专利名称：两种乳杆菌株及其用于制备通便生态口服液的方法
技术领域：
本发明涉及两种乳杆菌株及其在制备保健食品中的应用。
背景技术：
便秘是一种常见的临床症状，对人体的危害很大，会引起头痛、肩膀酸痛、肌肤粗糙等衰老、患病症状。目前治疗便秘的方法主要是用泻药，通过刺激小肠而产生腹泻，但这样往往会引起脱水，影响肠道的正常生理平衡，因而寻求一种能够润肠通便，无毒无害，可以长期食用的保健食品对便秘患者无疑具有重要的意义。
近些年来，利用微生物技术研制益生菌类保健食品风靡了全世界。很多研究已表明，益生菌具有提高肠道机能，改善人体胃肠功能，维持肠道菌群平衡的作用。如何选育优质益生菌菌株并将其应用于开发具有通便功能的保健食品是目前研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有润肠通便作用的益生菌保健食品。为此，本发明公开了两种经选育得到的乳杆菌株以及将它们用于制备通便生态口服液的方法。
本发明所提供的两种乳杆菌株，分别为德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus和嗜酸乳杆菌株Lactobacillus acidophilus，已于2007年1月31日保藏在位于北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC No.1936和CGMCCNo.1937。
德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，是将保加利亚乳杆菌标准菌株1.1480(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)经活化后筛选得到。将该菌株在MRS琼脂培养基上的形态观察结果为革兰氏染色呈阳性，细胞形态为长杆状，形成芽孢呈阴性，过氧化氢酶呈阴性。
嗜酸乳杆菌株Lactobacillus acidophilus，是将嗜酸乳杆菌标准菌株1.1854(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)经活化后筛选得到。将该菌株在MRS琼脂培养基上的形态观察结果为革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，形成芽孢呈阴性，过氧化氢酶呈阴性。
本发明还提供了采用上述乳杆菌株用于制备通便生态口服液的方法，包括以下步骤
(1)采用MRS培养基对权利要求1和权利要求2的菌株分别进行培养，培养温度为35℃，培养时间为120h；(2)将步骤(1)中培养好的两种菌种按照1∶1的比例接入菌种罐内进行复合培养，采用营养琼脂作为培养基，培养温度为35℃，培养时间为48h；(3)将步骤(2)中培养好的复合菌种接入大罐内做进一步培养，采用红糖作为培养基，培养温度为28℃，培养时间为72h；(4)将步骤(3)中所得液体按常规罐装制得口服液产品。
所述MRS培养基每1000ml蒸馏水中包含如下成分蛋白胨10g 牛肉膏5g 乙酸钠5g葡萄糖20g吐温80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 柠檬酸铵2g K2HPO42g。
所述营养琼脂培养基每1000ml蒸馏水中包含如下成分琼脂20g蛋白胨10g 牛肉膏10g 乙酸钠5g葡萄糖5g 吐温80 1g 柠檬酸铵2g酵母膏5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
本发明通便生态口服液的制备采用复合培养新工艺，该工艺先进、合理、稳定、可靠，克服了只能将单个菌种单独生产后再混合使用投资大、工艺复杂的问题。两种菌的复合培养，可有效弥补单纯嗜酸乳杆菌发酵口味差的缺点，同时由于存在共生关系，保加利亚乳杆菌分解蛋白产生的氨基酸可为嗜酸乳杆菌的生长提供营养物质，而嗜酸乳杆菌产生的乙酸可以促进保加利亚乳杆菌的生长，使其产酸能力增强，缩短复合培养的周期。经过实验证明，本发明所制通便生态口服液具有营养高、口味佳的特点，产品质量稳定，保质期长。
具体实施例方式
实施例1 两种菌种的复合培养先在250L菌种罐内通活蒸汽，罐内温度升至121℃，消毒30min后，罐夹层通入蒸馏水降温至50℃，再在罐内加入琼脂20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、葡萄糖5g、吐温80 1g、柠檬酸铵2g、酵母膏5g、MnSO4·H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.2g、K2HPO41g，并加水至1000ml。将罐内温度升至121℃，实消25min，再在夹层通入蒸馏水，当罐内温度降至35℃时，按体积比1∶1的比例，接入已培养好的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳杆菌菌种进行复合培养，培养温度为35℃，培养时间为48h。
实施例2 复合菌种的大罐培养先在2000L大罐内通活蒸汽，当罐内温度升至121℃，消毒30min，罐夹层通入蒸馏水降温至50℃时，在罐内加入红糖50g，加水至1000ml，再升温至121℃消毒25min，降温至35℃，罐内接入实施例1中培养好的复合菌种50ml。接完菌种后，在28℃保温，培养72h经检验合格后，待罐装。
实施例3 通便生态口服液的通便功能试验为了解本发明所制备通便生态口服液的通便功能，由中国疾病预防控制中心营养与食品安全所与山东大学第二医院合作，选择了100名自愿受试者，随机分为试食组和对照组，每组50名，从2005年11月开始进行人体试食试验。
受试对象选择标准为排便次数一周少于3次者；粪便硬度增加者；无器质性便秘者；习惯性便秘者。受试口服液为每瓶100ml，人体用量为每人(以成人60kg体重计)每日2次，每次40ml。
试食者服用本发明所制备通便生态口服液，对照组服用外观和口味与通便生态口服液均相似的安慰剂。按照盲法进行试食试验，服用方法为每人每日2次，每次40ml，共服用观察2周(14天)。在试食期间，使两组受试者尽量保持其生活方式及饮食习惯不变，观察记录两组受试者的排便次数、排便状况、粪便性状及膳食摄入量。
统计方法应用SPSS统计软件包对试验数据进行处理。数据经检验复合正态分布后，采用t检验的方法比较试食前后各指标的变化。对于数据为非正态分布的资料，采用非参秩和检验比较试食前后各指标的变化。计数资料使用X2检验进行统计分析。
结果判定试食前后，试食组自身比较排便次数明显增加，排便状况和粪便性状二项指标中一项指标评分明显下降，差异有显著性；试食后，试食组与对照组比较，排便次数、排便状况和粪便性状任一项明显改善，差异有显著性，可判定该受试样品有通便功能。
通便生态口服液对受试者排便次数的影响用组间t检验和试验前后自身对照t检验对受试者试食前一周和试食期间平均一周的排便次数进行统计处理，结果见表1。
表1 通便生态口服液对受试者每周排便次数的影响(n，Mean±SD)
表1结果表明，两组受试者试食前的排便次数没有显著差异，具有可比性。服用通便生态口服液期间，试食组排便次数与试食前相比有极显著增加(P＜0.01)，且极显著高于试验期间对照组的周平均排便次数(P＜0.01)，说明通便生态口服液可增加便秘者的排便次数。
通便生态口服液对受试者排便状况的影响排便状况根据排便困难程度分为四级，评分值标准如下I级(0分)排便正常；II级(1分)仅有下坠感、不适感；III级(2分)下坠感、不适感明显，或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门烧灼感；IV级(3分)经常出现腹痛或肛门烧灼感，影响排便。
用组间t检验和试验前后自身对照t检验对受试者的平均排便状况评分进行统计处理，结果示于表2。
表2 通便生态口服液对受试者排便状况评分的影响(分/次，Mean±SD)
表2结果表明，两组受试者试食前的平均排便状况评分没有显著差异，具有可比性。服用通便生态口服液期间，试食组平均排便状况评分与试食前自身相比有极显著降低(P＜0.01)，并且也极显著低于对照组试食期间的平均评分(P＜0.01)，说明通便生态口服液可改善便秘者的排便状况。
通便生态口服液对受试者粪便性状的影响粪便状况根据Bristol粪便性状分类法分为三级，评分值标准如下I级(0分)像香肠或蛇，平滑且软；像香肠，但在表面有裂痕；
软的团块，有明显的边缘(容易排出)。
II级(1分)香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙。
III级(2分)分离的硬团，像果壳(不易排出)。
用组间t检验和试验前后自身对照t检验对受试者的平均粪便性状评分进行统计处理，结果示于表3。
表3 通便生态口服液对受试者粪便性状评分的影响(分/次，Mean±SD)
表3结果表明，两组受试者试食前的平均粪便性状评分没有显著差异，具有可比性。服用通便生态口服液期间，试食组平均粪便性状评分比试食前有了极明显下降(P＜0.01)，且显著低于试食期间对照组的平均评分(P＜0.05)，说明通便生态口服液可改善便秘者的粪便性状。
从以上的人体试食试验结果可以看出，便秘者服用本发明所制通便生态口服液14天，试食组自身前后比较排便次数明显增加(P＜0.01)，平均排便状况和粪便性状评分均明显下降(P＜0.01)；与对照组比较，试食期间试食组排便次数明显增加(P＜0.01)，平均排便状况和粪便性状评分均有明显的改善(P＜0.01)。根据《保健食品检验与评价技术规范-2003年版》中的判定标准，可以认为本发明所制通便生态口服液对便秘者有通便功能。
实施例4 通便生态口服液的稳定性试验对本发明所制备的通便生态口服液做了13批次的稳定性观察实验，其实验结果如下
以上数据结果表明，不同批次所生产的通便生态口服液，其活菌总数大约在109cfu/ml，保存期一年后活菌总数仍能维持在大约108cfu/ml，说明由本发明制备所得通便生态口服液的活菌总数高，产品质量稳定可靠，保质期可在一年以上。
权利要求
1.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，其保藏号为CGMCC No.1936。
2.一种嗜酸乳杆菌株Lactobacillus acidophilus，其保藏号为CGMCC No.1937。
3.一种制备通便生态口服液的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)采用MRS培养基对权利要求1和权利要求2的菌株分别进行培养，培养温度为35℃，培养时间为120h；(2)将步骤(1)中培养好的两种菌种按照体积比1∶1的比例接入菌种罐内进行复合培养，采用营养琼脂作为培养基，培养温度为35℃，培养时间为48h；(3)将步骤(2)中培养好的复合菌种接入大罐内做进一步培养，采用红糖作为培养基，培养温度为28℃，培养时间为72h；(4)将步骤(3)中所得液体按常规罐装制得口服液产品。
4.根据权利要求3所述的制备通便生态口服液的方法，其特征在于所述MRS培养基每1000ml蒸馏水中包含如下成分蛋白胨 10g 牛肉膏 5g乙酸钠5g葡萄糖 20g吐温80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 柠檬酸铵 2g K2HPO42g。
5.根据权利要求3所述的制备通便生态口服液的方法，其特征在于；所述营养琼脂培养基每1000ml蒸馏水中包含如下成分琼脂 20g 蛋白胨 10g牛肉膏10g 乙酸钠 5g葡萄糖 5g 吐温80 1g 柠檬酸铵 2g酵母膏 5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
全文摘要
本发明提供两种乳杆菌株，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.1936和嗜酸乳杆菌CGMCC No.1937，以及将它们用于制备通便生态口服液的方法。该方法包括如下步骤(1)采用MRS培养基对两种菌株分别进行培养，培养温度35℃，培养时间120h；(2)将步骤(1)中培养好的两种菌种按体积比1∶1接入菌种罐内进行复合培养，采用营养琼脂作为培养基，培养温度35℃，时间48h；(3)将步骤(2)中培养好的复合菌种接入大罐内做进一步培养，采用红糖作为培养基，培养温度28℃，时间72h；(4)将步骤(3)中所得液体按常规罐装制得产品。本发明所制通便生态口服液营养高、口味佳，产品质量稳定，保质期长。
文档编号A61K35/66GK101050440SQ20071006465
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月22日 优先权日2007年3月22日
发明者雷振东 申请人:雷振东