用于治疗或预防卵巢癌的药物组合物的制作方法

专利名称：用于治疗或预防卵巢癌的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及卵巢癌及其转移的治疗性和预防性治疗领域。更具体地， 本发明涉及包含与卵巢组织细胞相关的蛋白质或其免疫活性变体的至少一 部分的免疫原性多肽，以及编码所述多肽的核酸。所述多肽和核酸序列可 用于疫苗和药物组合物中用于卵巢癌及其转移的治疗性和预防性治疗。
背景技术：
卵巢癌在女性最常见类型的癌症中居第八位。美国癌症学会估计在
2005年期间在美国将有约22,220个卵巢癌新病例被诊断。在女性中，卵巢 癌占全部癌症的约3%。因为许多卵巢癌不能在它们发育的早期检测到， 它们在致死性癌症中占不成比例的数目，导致女性生殖道癌症死亡的几乎 半数，比任何其它生殖器官癌症的死亡数都要高。年长的女性处于更高的 风险。超过半数的卵巢癌死亡发生在年龄介于55岁至74岁的女性中。大 约25%的卵巢癌死亡发生在年龄介于35岁至54岁的女性中。
对卵巢癌的主要治疗有外科手术、化疗和放射治疗。将这些治疗的组 合用于治疗卵巢癌。
外科手术是针对患有卵巢癌的女性最常用的初始治疗。通常，卵巢、 输卵管、子宫和子宫颈被切除。外科手术中的分期(以找出癌症是否已经 扩散)通常包括摘除淋巴结、收集来自隔膜和腹部其它器官的组织样本、 以及收集腹部液体。如果癌症已经扩散，外科医生通常会切除尽可能多的 癌症。这减少了随后将不得不通过化疗或放射治疗进行治疗的癌症的量。
化疗是利用药物杀死癌细胞。可以进行化疗以破坏外科手术后仍可能 残留在机体中的任何癌细胞，以控制肿瘤生长或减轻疾病的症状。大多数 用于治疗卵巢癌的药物是经静脉施用或通过导管直接施用于腹部。
放射治疗，也称放疗，包括使用高能射线杀死癌细胞。放射治疗仅在 治疗区域影响癌细胞。放射线可以来自器械；或者女性接受称做腹腔内治 疗的治疗，其中通过导管将放射性直接放入腹部。
确定特殊的疗程典型地是基于多种前兆参数和标记物(Fitzgibbons， et al. (2000) Arch. Pathol. Lab. Med. 124:966-978; Hamilton and Piccart (2000) Ann. Oncol. 11:647-663))，包括遗传诱因标记物BRCA-1和BRCA-2 (Robson (2000) J. Clin. Oncol. 18:113sup-l 18sup)。
尽管许多卵巢癌患者得到了有效治疗，但目前的疗法全都可能诱导严 重的副作用，从而降低生活质量。此外，大约85%的已通过基于铂和紫杉 醇的化疗得到有效治疗(包括完全有效)的患者在治疗后的2年内复发。
新的治疗耙的鉴定是改善卵巢癌患者目前治疗所必需的。近来在分子 医学上的进展已提高了在肿瘤特异性细胞表面抗原方面的兴趣，所述抗原 可以用作各种免疫治疗策略或小分子策略的靶。
在免疫系统的各元件中，T淋巴细胞可能最善于识别和消除表达外源 性或与肿瘤相关的抗原的细胞。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达CD8细 胞表面标记并专门诱导靶细胞的裂解，它们经穿孔素/粒酶和/或Fas/Fas-L 途径与所述靶细胞反应。CTL的抗原的T细胞受体(TCR)结合靶细胞表面 的分子复合物，所述分子复合物通过衍生自经加工的外源性或与肿瘤相关 的抗原的小肽(8-11个)残基形成，其与主要组织相容性复合体(MHC) I类 分子结合。
另一主要T细胞亚群(辅助性T淋巴细胞(HTL或T辅助细胞))的特 征在于其表达CD4表面标记。T辅助细胞识别略大的肽(8-ll个残基)，所 述肽也衍生自外源性或与肿瘤相关的抗原但仍属于MHCII类分子，其仅 由专职抗原呈递细胞(APC)例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC) 表达。
通过APC上的肽/MHC复合物对天然CTL和HTL的TCR剌激的结果 是，CTL成熟为能够裂解表达对应的肽/MHC I类复合物的(肿瘤)细胞的 效应物杀伤细胞。通过使APC在剌激天然CTL方面更有效以及通过产生 刺激CTL的成熟和增殖的淋巴因子，HTL放大了 CTL应答。T辅助细胞 的这种增强效应在发生免疫应答的次级淋巴器官，以及需要维持CTL应答 直至肿瘤细胞被消除的肿瘤部位均发生。因此，可以预测疫苗应当刺激肿 瘤反应性CTL和HTL以产生有效的抗肿瘤免疫性。
适用于免疫治疗癌症策略的抗原应该是在癌组织中高度表达并理想地 在正常成熟组织中不表达。组织中的表达不是生命所必需的，但是是可接 受的。
迄今，已描述了许多适用于卵巢癌治疗中的免疫治疗策略的抗原，包
括MUC1、 CT、 SP 17和Her2/neu。
多态性上皮粘液素(MUC1)是一种跨膜蛋白，存在于腺上皮细胞的顶 表面。它在卵巢癌中常常(超过全部卵巢癌的90%)过表达，并典型地呈现 出改变的糖基化模式，产生抗原性不同的分子。MUC1在早期临床试验中 用作疫苗靶点(Giewski, et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:1693-701; Scholl， et al. (2000) J. Immunother. 23:570-580)。肿瘤表达的蛋白质在循环中作为肿 瘤标记常常是可检测的(参见，Bon， et al. (1997) Clin. Chem. 43:585-593)。
一种独特类型的分化抗原，癌/睾丸(CT)抗原，除在睾丸和某些情况 下在胎盘表达外，在正常组织中不表达。这一事实使得CT抗原成为对癌 症的特异性免疫免疫疗法具有吸引力的靶。大多数CT抗原的功能目前是 未知的。Tammela et al. (Tamella， et al. (2004) Cancer Immunity 4:10-21)证 明SCP-1，在配子发育中具有已知功能的一种CT抗原，在15%的卵巢癌 病例中表达。由于SCP-1在正常组织中的限制表达以及在肿瘤组织中的异 常表达，其被建议可用作卵巢癌的疫苗治疗的潜在靶。
用于卵巢癌患者的免疫疗法的另一潜在的靶是精子蛋白17 (SP17)。发 现SP17在来自70%的卵巢患者的原发肿瘤细胞中表达。SP17在正常组织 中的限制表达使其成为肿瘤疫苗的理想的耙。 一种重组SP17蛋白与衍生 自单核细胞的树突细胞和自体外周血单个血细胞联合使用以产生SP17特 异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。人类白细胞抗原(HLA) I类抗原限制性 SP17特异性CTL在疾病出现时从3位卵巢癌患者的外周血中成功产生。 这些CTL能够以依赖于SP17的方式裂解自体埃-巴二氏病毒转化的类淋巴 母细胞。所述CTL还裂解SP17-阳性自体肿瘤细胞，表明在SP17-阳性肿 瘤细胞中SP17被加工并与HLA I类分子联合呈递。(Chiriva et al. (2002) Cancer 94(9):2447-2453)。
人表皮生长因子受体2 (Her2/neu)是一种致癌基因，其通过基因扩增 并伴随另一种(正常)基因产物的增强表达被激活。Her2/neu在20。/。-30。/o的 乳腺癌和卵巢癌患者中过表达。开发基于肽的Her-2/neu疫苗的最初研究
是在大鼠模型中进行的(Disis et al. (1999) Clinical Cancer Research 5:1289-1297)。在用完整的大鼠neu蛋白免疫的动物中没有观察到T细胞应答或抗 体应答。通过经标记的对照物，大鼠中对大鼠蛋白的耐受性可以通过 用基于肽的疫苗进行免疫而得以避免。用设计用于引发CD4+ T细胞应答 的"e"肽免疫的大鼠产生了特异于免疫肽和全蛋白的T细胞应答和抗体应 答。
Brossart et al.证明可以用以衍生自Her2/neu或MUC1的肽脉冲的自体 树突细胞(DC)对晚期乳腺癌和卵巢癌患者进行有效接种。10位患者中有 5位可以在外周血中检测到肽特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞。据报 道，在一位用MUC-1肽脉冲的树突细胞进行治疗的患者中观察到MAGE-3和CEA肽特异性的CD8+ T细胞，且用衍生自HER2/neu的肽接种后在 另一患者中观察到MUC-1特异性T细胞。Brossart et al.提出这表明在治疗 的基础上在这些患者中发生了表位扩展(Brossart et al. (2002) Transfiis Apher Sci. 27(2): 183-186)。
表位扩展是一种公认的自身免疫应答现象，并被认为是CD4+T细胞 介导的自身免疫病中的一种加重因子(exacerbating factor)。该现象已在鼠 复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、泰累尔氏鼠脑脊髓炎病毒 诱导的脱髓鞘病和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病中得到证实。已经提 出了显示表位扩展在CD4+ T细胞介导的自身免疫病中是如何发生的模 型。这一模型得到直接证据的支持，即组织损伤、通过MHC II类肽复合 物在CD4+ T细胞上的TCR连接、CD40-CD40配体间的相互作用以及 CD28介导的共刺激是使表位扩展变得明显所必需的。存在于位于耙组织 中的专职抗原呈递细胞(APC)表面的MHC II类分子中的初始自身抗原或 持续性病毒表位被认为引起了特异于该抗原的CD4+ T细胞的活化。该T 细胞活化产生慢性炎症，导致所述靶组织的损伤。组织碎片随后被APC吞 噬，所述APC已上调应答于炎症细胞因子的MHC II类分子和共刺激分子 的表达。这些APC然后能够激活特异于由所述APC呈递的次生组织表位 的CD4+T细胞。新激活的T细胞然后辅助进行靶组织的破坏。
由于通过APC呈递外源性抗原的需要，表位扩展历史上被认为是独特 于CD4+T细胞应答的现象。然而，最近的数据己表明通过APC进行交叉 引发(cross-priming)也可以参与诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应
答。特别地，鼠肿瘤模型中的骨髓嵌合体研究已表明肿瘤特异性CTL主要 受限于宿主的MHC而非肿瘤的MHC，表明通过宿主APC的间接呈递与 肿瘤特异性CTL的产生有关。此外，越来越多的证据表明存在可以将外源 性抗原呈递给负载于MHC I类分子上的最终的肽的途径。这一现象为树突 细胞(DC)进行了最好的描述并提供了一种用以解释交叉引发过程的细胞 机制。集合起来，这些数据表明在MHC I类-限制型CTL应答的过程中可 能发生表位扩展。因为己知发生MHC I类-限制型肿瘤抗原的再呈递，因 此假定如果携带肿瘤的宿主能够在CTL引起肿瘤细胞损伤后起始抗单一肿 瘤抗原的CTL应答，则可能经与在CD4+ T细胞介导的自身免疫病中所描 述的机制相类似的机制发生表位扩展。然而，与自身免疫应答过程不同的 是，抗肿瘤应答过程中的CTL表位扩展可能通过使肿瘤细胞变体消除而有 益于宿主，所述肿瘤细胞己丧失所述抗原的表达(抗原阴性肿瘤细胞) (Markiewicz et al.， (2001) International Immunology 13:625-632)。
Markiewicz et al发现用单一肿瘤肽P1A免疫并继以肿瘤排斥导致抗 P1A肿瘤的CTL活性，这指示表位扩展现象不限于CD4+ T细胞应答。 CTL的群体包括识别非相关抗原PIE的细胞。因为这一表位不包括在疫苗 中并且是一种不存在于正常组织中的突变的肽，因此PIE抗原来源必然是 肿瘤细胞攻击。
因为许多患者具有不表达前述抗原中的任何一种抗原的卵巢肿瘤，因 此需要揭示出用于免疫疗法的其他抗原性靶以处理局限性和转移性疾病。 因此，本申请提供了用于卵巢癌中的免疫治疗措施的分子靶。
透明带(ZP)形成环绕在发育的和排出的卵母细胞以及植入前胚胎周围 的胞外糖蛋白基质，并且在闭锁卵泡中也是可检测的。ZP诱导精子上的顶 体反应，决定受精的种特异性并防止哺乳动物中的多精入卵。透明带含有 四种主要的糖蛋白，ZP1、 ZP2、 ZP3和ZP4。在小鼠中进行的体外研究表 明ZP3的o-连接寡糖侧链与精子与ZP3的初级结合有关，而ZP2促成随 后持久的ZP结合以及作为次级精子受体的功能。
已经对ZP糖蛋白进行了广泛研究以开发用于动物和人类的生育力控 制的疫苗。建议的疫苗功能是在雌性对象中诱导有效持续的但为可逆转水 平的ZP特异性抗体，所述抗体抑制精-卵结合和/或防止ZP的精子穿入。 用抗小鼠ZP2或ZP3的大鼠单克隆抗体对雌性小鼠进行被动免疫导致所述
抗体被定位于卵巢内的卵母细胞以及长效但可逆转的避孕。用衍生自ZP3 的肽ZP3^-^对雌性小鼠进行主动免疫也导致可逆转的虽然不完全的避 孕，所述肽包含ZP3特异性避孕抗体识别的B细胞表位。这些ZP3肽也诱 导针对所述ZP3肽的T细胞应答。这些CD4+ ZP3特异性T细胞将自身免 疫性卵巢疾病(AOD)过继转移给同系受体(syngeneic recipients)。由于已知 ZP3免疫所想要的避孕效果是由抗体介导的，可接受的避孕用ZP疫苗应 当诱导足够的抗体应答而不激活ZP3特异性T细胞。实际上，已设计了由 来自牛核糖核酸酶(RNase)的外来T细胞表位和修饰的鼠ZP3^-^B细胞 表位组成的嵌合肽，其引发针对ZP的抗体并具有显著的避孕效果而不引 起显著的卵巢炎/AOD。所述牛核糖核酸酶T细胞表位在小鼠中刺激T辅 助细胞(辅助性T淋巴细胞，HTL)应答，因此使得可能存在避孕功效而不 诱导ZP(3)-特异性T细胞功能和T细胞介导的卵巢损伤。
以(自身)ZP抗原进行接种也已被用于研究自身免疫性卵巢疾病 (AOD)。更具体地，已报道了适于研究AOD的动物模型，其中利用ZP抗 原接种诱导自身免疫病。例如，Rhimetal.(Rhimetal. (1992) J.Clin. Invest. 89:28-35)证明在B6AF,小鼠中，用小鼠ZP3328'342肽进行接种诱导了 T细 胞和抗体应答。对截短的ZP3328'342肽的进一步研究证实，T细胞应答足以 诱导卵巢炎，7种这样的缺少抗体结合位点的肽引发了严重的卵巢炎而不 伴随有抗体应答。这些肽包括一种8个氨基酸的最小的产生卵巢炎的 (oophoritogenic)肽(ZP3孤337)，其与7个氨基酸的抗体结合位点(ZP333"42) 有两个残基的重叠。
据Bagavant et al. (Bagavant et al. (1999) Biology of Reproduction 61:635-642)报道，将ZP3肽特异性T细胞转移进原初受体小鼠导致肉芽肿性卵巢 炎并增强IL-1、 TNF-a和IFN-y的卵巢表达。然而，细胞受体的卵巢功能 是正常的，且所述小鼠保持能育。针对ZP3的抗体不能单独地引起任何卵 巢病状。致病性T细胞和ZP抗体一起的共转移将炎症靶向发育中的卵泡 导致它们被破坏以及卵巢萎縮的发展。在另一项研究中，Bagavant etal (Bagavant et al. (2002) American Journal of Pathology 160: 141-149)证实灵长 类中的ZP3肽(人ZP332M41、猕猴ZP3^s"和小鼠ZP333Q'342)免疫可以引 发T细胞应答并引发与鼠AOD相类似的卵巢免疫病理学。
国际专利申请WO 2005/026735 (Buschmann et al.)涉及差异表达的肿 瘤特异性免疫原性膜蛋白及其用途，尤其是用于发现至少一种特异性调节 至少一种所述膜蛋白的表达的治疗性分子或化合物或用于发现特异性结合 所述膜蛋白的任何一种和/或与其相互作用的治疗性分子。所述膜蛋白可以 是SYPL、 STOML2、 RAGA 、 CLNS1A 、 PRNP 、 GNB2L1 、 GNG4 、 ITM2B、 ITM1、 TM9SF2、 TM4SF6、 OPRLI、 LRP4、 GLEPP1、 TLR3和/ 或ZP3。 WO 2005/026735教导给致瘤性靶细胞施用前述的治疗性分子或化 合物以调节所述致瘤性靶细胞的增殖、分化和/或细胞迁移。按说明，待治 疗的非甾体依赖性癌症是由于至少一种所述免疫原性膜蛋白的异常的表达 和/或生物活性所致。WO 2005/026735中还简要地提及， 一种特定病变的 发展，例如可以在上皮组织中发现的致瘤前病变发展成致瘤性病变，可以 通过给对象接种一种足以产生抗体和/或T细胞免疫应答所述膜蛋白而被抑 制。其还特别说明，根据另一个实施方式所述方法包括经载体输送一种所 述免疫原性膜蛋白以诱导所述免疫应答进而产生抗体保护对象免于疾病， 所述载体指导所述蛋白质的体内表达。因此，WO 2005/026735教导了几种 利用siRNA、受体拮抗剂或抗体抑制其中的ZP3膜蛋白在致瘤性靶细胞中 的表达和/或生物活性以调节所述靶细胞的增殖、分化和/或迁移的方法。 WO 2005/026735仅公开了 ZP3膜蛋白在某些结肠癌细胞中的表达。没有 其它对与任何ZP糖蛋白的表达相关的肿瘤的报道。
发明概述
本发明人已经惊奇地发现透明带糖蛋白提供了用于卵巢癌及其转移的 治疗性和预防性治疗中的免疫治疗策略的适合的抗原。能够诱导CD8+和/ 或CD4+ T细胞应答的ZP抗原以及编码所述抗原的核酸序列可以适当地用 于所述免疫治疗策略中。
应答于本发明的方法的患者中的卵巢肿瘤细胞自己可以以显著量表达 ZP糖蛋白，从而使得它们被初级免疫应答所靶向。然而，不希望受理论的 约束，假定本发明的方法还可以很大程度上依赖于表位扩展现象；用透明 带抗原进行免疫诱导了针对表达ZP糖蛋白的细胞的T细胞应答，随后通 过APC将所述含有次级表位的表达ZP的细胞的碎片交叉呈递给CD8+和/ 或CD4+ T细胞可以诱发针对衍生自不同抗原(即不用于接种的抗原)的表
位的细胞毒性/细胞毒性T细胞免疫应答。表达这些抗原的(肿瘤)细胞将 在这一"次级"免疫应答中被攻击。在这方面，本发明的方法还可以被视为 其中产生了与自身免疫性卵巢疾病(AOD)相当的或类似的病状的方法。
WO 01/02000公开了用于动物繁殖的控制、生殖疾病和障碍的治疗以 及动物行为管理的免疫原性组合物，其包含衍生自透明带蛋白的免疫原。 WO 01/02000中所描述和/或提出的所有方法都基于这样一个发现，即这些 免疫原性组合物可以以引起可逆转的暂时性不育(免疫避孕)或永久的不可 逆的不育(免疫绝育(immunosterilisation))的方式用于影响这些动物的生殖 系统。WO 01/02000中提出在允许经历无限制的动情期的兔中，所述方法 可适于预防多种病症，包括生殖道和这些动物的乳腺的瘤形成。如本领域 中通常知道的那样，过度的雌激素暴露(例如由经历无限制的动情期的动 物所致)将促成生殖道和乳腺中的某些雌激素敏感型致瘤性疾病的发生。 如WO 01/02000中解释的那样，在试图减少(过度的)雌激素暴露方面，免 疫绝育和/或免疫避孕可以成为卵巢子宫切除术的有效替代方式。对雌激素 暴露敏感的最常见类型的生殖道致瘤性疾病是子宫内膜癌。卵巢癌一般对 雌激素暴露不敏感。本发明涉及治疗和域预防人类的卵巢肿瘤的方法，.包 括用一种多肽来源免疫所述哺乳动物，所述多肽包含MHC I类或MHC II 类限制性天然透明带T细胞表位或其免疫活性变体；以及适用于所述方法
中的组合物。
下面将对本发明进行更详细的描述。
发明详述
本发明的第一个方面涉及通过诱导针对ZP (糖)蛋白的初级免疫应答 用于治疗性和/或预防性治疗人卵巢癌及其转移的方法，该方法包括给所述 人施用一种多肽来源的步骤，所述多肽包含能在体内引发T细胞介导的免 疫应答的MHC I类和/或MHC II类限制性天然透明带T细胞表位或其免疫 活性变体。在本发明的一个特别优选的实施方式中，本发明的方法是一种 用于治疗性治疗的方法。
这些年来ZP糖蛋白组分的命名很不一致，采用了多个标准(包括表观 分子量、蛋白质序列长度和序列相同性比较)，从而导致混乱的命名。 Harris et al. ((1994) DNA s叫.96:829-834)提出了一个命名的统一系统，其中对ZP基因按照它们所编码的蛋白质序列的长度从长至短的顺序进行命 名。因为，在那些标准下，小鼠ZP基因被排为ZP2，然后是ZP1再然后 是ZP3，因此引入新系统其中将ZP2变成ZPA， ZP1变成ZPB， ZP3变成 ZPC。更近期，Hughes et al ((1999) BBA-Gene Structure and Expression 1447:303-306)报道已知的小鼠ZP1基因的真实直向同源基因不是ZPB，但 存在一个不同的人ZP1基因。现在被普遍接受的是，存在4种不同的(人) ZP糖蛋白家族，ZP1、 ZP2、 ZP3和ZPB (参见Lefievre et al (2004) Hum. Reprod. 19:1580-1586)。根据这一命名法的ZPB糖蛋白现在也称作ZP4。 这一命名法例如用于Uniprot/SWISSprot、 ensEMBL、 BLAST (NCBI)、 SOURCE、 SMART、 STRING、 PSORT2、 CDART、 UniGene和SOSUI数 据库中，全部这些数据库在Bioinformatic Harvester (http://harvester.embl.de) 中均提供。
据此，术语ZP1、 ZP2、 ZP3和ZP4被用于本申请中表示4种ZP糖蛋 白家族，其中ZP2、 ZP3和ZP4分别对应于根据Harris et al提出的命名法 的ZPA、 ZPC和ZPB。更具体地，本申请中所用术语hZPl、 hZP2、 hZP3 和hZP4分别指具有包含SEQ ID NO.l、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO.3和 SEQIDNO.4的序列的多肽骨架的(糖)蛋白。
在本申请说明书及权利要求书中，动词"包含(to comprise)"及其动词
变形形式在其非限制性意义上进行使用，意指包括该词之后的各项，但不 排除未特别提及的项。此外，通过不定冠词"a"或"an"限定的组件不排除存 在超出一种所述组件的可能性，除非上下文中明确规定存在一种或仅有一 种所述组件。因此，不定冠词"a"或"an"通常意指"至少一种"。
本申请所用术语"卵巢癌"指原发性卵巢肿瘤以及可位于机体任何部位 的所述原发性卵巢肿瘤的转移。根据本发明的方法也可以有利地用作使用 任何传统方法(包括例如卵巢切除手术、放射治疗和/或化疗)对患者进行 治疗期间或之后的辅助治疗。然而，公知许多传统抗癌治疗(例如化疗和 放疗)可以是高免疫抑制的。因此，对于本领域技术人员而言将很清楚， 当进行所述治疗后，本发明的方法的效力可能会更低。本发明提供适用于 治疗原发性卵巢癌及其转移的方法(治疗性治疗)，以及用于预防在其他治 疗方法(例如上面所描述的方法)之后或联合其他治疗方法时卵巢癌的转移 和/或复发的方法(预防性治疗)。 对于本发明的方法而言，待治疗的人为女性，优选幼年女性、绝经前 女性或绝经早期女性。在停经后的女性中，大多数卵泡将自卵巢消失。剩
下的卵泡不能表达足够量的ZP糖蛋白用于开展初级自身免疫应答，使得 通过ZP接种来治疗和/或预防卵巢癌的本发明的方法更不可能在所述停经
后的女性(相对幼年、绝经前和绝经早期的女性)中获得成功。所述雌性哺 乳动物特别优选是幼年或绝经前雌性。
本申请所用术语"表位"指典型地通过肽定义的抗原的一部分，当其存
在于体内生理相关环境中时能够引发细胞或体液免疫应答。"T细胞表位" 指与MHC分子结合并且当存在于MHC分子中时被T细胞所识别的肽或 其部分。T细胞表位能够经由在杂二聚聘MHC分子中的直接或间接呈递 诱导细胞介导的免疫应答。简言之，MHC分子优先结合称作"锚"残基的特 定氨基酸残基(K. Falk et al.， Nature 351:290-96 (1991))。这一特征允许将I 类和II类MHC识别表位鉴定在任何已知肽序列的范围内。在本说明书 中，术语"MHC限制性表位"与T细胞表位同义。本申请所用术语"I类 MHC限制性表位"指由细胞毒性T淋巴细胞(也称作CD8+细胞或CTL)联 合I类MHC所识别的肽序列。本申请所用术语"II类MHC限制性表位"指 由辅助性T细胞(也称作CD4+细胞或HTL)所识别的肽。"B细胞表位"是 抗原的一部分，典型地是一种肽，其能够结合免疫球蛋白的抗原结合位点 并因此能够刺激体液应答而不存在于MHC分子中。如在前面所解释的那 样，可用于本发明中的多肽或编码所述多肽的核酸包含至少一种T细胞表 位。然而，本发明不排除使用还包含B细胞表位的多肽。本发明的免疫原 性多肽还可以包括多种T细胞表位，以及任选地包括B细胞表位。但在多 肽中存在多种表位时，所述表位可以串联排列；或者以嵌合或重叠构形存 在，其中两个或多个表位可共享至少一个氨基酸残基。
本发明的多肽优选包括一或多种MHC I类结合表位。如本领域技术人 员普遍公知的那样，包含单个肽表位的抗原将仅对治疗一 (小)组表达 MHC等位基因产物的患者有用，所述等位基因产物能够结合该特定的 肽。己预测，在人类，含HLA-A1、 -A2、 -A3、 -A24和-B7限制性CTL表 位的疫苗将为大多数种族背景的大约80%的个体提供保护。因此，如果本 发明的方法被用以治疗人类女性，特别优选本发明的多肽来源包含有效量 的包含一种、更优选两种、最优选三种选自HLA-A1、 HLA-A2、 HLA-
A3、 HLA-A24和HLA-B7限制性表位的结合I类MHC的天然ZP表位的 一或多种不同的多肽或其同系物，或编码所述一或多种多肽或其同系物的 一或多种核酸序列。
根据另一个实施方式，本发明的多肽优选包括一或多种MHC II类结 合表位。在人类中，最经常被发现的MHC II类等位基因产物包括HLA-DR1、 -DR3、 -DR4和-DR7。因此，优选本发明的多肽来源包含有效量的 一或多种不同的多肽或其同系物或编码所述一或多种多肽或其同系物的一 或多种核酸序列，所述一或多种不同的多肽包含一种、更优选两种、最优 选三种选自HLA-DR1、 HLA-DR3、 HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位的 结合II类MHC的天然ZP表位。
在另一个实施方式中，本发明的多肽来源包含有效量的一或多种多 肽、其同系物或编码所述多肽或其同系物的一或多种核酸序列，如本申请 上面所述，所述一或多种多肽包含一或多种MHC I类结合表位和一或多种 MHCII类结合表位。甚至，更优选地所述来源包含有效量的一或多种不同 的多肽或所述一或多种多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物的一或多 种核酸序列，所述多肽总共基本包括了一种天然ZP糖蛋白中所含的全部 MHC I类和MHC II类结合表位。
在一个实施方式中，本发明的多肽来源包含有效量的一或多种不同的 免疫原性多肽或所述一或多种多肽的同系物或编码它们的一或多种核酸序 列，所述一或多种不同的多肽总共包含天然ZP糖蛋白中所含的至少 50°/o、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%和最优选至少 95%的MHC I类和MHC II类限制性结合表位。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽来源包含有效量的免疫原性 多肽或所述多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物的核酸序列，所述多 肽包含天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50%、更优选至少70%、 更优选至少80%、更优选至少90%和最优选至少95%。
在另一个特别优选的实施方式中，多肽来源包含有效量的天然ZP糖 蛋白的多种不同的重叠多肽片段或所述多肽的同系物或编码所述多肽或其 同系物的一或多种核酸序列，所述不同的重叠多肽片段的长度介于18-60 个氨基酸并总共包含所述天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50%、 更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少卯°/。和最优选至少95%。
典型地，不同的连续16-80个氨基酸多肽片段之间的氨基酸重叠为至少7 个氨基酸、优选至少8个、更优选至少9个和最优选至少10个氨基酸。
对最常见的MHC I类和II类等位基因的MHC结合基序已有记载。这 些基序详细列举了用作用于特定的MHC I类和II类等位基因的MHC结合 锚的氨基酸残基。考虑了所述MHC结合锚以及肽的氨基酸序列的复杂的 基于计算机的算法被用于预测并定量所述肽/MHC的相互作用的结合亲和 力。因此，从输入透明带(糖)蛋白的己知氨基酸序列开始，这些算法列出 了全部潜在的T-细胞表位，每个表位带有其相应的预测性的结合评分。公 知的用于这些目的的生物信息学工具包括HLA_BIND、 SYFPEITHI、 NetMHC和TEPITOPE 2000 (参见参考文献1-6)。或者，本领域技术人员 能够利用标准实验试验性地确定出HTL和CTL结合表位(Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience 2004》
在某些情况下，已观察到相同的肽可以结合几种MHC I类和II类等 位基因产物。在一个实施方式中，尤其优选在本发明的方法中使用这种 "滥交(promiscuous)"MHC结合肽。
根据本发明的方法的施用给人的"多肽来源"可以包含蛋白质、所述蛋 白质的消化产物和/或其片段，其可以以纯化形式存在或可以包含在(优选 生物来源的)粗制组合物中，例如原核或真核细胞系的裂解产物、超声处 理产物或固定产物。或者，所述免疫原性多肽来源可以包含化学合成的 (多)肽或体外酶促产生的多肽，其可以以纯化形式存在或可以包含在粗制 组合物中。所述多肽来源也可以是来自RNA或DNA模板的编码所述多肽 的核酸。所述RNA或DNA分子可以是"裸露"DNA，优选包含于小泡或脂 质体中，或可以包含于载体中。所述载体可以是本领域中已知的任何(重 组)DNA或RNA载体，优选是质粒，在所述质粒中编码潜伏抗原的基因 被可操纵地连接至赋予所编码的信使的表达和翻译的调控序列。所述载体 还可以是任何DNA或RNA病毒，例如但不限于腺病毒、腺伴随病毒 (AAV)、反转录病毒、慢病毒、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)或鸡痘病 毒，或者任何其它能够赋予宿主表达包含潜伏表位的多肽的能力的病毒载 体。DNA载体可以是非整合的(例如附加型复制载体)或者可以是通过随 机整合或通过同源重组整合在宿主基因组中的载体。可以适当地用于本发 明的、掺入人ZP2 cDNA的质粒的构建的例子可以在Martinez et al.的出版
物((1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement 50:35-41)中找
到，该文献通过引用并入本发明。
任选地含于载体(例如病毒或质粒)中的包含编码根据本发明的多肽的 基因的DNA分子可以整合在宿主的基因组中。在本发明的一个优选的实 施方式中，这样的宿主可以是一种微生物。优选地，这样的重组微生物是 能够将根据本发明的多肽或其片段输送至宿主的分枝杆菌，例如结核分枝 杆菌或牛分枝杆菌以及最优选地是牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。重组BCG 和用于重组的方法是本领域中已知的，例如在WO2004094469中所记载 的。可以将这种重组微生物配制成重组活疫苗和/或减毒活疫苗，如在 Jacobs et al. 1987, Nature, 327(6122):532-5)中所记载的那样。所述载体也可 以包含在细菌来源的宿主中，例如但不限于活的减毒的和/或重组志贺氏菌 或沙门氏菌。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于在人类女性中诱导针对天 然透明带糖蛋白的初级免疫应答的方法，其中所述方法包括给所述人施用 一种多肽来源或编码所述免疫原性多肽的核酸序列的步骤，所述肽包含I 类MHC-和/或II类MHC-限制性天然透明带T细胞表位或其免疫活性变 体，其中所述多肽来源包含有效量的选自透明带糖蛋白、其同系物和所述 多肽和其同系物的免疫活性片段。根据本发明的一个优选实施方式，所述 透明带蛋白选自ZP1蛋白、ZP2蛋白、ZP3蛋白和ZP4蛋白，更优选ZP2 蛋白和ZP3蛋白，最优选ZP2蛋白。
术语"其免疫活性片段"在本领域中将通常被理解为是指包含至少一个 表位的多肽抗原的片段，这意味着该片段至少包含来自所述多肽抗原的序 列的4、 5、 6、 7或8个连续的氨基酸。根据本发明，所述片段至少包含T 细胞表位。因此，根据本发明的"免疫活性片段"包含来自ZP蛋白抗原或 其同系物或类似物的序列的至少8、 9、 10、 11、 12、 13或14个连续的氨 基酸。更优选地，所述片段同时包含CTL和T辅助细胞表位。然而，更优 选地，所述片段是一种需要通过抗原呈递细胞加工的肽，即所述片段具有 至少约18个氨基酸的长度，所述18个氨基酸不一定是来自所述多肽抗原 的连续序列。
本申请所用术语"其同系物"指由于小的修饰而不同于天然存在的多肽 的多肽，但其保留了天然存在形式的基本的多肽和侧链结构。这种改变包
括但不限于 一或几条氨基酸侧链的改变、 一或几个氨基酸的改变(包括 缺失(例如所述肽的截短形式)、插入和/或取代)、 一或几个原子的立体化 学的改变、和/或小的衍生化(包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙
酰化、豆蔻酰化、异戊烯化、palmitation、氨基化和/或添加糖基化磷脂酰 肌醇)。在本申请中，同系物或类似物相对于天然存在的多肽具有增强的或 基本相似的功能性。典型地，当例如通过利用缺省参数的GAP或 BESTFIT程序进行最佳比对时，天然存在的多肽与其同系物享有至少某一 百分比的序列相同性。GAP利用Needleman和Wunsch的全局比对算法， 对两条序列在其全长上进行比对，使匹配数最大化并使缺口数最小化。通 常，使用GAP缺省参数，其中缺口产生罚分=8，缺口延长罚分=2。对 于蛋白质而言，缺省得分矩阵为Blosum62 (Henikoff & Henikoff， 1992， PNAS 89， 915-919)。用于百分比序列相同性的序列比对和得分可以通过计 算机测序确定，例如GCG Wisconsin Package (版本10.3，可获自Accelrys Inc., 9685 Scranton Road， San Diego, CA 92121-3752, USA)。或者，百分比 相似性或相同性可以通过搜索数据库(例如FASTA、 BLAST等)确定。
在本申请中，同系物被理解为包含与前面提及的天然存在的ZP多肽 具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少95%、更优 选至少98%、以及最优选至少99%的氨基酸序列相同性并仍然至少能够引 发可由此获得的免疫应答的免疫原性多肽。在本申请中，同系物或类似物 可以包含取代、插入、缺失、额外的N-或C-末端氨基酸、和/或额外的化 学部分(例如碳水化合物)以增加稳定性、溶解性和免疫原性。
根据本发明的一个优选实施方式，上面所定义的本发明的免疫原性多 肽是糖基化的。不希望受到理论的束缚，假定通过这些多肽的糖基化，其 免疫原性被提高。因此，根据本发明的一个优选实施方式，如本申请中前 面所定义的前述免疫原性多肽是糖基化的，其具有的碳水化合物含量占糖 蛋白或糖基化多肽的总量的从10wt。/。至80wt%。更优选地，所述碳水化合 物含量从15wt。/。至70wt。/c)，更优选从20wt。/。至60wt%。在另一个实施方式 中，所述糖基化免疫原性多肽包含与对应的被治疗的人的透明带糖蛋白 (或其片段)的糖基化模式相类似的糖基化模式。假定这更进一步提高了所 述多肽的免疫原性。因此，优选所述免疫原性多肽包含与对应的人ZP糖 蛋白或其片段的的糖基化模式相类似的糖基化模式。 根据一个特别优选的实施方式，多肽来源包含有效量的选自人透明带 蛋白的免疫原性多肽、其同系物和这些蛋白及其同系物的免疫活性片段、
或编码所述免疫原性多肽的核酸序列。优选地，所述人透明带蛋白(hZP 蛋白)选自hZPl蛋白、hZP2蛋白、hZP3蛋白和hZP4蛋白。根据一个更优 选的实施方式，所述蛋白选自hZP2蛋白和hZP3蛋白，更优选所述蛋白是 hZP2蛋白。
根据一个特别优选的实施方式，本发明的免疫方法包括施用免疫活性 多肽片段来源，所述多肽片段选自如前面所定义的透明带蛋白片段和/或其 同系物，所述多肽片段包含显性CTL和/或HTL表位且所述片段具有介于 18个氨基酸和45个氨基酸之间的长度。如WO 02/070006中所描述的那 样，已观察到具有介于18个氨基酸和45个氨基酸之间的长度的肽提供了 更佳的免疫原性特性。优选地，肽可以化学合成且任选地可以(部分)重叠 和/或也可以与其它分子、肽或蛋白质连接。如PCT/NL03/00929和Welters et al. (Vaccine. 2004 Dec 2; 23(3):305-11)中那样，也可以将肽融合形成合成 的蛋白质。还可以优选给所述肽的氨基或羧基末端添加化学部分或额外的 (修饰的或D-)氨基酸以增加所述肽的稳定性和/或降低其生物降解性。为 了提高免疫原性，可以例如通过脂化或糖基化结合免疫刺激部分。为了增 强所述肽的溶解性，可以添加荷电氨基酸或极性氨基酸以增强溶解性并增 加体内的稳定性。
为了免疫的目的，前述的根据本发明的免疫原性多肽也可以与蛋白质 融合，所述蛋白例如是但不限于破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素或 其它载体分子。根据本发明的多肽也可以优选与热激蛋白融合，例如在(参 考文献Rapp UK and Kaufhiann SH, Int Immunol. 2004 Apr; 16(4):597-605; Zugel U, Infect Immun. 2001 Jim; 69(6):4164-7)中所描述的作为免疫显性肽 的载体的重组内源性(鼠)gp96 (GRP94)，或与Hsp70的融合蛋白(Triebel etal; W09954464)。
可以将本发明的免疫原性(多)肽的单个氨基酸残基通过肽键或模拟肽 键(peptide bond mimetic)掺入所述肽中。本发明的拟肽键包括本领域技术 人员公知的肽骨架修饰。这种修饰包括酰胺态氮、a-碳、羰基酰胺、酰胺 键的完全取代、延长、缺失或骨架交联等修饰。通常参见Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids， Peptides and Proteins, Vol. VII
(Weinstein ed., 1983)。几种肽骨架修饰是已知的，包括v [CH2S] 、 \|/ [CH2NH]、 \j/ [CSNH2]、 \)/ [NHCO〗、\|/ [COCH2]和\}/ [(E)或(Z) CH-CH]。 上面所使用的命名法遵循前面Spatola的建议。在本申请中，ij/指没有酰胺 键。取代酰胺基团的结构于括号中详细说明。
氨基酸模拟物也可以掺入所述多肽中。本申请所使用的"氨基酸模拟 物"是不同于天然存在的氨基酸的部分，其在构象和功能上用作本发明的 多肽中的氨基酸的替代物。如果不妨碍所述肽引发抗天然ZP T细胞表位 的免疫应答的能力，这样的部分用作氨基酸残基的替代物。氨基酸模拟物 可以包括非蛋白氨基酸，例如P-、 y-、 s-氨基酸，p-、 Y-、 s-亚氨基酸(例 如哌啶_4_羧酸)以及许多L-a-氨基酸的衍生物。许多适当的氨基酸模拟物 是本领域技术人员已知的，它们包括环己基丙氨酸、3-环己基丙酸、L-金 刚烷丙氨酸、金刚垸乙酸及类似物。Morgan and Gai加r， (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252讨论了适用于本发明的肽的肽模拟物。
根据一个优选的实施方式，本发明的方法包括施用包含一或多种如上 面所定义的本发明的免疫原性多肽和至少一种赋形剂的组合物。赋形剂是 带J药领域中已知的，可以例如在教科书(Remmington's pharmaceutical sciences, Mack Publishing, 1995)中找到。佐剂可以包含疫苗接种领域中任 何已知的佐剂，并可以利用教科书(例如Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 2004)进行选择。
佐剂在本申请中意欲包括当与抗原联合使用对人或动物进行免疫时，
刺激免疫系统从而激发、增强或促进抗所述抗原的免疫应答(优选不产生 针对佐剂本身的特异性免疫应答)的任何物质或化合物。与在相同条件但 缺少佐剂的条件下产生的抗所述抗原的免疫应答相比，优选的佐剂使抗给 定抗原的免疫应答增强至少1.5、 2、 2.5、 5、 10或20倍。用于在一组动物 或人中测定通过佐剂产生的抗给定抗原的免疫应答相对于对应的对照组的 统计学平均增强的检测是本领域中可利用的。所述佐剂优选能够增强抗至 少两种不同抗原的免疫应答。本发明的佐剂将通常是人的外源化合物，从 而排除了人的内源性免疫剌激性化合物(例如白介素、千扰素和其它激 素)。
许多佐剂是本领域技术人员所公知的。适当的佐剂包括，例如弗氏不 完全佐剂、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰
胺(thr-MDP)、 N-乙酰-去-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP 11637，称作 nor-MDP)、 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈 酰-sn-甘油基-3-羟基-磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835 A，称作MTP-PE)、 DDA (2 二甲基二十八烷基溴化铵)、polyIC， Poly-A-poly-U、 RIBFM、 GERBIFM、 Pam3TM、 CarbopoITM、 SpecolTM、 TitermaxTM、破伤风类毒 素、白喉类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、白喉蛋白CRM197。优选的佐剂 包含被存在于抗原呈递细胞上的Toll-样受体(TCR)识别的配体。各种被 TCR识别的配体是本领域中已知的，包括例如脂肽(参见例如WO 04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸质、脂阿拉伯甘露糖、(来自支原 体或螺旋菌的)脂蛋白、双链RNA(聚I:C)、非甲基化DNA、鞭毛蛋白、 含CpG的DNA和咪唑喹啉以及这些配体的具有化学修饰的衍生物。
本发明的用于免疫的方法可以进一步包括施用(优选共同施用)CD40 结合分子以增强CTL应答并从而增强本发明的方法及组合物的治疗效果。 CD40结合分子的应用在WO 99/61065中被描述，该文献通过引用并入本 发明。所述CD40结合分子优选是一种抗体或其片段或CD40配体或其变 体，并可以独立地添加或可以含于根据本发明的组合物中。对于治疗性应 用而言，以足以诱导针对天然ZP糖蛋白和表达ZP糖蛋白的组织细胞的初 级自身免疫应答的量，将本发明的免疫原性多肽或编码它们的核酸序列或 包含这些多肽或编码它们的核酸序列的本发明的组合物施用给患有卵巢肿 瘤及其可能存在的转移的患者或接受了其它治疗卵巢肿瘤的方法(例如前 面所述的传统方法)的患者。足以实现该目的的量被定义为"治疗-"或"预 防-有效剂量"。所述有效剂量将取决于多种因子(包括患者的健康状况或总 体状态)。因此，可以通过经过训练的医疗人员确定和调节剂量制度以提供 最佳的治疗和预防效果。
在本发明的方法中，典型地将一或多种免疫原性多肽以约lpg/kg患者 体重或更高的剂量施用至少1次。通常剂量超过10pg/kg。根据本发明， 所述剂量优选在从lpg/kg至于lmg/kg的范围。
根据一个优选的实施方式，典型的剂量制度包括l-1000ng/kg、更优选 10-500pg/kg、甚至更优选10-150pg/kg的剂量， 一周施用一次、两次或三 次，共施用一周、两周、三周、四周或五周。根据一个优选的实施方式， 施用10-100pg/kg， 一周一次，共一周或两周。
优选地，本发明的方法包括经肠胃外或口服途径(优选肠胃外途径)施 用本发明的免疫原性多肽和包含它们的组合物。在本发明的另一特别优选 的实施方式中，本发明的方法包括阴道施用本发明的免疫原性多肽和包含 它们的组合物。
本发明的另一实施方式包括给来自患者血液的单个核细胞(尤其是自
其分离的DC)离体施用包含本发明的免疫原性多肽的组合物。可以使用促 进DC的收获的药物，例如Progenipoietin.TM. (Monsanto, St. Louis, Mo.)或 GM-CSF/IL-4。用肽脉冲所述DC并进行洗涤以除去未结合的肽后，将所 述DC再灌注入所述患者。在这一实施方式中，提供了包含肽脉冲的DC 的组合物，所述DC将HLA分子中被脉冲的肽表位呈递到它们的表面。 应用离体的肽脉冲的DC诱导免疫应答的方法是本领域技术人员所公知 的。
本发明的另一方面涉及一种药物制剂，其包含本申请前面所定义的作 为活性成分的本发明的多肽来源。更具体地，药物制剂包含作为活性成分 的一或多种前述的免疫原性多肽，所述免疫原性多肽选自ZP蛋白、其同 系物和所述ZP蛋白的片段及其同系物，或如苯申请前面所定义的基因治
疗载体o
根据第一个实施方式，提供了一种药物制剂，其包含一或多种本发明 的免疫原性多肽。所述多肽在所述药物组合物中的浓度可以变化很大，即
从低于按重量计的约0.1% (通常为约按重量计的至少1%)至差不多按重量 计的20%或更高。
优选地，所述组合物除活性成分外至少包含一种药学上可接受的载 体。该药学上的载体可以是适于输送所述免疫原性多肽或基因治疗载体给 患者的任何相容的、非毒性物质。例如，对于多肽而言，可以将灭菌水、 醇、脂肪、蜡质和惰性固体用作载体。药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分 散剂及类似物也可以掺入所述药物组合物中。
根据一个特别优选的实施方式，本发明的药物组合物包含一种如在本 申请前面更详细地定义的佐剂。用于掺入本发明的组合物中的佐剂优选选 自被抗原呈递细胞上存在的Toll样受体(TLR)所识别的一组配体，包括脂 肽(参见例如WO 04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸质(liopteichoic acids)、脂阿拉伯甘露糖、(来自支原体或螺旋菌的)脂蛋白、双链RNA(聚I:C)、非甲基化DNA、鞭毛蛋白、含CpG的DNA和咪唑喹啉以及这些配 体的具有化学修饰的衍生物。本领域技术人员将能够确定这些待掺入本发 明的药物制剂以赋予它们足够的免疫原性的佐剂中的任何一种的确切的 量。根据另一个优选的实施方式，本发明的药物制剂可以包含一或多种用 以增强如本申请中前面所解释的CTL免疫性的额外成分。根据一个特别优 选的实施方式，本发明的药物制剂包含CD40结合分子。
制备包含多肽的药物组合物的方法在US 5,789,543和US 6,207,718中 有记载。优选的形式取决于希望的施用和治疗性应用的模式。
对于基因治疗而言，可以将包含编码本申请前面所定义的免疫原性多 肽的核酸序列的载体(例如质粒、噬粒、噬菌体、粘粒、病毒、反转录病 毒、附加体或转位因子)掺入药物组合物中。基因治疗载体可以通过例如 静脉注射、局部施用(参见US 5,328,470)或通过立体定向注射(参见例如 Chen et al， /WJS 91:3054-3057， 1994)输送给对象。所述基因治疗载体的药 物组合物可以包括于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括其 中埋入了基因输送载体的缓慢释放基质。或者，在可以从重组细胞(例如 反转录病毒载体)产生完整基因输送载体的情况下，所述药物制剂可以包 括一或多种产生所述基因输送系统的细胞。
本发明的免疫原性多肽优选肠道外施用。用于肠道外施用的制剂的多 肽必须是无菌的。在冻干和重建之前或随后，可以通过无菌过滤膜过滤容 易地实现灭菌。根据已知的方法，用于施用所述肽的肠道外途径例如是通 过静脉注射或灌注、腹膜内、肌内、动脉内、皮下或病变内途径。通过灌 注或通过大丸剂注射连续施用所述多肽。典型的用于静脉内灌注的组合物 可以被制成含有10-50ml无菌的0.9% NaCl或5%葡萄糖(任选地补充20% 的白蛋白溶液)和介于10pg和50mg (优选介于50吗和10mg)的所述多 肽。典型的用于肌内注射的药物组合物可以被制成含有例如l-10ml无菌缓 冲液和介于IO吗和50mg (优选介于50昭和10mg)的本发明的多肽。用于 制备可肠道外施用的组合物的方法在本领域中是公知的，并在多种来源中 有详细记载，包括例如Remington's Pharmaceutical Science (15th ed.， Mack Publishing, Eastern, PA， 1980)(对于全部目的，通过引用以其整体并入本发 明)。
对于口服施用，所述活性成分可以以固体剂量形式(例如胶囊、片剂 和粉剂)或液体剂量形式(例如酏剂、糖浆和悬浮剂)被施用。可以将活性 组分与无活性成分及粉末状载体(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀 粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁 及类似物) 一起封装在明胶胶囊中。可进行添加以提供所需的颜色、味 道、稳定性、缓冲能力、分散性或者其他已知所需特性的额外的无活性成 分的例子有氧化铁红、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用白墨及 类似物。类似的稀释剂可以用于制备压制片剂。片剂和胶囊均可以制成缓 释产品以用于在数小时的时期内持续释放药物。压制片剂可以是糖包被的 或膜包被的以掩盖任何令人不愉快的味道并保护所述片剂免遭空气破坏， 或者是肠溶包衣的以选择性地在胃肠道中裂解。用于口服施用的液体剂量 形式可以含有色素和调味剂以增加患者接受度。
多种阴道药物输送系统是本领域中己知的。适当的系统包括乳膏、泡 沫剂、片剂、凝胶、液体剂量形式、栓剂和阴道栓剂。包含与水接触后能 够膨胀并扩散到粘膜表面上的弱交联聚合物的粘膜吸附性凝胶和水凝胶已 被用于通过先前的阴道途径进行肽和蛋白质的接种。已提出了用于肽和蛋 白质药物的阴道输送的微球体的应用。包括赋形剂的阴道施用的剂量形式 的更详细的规格及制备所述剂量形式的实际方法对本领域人员而言是己知
的或将是显而易见的。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed.， Mack Publishing, Eastern, PA， 1980)。
用于本发明的免疫原性多肽可以使用重组技术制备，其中在适当的宿 主细胞中表达编码感兴趣的多肽的核苷酸序列(例如在Ausubel et al.， "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York (1987)和Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中所描述的宿主细胞，所述 文献均通过引用以其整体并入本发明)。还参见Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488 (记载了定点诱变)以及Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734或Wells, J.A., et al, (1985) Gene 34:315 (记载了盒式突变)。
利用杆状病毒制备重组人ZPA和ZPB的例子可以在前述的Martinez et al.的出版物((1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement 50:35-41)中找到。
利用细菌(大肠杆菌)、酵母细胞(巴斯德毕赤酵母)、昆虫细胞(苜蓿 银纹夜蛾多核型多角体病毒 (Autographa califomica multiple nuclear polyhedrosis virus))和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达系统制备重组人 ZPA和ZPB的例子在Harris et al.的出版物((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)中被公开，该出版物通过引用并入本申请。
因此，本发明的一个方面涉及包含如本申请前面所定义的编码本发明 的免疫原性多肽的核酸分子。优选地，所述载体是复制型载体，其包含确 保所述载体在所述载体的适当的宿主中的增殖的复制起点(或自主复制序 列)。或者，所述载体能例如通过同源重组或别的方式整合到宿主细胞的 基因组中。特别优选的载体是表达载体，其中编码如上定义的多肽的核苷 酸序列被可操纵地相连接于能够指导所述编码序列在用于所述载体的宿主 细胞中的表达的启动子。
本申请所用术语"启动子"指功能为控制一或多个基因的转录的核酸片 段，其位于相对于所述基因的转录起始位点的转录方向的上游，并通过用 于依赖于DNA的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它的 DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、抑制或活化蛋白结合位点) 以及本领域技术人员己知的直接或间接调控从所述启动子转录的量的任何 其它的核苷酸序列的存在进行结构上的确认。"组成型"启动子是在最佳生 理和发育条件下具有活性的启动子。"诱导型"启动子是根据生理或发育条 件而被调控的启动子。"组织特异性"启动子仅在特定类型的分化细胞/组织 中有活性。
如在Ausubel et al.， "Current Protocols in Molecular Biology", Greene
(2001， supra)(均通过引用以其整体并入本发明)中所记载的那样，表达载 体使得可以利用重组技术制备如上定义的免疫原性多肽，其中在适当的细 胞(例如培养细胞或多细胞生物体的细胞)中表达编码感兴趣的多肽的核苷 酸序列。还参见Kunkel (1985) Proc, Natl. Acad. Sci. 82:488 (记载了定点诱
变)以及Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734或Wells, J.A.， et al. (1985) Gene 34:315 (记载了盒式诱变)。
典型地，将编码所需多肽的核酸用于表达载体中。短语"表达载体"通 常指能够影响基因在与所述序列相容的宿主中的表达的核苷酸序列。这些 表达载体典型地至少包括适当的启动子序列和任选地转录终止信号。在本 申请中，也可以使用有效表达所需的或有用的额外的因子。将编码多肽的 DNA掺入能够导入体外细胞培养物并在其中表达的DNA构建体中。具体 地，DNA构建体适于在原核宿主(例如细菌如大肠杆菌)中进行复制，或 者能够被导入培养的哺乳动物、植物、昆虫(例如Sf9)、酵母、真菌或其 它真核细胞系中。
制备用于导入特定宿主中的DNA构建体典型地包括被所述宿主识别 的复制系统、编码所需多肽的DNA节段、以及与所述编码多肽的节段可 操纵地连接的转录和翻译起始和终止调控序列。当DNA节段与另一 DNA 节段功能性相关时，它们被"可操纵地连接"。例如，如果启动子或增强子 刺激序列的转录，其被可操纵地连接至编码序列。如果信号序列的DNA 作为参与多肽分泌的前体蛋白被表达，所述信号序列的DNA被可操纵地 连接至编码所述多肽的DNA。通常，被可操纵地连接的DNA序列是连续 的，且在信号序列的情形中是连续的并处于读框中(in reading phase)。然 而，增强子无需与其控制转录的编码序列是连续的。通过在方便的限制性 位点或在其替代插入的接头或连接子处的连接实现相连。
适当的启动子序列的选择通常取决于选择用于表达所述DNA节段的 宿主细胞。适当的启动子序列的例子包括本领域中公知的原核和真核启动 子(参见，例如Sambrook and Russell, 2001， supra)。所述转录调控序列典型 地包括被所述宿主所识别的异源增强子或启动子。适当的启动子的选择取 决于所述宿主，但是启动子(例如trp、 lac和噬菌体启动子、tRNA启动子 和糖酵解酶启动子)是已知和可利用的(参见，例如Sambrook and Russell, 2001, supra)。表达载体包括复制系统，可以应用转录与翻译调控序列以及 用于编码节段的多肽的插入位点。细胞系和表达载体的有效组合的例子在 Sambrook and Russell (2001, supra)以及Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36中有记载。例如，适当的表达载体可以在酵母例如酿酒酵母、昆虫细胞 例如Sf9细胞、哺乳动物细胞例如CHO细胞和细菌细胞例如大肠杆菌中表
达。由于原核细胞不具有糖基化所必需的细胞器官，通过原核细胞产生的 多肽将不具有碳水化合物侧链。真核细胞不具有糖基化手段，但酵母细胞 将提供与哺乳动物细胞不同的糖基化模式。因此，优选使用提供最"天然 的"糖基化模式的表达系统。最优选哺乳动物细胞。因为假定具有与对应 的人透明带糖蛋白的糖基化模式相类似的糖基化模式的根据本发明的抗原 能够增强免疫原性，可以优选使用具有与人的糖基化手段相类似的糖基化
手段的细胞系。适当的细胞系包括CHO细胞(参见例如US 5,272,070)，尤 其是人卵巢或卵泡细胞系(参见WO 99/42581)。
突变蛋白的体外诱变和表达在Ausubel et al. (1987， supra)和Sambrook and Russell (2001， supra)中有广泛记载。还参见Kunkel (1985， supra;记载 了定点诱变)和Roberts et al. (1987, supra;记载了盒式诱变)。
用于制备本发明的免疫原性多肽的另一方法是应用体外转录/翻译系 统。将编码多肽的DNA克隆到上述的表达载体中。然后在体外转录和表 达所述表达载体。翻译产物可以直接使用或首先进行纯化。尽管由于微粒 体的固有存在可以发生一些翻译后修饰，体外翻译产生的多肽典型地不含 有体内合成的多肽上存在的翻译后的修饰。通过体外翻译合成多肽的方法 通过例如Berger & Kimmel, Methods in Enzymology， Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego， CA, 1987 (通 过引用以其整体并入本发明)。
因此，本发明的另一方面涉及包含如上述的载体的宿主。所述宿主细 胞可以是如上面指出的原核或真核宿主细胞。所述宿主细胞可以是适于在 液体中或在固体培养基上培养的宿主细胞。或者，所述宿主细胞是多细胞 生物体例如转基因植物或动物(优选非人动物)的一部分的细胞。
另一方面，本发明涉及用于制备上面所定义的本发明免疫原性多肽的 方法。所述方法包括在有助于多肽的表达的条件下培养上面所定义的宿主 细胞的步骤。任选地，所述方法包括回收所述多肽。可以例如通过标准的 蛋白质纯化技术(包括本领域中本身已知的多种层析方法)从所述培养基中 回收所述多肽。
本发明的另一方面涉及一种转基因动物，在其体细胞和生殖细胞中包 含如上面所定义的载体。所述转基因动物优选是一种非人动物。用于产生 转基因动物的方法例如在WO 01/57079及其引用的参考文献中有记载。这
种转基因动物可以用于制备如上面所定义的多肽的方法中，所述方法包括 从包含所述载体的转基因动物或其雌性后代回收体液的步骤，其中所述体
液含有所述多肽；以及任选地从所述体液回收所述多肽。这种方法在WO 01/57079及其引用的参考文献中也有记载。所述含有多肽的体液优选地是 血液，更优选是乳。
本发明的另一方面涉及一种转基因植物，在其细胞中包含如上面所定 义的载体。用于产生转基因植物的方法例如在US 6,359,196及其引用的参 考文献中有记载。所述转基因植物可以用于制备如上面所定义的多肽的方 法中，所述方法包括回收在其细胞中包含所述载体的转基因植物的一部分 或这种转基因植物的后代的一部分的步骤，其中所述植物部分含有所述多 肽；以及任选地从所述植物部分回收所述多肽。这种方法在US 6,359,196 及其引用的参考文献中也有记载。
本发明在以下实施例中被进一步说明，所述实施例不以任何方式限制 本发明的范围。
实施例 实施例l
携带小鼠抑制素a亚单位启动子/猿病毒T-抗原融合基因的雌性转基 因小鼠在它们的卵巢中自卵泡膜细胞产生了肿瘤。这些肿瘤发生100%的 外显率和转移。这些雌性小鼠具有正常动情周期。
对于该研究，使用已利用Harris et al. ((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)描述的方法制备的表达rhZP2的CHO。
在发生卵巢癌(其大约发生在4月龄)之前，在40只雌性转基因小鼠 中进行该研究用重组人透明带2蛋白(rhZP2)免疫一组20只小鼠。其它 两组(每组10只雌性小鼠)包含对照组和假治疗组。用rhZP2免疫的小鼠 rhZP2发生在显微镜下可见的卵巢炎。尸体解剖时未在用rhZP2接种的小 鼠中发现肿瘤。所有对照组动物和假治疗的小鼠发生侵入性卵巢肿瘤且在 全部小鼠中可见到转移。尸体解剖后，对卵巢称重作为肿瘤负荷的度量。 对照组和假治疗的小鼠产生巨大的肿瘤负荷，涉及卵巢重量增加20-40 倍。用rhZP2免疫的组由于卵巢炎卵巢重量仅显示出小的增加。
实施例2
携带小鼠抑制素a亚单位启动子/猿病毒T-抗原融合基因的雌性转基 因小鼠在它们的卵巢中自卵泡膜细胞产生了肿瘤。这些肿瘤发生100%的 外显率和转移。这些雌性小鼠具有正常动情周期。
对于该研究，使用已利用Harris et al. ((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)描述的方法制备的表达rhZP2的CHO。
在发生卵巢癌(其大约发生在4月龄)之后，在40只雌性转基因小鼠 中进行该研究。在研究开始时，全部小鼠患有卵巢肿瘤和转移。用重组人 透明带2蛋白(rhZP2)免疫一组20只小鼠。其它两组(每组IO只雌性小鼠) 包含对照组和假治疗组。用rhZP2免疫的小鼠产生在显微镜下可见的卵巢 炎。
免疫后，对照组小鼠和假治疗的小鼠全部死于卵巢肿瘤及转移。尸体 解剖时，用rhZP2免疫的小鼠显示出没有卵巢肿瘤或小的卵巢肿瘤。
参考文献
1. Parker, K. C.， M. A. Bednarek， and J, E. Coligan. 1994. Scheme for ranking potential HLA- A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol- 152:163. HLA BIND (http://bimas.cit.nih.gov/mo lbio/hla—bind/)
2. Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands and peptide motifs: 1st listing, Immunogenetics 41， 178-228, 1995; SYFPEITHI (http:〃www.syQ)eithi.de/) and Rammensee, Bachmann, Stevanovic:MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience 1997 (International distributor - except North America: Springer Verlag GmbH & Co. KG， Tiergartenstr. 17， D-69121 Heidelberg
3. Buus S， Lauemoller SL， Worning P， Kesmir C， Frimurer T， Corbet S, Fomsgaard A， Hilden J， Holm A, Brunak S. Sensitive quantitative predictions of peptide國MHC binding by a 'Query by Committee' artificial neural network
approach, in Tissue Antigens., 62:378-84， 2003; NetMHC (http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC7)
4. Nielsen M, Lundegaard C, Woming P, Lauemoller SL, Lamberth K， Buus S， Brunak S， Lund O.， Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein ScL， 12:1007-17, 2003.
5. Improved prediction of MHC class I and class II epitopes using a novel Gibbs sampling approach, Nielsen M， Lundegaard C， Woming P, Hvid CS， Lamberth K, Buus S， Brunak S， Lund O.， Bioinformatics， 20(9): 1388-97， 2004.
6. Sturniolo， T. et al" Nature Biotechnology 17， 555-562, 1999， Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA chips and virtual HLA class II matrices; TEPITOPE (http:〃www.vaccinome.com/pages/597444/).
权利要求
1.包含I类MHC和/或II类MHC限制性天然透明带T细胞表位或其免疫活性变体的多肽来源用于制备用于治疗性和/或预防性治疗人卵巢癌和/或其转移的方法中的药物的用途。
2. 根据权利要求1的用途，其中的治疗方法是一种治疗性治疗的方法。
3. 根据权利要求1或2的用途，其中所述多肽来源包含有效量的免疫 原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽选自透 明带蛋白、其同系物和所述蛋白及其同系物的免疫活性片段。
4. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽来源包含有效量 的免疫原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽 选自hZPl、 hZP2、 hZP3、 hZP4，其同系物和所述蛋白及其同系物的免疫 活性片段。
5. 根据权利要求4的用途，其中所述免疫原性多肽选自hZP2、其同系 物和所述蛋白及其同系物的免疫活性片段。
6. 根据权利要求1-5中任一项的用途，其中所述多肽来源包含有效量 的免疫原性多肽片段或编码所述多肽片段的核酸序列，所述多肽片段选自 天然透明带蛋白片段和/或其同系物，所述片段的长度介于18个氨基酸和 45个氨基酸之间。
7. 根据权利要求1-5中任一项的用途，其中所述多肽来源包含有效量 的一或多种不同的免疫原性多肽、所述一或多种免疫原性多肽的同系物或 编码所述多肽或其同系物的一或多种核酸序列，所述一或多种免疫原性多 肽总共包含天然ZP糖蛋白中所含的MHC I类和MHC II类限制性结合表 位的至少50%、更优选至少70%。
8. 根据权利要求1-5中任一项的用途，其中所述多肽来源包含有效量 的免疫原性多肽、所述免疫原性多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物 的核酸序列，所述免疫原性多肽包含天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的 至少50%、更优选至少70%。
9. 根据权利要求1-5中任一项的用途，其中所述多肽来源包含有效量 的天然ZP糖蛋白的多种不同的重叠多肽片段、所述多肽片段的同系物或 编码所述多肽片段或其同系物的一或多种核酸序列，所述不同的重叠多肽片段的长度介于18-60个氨基酸并总共包含所述天然ZP糖蛋白的完整氨基 酸骨架的至少50%、更优选至少70%。
10. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽包含与对应的 天然ZP糖蛋白或其片段的糖基化模式相类似的糖基化模式。
11. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述方法包括施用、优 选共同施用至少一种佐剂。
12. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述人是幼年女性或绝 经前女性。
13. 药物组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所定义的多肽来源。
14. 根据权利要求13的药物组合物，其包含佐剂。
15. 根据权利要求13或14的药物组合物，其中所述免疫原性多肽是 hZP2、其同系物、或所述蛋白或其同系物的免疫活性片段。
全文摘要
本发明涉及卵巢癌及其转移的治疗性和预防性治疗。更具体地，本发明涉及包含与卵巢组织细胞相关的蛋白质或其免疫活性变体的至少一部分的免疫原性多肽，编码所述多肽的核酸及其在免疫治疗方法中的应用。所述免疫原性多肽通过透明带(ZP)糖蛋白提供。能够诱导CD8⁺和/或CD4⁺T细胞应答的ZP糖蛋白及其片段以及编码它们的核酸序列可以适当地用于本发明的免疫治疗策略中。
文档编号A61P35/04GK101365473SQ200680051184
公开日2009年2月11日 申请日期2006年11月16日 优先权日2005年11月16日
发明者B·H·J·T·科林格, V·莫妮克 申请人:潘塔希生物科学股份有限公司