专利名称：：原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途。技术背景随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。目前耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)感染已与HBV，AIDS并列世界范围内三大最难解决的感染性疾患。MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，为引起医院感染的主要病原菌之一。建国以来，我国虽然对中草药抗金葡菌等感染的作用进行过筛选研究，但这些研究多限于药材提取物，对耐药菌的作用也只是在近年来才得到关注，迄今罕见针对MRSA感染的单体化合物的研究报道。我们针对临床上国内外耐药菌感染的现状，重点对传统中草药中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入研究，从岩黄连中发现了一类对这种病原体显示较强抑制活性的生物碱一原小檗碱(protoberberine)类生物碱。原小檗碱(protoberberine)类生物碱具有异喹啉结构，前人关于原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物的制备和抗菌作用研究，主要是抗标准菌，如黄连等植物中含有的小檗碱的抗菌谱包括金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、白喉杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、淋球菌等细菌，以及白色念珠菌和红色毛癣菌等真菌。^Li2L等研究了黄连和黄檗的主要成分小檗碱对所测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株显示抗菌活性(YuHH，KimKJ，ChaJD，efa/.Antimicrobialactivityofberberinealoneandincombinationwithampicillinoroxacillinagainstmethicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]./Med_Foot/，2005，8(4):454-461)。还有文献报道脱氢卡维丁、卡维丁等对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、白喉杆菌有明显的抑制作用(陈重阳，赵一.中药岩黄连主要成分脱氢卡维丁的药理研究.中药通报.1982，7(2):31.)。岩黄连(CorydalissaxicolaBunt.)为罂粟科(Papaveraceae)荷包牡丹亚科紫堇属多年生草本植物，主要分布于广西、贵州、云南、四川、西藏、湖北、甘肃等省，多生于岩石峭壁或高山岩洞口。岩黄连具有清热、消肿、止痛等作用。广西民间用其根止痛、消肿、拔毒，治疗疥疮肿毒，也用于治疗肝炎、肝硬化和肝癌等疾病。其主要有效成分包括多种异喹啉类生物碱，已经从该植物中分离鉴定了小檗碱(berberine)、(±)卡维丁[(±)cavidine]、脱氢卡维丁(dehydrocavidine)、白蓬叶碱[(+)thalictrifoline]、(一)13p-hydroxystilopine四氢巴马丁[(+)tetrahydropalmatine]、(一)四氢非洲l防己胺[(一)tetrahydrocolumbanfme]、(一)斯库来碱[(一)scoulerine]等原小檗碱(protoberberine)类生物碱(柯珉珉，张宪德，吴练中.岩黄连有效成分的研究[J].植物学报，1982，24(3):124-125.)。脱氢卡维丁类生物碱的抗肝炎病毒作用有专利记载(脱氢卡维丁类化合物及其在医药中的用途，CN1660836A)。纵观国内外的报道，除小檗碱(berberine)夕卜，没有一项专利特指本发明所涉及的原小檗碱(protoberberine)类生物碱的抗MRSA作用。
发明内容本发明的目的是提出一种原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途，尤其是化合物黄连碱、脱氢卡维丁和脱氢阿朴卡维丁在抗耐药菌药物中方的应用。本发明基于当前临床耐药菌感染的实际，结合植物药抗菌药敏筛选和有效成分分离纯化方法，从罂粟科(Papaveraceae)紫堇属(Corydalis)植物岩黄连(CorydalissaxicolaBunt.)中提取原小檗碱(protoberberine)类生物碱并证实其抗耐药菌活性，所述的原小檗碱(protoberberine)类生物碱经药理试验，结果证实对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的抑制作用。本发明所述的化合物原小檗碱(pmtoberberine)类生物碱，可进一步作为活性成分，制成新型治疗耐药菌感染的药物。上述的活性生物碱类化合物具有下式I和II代表的化学结构其中，R,至Rs为羟基、具有1一12个碳原子的烷氧基或酰氧基、苄氧基、X(氯及其他卤素原子)、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和一OCONH2，&为氢或甲基。Rr~R2、R3—R4或邻R4—Rs可以是次甲二氧基。各取代基及化合物l-6情况如表1所示。本发明涉及的原小檗碱(protoberberine)类生物碱包括化合物黄连碱(Coptisine)、脱氢阿朴卡维丁(Dehydroapocavidine)、剌罂粟咸(stylopine)、阿朴卡维丁(Apocavidine)、脱氢卡维丁(Dehydrocavidine)禾tlThalifaurine。基于原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物的化合物具有抗耐药菌MRSA的作用。在本发明中用作有效成分的化合物1至6中的一个或多个在多种药用植物类群中均有分布，如罂粟科(Papaveraceae)植物的紫堇属(Coo^"仏)，小檗禾斗(Berberidaceae)小檗属(Berberis)，毛茛禾斗(Ranunculaceae)黄连属(Coptis)，芸香禾斗(Rutaceae)黄柏属(Phellodendron)以及防己禾斗(Menispermaceae)、番蒸枝禾斗(Annonaceae)、旋花禾斗(Convolvulaceae)禾卩马兜铃禾斗(Aristolochiaceae)等植物中，常见如岩黄连(CorydalissaxicolaBunt.)，黄连(Cop"sc/z/"em/sFranch.)禾卩黄柏(Macleayacordata)等。具体实施方式用于本发明的原小檗碱(protoberberine)类生物碱可以按现有文献记载的生物碱提取分离方法制备。如下面表1所示的化合物1至6可以从岩黄连中制得。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。表1.原小檗碱(protoberberine)类生物碱1至6的化学结构<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.岩黄连单体化合物1-6抑制MSSA和MRSA的MIC(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例1:从岩黄连全草中提取分离单体生物碱1至6取岩黄连(CorydalissaxicolaBunt.)干燥全草粗粉1kg于室温下用0.5%硫酸5L浸渍48小时后过滤，滤液加氯化钠至浓度为10%，再用饱和氢氧化钠调至PHIO，氯仿萃取，回收氯仿得总碱浸膏。将此浸膏用丙酮搅拌，静置、过滤，回收丙酮得丙酮可溶物14g和不溶物20g。取丙酮可溶物进行低压硅胶柱层析，用石油醚乙酸乙酯=15:1~3:1梯度洗脱得化合物3(0.08§)、4(0.2§)和5(0.48);丙酮不溶物进行低压硅胶柱层析，用石油醚乙酸乙酯甲醇梯度洗脱=6:1:0.1-5:1:1得化合物l(O.lg)、2U.53g)、6(0.08g)和小檗碱(O.Olg)。实施例2:单体化合物1至6的理化和波谱数据黄连碱(Coptisine)(1)黄色棱状晶体，C19H14N04+，mp217-218°C。ESIMS(positiveionmode)w/z:320。！HNMR(DMSO-4,400MHz):&9.84(1H，s，H-8)，8.90(IH，s，H-13),7.98(IH，4/=8.4Hz,H-ll)，7.81(IH，d,/=8.6Hz,H-12),7.74(IH，s,H隱l)，7.00(IH，s，H-4),6.52(2H，s，OCAO-9，10),6.11(2H,s,OCH20-2，3)，4.79(2H，dd，J=6.3，5.9Hz，H-6),3.19(2H，dd，/=6.3，6.0Hz,H-5);I3CNMR(DMSO-4,100MHz):&105.1(d,C-l),147.2(s，C-2),149.6(s，C-3),108.0(d,C-4)，130.4(s，C國4a)，26.1(t，C-5)，55,0(t，C-6)，143.9(d，C-8)，120.2(s，C-8a)，143.5(s，C-9),147.4(s，C-IO)，120.7(d,C画ll)，120.8(d,C-12),132.4(s，C-12a)，121.5(d，C-13),136.7(s，C-13a),11L4(s,C-13b),101.8(t，OCH20-2,3)，104.2(t，OCH2O-9，10)。脱氢阿朴卡维丁(Dehydroapocavidine)(2)黄色无定形固体，C20H18N04+。ESIMS(positiveionmode)w/z:336;&NMR(DMSO-4,400MHz):&9.卯(1H，s,H-8),8.02(1H，d,/=9.0Hz,H-12),7.95(1Hd，/-9.0Hz，H-ll),7.31(1H，s,H-l)，6.89(IH，s，H-4),6.53(2H,s，OCH2O-9,10)，4.76(2H,m,H誦6)，3.84(3H，s,OCH3-13),3.06(2H,m，H-5),2.92(3H,s,CH3);13CNMR(DMSO-4100MHz):&114.4(d,C-l),146.3(s，C-2),149.0(s，C-3)，115.5(d，C扁4)，130.1(s，C國4a),26.5(t，C國5)，56.7(t，C-6)，142.9(d，C-8),117.8(s，C-8a)，144.4(s，C-9),146.8(s，C陽IO)，119.3(d，C陽ll),120.1(d，C-12),131.7(s，C-12a);132.5(s，C-13),136.2(s，C-13a),110.8(s，C-13b)，56.5(q,OCH3隱3),104.6(t,OCH2O-9,10)，18.2(q，CH3-13)。剌罂粟碱(Stylopine)(3)黄色晶体，Mp203-204。C,[a]g+305°(c,0.6，CHC13)，C19H17N04，ESIMS(positiveionmode)w/z::324;!HNMR(C5D5N，400MHz):&6.94(IH，s，H-l)，6.82(1H,(!，/=7.9Hz,H-12),6,70(1H,d,J=7.9Hz,H-l1)，6.63(1H,s，H-4),5.97(2H,d,/=5.4Hz,OCH20-2，3)，5.95(2H，d，《/=5.4Hz,OCH2O-9，10),4.11(IH，d,/=15.3Hz，H誦8a),3.43(1H,s，H國13a)，3.38(1H，d，/=15.3Hz,H-8P)，3.07(1H,in:H誦13a)，2.72(1H，m，H-13|3)，2.46-3,08(4H，m,H-5，H-6);13CNMR(C5D5N，100MHz)107.0(d，C画l)，143.8(s，C國2)，146.5(s,C-3),117.5(d，C-4)，128.3(s,C-4a),29.9(t，C-5)，51.4(t，C-6)，53.3(t，C-8)，117.7(s，C-8a),146.8(s，C画9)，145.5(s，C-IO)，107.0(d,C-ll)，121.5(d，C-12)，129.2(s,C陽12a)，36.9(t，C-13),60.0(d，C-l3a),131.5(s,C-13b)，101.2(t，OCH20-2，3)，101.6(t,OCH2O-9,10)。阿朴卡维丁Apocavidine(4)黄色晶体，C20H23NO4,mp175°C。ESIMS(positiveionmode)341;!HNMR(C5D5N,400MHz):&6.92(1H,s，H-4),6.86(1H,7.9Hz,H画ll)，6.78(IH，d,/=7.9Hz,H-12)，6.76(1H，s，H-l),5.97(2H,d，/=17.8Hz,OCH20-9，10),4.18(1H,d,/=15.3Hz，H曙8a),3.77(3H，s,OCH3)，3.68(IH，d,/=4.1Hz,H-13a)，3.49(1H,d,/=15.3Hz，H邻)，3.03(1H,dd，《/=4.0,6.8Hz,H-13),2,37-3.35(4H，m，H-5，6),1.09(3H，(!，/=6.8Hz，CH3-13);13CNMR(C5D5N,100MHz)110.0(d，C-l)，147.5(s,C隱2)，145.2(s，C-3),112.4(d,C-4)，128.3(s,C-4a),29.2(t，C-5),51.4(t，C-6),53.8(t,C-8)，117.1(s，C-8a),146.0(s，C-9)，143.3(s,C-IO)，112.5(d，C-ll)，123.5(d，C-12)，136.2(s,C-12a),(d，C-13),63.7(d，C-13a)，129.4(s,C-13b)，102.2(t，OCH2O-9，10),56.2(q,OCH3)，18.8(q，CH3-13)。脱氢卡维丁Dehydrocavidine(5)黄色无定形固体，C20H18N04+，mp273-274°C。ESIMS(positiveionmode)w/z:350;!HNMR(DMSO-4,400MHz):&9.87(1H,s,H-8)，8.02(IH，d,/=9.0Hz，H-12),7.80(IH，d，《/=9.0Hz,H-ll)，7.11(1H，s,H國l)，6.89(1H，s,H-4),6.39(2H，s，OCH2O-9,10),4.64(2H,m,H-6)，3.72(3H，s，OCHr13),3.06(2H，m，H-5)，2.82(3H，s，CH3);13CNMR(DMSO-^，100MHz):&114.4(d,C-1)，146.3(s,C-2),149.0(s，C-3),115.5(d,C-4)，130.10，C-4a),26.5(t,C-5),56.7(t，C-6)，143.0(d,C-8),117.8(s,C-8a),144.4(s,C-9),146.8(s，C-10),120.4(d，C-ll),120.1(d，C-12)，131.7(s，C-12a);132.5(s,C-13)，136.2(s，C-13a),110.8(s,C-13b)，55.8(q，OCH3-3),102.9(t，OCH2O-9,10)，18.0(q，CH3-13)。Thalifaurine(6)黄色晶体，C19H16N04+，mp257-259°C。ESIMS(positiveionmode)/r2/z:322;^NMR(DMSO-4，400MHz):&9.64(1H，s,H-8)，8.82(1H，s，H-13),7.81(1H,d，/=8.6Hz，H-12)，7.74(1H，s,H-l)，7.00(1H,s，H-4)，6.71(1H，s，H-9),6.70(1H，s，H-12),6.42(2H,s,OCH2O-10,ll),4.78(2H，dd，/=6.2，6.0Hz，H-6)，3.19(2H，dd，/=6.3，6.0Hz,H-5);13CNMR(DMSO-4100MHz):&112.6(d，C-1),148.1(s，C曙2)，145.6(s，C-3)，114.3(d，C-4)，127.7(s,C-4a)，28.9(t,C國5)，56.5(t，C-6),144.5(d，C-8),118.2(s，C-8a),113.7(s,C-9)，147.9(s,C-10),148.5(d，C-ll)，113.4(d，C-12),140.9(s，C-12a),131.3(d，C-13)，146.2(s，C-13a)，121.7(s，C-13b)，56.3(q，OCH3)，101.5(t，OCH2O-10，ll)。实施例3:用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA的筛选1.试验材料抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。2.标本来源从我院临床标本中分离筛选4株细菌标本，编号为MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55，冰箱-20。C下保存备用。3.细菌鉴别依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标本细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对该标本的抑菌圈均《19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。4.药敏试验进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35t:培养17小时，测定4株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表2。实施例4:化合物1至6对耐药菌株MRSA的抗菌活性测定1.试验材料培养基MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药化合物1至6样品(由岩黄连中提取分离得到)，溶剂DMSO(分析纯)，蒸馏7jC;标准金黄色葡萄球菌(MSSA):ATCC25923(中国药品生物制品检定所)，耐药菌(MRSA):MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55;对照药小檗碱、氨节西林和万古霉素。2.药液制备用电子分析天平称取各受试药品5mg，以无菌DMSO配成5mg/ml溶液作为原药溶液。3.菌液的制备用接种环把菌株接种在MH琼脂平板上，置于35。C恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成106cfu/ml作测定MIC用。4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度(MIC)采用公知的二倍稀释法，取10支无菌试管编号并置于试管架上，在每支试管中加入lmlMH肉汤培养基，取原药液lml与第一支试管摇匀，继而吸取lml加入第二支试管中，依次类推稀释至第十管，弃去lml，除第十管不加菌液外，其余都加0.1ml稀释为106CFU/ml菌液摇匀，置培养箱中于35"C培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，所得测定结果见表3。权利要求1、具有通式I或/和II的原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，其中，R1至R5为羟基、具有1-12个碳原子的烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2，R6为氢或甲基。2.按权利要求1所述的原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，其特征在于R1—R2、R3—R4或邻R4—R5是次甲二氧基。3.按权利要求1所述的原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，其特征在于原小檗碱(protoberberine)类生物碱包括化合物黄连碱(Coptisine)、脱氢阿朴卡维丁(Dehydroapocavidine)、刺罂粟碱(stylopine)、阿朴卡维丁(Apocavidine)、脱氢卡维丁(Dehydrocavidine)禾口Thalifaurine。4.按权利要求1所述的原小檗碱(protoberberine)类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，其特征在于基于原小檗碱(pmtoberberine)类生物碱及其衍生物的化合物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的作用。全文摘要一种原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途，尤其是化合物黄连碱、脱氢卡维丁和脱氢阿朴卡维丁在抗耐药菌药物中方的应用，本发明从罂粟科(Papaveraceae)紫堇属(Corydalis)植物岩黄连(CorydalissaxicolaBunt.)中提取原小檗碱类生物碱，经药理试验证实对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的抑制作用；本发明所述的化合物原小檗碱类生物碱，可进一步作为活性成分，制成新型治疗耐药菌感染的药物。文档编号A61P31/00GK101129364SQ20071006614公开日2008年2月27日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者何洪静,巍余,刘树玲,斌唐,左国营,青张,徐贵丽,王根春,赵益斌申请人:成都军区昆明总医院