呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用的制作方法

专利名称：：呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用的制作方法呼鹏合胞病毒亚单位疫苗、制备施和应用駄领域本发明涉及呼鹏合胞病毒疫苗及其制备方法，更具体地说是鹏大肠杆菌表达重组呼,合胞病毒G蛋白及突变G蛋白，并与无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素制备疫苗，用于人体或动物预防接种，呼吸道合胞病毒的感染，属于生物
技术领域：
。背景狱人类呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialvirus,RSV)是全世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体，免疫缺陷病A^^人也是RSV的易感人群。仅在美国估计每年因RSV感染住院的就有90000个婴幼儿，其中死亡率为2%5%。我国不但有RSV散发性感染，还发顿数次大规麟发流行。小儿呼吸纖染的患者中，合鹏毒的感染率达到12.3%，其中小于7月龄的患儿的合胞病，染率高达67.10%，2岁时儿童约有90X以上感染RSV，住院治疗约占0.5%2%。正如其它病毒弓胞的疾病一样，至今没有特异性治疗方法。本病对小儿Mitfe割艮大，临床表现以低热、下呼^m感染病变多见，婴幼儿多呈阵咳、憋喘症状，甚至死亡。只有采用特异抗体进行被动免疫治疗，但给患儿和家长带来极大的痛苦和财产损失。所以疫苗的研顿得非常迫切，世界卫锁织(WHO)早已将RSV疫苗列为顿疫苗赚it^i冲优先赚的疫苗之一。呼M合胞病毒(RespiratoiySyncytialVirus,简称RSV)属于副粘病毒科，肺病毒属，中等大小(200300nm)，有囊膜，为单股负链RNA病毒。基因组由约15000个核苷酸组成，编码3种跨膜蛋白(F、G、SH)，2种基质蛋白(M1、M2)，3种核衣壳蛋白(N、P、L)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。RSVftt上的膜融，)和粘断G)糖蛋白可以诱导RSV中和抗体，是病毒疫苗石开究开发的顧蛋白。F蛋白与G、SH蛋白共同参与病毒外膜与宿主细鹏胞的融合以及细胞培养过程中胞合体的形成，F蛋白可引起,免疫和细胞免疫；G蛋白介导与宿主细胸摸的粘附，在RSV中主要参与决定抗原的多样性，因此将RSV可分为A、B亚型，他们之间的G蛋白仅有53X的氨基酸同源性，在我国主要流行A亚型。^呼,合毒疫苗的研究和开发方面，公知的RSV疫HW灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗。60年代^^RSV灭活疫苗免疫儿童时可以诱导中和抗体的产生，但不具保护性，而且疫苗使用后增强了幼儿后继感^if毒株RSV的发病程度，住院治疗和死亡率显著提高。而RSV的减毒活疫苗给予12月龄未感染过RSV的婴儿时，会导致上呼吸道的轻微至中度充血，表明还需要进一步减毒。虽然减毒活疫苗的临床微没有弓胞疫苗增强疾病，但减毒活疫苗仍存在免疫原性差、毒力令AX隹以接受和遗传不稳定性，人们对使用该疫苗仍有疑虑。亚单位疫苗被认为是^顿很安全的，不存在减毒活疫苗的毒力返祖和免疫原性差等问题，没有RSV灭活疫苗使用后病情加重的担忧。国外现已有RSV膜糖蛋白G和F为主构建的两种蛋白亚单位疫苗完成了II柳临床试验。临床试验结果表明，PFP和BBG2Na疫苗是安全的，耐受'断并具有免疫原性。以F蛋白为主的PFP疫苗是由细胞培养RSV，病毒，解纯化F蛋白制成的亚单位疫苗，因此^成本高，病毒大St咅养时有安全风险；而由细菌表达的以G蛋白为主的BBG2Na疫苗，虽然降低了生产成本、提高了生产的安全性，但是由于G蛋白以及RSV的其它膜蛋白本身是糖蛋白，细菌表达系统没有糖Sit功能，因而影响了疫苗的抗原性，斷氐了免疫效果；大肠杆菌等真核生物具有对外源蛋白的糖割七功能，表达的蛋白与天然蛋白具有完全相同的功能，但ffiii文献和专利检索，尚未发现在大肠杆菌中皿RSV膜蛋白的研究。绝大多数病原体^aa粘膜组织(呼B腿、消鹏、對直道等)感染人体的，RSV也不例外，为了有效地预防粘ra染，抗原，苗必须加强^a局部粘膜组织的免ffi答。而粘膜免疫佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素(heat-labileenterotoxin，简称LT)的全毒素(含A、B两个亚基)或其B亚基會,协助抗原蛋白有效鹏撒局部粘膜组织产生分泌型IgA(slgA)以及机体的体液和细胞免疫应答。slgA是粘膜组织表面的主要免疫分子，它可以中和粘膜部位的病原体，ffiih病原体对粘膜的后继感染，同时机体对sIgA分泌有免疫记忆能力，反复的抗原或疫苗刺激可以提高特异的slgA分泌量，增强粘膜的抗感染能力。Cusi等将RSVF亚单位疫苗使用了无毒型LT佐剂免疫小鼠进行了有益的尝试，表明小鼠免疫后在粘膜和血清中产生较高的sIgA和IgG(Cusi改al，Vaccine,2002，20(29-30):3436)，该疫苗只是针对了RSV的单一性旨抗原F蛋白。Simmons等将RSV与LT和LTK63(无毒型LT)分别物理混合后滴鼻免疫小鼠，可以有效地M:粘膜部位的sIgA以及CTL反应，使小鼠对RSV野毒株的攻击更具有l^性(Simmonsetal，JImmunol,2001，166(2):1106)，但RSV全病毒疫苗，在接种后引起了野毒株RSV感染的疾病加重。这两篇文献中疫苗抗原的制备方面采用全病毒细胞培养的方式进行生产和纯化的，后续工艺复杂，生产成本高。因itbX寸于RSV亚单位疫苗而言，开发出一种既能降低大動恪疫苗时的安全风险，又能节约生产成本，还可以加强RSV疫苗的粘膜免疫、條免疫和细胞免疫功能，同时又不影响疫苗的抗原性和免疫效果的制备系统极为必要。
发明内容:本发明的目的是皿一种呼fM合胞病毒疫苗，在大肠杆菌中,RSV膜蛋白G，并以无毒型粘膜佐剂LT为佐齐糊被苗的方法，具体是应用大肠杆菌表达突变的RSV膜蛋白G及截短的G，以无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT为佐剂，旨在提高RSV膜蛋白G免疫动物的免疫力和粘膜免勤JC平，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染。本发明的目的还是皿一种呼IM合胞病毒(RSV)亚单位疫苗及其制备方法和应用。通过克隆RSVG蛋白的保守区域并对CX3C模序去除或替换成CTL表位基因序列，在大肠杆菌中表达并中试发酵、纯化，单独或S^无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素S^免疫机体，可以激发机体的,免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。为了实现本发明的，目的，本发明,了如下技术方案-呼^ii合胞病毒亚单位疫苗，含有截短的呼M合胞病毒RSV膜蛋白G。进一步还含有无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT佐剂。戶舰疫苗，是截短的呼b鹏合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aal30230之间的錢酸，并且将aal82186之间的氨基酸CAWIC(CX3C,)替换为RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成Gctl蛋白，其基因序列为CACAAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATnTCACTTTGAAGTAAGGAAGTACCTACCACCAAGCCTCACCACCACCACCACCACTAA。上述疫苗是将GciL蛋白基因重组到细菌表趟体上，并在大肠杆菌中表达、制备。更具体地，本发明,了由下述方法构建而成的疫苗1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690总共303bp,以及引物gcl:5'-CnTCTnTTCCAGGTAAGrrGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATITATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';部10:5'-GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、gp10用于扩增G蛋白基因，并引入iV^I和及卵Hl酶切位点和6XHISi^，gcl，gc2用来突变G基因中的CX3C模序，替换为CTL表位；引物gpl、gplO进行PCR扩增，PCR产物即为截短的G基因；以G基因为微，分别用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0进行扩增，获得片段gll和g210，这两个片段纯化后适量混和为模板，再用引物gpl/gplO进行扩增，获得突变的GoL基因；(2)重组表达载体Gcn7pET22b的构建G基因和GcxL基因纯化后分别用A/^I和5fl/wHI于37'C酶切2小时，回收纯化片段，与纯化的就载体pET22b双酶切产物用T4DNA连接酶于16。C连,夜，连接产物3^热休克法转化用0&(:12制备的￡.0^01150，涂布Amp+-LB平板，37'C培养16小时，挑取数个单麟接种Amp+-LB培养液，37'C振荡培养12小时，碱裂解法抽粒，Mfel和5謡i/I双酶切质粒，构建重M丰採用战方法再次转化^co/mL21(DE3诉于诱导表达Gcn^蛋白。(3)GciL蛋白的诱导表达分另跟k取重组工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21单菌落接种到Amp+-LB培养液中，37'C震荡培养过夜，第二天按1%分别接种到飾羊Amp+-LB培养液中，37'C震荡培养至OD600约为l.O时，分别加入0.5mmolIPTG在37。C诱导,4小时，诱导结束后M量样品进行SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定；(4)重组工程菌Gcn7pET22b/BL21的中试发酵控制DO》400/。、pH值为7,2左右、鹏37°C，发酵8小时菌液密度达到OD600约为30时，加入0.1mmol/LIPTG，鹏降至25'C诱导4小时，发酵结束时，菌液OD600约为54，菌^M重为39.20g/L，干重为6.95g/L，目标蛋白的表达率约为18.2%，为可溶表达形式；(5)GcxL蛋白的纯化中试发酵获得诱导表达的重组菌液纟纽离心收集菌体，溶于结合缓冲液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPC^0.01mol/L咪唑)中，高压破菌，离心收紅清，鄉淀，选择ChelatingSepharoseFastFlowW柱和C。2+进行亲和层析纯化，使用洗脱缓冲液(0.5mol/LNaCl，0.02mol/LNa2HPO4,0.5mol/L咪唑)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测；(6)GciL蛋白的动物免疫使用GciL蛋白加佐剂无毒型LT。此外，本发明戶腿疫苗应用于增强粘膜免疫、微免疫和细胞免疫功能的RSV疫苗制备系统中。本发明的构建疫苗的方案主要包括如下几项1.在大肠杆菌中进行,截短的RSV膜蛋白GRSV膜蛋白G的aal30230(基因序列nt390690)具有高度的保守性，以此为抗原免疫动物可以同时预防RSVA和B亚型的感染。PCR扩增G基因序列nt390690以及双酶切后重组到大肠杆菌,载体pET22b上，转化￡//81^210^3)，在AMP-LB平板上筛选，PCR扩增以及抽粒和酶切鉴定。构建正确的重组质粒用IPTG诱导表达截短的G蛋白。SDS-PAG和Westernblot鉴定G蛋白的W量和抗原性。2.在杆菌中进行表达截短并突变的RSV膜蛋白G截短的RSV膜蛋白G(aal30230)中aal82186含有CX3C模序(CAWIC)，，列可以引起以酸性粒细胞增多糊市部病变特征，因雌用RSVM蛋白上的CTL表位(aa229-237，YLEKESIYY)替换G蛋白上的CX3C模序。合成CTL表位的基因序列，ffli!S叠延伸PCR连接CTL表位和截短的G蛋白基因序列，形成Gcil蛋白序列，双酶切后重组到^M杆菌皿载体pET22b上，转化￡>//81^1(0￡3),在AMP-LB平板上筛选，PCR扩增以及抽提质粒和酶切鉴定。构建正确的重会IM粒用IPTG诱导,截短的G蛋白。SDS-PAG和Westernblot鉴定Gcil蛋白的針量和抗原性。3.RSV膜蛋白G和Gctl分別与无毒型LT佐剂混和免疫动物。蛋白G+LT、GciL+LT分别免疫小鼠，ELISA检测小鼠的血清、唾液、呼鹏灌洗液中是體有抗G抗体，血液和呼吸道灌洗液中的嗜酸性粒细胞数量，if^S几种疫苗的免疫效果。与现有技斜目比，本发明具有以下有益效果(1)针对RSV疫苗的临床试验中，国外4顿的G蛋白亚单位疫苗由W有CX3C模序，会引起机体呼吸道中以嗜酸性f娜胞增多为特性的肺炎，限制了该疫苗的进一步开发。本发明不仅去除了G蛋白上的CX3C樹芋，而且用RSV的M蛋白上的CTL表位替换，即消除了CX3C弓胞的病理反应，又增强了疫苗的细胞免ffi答功能。(2)采用无毒型LT与RSVG蛋白S^免疫动物，提高了G蛋白的免疫原性，加强了G蛋白诱发机体的局部粘膜免疫功能和系统免疫功能，为机條呼吸道粘膜部位表面抗RSV感染提供了餅。(3)在大肠杆菌中表达RSV截短的蛋白G和突变的GciL，可以提高蛋白疫苗的表&7jC平，减少用动物细胞培养病毒制备RSV疫苗时，由病毒所带来的安全隐患。由于大肠杆菌结构简单、生长快速、易于培养和发酵、4^成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产粘膜佐剂及其临床应用具有重要的现实意义。下面结合附图，用本发明的实施例进一步阐述本发明。但不以雌限制本发明。图1是重组质粒G/pET22b和Gcn/pET22b的双酶切鉴定(M:DNAMarkerDL2000;1和2:G/pET22b的WifeI和5amHI双酶切；3:Gcn7pET22b的MfeI和Bomi/1双酶切)。图2是SDS-PAGE检测重组G和GciL的表达(M:蛋白分子量标准；1:未诱导的G/pET22b/BL21;2:诱导的G/pET22b/BL21;3:未诱导的Gcn7pET22b/BL21;4:诱导的Gcn/pET22b/BL21)。图3是Westemblot检测重组G和GciL(1:阴性对照；2:重组G蛋白；3:重組Gctl蛋白)。图4是SDS-PAGE检测G蛋白和GciL蛋白的纯化结果(M:蛋白W量标准；1:流穿峰；2:G/pET22b/BL21诱导产物；3:纯化的G蛋白；4:纯化的Gctl蛋白)。图5是构建本发明重组皿载体Gcn/pET22b的^路线图。附图中，截短的G蛋白基因序列AAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATnTCACTTTGAAGTGTrACCAAGCCT具体实船式本发明中的实施例以￡>//8121(0￡3)及其表达载体？￡1221)进行,118￥膜蛋白G、Gctl来说明。实施例l:截短的RSV膜蛋白G和突变GciL基因的获得委托DNA合成公司全基因合成RSVG蛋白基因序列nt288690总共303bp,以及弓胸gcl:5'^CnTCTTnTCCAGGTAAGTrGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC陽3';gplO:5'隱GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3'。其中，gpl、gp10用于扩增G蛋白基因，并引入MfeI和及柳HI酶切位点和6XfflS标签，gcl，gc2用来突变G基因中的CX3C丰辦，替换为CTL表位。引物(gpl、gplO)进行PCR扩增，PCR产物(约320bp)即为截短的G基因。采用重叠延伸PCR方法获得GoL基因，即以全基因合成的G基因为模板，分别用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0进行扩增，获得片段gll和g210，这两个片段纯化后适量混和为模板，再用引物gpl/gp10进行扩增，从而获得突变的GciL基因(约340bp)。G基因和Gc化基因的上下两端分别引入了AWeI和及卵HI酶切点以及在5amHI酶切位点前加入6XfflS标签。实施例2:重组,载体G/pET22b和Gcn7pET22b的构建G基因和GciL基因纯化后分别用AWeI和5omHI于37"C酶切2小时，回鹏化片段，与纯化的親载体pET22b双酶切产物用T4DNA^接酶于16。C连接过夜，连接产物舰热休克法转化用CaCl2制备的Eco/ZDH5a，涂布Amp+-LB平板，37'C培养16小时，挑取数个单離接种Amp+-LB培养液，37。C振荡培养12小时，^^法抽MM粒，MfeI和5函/H鹏切质粒鉴定含有预期大小的GS因和Gcil基因，并M3i专MkDNA测序公司测序结果序列正确。构建正确的重l舰茅裸用战方法再次转^Eco//BL21(DE3诉于诱导^ii截短的G蛋白和GciL蛋白。实施例3:G蛋白和GciL蛋白的诱导表达分别挑取重组工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21单菌落接种到Amp+-LB培养液中，37。C震荡培养过夜，第二天按l%分别接种到ifl羊Amp+-LB培养液中，37'C震荡培养至OD600约为1.0时，分别加入0.5mmolIPTG在37'C诱导表达4小时。诱导结束后皿量样品进行SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。结果表明:G蛋白和Gcil蛋白的表观M量分别是14.2KDa和14.7KDa，与理论计算值基本一致，占菌体总蛋白的相对含量分别是18.4%和19.4%。实施例4:重组工程菌G/pET22b/BL21和Gcn7pET22b/BL21的中试发酵自控发酵罐中分别发酵重组工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21。在高密度发酵过程中，在线检测发,的DO、pH和温度，控制DO》40。/。、pH值为7,2左右、温度37'C，并且检测培养过程中菌液的OD600、培养液中葡萄M量，及时对发^#行调整。发酵M、时菌液密度达到OD600约为30时，加入0.1mmol/LIPTG，鹏降至25'C诱导4小时。发酵结束时，菌液OD600约为54，菌体湿重为39.20g/L，干重为6.95g^L，目标蛋白的表达率约为18.2%，为可溶表达形式。实施例5:G蛋白和GciL蛋白的纯化中试发酵获得诱导鋭的重组菌液乡纽离心收集菌体，溶于结合缓冲液(0.5moI/LNaCl，0.02mol/LNa2HPO4,0.01mol/L咪唑)中，经高压均质机破菌，离心收集上清，鄉淀。选择ChelatingSepharoseFastFlow;赚柱和0)2+进行亲和层析纯化，4柳^E缓冲液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPO4，0.5mol/L咪唑)目的蛋白，SDS-PAGE检测，显示单一，，分子量为14KDa，纯度为93.6%以上。实施例6:G蛋白和GciL蛋白的动物免疫BALB/c小鼠分成6组，每组20只小鼠，采用口服、滴鼻或者注射，分别在0，1，4周进行免疫。A组使用PBS;B组使用无毒型LT;C组j顿GciL蛋白+无毒型LT;D组使用G蛋白+无毒型LT;E组使用G蛋白；F组^fflGciL蛋白。免疫结束后，10只小鼠用ELISA检测小鼠血清和呼吸道内的IgG、IgA或sIgA，细胞计数小鼠血液和呼吸道内嗜酸性粒细胞。另10只小鼠用G蛋白或Gcil蛋白注射小鼠后退的一只脚掌，另一只脚掌注射PBS，24小时后测量2只小鼠后腿脚掌的肿胀面积，比较疫苗激发小鼠细胞免疫的能力。然后用RSVLong株攻毒，2周后麻醉处死小鼠，分离小鼠呼吸道，进行病毒培养和病理切片检测。结果表明^fflGciL蛋白+无毒型LT的D组小鼠体内IgG、IgA、slgA显著高于其他组(p<0.01);血液和呼TO灌洗液中的嗜酸性粒细胞与对照组A组和B组数量相近，没有显著差异(p〉0.05)，但显著低于C组和E组(p<0.01);C组、D组、E组和F组都可激发小鼠的迟发型超敏反应；Gctl蛋白+无毒型LT齢疫苗対小鼠的保护率为80%以上。因此，Gcn/LT齢疫苗可以提高小鼠的舰免疫、细胞免疫以及呼吸道的粘膜免疫，并对小鼠有很好的做效果。上述生ttf才料中，G蛋白基因序列以及引物序列可通过相关肝生物学试齐忪司合成如上海生工生物工程技术服务有限公司，细菌敏载体pET22b购买于美国Novagen公司，其他试剂购买于国内的相关公司。本发明对于预防人类呼吸道合胞病毒的感染具有重要的现实意义。表1不同M时间的小鼠血清中G蛋白1f^性IgG的几何平i^i度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。2、根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于还含有无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT佐剂。3、根据权利要求1所述呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aal30230之间的,酸，并且将aal82186之间的氨基酸CAWIC(CX3C模序)替换为RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成Gcil蛋白，其氨基,列为MTVKTKNTTTTQIQPSKSTTKQRQNKPQNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTYLEKESIYYKRIPNKKPGKKTTTKPTKKFnKTTKKDPKPQTTKPKEWTTKPHHHHHH其对应的基因序列为CACAAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATTTTCACTTTGAAGTTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCAAAAGGAAGTACCTACCACCAAGCCTCACCACCACCACCACCACTAA。4、根据权利要求13任一0M的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗是将Gcil蛋白基因重组到细菌表达载体上，并在大肠杆菌中表达、帝U备。5、权利要求13任一所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，由下述方法构建而成1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690总共303bp,以及引物gcl:5'^CnTCTTnTCCAGGTAAGTTGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';gpl0:5'^GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、即10用于扩增G蛋白基因，并引入MfeI和及wwHI酶切位点和6XHIS标签，gcl，gc2用来突变G基因中的CX3C模序，替换为CTL表位；弓l物gpl、gplO进行PCR扩增，PCR产物即为截短的G基因；以G基因为模板，分别用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0进行扩增，获得片段gll和g210，这两个片段纯化后适量混和为模板，再用引物gpl/gplO进行扩增，获得突变的GcTL基因；(2)重组^iit;体Gcn/pET22b的构建G基因和GciL基因纯化后分别用MfeI和BflmHI于37'C酶切2小时，回收纯化片段，与纯化的^ii^体pET22b双酶切产物用T4DNA连接酶于16。C连接过夜，连接产物351热休克法转化用€3(:12制备的￡0>//0115(1，涂布Amp+-LB平板，37'C培养16小时，挑取数个单麟接种Amp+-LB培养液，37'C振荡培养12小时，^法抽粒，Mfel和^m/n双酶切质粒，构建重M丰採用战方法再次转化五.co/!'BL21(DE3诉于诱导^iiGciL蛋白。6、根据权利要求13任一所述的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗制备方'法1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690总共303bp，以及弓嫩gcl:5'-CnTCTTnTCCAGGTAAGTTGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'^GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';gpl0:5'^GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、gp10用于扩增G蛋白基因，并引入MfeI和及卵HI酶切位点和6XHISt碟，gcl，gc2用来突变G基因中的CX3C樹字，替换为CTL表位；引物gpl、gplO进行PCR扩增，PCR产物即为截短的G基因；以G基因为微，分别用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0进行扩增，获得片段gll和g210，这两个片段纯化后适量混和为模板，再用引物gpl/gplO进行扩增，获得突变的GciL基因；(2)重组表]!i^体Gcn/pET22b的构建G基因和GciL基因纯化后分别用MfeI和及卵HI于37'C酶切2小时，回收纯化片段，与纯化的^ii载体pET22b双酶切产物用T4DNA连接酶于16。C连接过夜，连接产物皿热休克法转化用€3(:12制备的￡<:0//01150，涂布Amp+-LB平板，37'C培养16小时，挑取数个单離接种Amp+-LB培养液，37'C振荡培养12小时，麟鹏抽颇粒，Mfel和及卵/n双酶切质粒，构自会，粒采用±^方法再次转化￡//8121(0￡3)用于诱导,GciL蛋白；(3)GcTL蛋白的诱导表达分另跟^取重组工程菌G/pET22b/BL21和Gcn7pET22b/BL21单菌落接种到Amp+-LB培养液中，37'C震荡培养过夜，第二天按1%分别接种到飾羊Amp+-LB培养液中，37'C震荡培养至OD600约为1.0时，分别加入0.5mmolIPTG在37'C诱导表达4小时，诱导结束后皿量样品进行SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定；(4)重组工程菌Gcn/pET22b/BL21的中试发酵控制DO》40。/。、pH值为7,2左右、37°C，发酵8小时菌液密度达到OD600约为30时，加入0.1mmol/LIPTG，離降至25。C诱导4小时，发酵结束时，菌液OD600约为54，菌体湿重为39.20g/L，干重为6.95g/L，目标蛋白的表达率约为18.2%，为可溶表达形式；(5)GciL蛋白的纯化中试发酵获得诱导泰&的重组菌液^1离心收集菌体，溶于结^M冲液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPC^0.01inol/L咪唑)中，高压破菌，离心收牡清，鄉淀，选择ChelatingSepharoseFastFlow鹏柱和0)2+进《豫和层析纯化，使用洗脱缓冲液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPO4,0.5mol/L咪唑)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测；(6)GciL蛋白的动物免疫^fflGciL蛋白加无毒型LT佐剂。7、呼,合胞病毒亚单位疫,增强粘膜免疫、M免疫和细胞免疫功能的RSV疫苗中的应用。全文摘要本发明涉及一种呼吸道合胞病毒疫苗、制备方法和应用，更具体地说是应用大肠杆菌表达重组呼吸道合胞病毒G蛋白及突变G蛋白，并与无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素制备疫苗，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，属于生物
技术领域：
。其特征是所述呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。进一步还含有无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT佐剂。疫苗是截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aa130～230之间的氨基酸，并且将aa182～186之间的氨基酸CAWIC(CX3C模序)替换为RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成G_CIL蛋白。本发明对于预防人类呼吸道合胞病毒的感染具有重要的现实意义。文档编号A61P37/00GK101264323SQ20071006647公开日2008年9月17日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日发明者井申荣,季秀玲,光李,林连兵,魏云林申请人:昆明理工大学