专利名称：构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法
技术领域：
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体说它是一种能制造“危重病人预警蛋白质”动物模型的构建方法。
背景技术：
“危重病人预警蛋白质”是人类和动物类在正常情况下血清中并不存在的蛋白质组，是人类和动物类在疾病发展过程中才产生的一组蛋白质。这种特殊蛋白质可加重病情的发展、导致恶化、引起人和动物的死亡，该蛋白质组已于2004年，由申请者在濒临死亡患者的血清中被捕捉到，2005年通过山西省组织的专家鉴定(科学技术成果鉴定证书 晋科鉴字 第193号；登记号051193；批准日期2005年11月3日)。
由于对疾病治疗无效，导致人的死亡，这是疾病发展的自然现象。目前人类对疾病引发死亡的认识，仅限于对它临床表观症状的观察，还从未有人能认识到这其中的演变规律。由于不能做到早期预警常常因为晚期而无法救治，就限制了疾病治疗学的发展，这就是目前临床医学的现状。
2005年申请者首次报道了导致疾病发展、恶化和死亡发生的蛋白质组指纹，即“危重病人预警蛋白质”指纹------LGT其血清称为
①中文标准名危重病人预警蛋白质②英文标准名称Lost goodwill target(简写LGT)English standard nameLost goodwill target(AbbreviationLGT)③学名危重病人预警蛋白质Systematic nameLost goodwill target Proteomics(AbbreviationLGT)④其他名称死亡蛋白、预警蛋白Other namesDeath protein、Warning protein)(其指纹称为●“危重病人预警蛋白质”(指纹)●“Lost goodwill target”(fingerprint)●“LGT”(fingerprint)●“危重病人预警蛋白质组”(指纹)●“Lost goodwill target Proteomics”(fingerprint)●“死亡蛋白”(指纹)●“Death protein”(fingerprint)●“预警蛋白”(指纹)●“Warning protein”(fingerprint)在报导中指出人类疾病恶化导致死亡是由蛋白质组变异所造成；并且发现该蛋白质组指纹能在疾病恶化与生命机体濒临死亡前数月出现，可以为其起到预警作用(早期发现——预警作用)。这种蛋白质是一组在疾病发展到一定程度(恶化之前)才出现的蛋白质组。申请人将此蛋白质组命名为“危重病人预警蛋白质”组(LGT)。随后将此项技术引入临床工作，用于早期发现疾病的恶化，从而进行药物阻断治疗，并获得了成功。这说明该蛋白质组作为危重病人的预警作用是可行的，可以提示医师及时早期发现病情恶化的迹象，及时给予治疗和实施干预措施，明显提高所救治病人的生存期和生存质量。因此很有必要，进一步了解该蛋白质组的结构、功能、以及来源。
由于工作刚刚开始，急需构建产生该蛋白质组的模型，由此获得供研究用的含有“危重病人预警蛋白质”的血清，以利于今后的进一步的研究；由于用人体构建该蛋白质组模型是违法的，自然产生该蛋白质组血清的病人不能称为模型；除此之外，人类患病、治疗、加重、至死亡的过程极为复杂，且都有并发症，很显然这些血清蛋白质组的构成是多样化的，不利于专项研究；所以应该根据比较医学原理构建该蛋白质组的动物模型。
人类疾病动物模型为疾病研究提供研究平台，为探讨和明确疾病的发生与治疗规律提供实验条件，成为人类与疾病斗争的有力手段，蛋白质组动物模型的构建就是其中的一种。目前蛋白质组动物建模方法，都集中在已知疾病的方面，获取已知的蛋白质及已知的蛋白质组，设计思路是给予模型动物某些外加因素，使模型动物体内增加某种特定蛋白的数量或比例，达到疾病状态，以供研究。如早老型痴呆鼠动物模型，就是为产生达到早老型痴呆蛋白质指标而进行构建的，其专利公开号CN 1558383A。但是对于建立被新发现、只在人体和动物体内，于病情恶化、濒临死亡之前出现“危重病人预警蛋白质”的相关动物模型，显然不是仅用增加原有蛋白质的数量与相对比例就可以解决的简单问题；目前尚未发现利用现方法，构建含有在病人病情危重、濒临死亡的过程中才出现的新型蛋白质模型动物的先例。
发明内容
本发明的目的是提出可以建立制造“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，要解决的技术问题是，提出构建“危重病人预警蛋白质”动物模型方法的技术方案。
本发明的具体内容是，构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法包括选择能够构建人类疾病动物模型的动物，施用致病因素于该建模动物，使之致病；随后，再施以使其疾病迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素；直至建模动物产生“危重病人预警蛋白质”；“危重病人预警蛋白质”指纹文字描述是，被检物质经SELDI(Surface-enhanced laser desorption/ionization)技术及其他质谱技术检测，该检测是经过SELDI技术检测“危重病人预警蛋白质”模型鼠血清得到的；按被检物质的质荷比(M/Z)大小，在一平面图上，顺次记录其含量的大小(即丰度)进行结果描述所获得的质谱图(即指纹图)中，该蛋白质的指纹图是在10800+H至13900+H之间出现三峰或以上的质谱峰簇(cluster)，其中一个或多个质谱峰丰度≥20％，其余均在5％以上；危重病人预警蛋白质组的质谱峰簇距上游质谱峰簇和下游质谱峰簇的质荷比(M/Z)均大于1000个质量单位，它的疑似特征是仅在10800+H至13900+H之间出现单峰且丰度值≥5％的指纹图谱(LGT)。
“危重病人预警蛋白质”的动物血清，能用质谱技术(SELDI技术)捕捉到与人类在病情危重和濒死状态下才出现的“危重病人预警蛋白质指纹”基本相同的指纹图谱，经前述工作方法并达到本结果的视为建模成功。其中，SELDI技术即表面增强激光解析离子飞行时间(time of flight)质谱技术{SELDI技术}这样，建模动物的选择为动物模型提供了模型动物的生命机体；致病因素的介入，使模型动物致病，是导致疾病状态恶化、濒临死亡的前提；使患有疾病的模型动物病情迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素，则是“危重病人预警蛋白质”生成的条件；其中，实行人为干预、使之病情迅速恶化是出于建立模型的需要，便于研究观察、便于控制、提高了效率。上述方法实现了本发明的目的，解决了本发明提出的技术问题。
本发明所述使患有疾病的模型动物病情迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素是，对已经患有疾病的建模动物施用相应对症药物，其建模用药模式为每天用其标准量的1倍-----20倍，用药时间是2----21天，其用药总量是每天标准量的2倍------50倍。
标准剂量的根据参 苗明三.《实验动物和动物实验技术》.中国中医药出版社.1997.143-145.。
此种用药模式即可对患有疾病的模型动物，起到促使病情恶化、达到濒临死亡状态的作用。由于对药物的作用均有相当的研究与实践基础，对其使疾病恶化的 作用进程比较清楚，相对于其他因素的作用用药的影响效果更为简单直接，易于控制与量化，有利于对实验结果的分析与总结。
制作本发明以药物为施加因素方法所建立动物模型“危重病人预警蛋白质”标本的方法是，在停药的第2天---第30天内取血，制备标本。由于“危重病人预警蛋白质”本身并不是生命体内原生存在的，目前认为其应该是只在疾病恶化、生命濒临死亡阶段，以某种方式生成、并以一过性状态存在的一种特殊蛋白质，因此过早取血可能因其尚未生成而无法得到，过迟取血，则会由于生命的终结，同样无法利用模型动物体内的这种特殊蛋白质，因此适宜时机的选取是应该十分注意的。
本发明所述以药物为施加因素构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法是用肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以2的剂量注入接种的肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为4天。标准饲养是指建模鼠在实验动物室(清洁级)饲养观察90天，。建模鼠在实验动物室温度22～24℃，相对湿度40％～45％，日光灯12h人工照明。
本发明所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法是用特定的肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以2的剂量注入接种的肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为8天。
本发明上述两种方法所建模型制作标本的取血时间，皆为施药停用后的第4天，然后制作标本。
本发明所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法是用特定的肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以4的剂量注入接种的肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为2---4天。其制作标本的取血时间，是于停药的第2天开始取血，制备血清标本。
本发明所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的构建方法是用特定的肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量1倍-----4倍的剂量注入接种的肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为8天。其制作标本的取血时间，是于停药的第2-----30内天开始取血，制备血清标本。
这里，本发明的主要方法是用药物构建濒临死亡的动物模型，使之产生原来没有的未知的蛋白质及蛋白质组。这是一种全新的建模思路，其建模方法是目前所有蛋白质组动物模型的构建中所没有的，是具有历史性意义的突破.
这种方法建模的成功率很高，真正能做到建立有预警作用的“危重病人预警蛋白质”的动物模型，形成一个比较理想的“危重病人预警蛋白质”动物模型的构建标准。在其模型的血清中能用质谱技术(SELDI技术 )捕捉到与人类在病情危重和濒死状态下才出现的“危重病人预警蛋白质指纹”基本相同的指纹图谱。
注SELDI表面增强激光解析离子飞行时间(time of flight)质谱技术{SELDI(Surface-enhanced laser desorption/ionization)技术}由于疾病恶化导致死亡的诱发因素很多。动物模型可以使之单一化，即纯化标本，更有利于对该蛋白质组的研究。为人类最终揭开死亡之迷，控制疾病的恶化提供卓有成效的研究平台。
图1是鼠的“危重病人预警蛋白质”指纹；图2是鼠的“危重病人预警蛋白质”指纹(多峰变异)；
图3是鼠的“危重病人预警蛋白质”指纹(低丰度变异)；图4是鼠的“危重病人预警蛋白质”指纹(疑似)；图5是鼠的“危重病人预警蛋白质”指纹图阴性。
图中箭头所指为“危重病人预警蛋白质”的指纹。(是经过SELDI技术检测“危重病人预警蛋白质”模型鼠血清得到的)具体实施下面结合附图与具体实施例，对本发明作进一步说明。
为简化说明，仅以不同剂量化疗药物-----PDD对S-180鼠的“危重病人预警蛋白质”的构建方法为样例。
实例不同剂量PDD构建一种能制造“危重病人预警蛋白质”S-180鼠的动物模型。
1.建模鼠选择4-5周龄昆明种(KM)小鼠，共50只，体重为18-20g，均为雌性，购自于山西省中医研究院动物室。
2.瘤源从中国药品生物制品鉴定所引进S180瘤株3.接种①肿瘤细胞悬液的制备按常规制备方法无菌取出S-180鼠的肿瘤组织，制成匀浆，放入玻璃匀浆器中，用无菌生理盐水研磨成悬液。容器置于冰上，计数单位体积内的活细胞密度为2.37*107/ml，胎盘蓝染色计数活细胞数＞98.9％。
②接种取接种鼠，右腋下洛合碘消毒，用注射器汲取制备好的肿瘤悬液，将0.2ml(含2.37*107/ml活细胞)肿瘤细胞悬液于昆明小鼠右腋下的皮下接种。
③饲养条件小鼠在实验动物室(清洁级)饲养观察90天，每笼5只小鼠。小鼠在实验动物室温度22～24℃，相对湿度40％～45％，目光灯12h人工照明。
4.实验①接种肿瘤鼠分组按PDD每天用量分成5组，每组10只。
②实验操作 取血将小鼠用2％戊巴比妥钠麻醉后进行摘眼球取血后，血液立即放入4℃冰箱静置20min。4℃3000r/min离心5min分离血清备用。
实验仪器ProteinChip BiologySystem(PBS II 2c)质谱仪、弱阳离子交换型(Weak Cation Exchangcr，WCX2)蛋白质芯片(Ciphergen Biosystems公司产品)。
实验试剂乙腈、三氟乙酸、尿素、SPA、CHAPS、Tris2HCl等购自Sigma公司。
实验操作按Ciphergen公司制定标准进行操作，即用表面增强激光解析离子飞行时间(time of flight)质谱技术{SELDI(Surface-enhanced laser desorption/ionization)技术}进行检测。
结果鉴定被检物质经SELDI技术及其他质谱技术检测，按被检物质的质荷比(M/Z)大小，在一平面图上，顺次记录其含量的大小(丰度)进行结果描述所获得的质谱图(指纹图)中，在其特征为在10800+H至13900+H之间出现三峰或以上的质谱峰簇(cluster)，其中一个或多个质谱峰丰度≥20％，其余均在5％以上；危重病人预警蛋白质组的质谱峰簇距上游质谱峰簇和下游质谱峰簇的质荷比(M/Z)均大于1000个质量单位，它的疑似特征是仅在10800+H至13900+H之间出现单峰且丰度值≥5％的指纹图谱，具有这些特征的图谱均称之为“危重病人预警蛋白质”组指纹。
指纹图如图1-图5，图中箭头所指为“危重病人预警蛋白质”指纹依次为“危重病人预警蛋白质”模型鼠标准“危重病人预警蛋白质指纹”，“危重病人预警蛋白质”模型鼠标准危重病人预警蛋白质指纹(多峰变异)，“危重病人预警蛋白质”模型鼠标准“危重病人预警蛋白质”指纹(低丰度变异)，“危重病人预警蛋白质”模型鼠标准“危重病人预警蛋白质”指纹(疑似)，“危重病人预警蛋白质”模型鼠“危重病人预警蛋白质”指纹阴性图谱。
5.结果评价实验组1取S-180接种鼠10只，在上述标准饲养条件下，待接种肿瘤长至直径约1CM后，开始用PDD 1.3mg/kg，腹腔注入，每天1次，共计8天，于停药后4天开始取血，SELDI技术检测，“危重病人预警蛋白质”指纹出现率3/10(30％)疑似“危重病人预警蛋白质”指纹出现率2/10(20％)共计50％。无自然死亡。本建模方法不好实验组2取S-180接种鼠10只，在上述标准饲养条件下，待接种肿瘤长至直径约1CM后，开始用PDD 2.6mg/kg，腹腔注入，每天1次，共计4天，于停药后4天开始取血，SELDI技术检测，“危重病人预警蛋白质”指纹出现率5/9(56％)疑似“危重病人预警蛋白质”指纹出现率1/10(10％)共计66％。自然死亡1只。本建模方法不理想实验组3取S-180接种鼠10只，在上述标准饲养条件下，待接种肿瘤长至直径约1CM后，开始用PDD 2.6mg/kg，腹腔注入，每天1次，共计8天，于停药后4天开始取血，SELDI技术检测，“危重病人预警蛋白质”指纹出现率2/9(22.3％)疑似“危重病人预警蛋白质”指纹出现率7/9(77.7％)共计100％。1例取血不当失败。本例虽然建模成功率达到100％，但疑似较多，不利于分析研究，不是理想的建模方法。
实验组4取S-180接种鼠10只，在上述标准饲养条件下，待接种肿瘤长至直径约1CM后，开始用PDD 5.2mg/kg，腹腔注入，每天1次，共计4天，于停药后2天开始取血，SELDI技术检测，“危重病人预警蛋白质”指纹出现率10/10(100％)疑似“危重病人预警蛋白质”指纹出现率0(0％)共计100％。无自然死亡。本利为最佳建模方法实验组5取S-180接种鼠10只，在上述标准饲养条件下，待接种肿瘤长至直径约1CM后，开始用PDD 10.4mg/kg，腹腔注入，每天1次，共计2天，停药后第2天全部死亡。
权利要求
1.构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法包括对可构建人类疾病动物模型的动物，施用致病因素，使之致病；随后，再施以使其疾病迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素，直至建模动物产生“危重病人预警蛋白质”；“危重病人预警蛋白质”指纹文字描述是，被检物质经SELDI技术及其他质谱技术检测，该检测是经过SELDI技术检测“危重病人预警蛋白质”模型鼠血清得到的；按被检物质的质荷比(M/Z)大小，在一平面图上，顺次记录其含量的大小(即丰度)进行结果描述所获得的质谱图(即指纹图)中，该蛋白质的指纹图是在10800+H至13900+H之间出现三峰或以上的质谱峰簇(cluster)，其中一个或多个质谱峰丰度≥20％，其余均在5％以上；危重病人预警蛋白质组的质谱峰簇距上游质谱峰簇和下游质谱峰簇的质荷比(M/Z)均大于1000个质量单位，它的疑似特征是仅在10800+H至13900+H之间出现单峰且丰度值≥5％的指纹图谱。
2.如权利要求1所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，其特征在于所述使患有疾病的模型动物病情迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素是，对已经患疾病的建模动物施用相应对症药物，其建模用药模式为每天用其标准量的1倍-----20倍，用药时间是2----21天，其用药总量是每天标准量的2倍------50倍。
3.制作如权利要求2所述动物模型“危重病人预警蛋白质”标本的方法，其特征在于在所述用药停用的第2天---第30天内取血，制备标本。
4.如权利要求2所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，其特征在于所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法是，用肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以2的剂量注入该肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为4天。
5.如权利要求2所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，其特征在于用肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以2的剂量注入该肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为8天。
6.制作如权利要求4或5所述动物模型“危重病人预警蛋白质”标本的方法，其特征在于在所述用药停用的第4天开始取血，制备血清标本。
7.如权利要求2所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，其特征在于用肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量乘以4的剂量注入该肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为2---4天。
8.制作如权利要求7所述动物模型“危重病人预警蛋白质”标本的方法，其特征在于在所述用药停用的第2天开始取血，制备血清标本。
9.如权利要求2所述构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，其特征在于用肿瘤鼠，在标准饲养条件下，每天按标准用药量1倍-----4倍的剂量注入该肿瘤鼠的腹腔内，用药时间为8天。
全文摘要
构建“危重病人预警蛋白质”动物模型的方法，属于医疗评价、检测技术领域，是对可构建人类疾病动物模型的动物，施以致病因素，使之致病；再施用使其疾病迅速恶化，达到濒临死亡阶段的因素；直至建模动物产生“危重病人预警蛋白质”；使该动物模型建立。其中，可按每天用其标准量的1倍－20倍、施用2－21天、总量是每天标准量2倍－50倍的模式用药；并在停药的第2天－第30天内取血，制备标本；可得单一致病因素产生的纯化“危重病人预警蛋白质”的血清标本。用此模型可更精确比较研究，人类在疾病发展及恶化并导致死亡的过程中，蛋白质组的结构、功能、来源及其阻断药物；探索死亡发生的可能机制；开发早期及具有预警作用的检测方法和试剂。
文档编号A61B19/00GK101071128SQ20071008753
公开日2007年11月14日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者裴毅, 王蓉, 王清馨 申请人:裴毅