专利名称：一种用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂，具体讲涉及一种增加人脑胶质瘤、鼻咽癌、肺癌的放射敏感性的生物制剂。本发明还涉及上述生物制剂的用途。
背景技术：
放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要措施之一。为提高疗效，国内外对肿瘤放射增敏剂进行了多年研究。目前研究认为影响肿瘤细胞放射敏感性的因素，主要包括肿瘤细胞的内在放射敏感性、组织的含氧状态、亚致死损伤修复能力和肿瘤细胞凋亡等诸多方面。经典的放射生物学实验证实，乏氧细胞是放射抗拒的关键，氧是作用最强的放射增敏剂，因为细胞在有氧情况下受到照射，其敏感性为缺氧时的3倍。乏氧细胞不仅限制了放疗疗效，而且也成为肿瘤复发的根源。
氧被认为是作用最强的放射增敏剂，已证明试图通过直接提高肿瘤组织氧含量，达到提高放射敏感性的方法效果不佳，那么可否通过化学物质代替氧进入血供不好的肿瘤组织，以化学方式间接达到期望的放射增敏效果呢？研究提示NO对肿瘤细胞具有放射增敏作用。由于NO极易通过细胞膜、在细胞间弥散，可直接到达肿瘤深处发挥作用。Griffin报道NO能提高体外缺氧状态下SCK肿瘤细胞的放疗敏感性，Mitchell等表明能够释放和维持一定浓度NO的NO供体药物对乏氧细胞的放射增敏作用与氧一样有效，Verovski研究表明NO能提高缺氧状态下放疗不敏感的胰腺肿瘤细胞的放射敏感性。因此设法增加肿瘤组织中乏氧细胞的NO含量，可能是提高肿瘤放射敏感性的有效途径。虽然一些研究已经采用NO供体药物如S-硝基乙酰青酶胺(S-nitroso-N-acetylpenicilla-mine，SNAP)、FK-406和PKC-412等作为放射增敏剂，提高乏氧环境下肿瘤的放射敏感性，但由于上述药物可导致低血压，甚至具有潜在的促肿瘤生长的作用，因此限制了其临床应用。
近期文献报道内毒素活化巨噬细胞能增强肿瘤细胞的放射敏感性。活化的巨噬细胞通过释放细胞因子增强肿瘤细胞的放射敏感性。结果表明通过活化的巨噬细胞增加NO的合成，以增强肿瘤细胞的放射敏感性。
LPS(Lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)是革兰阴性杆菌细胞膜的组成部分，其化学结构包括Lipid A、核心多糖和O抗原3个组成部分，lipid A是其活性中心。正常情况下，机体的炎症反应细胞(如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等)处于非活化状态。LPS/Lipid A可刺激炎症反应细胞活化，大量释放各种炎症介质如TNF-α、IL-1、IL-6；LPS可通过激活中性粒细胞和巨噬细胞膜上的NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate)氧化酶引起细胞的呼吸爆发，产生大量的O2-·，并进一步通过歧化反应和Fenton反应原理产生H2O2和OH-等氧自由基，导致机体的脂质过氧化性损伤，包括细胞膜正常结构的破坏、蛋白功能的抑制、细胞能量代谢的障碍等。由于LPS具有广泛的病理作用引起全身严重的不良反应，如施瓦茨曼(Shwartzman)反应和弥漫性血管内凝血等，因此寻找与LPS/Lipid A具有类似的放射增敏作用而毒副作用又较小的放射增敏剂具有重要意义。
细菌基因组的DNA片段CpG ODN(CpG-containing DNA，CpG ODN)具有与LPS类似的作用。CpG ODN是含有未甲基化CpG的寡核苷酸片段，是细菌DNA的最小作用单位。其结构特征为含有CpG基元即6个碱基互补回文结构的六聚体，该六聚体中必须至少含有一个CpG二核苷酸。CpG ODN可以直接激活抗原递呈细胞(单核细胞、巨噬细胞、B细胞)，诱导其产生IL-12、TNF-α等Th1型细胞因子和NO、以及特异性Th1型细胞免疫应答。其诱导的信号转导通路可能为CpG ODN由细胞内化后，在内体中与受体TLR9(Toll-like receptor9，TLR9)结合，激活并启动NF-κB途径和应激激酶途径这两条途径，直接激活NF-κB和AP-1的转录活性，诱导特定基因的活化和表达。
由于CpG ODN能模拟原核生物DNA刺激机体的免疫系统，激活多种免疫细胞，产生多种细胞因子，具有独特而强大的免疫激活作用，不良反应较少，故在肿瘤、过敏性疾病、感染性疾病的治疗中将其作为免疫佐剂和/或疫苗。近期有文献报道CpG ODN可提高肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性2004年Milas报道CpG ODN能够增加肉瘤细胞对放射线的敏感性，2005年Meng报道CpG ODN能够增强神经胶质瘤的放射敏感性。实验结果均认为特异性Th1型细胞免疫应答和T细胞毒作用在CpG ODN提高肿瘤细胞对放疗敏感性的过程中发挥重要作用。
因此，有必要在上述研究的基础上，对CpG ODN进行针对性的研究，找出其中在提高肿瘤细胞对放疗敏感性的作用效果上突出的CpG ODN，寻找出新的放射增敏剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对肿瘤放射增敏效果显著、并可抑制肿瘤生长的生物制剂。
本发明的再一目的是提供上述生物制剂的用途。
为实现上述发明目的，发明人在现有技术的基础上经过大量的实验及创造性的劳动设计出用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂，所述的生物制剂的活性成分为CpG ODN。
所述的CpG ODN为如下DNA序列中的一种或几种SEQ ID NO1GGC GGC GGC GCG；SEQ ID NO2CGC GGC GCC GGG；SEQ ID NO3GGC GGC GGC GGA；SEQ ID NO4CCG CGC GCG GGC；SEQ ID NO5TGG CGC GGG GCG；(该序列为CpG ODN 107)SEQ ID NO6GCC GGC GCC CGG；SEQ ID NO7GCG CGC GCG GTA；SEQ ID NO8CCA GGC GGC GGG；SEQ ID NO9GGC CGC GGG GGT；SEQ ID NO10CAG CCC GGG GGA；SEQ ID NO11GCT CCC GGG CTT；SEQ ID NO12GCG CTC GGG CTT；
SEQ ID NO13CCG CCC GCG CCT；SEQ ID NO14GCA CCC GCG CGC。
优选地，所述的CpG ODN为如下DNA序列中的一种或几种SEQ ID NO1GGC GGC GGC GCG；SEQ ID NO4CCG CGC GCG GGC；SEQ ID NO5TGG CGC GGG GCG；SEQ ID NO6GCC GGC GCC CGG；SEQ ID NO9GGC CGC GGG GGT；SEQ ID NO10CAG CCC GGG GGA；SEQ ID NO11GCT CCC GGG CTT；SEQ ID NO12GCG CTC GGG CTT；SEQ ID NO13CCG CCC GCG CCT。
所述的生物制剂还可以包括LPS。
所述的生物制剂可应用于制备增加人脑胶质瘤细胞CHG-5、鼻咽癌细胞CNE-2和非小细胞肺癌A59的放射敏感性的药物。
公开号为CN1699394，发明名称为高免疫活性CpG-S ODN和拮抗CpG-SODN作用的CpG-N ODN的基因序列及其应用揭示了SEQ ID NO2-15所示的序列为具有高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸，并将其应用于预防和治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物。发明人在研究可增加肿瘤细胞放射敏感性的物质时意外地发现SEQ ID NO1-15所示的基因序列对增加肿瘤细胞放射敏感性具有显著的效果。本发明的一个较佳实施例中，发明人经研究发现SEQ ID NO2(下面均称为CpG ODN107)抑制上述细胞增殖，具有显著的增加人脑胶质瘤CHG-5细胞放射敏感性的作用。同时，发明人研究了CpGODN107对CHG-5细胞释放因子TNF-的影响，并与已知公开序列CpGODN1826对CHG-5细胞释放因子TNF-α的影响作比较，CpG ODN1826的序列为TCCATGACGTTCC TGACGTT，如序列表中SEQ ID AO15所示，研究发现CpG ODN107能显著增加细胞因子TNF-α释放，而且当CpG ODN107联合β射线时增加细胞因子TNF-α释放的效果更显著。上述技术效果对于本领域的技术人员来说需要付出创造性的劳动才能实现，是非显而易见的。
特别需要指出的是，本发明的生物制剂在有效增加肿瘤细胞放射敏感性的同时自身也可以有效抑制肿瘤的生长。
图1A、图1B、图1C、图1D是CpG ODN107对CHG-5细胞形态及迁移的影响的荧光示意图。
图2是CpG ODN107在裸鼠肿瘤种植模型实验中对肿瘤生长的影响曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实验例1 CpG ODN107对CHG-5细胞放射增敏的量-效关系调整人脑胶质瘤CHG-5细胞浓度为5×104/ml，接种于96孔板中，每孔0.2ml，培养4小时后，加入CpG ODN107(1μg/ml，3μg/ml，10μg/ml，30μg/ml)及LPS(0.3μg/ml)，再培养12小时；经β线照射(照射剂量为5Gy)，继续培养24小时；于每孔中加入20μl新鲜配置的MTT溶液，培养4小时，弃上清液，加入150μl DMSO作用15分钟后，在490nm处测定光密度值。按下列公式进行存活分数(survival fraction，SF)的计算SF＝(实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100％。
参照表1，此次实验结果表明CHG-5细胞经CpG ODN107(1、3、10、30μg/ml)处理，再经5Gyβ线照射后，照射组与未照射组比较，照射组CHG-5细胞的增殖受到显著抑制，细胞存活分数也呈显著下降趋势，且与CpG ODN107的剂量呈显著的量效关系。但当CpG ODN107的浓度达到10μg/ml后，细胞的存活分数不再下降(p＞0.05)。CHG-5细胞经LPS(0.3μg/ml)处理，再经5Gyβ线照射后，照射组与未照射组比较，照射组CHG-5细胞的增殖也受到显著抑制(p＜0.01)。
表1 CpG ODN107对CHG-5细胞存活分数的影响(％，n＝3，x±SD)
实验例2 CpG ODN107对CHG-5细胞的集落形成的影响。
将CHG-5细胞按每皿50、100、200个细胞接种于60mm培养皿中，每皿5ml，培养4小时，加入终浓度为10μg/ml的CpG ODN107(经CpG ODN107对CHG-5细胞增殖的影响实验得到10μg/ml为最佳剂量)、LPS(0.3μg/ml)，再孵育12小时；经β线照射后继续培养7-10天，中间更换一次培养液。培养结束后，弃培养液，PBS洗涤、甲醇固定、瑞氏吉姆萨染色后计数，含50个细胞以上的定义为一个集落。集落形成数和集落形成抑制率按下列公式计算集落存活分数＝实验组集落形成率/对照组集落形成率集落形成抑制率(％)＝(对照组集落形成率-实验组集落形成率)/对照组集落形成率×100％。
参照表2，实验结果表明CHG-5细胞经CpG ODN107(10μg/ml)处理后，CpG ODN107处理组细胞集落形成受到显著抑制(p＜0.01)；CHG-5细胞经CpGODN107处理后、再经5Gyβ射线照射，照射组与未照射组比较，照射组细胞集落形成进一步受到显著抑制(p＜0.01)。LPS组细胞集落形成抑制率显著低于CpG ODN107组(p＜0.01)。
表2 CpG ODN107对CHG-5细胞集落形成率的影响(％，n＝3，x±SD)
实验例3 CpG ODN107对CHG-5细胞迁移的影响调整细胞浓度为5×104/ml，接种子6孔板中，培养4小时待细胞贴壁后，加入终浓度为CpG ODN107(10μg/ml)培养12小时，用移液管头部沿培养板底部呈“一”字形划痕，更换培养液，经β射线照射后继续培养24小时，观察细胞的迁移情况。
参照图1A，未经任何处理的CHG-5细胞贴壁良好，呈梭形，折光性好，划痕处爬满迁移的细胞；参照图1B，仅经5Gyβ射线照射处理的CHG-5细胞形态无明显改变，但细胞数量明显减少，划痕处无细胞迁移；参照图1C，CHG-5细胞经CpG ODN107处理后可见细胞数量进一步减少，划痕处也未见细胞迁移，划痕处周围细胞数量也明显减少；参照图1D，细胞经CpG ODN107和5Gyβ射线照射处理后细胞团形成明显，细胞数量明显减少，折光性差，划痕处以及划痕处周围均未见细胞迁移。
实验例4 CpG ODN107对CHG-5细胞释放因子TNF-α的影响。
调整CHG-5细胞浓度为5×104/ml，接种于6孔板中，培养4小时，分别加入终浓度为CpG ODN107(10μg/ml)、LPS终浓度为(0.3μg/ml)，经β射线照射后，检测细胞上清中TNF-α含量。参照表3，此次实验结果表明CHG-5细胞经CpG ODN107(10μg/ml)处理后，细胞分泌TNF-α水平明显提高(110.3pg/ml)，细胞经CpG ODN107处理、再经5Gyβ射线照射后，照射组与未照射组比较，照射组细胞TNF-α分泌显著增加(p＜0.05)(表4)。CHG-5细胞经LPS(0.3μg/ml)处理，细胞分泌TNF-α能力无显著增加(p＞0.05)；CHG-5细胞经LPS处理、再经5Gyβ射线照射后，照射组细胞较未照射组TNF-α分泌显著增加(p＜0.01)，但增加幅度较CpG ODN107(10μg/ml)组为低(p＜0.05)。
表3 CpG ODN107对CHG-5细胞分泌TNF-α水平的影响(n＝3，x±S)
CpG ODN具有明显的种属特异性，1826主要对小鼠的免疫细胞的活性较强，对人的作用较弱。
实验例5 CpG ODN107在裸鼠肿瘤种植模型实验中对肿瘤生长的影响用0.25％胰蛋白酶消化CHG-5细胞，用新鲜的DMEM培养液稀释成单个细胞悬液，冰生理盐水离心洗涤两次，悬浮于生理盐水中，并调整细胞浓度均为2×107，用1ml注射器抽取0.15ml细胞悬液接种于裸鼠的背部皮下。接种后7天，测量肿瘤结节，并随机分为对照组、对照组+5Gyβ射线照射组、CpG ODN107组、CpG ODN107+5Gyβ射线照射组。每组6只动物。对照组给予100μl无菌生理盐水瘤内注射；对照组+5Gyβ射线照射组给予100μl无菌生理盐水瘤内注射再经5Gyβ射线照射；CpG ODN107组CpG ODN107 100μg/只瘤内注射；CpGODN107+5Gyβ射线照射组CpG ODN107100μg/只瘤内注射再5Gyβ射线照射；给药后4小时，腹腔注射1％戊巴比妥麻醉后，剂量率400cGy/分，6mVβ线等中心照射，射野大小为10cm×10cm，剂量8Gy，局部照射。隔日一次用游标卡尺测量肿瘤结节的长度(a)、宽度(b)和高度(c)，按公式求肿瘤近似体积(V)，V＝π/6(abc)，将肿瘤体积变化对应时间再绘出生长曲线。参照图2，CpGODN107在裸鼠肿瘤种植模型实验中抑制肿瘤生长的作用显著。对照组+5Gyβ射线照射组与CpG ODN107+5Gyβ射线照射组比较肿瘤体积受到显著抑制(p＜0.01)，并且对照组与CpG ODN107组比较也能显著抑制(p＜0.01)肿瘤体积生长。
上述提供的实施方案应看作是举例说明而非限制性的，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员在不违反前面充分阐述的本发明的实质或范围条件下，可对本发明的实施方案做各种改动或修饰，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>CpG ODN在增加肿瘤细胞放射敏感性中的应用<130>7U99016-CN<160>15<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>1ggcggcggcg cg 12<210>2<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>2cgcggcgccg gg 12
<210>3<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>3ggcggcggcg ga 12<210>4<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>4ccgcgcgcgg gc 12<210>5<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>5tggcgcgggg cg 12<210>6<211>12<212>DNA
<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>6gccggcgccc gg 12<210>7<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>7gcgcgcgcgg ta 12<210>8<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>8ccaggcggcg gg 12<210>9<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>9ggccgcgggg gt 12
<210>10<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>10catcccgggg ga 12<210>11<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>11gctcccgggc tt 12<210>12<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>12gcgctcgggc tt 12<210>13<211>12<212>DNA
<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>13ccgcccgcgc ct 12<210>14<211>12<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>14gcacccgcgc gc 12<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成的免疫刺激寡核苷酸<400>15tccatgacgt tcctgacgtt 20
权利要求
1.一种用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂，其特征在于所述的生物制剂的活性成分为CpG ODN。
2.按照权利要求1所述的生物制剂，其特征在于所述的CpG ODN为如下基因序列中的一种或几种SEQ ID NO1 GGC GGC GGC GCG；SEQ ID NO2 CGC GGC GCC GGG；SEQ ID NO3 GGC GGC GGC GGA；SEQ ID NO4 CCG CGC GCG GGC；SEQ ID NO5 TGG CGC GGG GCG；SEQ ID NO6 GCC GGC GCC CGG；SEQ ID NO7 GCG CGC GCG GTA；SEQ ID NO8 CCA GGC GGC GGG；SEQ ID NO9 GGC CGC GGG GGT；SEQ ID NO10 CAG CCC GGG GGA；SEQ ID NO11 GCT CCC GGG CTT；SEQ ID NO12 GCG CTC GGG CTT；SEQ ID NO13 CCG CCC GCG CCT；SEQ ID NO14 GCA CCC GCG CGC。
3.按照权利要求2所述的生物制剂，其特征在于所述的CpG ODN为如下DNA序列中的一种或几种SEQ ID NO1 GGC GGC GGC GCG；SEQ ID NO4 CCG CGC GCG GGC；SEQ ID NO5 TGG CGC GGG GCG；SEQ ID NO6 GCC GGC GCC CGG；SEQ ID NO9 GGC CGC GGG GGT；SEQ ID NO10 CAG CCC GGG GGA；SEQ ID NO11 GCT CCC GGG CTT；SEQ ID NO12 GCG CTC GGG CTT；SEQ ID NO13 CCG CCC GCG CCT。
4.按照权利要求1-3任一权利要求所述的生物制剂。
5.权利要求4所述的生物制剂在制备增加人脑胶质瘤、鼻咽癌、肺癌的放射敏感性的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂CpG ODN，所述的CpG ODN为SEQ ID NO1－14所示的基因序列中的一种或多种，本发明的用于增加肿瘤细胞放射敏感性的生物制剂具有对肿瘤放射增敏效果显著、并可抑制肿瘤生长的效果，可用于制备增加人脑胶质瘤、鼻咽癌、肺癌的放射敏感性的药物。
文档编号A61P35/00GK101041078SQ200710078248
公开日2007年9月26日 申请日期2007年3月1日 优先权日2007年3月1日
发明者周红, 颜伟, 郑江 申请人:中国人民解放军第三军医大学