体与天然存在的人a7亚基具有至少约80%的氨基酸序列相似度，优选至少约90%的氨基酸序列相似度，更优选至少约95%的氨基酸序列相似度。氨基酸序列相似度可用适宜的序列比对算法确定，如LASERGENE系统(序列拼装和比对软件；DNASTAR，Inc.,Madison,WI)，其使用Clustal方法和PAM250残基重量表、空格罚分IO、空格长度罚分10和缺省的参数(双序列比对参数ktuple=l,空格罚分=3、window=4、保存的对角线=5)。在另一实施方案中，功能变异体由与天然存在的核酸序列不同的核酸序列编码，但由于遗传密码的简并性，其编码哺乳动物a7亚基或其片段。在一个实施方案中，^r测或识别与哺乳动物a7烟石威受体结合的抗体的方法为竟争性结合测定法，其中评估了试验试剂(如抗体)抑制参比试剂(如配体或特异性已知的另一抗体)的结合的能力。例如，参比试剂可用如本文中所述的适宜标记物标记，且饱和测定中存在的a7烟碱受体所需的标记了的参比试剂的量是可确定的。在适于测定结合和络合物形成的情况下，标记了的参比试剂的饱和量和试-睑试剂的各种量可与包含哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体的组合物联系起来。参比或试验试剂与a7烟碱受体或其功能变异体或其片段(包括如上所述致免疫肽)间络合物的形成可直接或间接地用适宜的方法检测或测定。例如，可将试剂用适宜的标记物标记，故络合物的形成可通过标记物的检测测定。络合物的特异性可采用适宜的对照组如未标记的试剂或单单标记物来测定。适用于试剂与哺乳动物a7烟碱受体或其功能变异体间形成的络合物的检测中的标记物包括例如放射性同位素、抗原决定基、亲和标记物(如生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记物、酶、荧光基团或化学发光基团。就用来测定试验试剂如抗体与a7烟碱受体结合的能力的竟争性结合测定法而论，这种能力可以50。/。抑制(IC50值)标记参比试剂的特异性结合所需的试验试剂浓度给出。特异性结合优选定义为总结合(如络合物中的总标记物)减去非特异性结合。非特异性结合优选定义为在过量未标记参比试剂的存在下形成的络合物中仍检测到的标记物的量。适用于该方法中的参比试剂包括特异性地与哺乳动物a7亚基或其功能变异体结合的分子和化合物，例如a7亚基的配体或抗体。优选的参比试剂为已知对选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的人烟碱受体(SEQIDNO:l)的a7亚基片段具有特异性的抗体。胞中促炎细胞因子的释放进行。一道处理哺乳动物细胞。优选的试剂为细菌脂多糖(LPS)。所述化合物可在所述试剂之前、与所述试剂同时或在所述试剂之后给予哺乳动物细胞。优选所述化合物在所述试剂之前症合予。参见例如美国专利6,610,713,其相关公开通过引用结合到本文中。任何细胞。在优选的实施方案中，所述细胞为免疫细月包，例如巨噬细胞、单核细胞或嗜中性白细胞。在最优选的实施方案中，所述细胞为巨噬细胞。促炎细胞因子。在优选的实施方案中，所述细胞因子为TNF。对产生细胞因子的抑制的评估可采用任何已知方法，包括细胞因子的定量(如用ELISA)、或通过生物测定(如测定促炎细胞因子的活性是否降低)、或通过促炎细胞因子mRNA的测定。技术人员能利用任何这些检测法而无需过多实验。也参见美国专利6,610,713，其相关公开(例如在这点上有用的若干检测法)通过引用结合到本文中。这些方法可在体内进行，其中，动物如大鼠用所述化合物与刺激促炎细胞因子级联反应的试剂一道处理，并通过例如测定血清TNF水平测定所述试剂对促炎细胞因子级联反应的诱导的影响。但所述方法优选在体外进行，例如用巨噬细胞培养物。在其他实施方案中，本发明涉及测定所述抗体是否有能力抑制发炎的方法。在一些方面，这些方法包括测定抗体是否为a7烟^威受体的激动剂。优选所述方法还包括通过测试抗体激活至少一种其他烟石咸受体的能力确定抗体是否对a7具有选择性。这些测定可按前述选巨嗟细胞)的释放。治疗方法
技术领域：
：本发明涉及细胞因子介导的炎性疾病的治疗，其中细胞因子释放水平可通过a7受体激活而降低。在优选的实施方案中，所述疾病影响的疾病。所述疾病可为其中炎性细胞因子级联反应导至4应如脓毒性休克的疾病。或者，所述疾病可由局部化的炎性细^^因子级联反应介导，如在类风湿性关节炎中。可用本发明有效地治疗的疾病的非限制性实例包括阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、急性或缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、炎症性肠病(包括例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肠炎、惠伯尔病、哮喘、慢性阻塞性肺病、肠梗阻(包括例如术后肠梗阻)、过敏症、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒病、败血病、内毒素性休克、恶病质、高热症、骨嗜酸性肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎、尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、嚢性纤维化、肺炎、矽肺病、肺泡炎(alvealitis)、毛细支气管炎、咽炎、胸膜炎、窦炎、流行性感冒、呼吸道合胞体病毒感染、疱渗、播散性菌血症、登革热、念珠菌病、痴疾、丝虫病、变形虫病、包虫嚢胂、烧伤、皮炎、皮肤肌炎、晒斑、荨麻疹、疣、风疹块、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、阿耳茨海默氏病、乳糜泄、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、脑梗塞、脑栓塞、Guillame-Barre综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、瘫痪、葡萄膜炎、关节炎性皮渗、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、贝切特氏综合征、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、关节强硬性脊推柱炎、贝格尔氏病、II型糖尿病、Retier综合征或霍奇金病。在一个实施方案中，所述疾病选自阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、肝炎、哮喘、过敏症、过敏性休克、器官坏死、枯草热、脓毒病、败血症、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、播散性菌血症、烧伤、乳糜泄、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、心肌缺血、脑梗塞、脑栓塞、脊髓损伤、瘫痪、同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病。在另一实施方案中，所述疾病选自腹膜炎、胰腺炎、脓毒病、内毒素性休克、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩病，溃疡性结肠炎、肠梗阻、阿耳茨海默氏病、烧伤、心肌缺血、同种异体移植物排斥、译喘、移植物抗宿主病、充血性心力衰竭和嚢性纤维化。或多种其他的a7烟碱受体激动剂的组合治疗。适宜的其他激动剂见公开于例如共同未决的美国专利申请10/729,427中。美国专利申请10/729,427的相关公开通过引用结合到本文中。给药方式a7受体激动剂的给药途径取决于待治疗的疾病。例如，静脉注射对于全身性疾病如脓毒性休克的治疗可能是优选的，而口服对于胃肠道疾病如胃溃疡的治疗可能是优选的。按照所述方法，本发明的一种或多种抗体可通过适宜的途径或单独或与另一种药物复配地给予患者。应给予有效量的试剂(即a7受体激动剂抗体或其抗原结合片段)。"有效量"为给药条件下足以获得所需治疗或预防效果的量，如足以抑制炎症反应和减轻或治愈炎性疾病的量。所述试剂可以单剂量或多剂量给药。剂量可通过本领域内熟知的方法确定并取决于例如所选择的特定试剂、患者的年龄、药敏性和耐药性、以及整体的健康状态。抗体的适宜剂量可为每次>'台疗纟々0.01mg/kg亚)J纟々100mg/kg体重。有多种可能的给药途径，包括例如口服、饮食给药、局部给药、经皮给药、直肠给药、肠胃外给药(如静脉、动脉、肌肉、皮下注射、皮内注射)和吸入(如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴入)给药途径，具体取决于试剂和待治疗的病患或疾病。可按指示局部或全身给药。优选的给药方式可随所选择的特定试剂(a7受体激动剂抗体或其抗原结合片段)以及待治疗的特定疾病(如病患)而异。静脉内给药、口服或肠胃外给药是优选的。所述试剂可以中性化合物或以药学可接受的盐给药。可通过例如与适宜的有才几或无^L酸如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等反应获得含胺或其他碱性基团的化合物的盐。具有季铵基团的化合物也含对阴离子如氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、高氯酸盐等。含羧酸或其他酸性官能团的化合物的盐可通过与适宜的碱如氢氧化物反应制备。酸性官能团的盐含对阳离子如钠、钾等。本文中用到的所公开化合物的"药学可接受的盐"为使本发明的化合物与适合给予患者的酸或碱反应所得到的含离子键的产物。例如，含胺或其他碱性基团的化合物的酸盐可通过使化合物与适宜的有机或无机酸如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等反应获得。这类盐的其他实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲基磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯曱酸盐以及与氨基酸如谷氨酸的盐。当所述化合物包含酸官能团如-COOH或-S03H时，盐也可与适宜的有机石成形成。适于与本发明的化合物形成药学可接受的碱加成盐的这类碱包括无毒且强度足以与酸官能团反应的有机碱。这类有机碱是本领域内众所周知的，包括氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)、单-、二-和三乙醇胺、胆碱、单-、二-和三烷基胺(如曱胺、二曱胺和三甲胺)、胍、N-节基苯乙胺、N國曱基葡糖胺、N-曱基哌。秦、吗啉、乙二胺、三(羟甲基)氨基甲烷等。所述试剂可作为用于调制烟碱受体功能并包含这类功能的抑制剂和药学可接受载体的药物组合物的一部分给予个体。本文中用到的"药物组合物"为以适于向患者给药的形式包含所公开的抗体和药学可接受的稀释剂或载体的制剂。适宜的药学可接受的载体包括惰性固体填充物或稀释剂和无菌水或有机溶液。制剂将随所选择的给药途径而异(如溶液剂、乳剂、胶嚢剂)。适宜的药物载体可含不与烟碱受体功能的启动子(激动剂)或抑制剂(拮抗剂)相互作用的惰性成分。可采用标准的药物制剂技术，如Remington'sPharmaceuticalSciences(雷氏药学大全)，MackPublishingCompany,Easton，Pa.中所描述的那些。对于肠胃外给药而言适宜的药物载体包括例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含约0，/omg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank溶液、乳酸林格氏液等。包封组合物(如硬明胶或环状糊精的包衣)的方法是本领域内熟知的(Baker,etal.,"ControlledReleaseofBiologicalActiveAgents(生物活性剂的受4空释;故)"，JohnWileyandSons,1986)。对于吸入，所述试剂可溶液化并装载于适宜的给药器中(例如雾化器、喷雾器或加压气雾器)。所述药物组合物可呈散剂或单位剂量形式。单位剂量形式可呈任何形式，包括例如胶嚢剂、静脉注射袋、片剂、一次泵送气雾剂或小瓶剂。单位剂量组合物中活性成分(即所公开的化合物或其盐的制剂)的量为有效的量，可随所涉及的特定治疗而异。可以理解，可能有必要根据病人的年龄和状况改变剂量。剂量也将取决于给药的途径。本文中用到的"患者，，包括哺乳动物(如人)、伴侣动物(如狗、猫、鸟等)、家畜(如母牛、绵羊、猪、马、家禽等)和实验动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。在所公开方法的优选实施方案中，所述患者为人。除非另有指出，本发明的实施将采取细胞培养、分子生物学、微生物学、细胞生物学和免疫学的常规技术，其在本领域内是众所周知的。这类l支术在文献中有详尽的描述。参见例如Sambrooketal.，1989,"MolecularCloning:ALaboratoryMannual(分子克隆实-验手册)"，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubeletal.(1995)，"ShortProtocolsinMolecularBiology(精编分子生物学实验指南)",JohnWileyandSons;MethodsinEnzymology(酶学方法)(若干巻)；MethodsinCellBiology(细胞生物学方法)(若干巻)和MethodsinMolecularBiology(分子生物学方法)(若干巻)。本发明的优选实施方案在下面的实施例中描述。根据本文中所公开的本发明的说明书或实施，本文权利要求范围内的其他实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。该说明书和实施例仅应视为示例性的，本发明的范围和精神由实施例后的权利要求书指定。实施例实施例1:巨噬细胞表达烟碱受体a7亚基实施例概述我们先前报道，乙酰胆碱介导的巨噬细胞TNF释放的抑制需要烟碱受体的a7亚基(参见共同未决的美国专利申请10/729,427)。如下面所概括的，a-银环蛇毒素与初代人类巨噬细胞表面上表达的离散受体簇的结合以及通过a7特异性抗体与a-银环蛇毒素结合珠附着而分离的蛋白的免疫印迹确认了a-银环蛇毒素-结合受体亚基与a7亚基的等同。结果与讨论用FITC-a-银环蛇毒素标记初代人类巨噬细胞；FITC-a-银环蛇毒素是一种肽拮抗剂，其与乙酰胆碱受体的亚群结合。在巨噬细胞表面上观察到a-银环蛇毒素的强结合(图3A)。烟碱预处理显著降低结合强度(图3B)。在神经肌肉接点以及神经元突触处，烟i咸受体形成受体聚集体或簇，其促进快速信号传导。(X-银环蛇毒素结合的离散簇可在较高的放大倍数下在巨噬细胞表面上清楚地观察到，尤其是集中于细胞体表面上(图3C，D)。到目前为止，al、a7和a9为人细胞中已知的a4艮环蛇毒素-结合》因石威受体亚基(Lindstrom,J.M.Nicotinicacetylcholinereceptors(》因石成乙酰月旦石咸受体)."HandBookofReceptorsandChannels:Ligand-andVoltage-GatedIonChannels(受体和通道手册配体和电压门控离子通道)"，R.AlanNorth编辑，CRCPress,Inc.(1995));Leonard,S.andBertrand,D.NeuronalNicotinicreceptors:fromstructuretofunction(神经元烟石威受体乂人结构到功能).Nicotine&TobaccoRes.3:203-223(2001)。al与卩l、5和或s(成人)或y(胎儿)亚基一起形成调节肌肉收缩的杂五聚体烟碱受体；a7和oc9可各自形成均五聚体烟碱受体。为确定巨噬细胞中是否表达了这些受体亚基，我们在体外从周围血RT-PCR分析。为提高实验的灵敏:生和特异性，我们在反转录后用对各亚基具有特异性的套式引物进行了两个回合的PCR。在源自无关供血者的人巨噬细胞中检测到了al、al0(数据未示出)和a7(图4A)mRNA的表达。相同的RT-PCR测试未在巨噬细胞中检测到a9亚基mRNA的表达(数据未示出)。接下来通过蛋白印迹法岸企测al和a7亚基的蛋白表达。a7特异性抗体识别出清晰的条带，来自两个分化的初代巨噬细胞和未分化的PBMC(数据未示出)的表观分子量为约55kD(与Peng，X,etal.Humana7acetylcholinereceptor:cloningofthea7subunitfromtheSH-SY5Ycelllineanddeterminationofpharmacologicalpropertiesofnativereceptorsandfunctionala7homomersexpressedinXenopusoocytes(人a7乙酰胆碱受体来自SH-SY5Y细胞系的a7亚基的克隆以及爪蟾卵母细胞中表达的天然受体和a7功能相似体的药理学性质的测定).Mol.Pharmacol.45:546-554(1994)中报道的a7蛋白的分子量相似)。在PBMC在体外向巨噬细胞分化的过程中，al蛋白表达下调至不可检测的水平(数据未示出)。S亚基(al杂五聚体烟碱乙酰胆碱受体的一种必要组分)不能通过这种套式RT-PCR测试检测到(数据未示出)。为确认巨噬细胞中的阳性信号代表与a-银环蛇毒素结合的a7烟碱受体，我们使用a-银环蛇毒素-结合珠作为何蛋白来钓出自人巨噬细胞或自PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞，其已经发现表达a7均五聚体)制得的蛋白。保留下来的蛋白按蛋白印迹法用识别人和大鼠a7蛋白(人和大鼠a7蛋白含相同数量的氨基酸且相似度为94y。)的多克隆或单克隆a7特异性抗体分析。结果清楚地表明，人巨噬细胞表达a-银环蛇毒素-结合a7蛋白，且表观分子量与PC12细胞中的a7亚基相似(图4B)。巨噬细胞a7亚基的身份用RT-PCR方法通过克隆巨噬细胞表达的全长a7确认。巨噬细胞中的全长烟碱乙酰胆碱a7亚基含外显子1-10，与神经元中所表达的烟碱乙酰胆碱a7亚基相同(Gault，J.etal.Genomicorganizationandpartialduplicationofthehumana7neuronalnicotinicacetylcholinereceptorgene(人a7神经元烟i成乙酰胆碱受体基因的基因组织和部分复制)(CHRNA7).Genomics52:173-185(1998))。这些数据一起证实了烟碱乙酰胆碱a7受体为人巨噬细胞表面上表达的a-银环蛇毒素-结合受体。实施例2:抗a7烟碱受体的兔多克隆抗体的制备按产生多克隆抗体(CovanceResearchProducts,Inc.，Denver,PA)的118天方法在兔中产生抗a7烟碱受体细胞外域和特异肽的多克隆抗体。简言之，将肽用无菌盐水稀释并与等体积的弗氏完全佐剂合并。向兔体内皮下注射分散在弗氏完全佐剂中的0.125mg抗原(抗原中含下面所述的肽和GSTN-端细胞外域)，共注射六次，分别在第0天(采血)、第3周、第6周、第9周、第12周和第15周注射。在第9、12和15周注射后的10天后采集耳缘血。通过蛋白印迹法检测兔血清的滴度。用蛋白A琼脂糖按生产商[Sigma,St.Louis，MO]的说明纯化抗-a7抗血清中的IgG。向两只不同的兔中注射肽KELVKNYNPLERPVANDSOP(SEQIDNO:2，对应于SEQIDNO:l的氨基酸31-50)以产生抗体1918和IDNO:3，对应于SEQIDNO:l的氨基酸108-127)以产生抗体1921和1922。向两只不同的兔中注射肽KRSERFYECCKEPYPDYTYT(SEQIDNO:4，对应于SEQIDNO:l的氨基酸204-223)以产生抗体1923和1924。氨基酸1-227(对应于a7的细胞外域)在大肠杆菌中表达为GST-融合蛋白。纯化GST-融合蛋白并向十只不同的兔中注射以产生抗体1973-1982。结果在图5中示出，该图中给出了蛋白印迹照片，照片表明了针对SEQIDNO:l的各种片段的若干兔多克隆抗体具有结合特异性。抗体1973-1981为SEQIDNO:l的位置范围为23-250的各种片l史的抗体。抗体1918为SEQIDNO:2的肽的抗体；抗体1921为SEQIDNO:3的肽的抗体。实施例3:烟碱受体a7亚基在细胞系中的表达a7亚基在细胞系和初代人类巨噬细胞中的表达通过蛋白印迹法用抗体1918研究。自ATCC(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD)获得鼠巨噬细胞样细胞RAW264.7、Jurkat细胞、Hela细胞、U937细胞和PC12纟田胞。将细胞在添加了100/o的热灭活FBS、2mM谷酰胺、lx青霉素和链霉素的RPMI1640或DMEM培养基中培养，培养基置于含5%的C02和95%的室内空气的加湿孵育箱中。自三个供体的血液中分离初代人类巨嗟细胞。用冷的裂解緩冲液(1%Brij97,50mMTris，pH7.5，150mM氯化钠，lmMEDTA,亮肽素和抑胃肽各lmg/ml，lmMPMSF和10mM氟化钠)孵育细胞制备细胞裂解物。对各细胞裂解物(相当于2x105个细胞)进行SDS-PAGE^r测并用抗体1918进行免疫印迹4企测。信号用ECL^式齐寸盒才要生产商(AmershamLifeScience,Inc.,ArlingtonHeights,IL)的说明一企测。该实验的结果在图6中给出。实施例4:抗包含SEQIDNO:2的烟碱受体a7亚基片段的抗体抑制LPS-刺激的巨噬细胞中TNFa和IL-8的产生按如下所述制备人巨噬细胞培养物。自健康供体的血液收集白细胞层。用Ficol/Hypaque(Phamacia，N丄)通过密度梯度离心分离初代血液单核细胞，悬浮(8xl06个细胞/ml)在添加了10%的热灭活人血清(GeminiBio画Products，Inc.,Calabasas，Calif.)的RPMI1640培养基中并接种于烧瓶中(PRIMARIA;BecktonandDickinsonLabware，FranklinLakes,N丄)。于37。C孵育2小时后，充分洗涤粘附细胞，用lOmM的EDTA短时处理，分离，再悬浮(106个细胞/ml)于添加了人巨噬细胞集落刺激因子(MCSF;SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.:2ng/ml)的RPMI培养基(10%人血清)中，并接种于24-孔组织培养才反(PRIMARIA;Falcon)上(106个细胞/孔)。让细胞在mCFS的存在下分化7天。第7天时，用lx的Dulbecco磷酸盐緩冲盐水(PBS，GibcoBRL,LifeTechnologies,Rockville,Md.)洗涤细胞3次，加入无mCFS的新鲜培养基并按说明进行实验。通过在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF;SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)的存在下孵育人周围血单核细胞建立初代人类巨噬细胞培养物。这些细胞被用在实验中以确定本发明的抗体对接触LPS4小时后巨噬细胞培养物中TNFa和IL-8水平的影响。在这些实^r中，如所示以或40(ig/ml或5|ig/ml的浓度向人巨噬细胞培养物中加入抗体1918(SEQIDNO:2的肽的抗体)、1921(SEQIDNO:3的肽的抗体)以及抗体1924、1973、1974和1976(SEQIDNO:l的各种片段的抗体)(图7A-D)。三十分钟后加入LPS(5ng/ml)，刺激2.5小时后收集上清液，随后通过酶联免疫吸附实验(ELISA)对上清液加以分析。所有实验均进行三次。给出了得自九组独立的巨噬细胞培养物的数据，其表示为Mean+/-SEM;n=9。如图7A-D中可见，与无关抗体对照组相比，在40ng/ml下，所有受试抗体均表现出了抑制活性(即对乙酰胆碱受体的激动活性)。即4更在5ng/ml下，与对照组相比，抗体1918、1921和1924也表现出了明显的TNFa和IL-8释》文抑制。实施例5:抗包含SEQIDNO:2的烟碱受体a7亚基片段的抗体抑制LPS-刺激的RAW细胞中TNF的释放让鼠巨噬细胞样细胞RAW264.7(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)在添加了10%胎牛血清、青霉素和链霉菌的DMEM中生长。将细胞接种在24-孔组织培养板上Opti-MEM1培养基中并在90%汇合时使用。用LPS(5ng/ml)处理细胞2.5小时。细胞用40吗/ml的抗体1918(SEQIDNO:2的肽的抗体)预处理三十分钟。收集上清液，用鼠ELISA试剂盒(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)测定TNF浓度。结果在图8中给出，可以清楚地看出，抗体1918抑制了RAW细胞中TNFa的产生。实施例6:抗包含SEQIDNO:2的烟碱受体a7亚基片段的抗体以剂量依赖方式抑制LPS-刺激的巨噬细胞中TNFa和HMGB-l的释放按上面实施例4中所述生长巨噬细胞。在测定抗体1918(SEQIDNO:2的肽的抗体)对TNFa释放的抑制作用的实-验中，抗体以0、2.5、5、10、20、40、80和160(ig/ml加入。在测定抗体1918对HMGB-l释i文的抑制作用的实,验中，抗体以0、10、50和100ng/ml力口入。加入抗体1918后三十分钟时，将培养物用浓度为5.0ng/ml的LPS处理。18小时后收集培养基。培养基用Centricon10过滤器浓缩。TNFa水平用人ELISA试剂盒(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)分析。HMGB-l水平用蛋白印迹法用如美国专利6,303,321中所述的抗-HMGBl多克隆抗血清分析，其相关公开通过引用结合到本文中。TNFa抑制的结果在图9A中以单用LPS处理的刺激百分数给出。HMGB-l抑制的结果在图9B中以条带强度的渐次降低呈现。图9A和9B清楚地表明，抗体1918以剂量依赖方式抑制了TNFa和HMGB-l的释ii。实施例7:抗SEQIDNO:2的肽的激动剂抗体保护小鼠免于因CLP而致死按FinkandHeard,J.ofSurg.Res.49:186-196(1990)、Wichmanetal"Crit.CareMed.26:2078-2086(1998)和Remicketal.,Shock4:89-95(1995)中所述行盲肠结扎穿孔(CLP)。筒言之，肌肉注射75mg/kgKetamine(FortDodge,FortDodge,Iowa)和20mg/kg曱苯蓬。秦(BohringerIngelheim,St.Joseph,MO)麻醉Balb/c小鼠。沿中线切开并分离盲肠。在远离回盲瓣并距离盲肠顶5.0mm的水平处用6-0的普罗纶线缝合结扎。结扎的盲肠残端然后用22号针穿孔一次，不直接挤出粪便。然后将盲肠放回其正常的腹内位置。腹部然后用6-0的普罗纶线施行两层连续缝合，腹膜和筋膜分开缝合以防止体液漏出。皮下给予20mg/kg体重的生理盐水使所有小鼠复苏。术后30分钟对各小鼠皮下注射亚胺i备南(0.5mg/鼠)(Primaxin,Merck&Co.，Inc.,^VestPoint,PA)。然后让小鼠复原。小鼠或每天两次用180mg/鼠的抗体1918(SEQIDNO:2的肽的抗体)或每天两次用180mg/鼠的对照IgG抗体处理。在所示的天数内，激动剂和对照抗体一天两次采用腹腔(i.p.)给药。术后十四天内每天监测死亡率。结果在图10中呈现，其中给出了用激动剂1918抗体或用无关对照抗体处理后存活动物的百分数。如图10中所示，在CLP后第7天，约有10%用IgG对照抗体处理的小鼠存活，而约有50%用抗体1918处理的小鼠存活。这些结果表明，抗a7亚基特定肽段的激动剂抗体显著提高鼠CLP脓毒病模型中的存活率。实施例8:抗体1918抑制RAW264.7细胞中内毒素诱导的TNF释放使RAW细胞在IgG或Abl918(20mg/ml)的存在下与LPS接触。细胞中的TNF于1.5小时后通过用抗-TNF抗体免疫染色分析。结果在图IIA中给出。从降低的荧光(右下图)可以看出，使用Abl918的处理显著减少LPS处理所诱导的TNF的水平。图IIB示意了Abl918对TNF释放的剂量依赖性抑制。使初代人类巨噬细胞在IgG或Abl918(l-180mg/ml)的存在下与LPS接触并于2小时后用ELISA对培养基中的TNF予以分析。实施例9:抗体1918抑制RAW264.7中LPS诱导的HMGB1释放使RAW细胞在Abl918(5-100mg/ml)的存在或不存在下与LPS接触。分泌的HMGB1于24小时后通过蛋白印迹法测定。结果在图12A和图12B中给出。图12A表明了Abl918对HMGB1的产生的剂量依赖性抑制，图12B表明了用Abl918处理后RAW264.7细胞中LPS诱导的HMGB1的产生的显著减少。实施例9:乙酰胆石咸受体a7亚基的反义寡核苦酸抑制AM918对初代巨噬细胞中TNF释力文的影响为说明Abl918通过结合乙酰胆碱(Ach)受体的a7亚基抑制TNF释放，我们测定了经用Ach受体不同亚基的反义寡核苷酸预处理的LPS-刺激的初代人类巨嗟细胞中TNF的释ii。a7亚基通过蛋白印迹法用Abl918检测，培养基中的TNF通过ELISA分析。结果在图13中给出，其表明了当a7亚基合成被反义寡核苷酸所抑制时，使用Abl918进行处理不减少TNF的产生，TNF的产生水平与无抗体或用无关抗体处理的那些相当。实施例10:抗体1918抑制内毒素血症小鼠中的全身性TNF释放给予LPS(7.0mg/kg，i.p.)前12小时通过腹腔(i.p.)给药给予小鼠(每组11只)IgG(对照)或Abl978(7.2mg/kg)。1.5小时后获得的血中的血清TNF水平通过ELISA分析(相对于对照组，*P<0.05)。结果在图14(A)中给出，其表明了给予Abl918后血清TNF水平的降低。脾脏中的TNF水平在给予LPS后1.5小时时通过用抗-TNF抗体免疫染色分析。结果在图14(B)中给出，其表明了用Abl918处理后小鼠脾脏中LPS诱导的TNF水平的显著降低。实施例11:Abl918抑制全身性HMGBl水平并提高盲肠结扎穿孔诱导严重脓毒病的小鼠的存活率在盲肠结扎穿孔(CLP)后小鼠(每组7只)每天两次通过腹腔给药用IgG(对照)或Abl918(7.2mg/kg)处理2天。血清HMGB1通过蛋白印迹法分析(相对于对照组，*P<0.05)。结果在图15A中给出，其表明了用Abl918处理后血清HMGB1水平的显著降低。在存活实验中，从术后24小时开始，小鼠(24只)经用IgG或Abl918(7.2mg/kg)处理3天(相对于对照组，*P<0.05)。结果在图15B中给出，其表明了经用Abl918处理的小鼠较经用无关IgG假处理的小鼠存活率的显著提高。虽然参照其优选的实施方案对本发明进行了具体示意和描述，但本领域技术人员应理解，可对其作多种形式和细节的改变而不偏离附随的权利要求书所涵盖的本发明的范围。权利要求1.一种单离抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段特异性地与由至少有80％与选自SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合。2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列组成的肽结合。3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:3相同的氨基酸序列组成的肽结合。4.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性地与由至少有80%与SEQIDNO:4相同的氨基酸序列组成的肽结合。5.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性地与由选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:2的片段、SEQIDNO:3的片段和SEQIDNO:4的片段的氨基酸序列组成的肽结合。6.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段为人的、人源化的或嵌合的。7.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段为单克隆的。8.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段为多克隆的。9.如权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab，片段、F(ab)，2片段和Fv片段。10.—种单离抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段特异性地与由SEQIDNO:2或其片4殳组成的肽结合。11.一种单离抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段特异性地与由SEQIDNO:3或其片段组成的肽结合。12.—种单离抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段特异性地与由SEQIDNO:4或其片段组成的肽结合。13.—种药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由至少有80%与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。14.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地与由选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:2的片段、SEQIDNO:3的片段和SEQIDNO:4的片段的氨基酸序列组成的肽结合。15.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体或片段为人的、人源化的或嵌合的。16.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆的。17.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段为多克隆的。18.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab，片段、F(ab)，2片段和Fv片段。19.一种药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由SEQIDNO:2或其片段组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。20.—种药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由SEQIDNO:3或其片段组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。21.—种药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体或稀释剂和特异性地与由SEQIDNO:4或其片段组成的肽结合的抗体或其抗原结合片段。22.—种治疗炎性疾病患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地与由至少有80%与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列相同的氨基酸序列组成的肽结合。23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或片段特异性地与由选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:2的片段、SEQIDNO:3的片段和SEQIDNO:4的片段的氨基酸序列组成的肽结合。24.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠梗阻、烧伤、阿耳茨海默氏病、会厌炎、失弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、惠伯尔病、哮喘、过敏症、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒病、败血病、内毒素性休克、恶病质、高热症、骨嗜酸性肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎、尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、嚢性纤维化、肺炎、矽肺病、肺泡炎、毛细支气管炎、咽炎、胸膜炎、窦炎、流行性感冒、呼吸道合胞体病毒感染、疱渗感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、播散性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、变形虫病、包虫嚢胂、烧伤、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样石更化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、乳糜泄、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、脑膜炎、脑炎、神经炎、神经痛、脊髓损伤、瘫痪、葡萄膜炎、关节炎性皮渗、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、曱状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、贝切特氏综合征、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、关节强硬性脊推柱炎、贝格尔氏病、Retier综合征和霍奇金病。25.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自腹膜炎、胰腺炎、脓毒病、内毒素性休克、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠梗阻、烧伤、阿耳茨海默氏病、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼齊、心肌缺血、同种异体移植物排斥、哞喘、移植物抗宿主病、充血性心力衰竭和嚢性纤维化。26.如权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物为人。27，如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段为人的、人源化的或嵌合的。28.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或片段为单克隆的。29.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或片段为多克隆的。30.如权利要求22所述的方法，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab，片段、F(ab)、片段和Fv片段。31.—种治疗炎性疾病患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地与由SEQIDNO:2或其片段组成的肽结合。全文摘要与烟碱乙酰胆碱受体的哺乳动物α7亚基或其功能变异体结合并为所述受体或变异体的激动剂的抗体或其抗原结合片段。包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。治疗炎性疾病患者的方法，所述方法包括给予所述患者本文中所描述的抗体或抗原结合片段。文档编号A61P29/00GK101355967SQ200680050315公开日2009年1月28日申请日期2006年11月15日优先权日2005年11月15日发明者K·J·特雷西,杨立宏申请人:范因斯坦医学研究院