预防与治疗自身免疫性疾病的物质的制作方法

专利名称：预防与治疗自身免疫性疾病的物质的制作方法
预防与治疗自身免疫性疾病的物质 联邦资助研发的声明本发明是由美国政府资助并在与美国国防部的National Medical Technology Testbed公司的合作协议(协议号DAMD-17-97-2-7016)下完成 的，因此美国政府拥有本发明的某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2002年8月6日在美国提交的临时申请第60/401，652号， 题目为"抑制糖尿病的方法和物质"的权益，其内容在本发明公开中全 部引用作为参考。技术背景自身免疫性疾病可造成较高的人类发病率和死亡率。这些疾病大约 包括80种疾病，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及多发性硬化症， 有大约5%的美国人受到影响。I型糖尿病作为一种自身免疫性疾病，在 儿童中是最常见的慢性疾病，其发病在全世界呈稳定的上升趋势。一般而言，通过抗原提呈细胞(APC)对胰腺/3细胞合成的自身抗原的 展现来作为I型糖尿病发病的开始。该展现导致胰腺/3细胞免疫系统的破 坏，这种破坏多数由I型T辅助细胞(Thl)和细胞毒T淋巴细胞而引起并 由此导致胰岛素产生能力的丧失。I型糖尿病的许多预防性和治疗性手段是通过诱导免疫系统使致病 的自身反应性淋巴细胞丧失、失活或抑制来防止|8细胞的破坏，该手段 例如给予单独传输自身抗原的疫苗、或给予作为免疫系统的直接作用因 子的物质(例如细胞因子)。然而，目前使用的以DNA为基础的疫苗在预 防所述的疾病中没有完全的作用，而且其中一些疫苗不但不能预防所述 的疾病相反却与诱导或增强自身免疫反应有关。此外，细胞因子的使用 可伴随较高的发病率。
因此，需要一种新的通过使用不伴随上述缺点的疫苗来预防、延迟 患者的自身免疫性疾病发病或治疗所述疾病的方法。此外，需要一种新的通过使用不伴随上述缺点的疫苗来预防、延迟 患者的I型糖尿病的发病或治疗所述疾病的方法。发明概述根据一个实施方案，本发明提供预防、延迟患者的一种或多种自身 免疫性疾病发病或治疗所述疾病的物质。所述的物质包含多聚核苷酸构建体，所述构建体包含编码促凋亡蛋白BAX和编码一种或多种自身免疫性疾病自身抗原的多聚核苷酸序列。根据另一个实施方案，本发明提供包含编码促凋亡蛋白BAX和编码 一种或多种自身免疫性疾病自身抗原的多聚核苷酸序列的多聚核苷酸构 建体的制备药物的用途，所述的药物用于预防、延迟一种或多种自身免 疫性疾病的发病或治疗所述疾病。根据另一个实施方案，本发明提供包含编码腺病毒蛋白E3-GP19k的 多聚核苷酸序列的多聚核苷酸构建体在制备药物中的用途，所述的药物 用于预防、延迟一种或多种自身免疫性疾病的发病或治疗所述疾病。根据另 一个实施方案，本发明提供包含编码ABCL-2的多聚核苷酸序 列的多聚核苷酸构建体在制备药物中的用途，所述的药物用于预防、延 迟一种或多种自身免疫性疾病的发病或治疗所述疾病。在一个实施方案中，所述的药物制备成约0.5mg-约5mg的剂量单位。 在另一个实施方案中，所述的药物制备成约lmg-约4mg的剂量单位。在 另一个实施方案中，所述的药物制备成约2.5mg-约3mg的剂量单位。在 另一个实施方案中，所述的药物制备成适合肌肉内给药的形式。在另一 个实施方案中，所述的药物制备成适合静脉内给药的形式。根据另一个实施方案，本发明提供预防、延迟患者的一种或多种自 身免疫性疾病的发病或治疗所述疾病的方法。所述的方法包括选择容易 发展为所述自身免疫性疾病、正发展为所述的自身免疫性疾病、或已经 患有所述的自身免疫性疾病的患者；及给予所述的患者一种或多种剂量 的包含编码促凋亡蛋白BAX和编码一种或多种自身免疫性疾病自身抗原
的多聚核苷酸序列的多聚核苷酸构建体，或者给予包含编码所述的腺病毒蛋白E3-GP19k的多聚核苷酸序列的多聚核苷酸构建，或者给予包含编 码所述的ABCL-2的多聚核苷酸序列的多聚核苷酸构建或者上述多聚核 苦酸构建的组合。在一个实施方案中，所述的自身免疫性疾病为I型糖尿病。在另一个 实施方案中，选择所述的患者包括鉴定所述患者的抗胰岛素抗体或抗 GAD自身抗体的存在或者抗胰岛素抗体和抗GAD自身抗体二者的同时 存在。在另一个实施方案中，选择所述的患者包括鉴定所述患者渐增的 高血糖症的存在。在另一个实施方案中，选择所述的患者包括鉴定所述 患者的尿糖的存在。在另一个实施方案中，选择所述的患者包括鉴定所 述患者的所述自身免疫性疾病的遗传性倾向的存在。在另一个实施方案中，所述的一种或多种剂量是多个剂量。在另一 个实施方案中，给予所述患者一种或多种剂量包括给予所述患者肌肉内 注射所述的一种或多种剂量。在另一个实施方案中，所述的方法进一步 包括给药后监测所述患者所述自身免疫性疾病的发展。


根据如下的描述、所附的权利要求以及附图将会更好地理解本发明 的上述及其它特征、方面以及优点，其中 图1为本发明三种物质的示意图；图2为十五种质粒的示意图，对这些质粒的预防、延迟患者的自身 免疫性疾病的发病或治疗所述疾病的效果进行了试验。发明的描述根据一个实施方案，本发明提供预防、延迟一种或多种自身免疫性 疾病发病或治疗所述疾病的物质。根据另一个实施方案中，本发明提供预防、延迟患者的一种或多种 自身免疫性疾病发病或治疗所述疾病的方法。在一个实施方案中，所述 的自身免疫性疾病为I型糖尿病。在一个优选的实施方案中，所述的方法 包括使用疫苗作为本发明的物质。本发明所述的物质与方法不单独使用 所述自身抗原的传输，以及不使用如现有方法中的免疫系统的直接作用 因子的分子。相反，本发明使用预防一种或多种类型细胞凋亡的疫苗， 该细胞能够抑制自身免疫性疾病。由于这些能够抑制自身免疫性疾病的 一种或多种类型的细胞能参与生理和免疫系统的调节，因此与现有的方 法比较，本发明的方法可最大限度地减少诱导或增强自身免疫反应的风 险。此外，由于本发明不包括给予作为所述免疫系统的直接作用因子(例 如细胞因子)的物质，因此本发明没有与此免疫系统直接作用因子相关的副作用的风险。其它的优点有，含有原始质粒DNA的遗传疫苗能够以相 对低的成本大规模生产并且不需要储存的"低温运输系统"。因此，本发明所述的物质与方法对于预防、延迟自身免疫性疾病的 发病或治疗所述疾病是经济和实用的。此外，本发明的遗传疫苗直接修 饰生物体的遗传物质，这意味着与蛋白疫苗不同，所述的生物体免疫系 统将会加工天然抗原决定簇。以下将对本发明所述的物质与方法进行详 细的描述。本发明所使用的术语"自身免疫性疾病"包括由于所述的生物体自 身的免疫系统导致的部分或全部正常细胞或组织的破坏而引发的疾病， 以及包括由于所述的生物体自身的免疫系统导致的移植到所述生物体中 的细胞或组织的破坏，该细胞或组织作为缺失或缺陷细胞或组织的替代， 例如胰岛细胞移植，或部分或全部器官移植。本发明所使用的术语"comprise"(本文译为包含、含有或包括)及其 变体如"comprising"和"comprises"意指不排除其它附加物、成分、整 体或步骤。在一个实施方案中，本发明包括能够单独、顺序或同时使用的三种 物质，其用来预防、延迟一种或多种自身免疫性疾病发病或治疗所述疾 病。所述三种物质的一种为含有多聚核苦酸序列SEQIDNO:l的DNA构 建体，其编码促凋亡蛋白BAX，并编码一种或多种自身免疫性疾病的自 身抗原。所述三种物质的另一种为含有多聚核苷酸序列SEQ ID NO:2的 DNA构建体，其编码腺病毒蛋白E3-GP19k,能够防止内质网中MHC-I 分子上的抗原出现。所述三种物质的第三种为含有多聚核苷酸序列SEQID NO:3的DNA构建体，其编码BCL-2的删减形式即本发明中所谓的ABCL-2。
本领域所属技术人员参考本发明的公开应该理解，虽然本发明已经给出了所述多聚核香酸的特定序列，例如编码所述促凋亡蛋白BAX、腺 病毒蛋白E3-GP19k以及ABCL-2的多聚核苷酸序列，本发明包括不引 起所翻译的氨基酸序列的改变的任何其它序列，以及虽可引起所翻译的 氨基酸序列改变但其改变基本上不引起所翻译的氨基酸序列使其不适 合用于本发明的预期用途的功能变化的任何其它序列。如图1所示，为本发明所述的三种物质的示意描述。如图中所示， 每种物质均包含质粒DNA构建体。物质A包含编码自身免疫性疾病的自 身抗原的多聚核苷酸的质粒构建体，例如I型糖尿病自身抗原分泌性谷氨 酸脱羧酶，其后跟随编码BAX的多聚核苷酸SEQIDNO:l。物质B包含 质粒构建体，其包含编码E3-GP19k的多聚核苷酸SEQIDNO:2，不含编 码自身免疫性疾病的自身抗原的多聚核苷酸。物质C包含质粒构建体， 其包含编码抗凋亡蛋白BCL-2的删减形式的多聚核苷酸SEQ ID NO:3， 不含编码自身免疫性疾病的自身抗原的多聚核苷酸。附图中所用的"CMV"表示细胞巨病毒启动子元件，"pA"表示多 聚腺苦酸位点，"IRES"表示来自EMCV病毒的内在的核糖体结合位点 SEQ ID NO:4。为说明本发明的优点，构建了 15种质粒并将其用做疫苗。将每种构 建克隆致载体pND2中。参见图2,给出了所述15种质粒的示意性描述，对这些质粒的预防、 延迟患者的自身免疫性疾病的发病或治疗所述疾病的效果进行了试验。如图所示，每一种质粒均在相同的启动子(CMVP)的质粒转录控制 下，来保证在每种转染细胞中的两种开放读码框架的表达。在这些含有 编码BCL-2的cDNA的质粒构建中，发现大分子cDNA可导致质粒的缺 失，因此，使用所谓的zfZ)c/-2, —种^/-2的删减形式来构建质粒。如图 2所示，所述的质粒，质粒1包含编码细胞浆GAD的cDNA， SEQ ID NO:5; 质粒2包含编码分泌性GAD(SGAD), SEQ ID NO:6;质粒3包含对照分 泌性焚光素酶，SEQ ID NO:7;质粒4包含删减人抗凋亡蛋白BCL-2 (ABCL-2)， SEQIDNO:3;质粒5包含抗凋亡蛋白BAX, SEQIDNO:l; 质粒6包含E3-GP19k， SEQ ID NO:2;质粒7-9分别包含ABCL-2(SEQ IDNO:3)与细胞浆GAD(SEQ ID NO:5)、分泌性GAD(SEQ ID NO:6)及分泌 性荧光素酶(SEQ ID NO:7)组合；质粒10-12分别包含BAX(SEQ ID NO:l) 与细胞浆GAD(SEQ ID NO:5)、分泌性GAD(SEQ ID NO:6)及分泌性荧光 素酶(SEQ ID NO:7)的组合；以及质粒13-15分别包含E3-GP19k(SEQ ID NO:2)与细胞浆GAD(SEQ ID NO:5)、分泌性GAD(SEQ ID NO:6)及分泌 性荧光素酶(SEQ ID NO:7)的组合。制备所有的质粒，使用PCR扩增所述的开放读码框架，并且用DNA 测序来检测所述的扩增产物，并证明没有突变。随后将每种构建体瞬时 转染致猿COS-7细胞中以进行细胞裂解物的免疫印记分析，此分析用于 验证正确大小的基因产物被编码(资料未显示)。其次，所述的15种质粒对非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠的作用被检测 如下。首先，使用Qiagen Endofree试剂盒(Qiagen Inc., Chatsworth， CA, US) 分离质粒DNA,将300/xg的15种质粒中每一种质粒DNA肌肉内注射到 15只4-5周龄的雌性NOD小鼠中。所述的300jUg剂量是依据生物体的重 量、相对于人类的临床用量而选择的。直到35周龄时才通过尿糖和血糖 分析来监测糖尿病的发病情况。当连续两天的血糖水平超过300mg/dl,高水平的尿糖试验阳性时， 则认为此小鼠患有糖尿病。这些试验结果如下所述。预防接种质粒1-3的35周龄小鼠的糖尿病 动物百分比范围为73-93%;预防*接种质粒4或7-9的小鼠为60-67%;预 防接种质粒5和10-12的小鼠为47-85%;以及预防接种质粒6和13-15 的小鼠为53-73%。对照动物(没有进行预防接种)糖尿病的发病率约为 93%。因此，给予300/ig单独的质粒载体或300]Lig单独的编码抗原的质粒 载体(质粒l-3)没有产生显著的抑制糖尿病作用。与未处理的小鼠比较， 预防接种质粒6-9和11的小鼠表现出具有统计学意义的显著抑制糖尿病 作用(质粒7， PO.05;质粒9, P<0.02)。此外，当与接受质粒pND2-GAD65、 质粒1或pND2-GAD65-BAX、质粒10比较时，接受pND2-E3-GP19k、 质粒6或pND2-SGAD55-BAX、质粒11的小鼠在35周龄时表现出糖尿 病发病率的显著降低(PO.04);而且当与接受pND2-GAD65、质粒1比 较时，接受pND2-GAD65-ABCL2、质粒7或pND2-SGAD55-ABCL2、质
粒8的小鼠表现出糖尿病发病率的显著降低(P0.05)。糖尿病的抑制与胰 岛的炎症反应降低有关(资料未显示)。这些结果在本文中有更加详细的描 述。预防接种包含z^c/-2的质粒(质粒4和质粒7-9)的小鼠无论共转染所 述的抗原与否，显示4-5周的糖尿病发病延迟，并且无论共转染所述的抗 原与否在35周龄时糖尿病的发病率降低(与未进行预防接种的对照小鼠 的约93%发病率比较，其为60-67%)。因此，共转染GAD自身抗原不抑 制所述的作用。除转染^a^55-Z^jc(质粒ll)外，预防接种包含6a义的质粒(质粒5和 质粒10-12)的小鼠没有表现糖尿病的抑制作用。尽管接种质粒11的小鼠 在与接种只包含6皿的质粒(质粒5)的其它小鼠在相似时间开始发生糖尿 病，但与未接种的对照小鼠的93%发病率比较，接种质粒11的小鼠在35 周龄的糖尿病发病率仅为47%(P<0.05)。预防接种含有五3-g/ /9A:的质粒6和13-15的质粒的小鼠依据共转染 所述的抗原的情况，糖尿病发病情况也不同。预防接种含有五3-砂/M而没有自身抗原的质粒6的小鼠开始发展为 糖尿病的时间延迟4-5周，并在35周龄时糖尿病发病率降低(53% vs 93%， 以未接种的对照小鼠作为对照)(P <0.05)。预防接种含有五3-gp/处与自身抗原的质粒13-15的小鼠无论是糖尿 病发病的时间延迟还是在35周龄时糖尿病发病率均表现出抑制作用。其次，通过GAD特异的ELISpot分析和血清抗同型GAD IgG的 ELISA来检测本发明所述物质的给药对糖尿病有抑制作用是否与炎症反 应Thl-样活性的抑制、及抗炎症Th2样反应的上调有关，从而确定免疫 反应的特性。所述的ELISpot分析按如下步骤进行。分离在糖尿病发病时或在非糖 尿病动物的观察终点的小鼠脾细胞。随后根据标准的厂商说明书用重组 的GAD蛋白刺激所述的细胞，并且计^:分泌IFN-7(Thl-样活性)与 IL-4(Th2样活性)的细胞。减去未进行GAD刺激而分泌所述细胞因子的 细胞数并分析结果。对于IFN-7,资料清楚地表明质粒6(单独编码 E3-GP19k)、或质粒4和质粒7-9(单独编码ABCL-2或与抗原一同编码)
产生的糖尿病抑制作用与GAD-特异活性抑制作用有关。因此，E3-19k 与ABCL-2可诱导免疫反应，其能够抑制针对0细胞的自身反应活性。奇 怪的是，SGAD55-BAX组合没有出现显著的抑制Thl-样活性。此外，单 独的SGAD55不能抑制糖尿病，但可抑制GAD-特异的Thl-样反应。对于IL-4,资料显示接受单独编码E3-GP19k的质粒6 (糖尿病抑制)、 编码SGAD55和E3-19k的质粒13 (非糖尿病抑制)及编码SGAD55和 △BCL-2的质粒8 (糖尿病抑制)的小鼠表现GAD-特异活性的增加。因此， 增加的Th2-样活性并不总是与Thl样活性和疾病的抑制相关。所述的ELISA以如下的方法进行。使用抗GAD IgG2a，b和同型IgGl 的动物血清来进行ELISA，其分别表明Thl样和Th2样活性。当与编码 BAX的质粒5比较而不与未接种的对照小鼠比较时，抗GAD IgG2a， b的 ELISA表明编码ABCL-2的三种质粒DNA(质粒4、 8和9)能够显著降低 Thl样活性。抗GAD IgGl的ELISA显示编码BAX的所有质粒DNA(质 粒5和10-12)能够降低Th2-样活性。这些资料结合在一起表明，第一，6fljc，编码促凋亡蛋白的质粒cDNA 能够用作预防自身免疫性疾病的遗传疫苗的分子佐剂，所述的疫苗例如 包含编码自身抗原分泌形式的多聚核苷酸的疫苗。第二，虽然编码 E3-GP19k或编码删减BCL-2的质粒cDNA与抗原组合作用降低，单独编 码E3-GP19k或编码删减BCL-2的质粒cDNA可抑制自身免疫性疾病。在一个实施方案中，本发明提供预防、延迟患者的一种或多种自身 免疫性疾病发病或治疗所述疾病的方法。所述的方法包括，首先选择容 易发展为所述自身免疫性疾病、正发展为所述的自身免疫性疾病、或已 经患有所述的自身免疫性疾病的患者。可使用本领域所述技术人员根据 本发明的公开能够理解的常规方法来进行所述的选择。例如，如果所述 的自身免疫性疾病是糖尿病，所述的选择可通过鉴定所述患者中抗胰岛 素或抗GAD自身抗体的存在、或者抗胰岛素和/或抗GAD自身抗体二者 的同时存在，渐增的高血糖血症的存在，尿糖的存在，所述糖尿病的遗 传性倾向的存在或者其多种的存在来实现。其次，给予所述的患者一种或多种剂量本发明的质粒构建体，所述 的质粒构建体包含编码BAX和编码自身免疫性疾病自身抗原的多聚核苷
酸，或者包含编码E3-GP19k但不编码自身免疫性疾病自身抗原的多聚核 苷酸的质粒构建体，或者包含编码抗凋亡蛋白BCL-2的删减形式但不编 码自身免疫性疾病自身抗原的多聚核苷酸质粒构建体。在一个优选的实 施方案中，所述的生物体被给予本发明的两种质粒构建体。在一个特别 优选的实施方案中，所述的生物体被给予本发明的全部三种质粒构建体。在一个优选的实施方案中，所述的质粒构建体以多个剂量给药。在 另一个优选的实施方案中，所述的剂量为约0.001mg/Kg至约10mg/Kg体 重。在另 一个优选的实施方案中，所述的剂量为约O.Olmg/Kg至约lmg/Kg 体重。在另一个优选的实施方案中，所述的剂量约为0.05mg/Kg体重。 在一个优选的实施方案中，适合成年人的剂量约为0.5mg-5mg。在一个优选的实施方案中，适合成年人的剂量约为lmg-4mg。在一 个优选的实施方案中，适合成年人的剂量约为2.5mg-3mg。在另一个优选 的实施方案中，所述的剂量每周给药约2次至约IO次。在一个特别优选 的实施方案中，所述的剂量每周给药4次。在一个特别优选的实施方案 中，所述的剂量只给药一次。可以适合的途径给药。在一个优选的实施方案中，所述的途径为肌 肉内或静l^内。此外，所述的方法包括给药后监测所述患者所述自身免疫性疾病的 发展。实施例I 糖尿病的预防根据本发明，能够延迟或预防患者中糖尿病的发病，如下例。首先， 根据循环抗胰岛素和抗GAD自身抗体的存在来选择患者。其后，给予所 述的患者肌肉内注射0.05mg/Kg体重的包含其编码促凋亡蛋白BAX的多 聚核苷酸序列SEQ ID N0:1的质粒构建体和编码SGAD的SEQ ID NO: 6 的质粒构建体或者包含编码腺病毒蛋白E3-GP19k的多聚核苷酸序列 SEQ ID N0:2的质粒构建体，或者包含编码ABCL-2的多聚核苷酸序列 SEQ ID NO:3的质粒构建体。所述的注射每周重复，共3周，同时监测循环抗胰岛素和抗GAD自
身抗体的水平。当所述的循环抗胰岛素和抗GAD自身抗体的水平恢复正 常时停止所述的治疗。尽管参照某些优选的实施方案已经对本发明做了相对详细的讨论， 但是其它的实施方案也是可能的。因此，所附权利要求的范围不受本发 明所公开的优选实施方案的限制。
序列 表SEQUENCE LISTING<110> 洛马林大学<120><130><140> <141><150> <1S1><160><170><210> <211> <212> <213><400>预防与治疗自身免疫性疾病的物质14102-1PCTto be assigned 2003-08-06US 60/401,652 2002-08-067Patentln version 3.2579 DNAHomo sapiensatggacgggtccggggagcagcccagaggcccagctctgagcagatcatgSOaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcg站tggggggg120gaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagc180g&gtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt240gccgccgtggcccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttt300tctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactg360gtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaaccatcatgggctggaca420ttggacttcctccgggagcggctgttgggctggatcc站gaccagggtggttgggacggc4B0ctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgt540ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaag579<210> 2<211> 492<212> DNA<213> Human adenovirus type 2<400> 2atgaggtacatgattttaggcttgctcgcccttgcggcagtctgcagcgc60gttgagtttaaggaaccagcttgcaatgttacattta站tcagaagctaatg站tgcact120actcttataaaatgcaccac3gaac3tg3a貼gcttattattcgccacaaagscaaaatt180ggcaagtatgctgtatatgctatttggcagccaggtgacactaacgactataatgtcaca240gtcttcc站ggtgaaaatcgtaaaacttttatgtataaatttccattttatgaaatgtgc300gatattaccatgtacatg&gcaaacagtacaagttgtggcgtgtttagag360aacactggcaccttttgttccaccgctctgcttattacagcgcttgctttggtatgtacc420ttactttatcaagcagacgcagttttattg3tgaaasg貼aatgccttga480ttttccgctt492<210> 3 <211> 599 <212> DNA <213> Homo sapiens<400> 3 atggcgcacgtggttacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccat60tataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgctaccgcggctgccgcggggcctgcg120ctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgscgacttctcc180cgccgcta_ccgccgcgacttcgccgageitgtccagccagctgcacctgacgcccttcacc240gcgcggggatgctttgccacggtggtggaggagctcttcagaactggggg300aggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggag360atgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctg420cacacctggatccaggataacggaggctgggatgcctttgtggaactgtacggccccagc480 atgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctgctcagtttggccctg540gtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtgaagtcaacatgcctg599<210> 4 <211> 619 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus<400> 4 tctagataatacgactcactatagggcgaattccccctctccctcccccccccctaacgt60tactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccac120catattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgag180cattcctaggggtctttcccctctcgccaaagg站t^caaggtctgttgaatgtcgtgaa240ggaagcagttcctctgg站gcttcttgaag3caaac祖cgtctgtagcgaccctttgcag300gcagcggaaccccccEicctggcgacaggtgcctctgcggcca^aagccaggtgtatsaga360tacacctgca站ggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggasLtagttgtggaaa420gagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaiacaaggggctgaaggatgcccsLg貼ggtac480cccattgtatgggatctgatctggggcctc.ctttacatgtgtttagtcga540ggttaaaaaacgtctaggccCCCCS3CC3Cggggscgtggttttcctttga^a站cacga600ttattatattgcctctagaS19<210> S<211> 1868<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5gagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga ccaccatggc atctccgggc tctggctttt 60ggtctttcgg gtcggaagat ggctctgggg attccgagaa tcccggcaca gcgcgagcct 1209gtgccaagt ggctcagaag ttcacgggcg gcatcggaaa caaactgtgc gccctgctct 180acggagacgc cgagaagccg gcggagagcg gcgggagcca acccccgcgg gccgccgccc 240
gg貼的ccgcctgcgcctgcgaccag站gccctgcagctgctccaaagtggatgtcaact300acgcgtttctccatgcaacagacctgctgccggcgtgtgatggagaaaggcccactttgg3S0cgtttctgcaagatgttatg貼cattttscttcagtatgtggtgaaaagtttcgatagat420c站ccasLagtgattgatttccattatcctaatgagcttct站ttggg祖ttggcagaccattgg的gaasttttgatgcattgcc貼3C33ctctaaaat540atgcaattaaaacagggcatcctagatacttcaatcaactttct3Ctggtttggatatgg600ttggattagcagcagactggctgacatcaataacatgttcacctatgaaa660ttgctccagtatttgtgcttttggaatatgtcacact站agaaatcattg720gctggccagggggctctggcgatgggatattttctcccggtctaacatgt780stgccstgstgatcgcacgctttaagatgttcccsgaagtcaa的agaaaggaatggctg840ctcttcccaggctcattgccttcacgtctgaacatagtcatttttctctc900ctgcagccttagggattggaagagacagcgtgattctgattaaatgtgat960aaatgattccatctgatcttgaaagaaggattcttgaagcgggtttgttc1020ctttcctcgtgagtgccacagctggaaccaccgtgtacggagcatttgaccccctcttag1080ctgtcgctgacatttgcaaaaagtataagatctggatgcatgtggatgcagctt卿gtg1140gatgtcccgaaaacacaagtgg3站ctg3gtggcgtggagagggccaact1200ctgtgacgtggaatcceicsc站gatg3tgggagtccctttgcagtggtctgctctcctgg1260cagaattgca3cca^aatgcsitgcctcctacctctttcagc1320aagataaacattatgacctgtcctatg3cactggagacELaggccttacagtgcggacgcc1380acgttgatgtttttaaactatggctgatgtggggactaccgggtttgaag1440cgcatgttgataaatgtttggagttggcagagtatttatacaacatcata1500gatggtgtttgatggg站gcaaatgtctgcttctggtacsL15S0ttcctccaagcttgcgtactctggaagacaatgaagagag站tgagtcgcctctcg站gg1620tggctccagt gattaaagcc agaatgatgg ccttgggaga caaggtcaat ttcttccgca aagacattga cttcctgatt gaagaaatag gctcaccaag ctgttccact tctctaggta ccggtacc .agtatggaac cacaatggtc agctaccaac 1680 t的tcatctc aaacccagcg gcaactcacc 1740 aacgccttgg acaagattta taataacctt 1800 gcgacctcga gcggccgctc gagggggggc 18601868<210> 6 <211> 1638 <212> DNA <213:> Artificial<220><223> secreted form of human GAD <400> Satgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60gcacctactt acgcgtttct ccatgcaaca gacctgctgc cggcgtgtga tggagaaagg 120cccactttgg cgtttctgca agatgttatg aacattttac ttcagtatgt ggtgaaaagt 180ttcgatagat caaccaaagt gattgatttc cattatccta atgagcttct ccaagaatat 240aattgggaat tggcagacca accacaaaat ttggaggaaa ttttgatgca ttgccaaaca 300actctaaaat atgcaattaa aacagggcat cctagatact tcaatcaact ttctactggt 360ttggatatgg ttggattagc agcagact的ctgacatcaa cagcaaatac taacatgttc 420acctatgaaa ttgctccagt atttgtgctt ttggaatatg tcacactaaa gaaaatgaga 480ga站tcattg gctggccagg gggctctggc gatgggatat tttctcccgg tggcgccata 540tctaacatgt atgccatgat gatcgcacgc tttaagaitgt tcccagaagt caaggagaaa 600ggaatggctg ctcttcccag gctcattgcc ttcacgtctg aacatagtca tttttctctc 660aagaagggag ctgcagcctt agggattgga agagacagcg tgattctgat taaatgtgat 720gagagaggga aaatgattcc atctgatctt gaaagaagga ttcttgaagc caaacagaaa 780gggtttgttc ctttcctcgt gagtgccaca gctggaacca ccgtgtacgg agcatttgac 840cccctcttagctgtcgctgatctggatgca tgtggatgca900gcttg卿tgggggattactgatgtcccgaggasisctgag tggcgtggag960gaatccacacaagatgatgg gagtcccttt gcagtggtct1020gctctcctgggggattgatgaccaaatgca tgcctcctac1080ctctttcagcttatgacctgtcctatgacactggagacaa ggccttacag1140tgcggacgccacgttgatgtttttaaactatggctgatgtggagggcaaa ggggactacc1200gggtttgsagcgcatgttgstaaatgtttgg的ttggcagagtatttata caacatcata1260aaaaaccgagaaggatatgagstgggaagcctgaggacac aaatgtctgc1320ttctggtacattcctccaagcttgcgtactctggaagacsatgaagagag aatgagtcgc1380ctctcgaaggtggctccagtgattaaagccagaatgatggagtatggaac cacaatggtc 1440agctaccaacccttgggagattcttccgcatggtcatctc 3L貼cccagcg1500aagacattgatcttcctgsttg祖gaaatag1560taataaccttgctcsccaagctgttccacttctctaggta gcgacctcga gcggccgctc1620ccggtacc1638<210> 7<211> 1271<212> DNA<213> Artificial<220><223>secreted form of Renilla luciferase <400> 7atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60gcacctactg aattcagctt aaagatgact tcgaaagttt atgeLtccstga acaaagg貼a 120cggatgataa ctggtccgca gtggtgggcc agatgtaaac aaatgaatgt tcttgattca 180tttatt站tt attatgattc agaaa站cat gcaga站atg ctgttatttt tttacatggt 240aacgcggcctcttcttatttat的cgacat gttgtgccacatattgagccagtagcgcgg300tgtattataccagatcttattggtatgggc aaatcaggcaaatctggtaatggttcttat3S0aggttacttgatatcttact gcatggtttgaacttcttaatt'taccaaag420aagatcatttttgtcggccatgattggggt gctgctttggcatttcattatagctatgag480catcaagataaLgatcaaagcaatagttcac gctgaaagtgtagtagatgtgattgaatca540tgggatgaatggcctgatattgaagaagat attgcgttgatcaaatctga600aaaatggttttggagaataacttcttcgtg gaaaccatgttgccatcaaaaatcstgaga660cagasgaatttgcagcatat cttgaaccattcaaagsgaaaggtgaagtt720cgtcgtccaacattatcatggcctcgtgaa atcccgttagtaaasggtggtaaacctgac780gttgtacaaattgttaggaattataatgct tatctacgtgcasgtgatgstttaccaaaa840atgtttattgaggattcttt tccaatgctattgttgaaggcgcc站gsag900tttcctastactgaatttgtcaaagtaaaa ggtcttcatttttcgcaagaagatgcacct9S0gatgaaatgggaa站tatatcaaatcgttc gttgagcgagttctcaaaaatgaacaataa1020ttactttggttttttatttacatttttccc gggttt站tacattttcaac1080aattttattttaactgaatatttcacaggg aacattcatatatgttgattaatttagctc1140gaactttsctctgtcatatcattttggaat attacctctttcaatgaaactttata站ca1200gtggttcaattaattaatat6LtELttat38Lt tacatttgttstgtaatsaLactcggtttta12S0ttataaaa站3127权利要求
1.包括启动子和SEQ ID NO3的多聚核苷酸序列的质粒在预防、延迟患者的一种或多种自身免疫性疾病发病或治疗所述疾病的药物制备中的用途。
2. 如权利要求1所述的用途，其中所述的药物被制备成约0.5mg-约 5mg的剂量单位。
3. 如权利要求1所述的用途，其中所述的药物被制备成约lmg-约 4mg的剂量单位。
4. 如权利要求l所述的用途，其中所述的药物被制备成约2.5mg-约 3mg的剂量单4立。
5. 如权利要求1所述的用途，其中所述的药物被制备成适合肌肉内 给药的形式。
6. 如权利要求1所述的用途，其中所述的药物被制备成适合静脉内 给药的形式。
7. 如权利要求l所述的用途，其中所述质粒诱导抗炎症Th2样免疫 反应上调。
8. 如权利要求1或7所述的用途，其中所述的自身免疫性疾病为I 型糖尿病。
9. 如权利要求8所述的用途，其中所述的I型糖尿病表现为患者的 抗胰岛素抗体或抗GAD自身抗体的存在或者抗胰岛素抗体和抗GAD自 身抗体二者的同时存在。
10. 如权利要求8所述的用途，其中所述的I型糖尿病表现为患者渐 增的高血糖症的存在。
11. 如权利要求8所述的用途，其中所述的I型糖尿病表现为患者的 尿糖的存在。
12. 如权利要求1所述的用途，其中所述自身免疫性疾病存在遗传性 倾向。
全文摘要
本发明公开了预防、延迟一种或多种自身免疫性疾病发病或治疗所述疾病的物质，所述的物质包含多聚核苷酸构建体，所述的构建体包含编码ΔBCL-2的多聚核苷酸序列。还公开了包括启动子和编码ΔBCL-2的多聚核苷酸序列的质粒在预防、延迟患者的一种或多种自身免疫性疾病发病或治疗所述疾病的药物制备中的用途。
文档编号A61K38/17GK101147807SQ200710097958
公开日2008年3月26日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年8月6日
发明者李逢春, 艾伦·P·埃舍尔 申请人:洛马林达大学