专利名称：：人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人谷胱苷肽-S-转移酶pi的新用途，具体涉及采用His-tag重组蛋白纯化技术纯化的人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症药物中的应用。二、
背景技术：
1985年，Coris首先提出全身炎症反应综合征(systemicinflammationresponsesyndrome,SIRS)是由不同疾病，包括微生物感染、创伤、烧伤等感染性疾病所引起的全身性的非特异性炎症反应，最终导致机体对炎症反应的失控。根据临床表现分为全身感染或脓毒症、败血症综合征、早期感染性休克、难治性感染性休克、多器官功能障碍综合征以及死亡6期。最近的临床资料表明，革兰氏杆菌所致全身炎症反应综合征的主要死亡原因是内毒素的作用。SIRS是一动态发展、连续的过程，治疗得当可使病情早期得到控制，避免其进一步发展。目前临床治疗措施有1、抗介质制剂治疗。目前国外巳将包括单克隆肿瘤坏死因子(TNF-a)抗体、重组人类白介素-1受体拮抗剂、TNF受体、内毒素单克隆抗体等抗炎介质应用于临床。2、CRRT治疗。通过体外循环清除血液中的代谢产物、内源性抗体、异常血浆成分及蓄积体内的药物或毒物。3、核因子-kB(NF-kB)抑制剂治疗。NF-KB抑制剂有糖皮质激素、IL-10等，糖皮质激素通过活化的糖皮质激素受体与调节它们表达的转录子结合而抑制炎症基因的表达；而IL-10可抑制与辅助T淋巴细胞1(Thl)反应相关的许多细胞因子基因的转录。4、基因治疗。利用脂质体转基因技术制成病毒疫苗传递某些必要的基因，可对抗过强的炎症反应，现己成功地给实验动物转入抗炎因子基因IL-4、IL-IO，抗氧化剂和抗蛋白酶等基因调节免疫应答，增强细胞的反应性、耐受性。目前的抗炎药物一定程度上都存在缺陷，很多药物抗炎疗效并不理想或不良反应较大，在减轻组织炎症损伤的同时亦削弱了机体免疫力，不利于炎症的治疗。提高抗炎药物的疗效和降低药物对机体正常免疫力的影响是各国科学家一直不断努力的研究目标。1961年，Boouh首先发现了谷胱苷肽-S-转移酶(GST)，该酶是由2个同源酶二聚体亚基组成的一个超基因家族，有a、ii、pi3种，在体内主要催化外源性和内源性亲电子有毒物质与谷胱苷肽结合，形成亲水性强的物质而起到解毒作用。目前研究最多的是pi亚型，已有研究表明谷胱苷肽-S-转移酶pi(GSTpi)与肿瘤的耐药性/肿瘤的发生发展有密切关系。目前尚未发现GSTpi在抗炎方面的应用。另外，未见应用重组蛋白纯化技术表达、纯化GSTpi的相关报道。三、
发明内容1、发明目的本发明的目的是提供一种人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制药中的新用途，即提供一种人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合症以及由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。2、技术方案本发明为人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合征疾病药物中的应用。本发明为人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。为了更好地理解本发明的实质，下面将用重组蛋白纯化技术得到人谷胱苷肽-S-转移酶pi(GSTpi)的方法以及GSTpi的药理药效试验的结果来说明其在制药领域中的新用途。(1)人谷胱苷肽-S-转移酶pi的表达纯化方法方法一、第一步将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素100mg/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,琼脂15g,用去离子水定容至1升，37'C振荡培养12h，挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/LLB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g,用去离子水定容至l升，37"C振摇培养16h，然后取lmL接种到100mLLB液体培养基，37t)振摇培养24h，006。。达到0.50.6时，加异丙基e-半乳糖苷至终浓度为0.4mM，继续振摇培养4h，12,500g离心10min收集菌体；第二步按每g菌体沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12,500g，4'C离心15min后取上清，上清与经结合缓冲液预平衡过的IDA-N广树脂在4'C结合40min，用以上结合缓冲液洗涤柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HC1,60mM咪唑，PH7.9的洗涤缓冲液洗涤2次，用0.5MNaCl,20rnMTris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脱缓冲液洗脱3次；第三步合并3次洗脱液上清，用0.5MNaCl,20mMTris-HC1,PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸钾，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析测定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM1(1^卩04的PBS缓冲液透析测定蛋白浓度，用凝血酶水解切割Hise标签。方法二、第一步将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素IOOrag/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨IOg，酵母提取物5g,NaCl10g,琼脂15g，用去离子水定容至1升，37'C振荡培养12h，挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/LLB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaCl10g,用去离子水定容至1升，37'C振摇培养16h，然后取1mL接种到100raLLB液体培养基，37'C振摇培养3h,OD咖达到0.50.6时，加异丙基e-半乳糖苷至终浓度为0.4mM,继续振摇培养4h，12,500g离心10min收集菌体；第二步按每g菌体沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04的PBS缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12,500g，4t)离心15min后取上清，将上清与谷胱甘肽亲和层析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C结合30min,PBS缓冲液洗涤柱3次，用含50raMTris-HC1,pH8.0,10raM谷胱甘肽的洗脱液洗脱2次。第三步合并3次洗脱液上清，用PBS缓冲液透析。(2)人谷胱苷肽-S-转移酶pi在炎症治疗中的应用①LPS是大肠杆菌内毒素的主要成分，常作为致伤剂，用于诱导动物全身炎症反应综合征。当空腹注射37.5mg/Kg的LPS时，小鼠死亡率达70%;而注射LPS后30分钟再注射2mg/kg的GSTpi，小鼠死亡率降为30%。实验证明GSTpi非常显著地对抗全身炎症反应综合征(SIRS)的致死作用，大大提高了动物的存活率。②一氧化氮(N0)含量的增加是全身炎症反应综合征(SIRS)的结果，NO在全身炎症反应中的作用是降低血压、产生氧自由基如0N000N00是NO致细胞毒性的主要物质，过量的氧化自由基导致细胞坏死、组织损伤和器官功能衰竭(邹冈等.基础神经药理学，第二版.科学出版社1999，5.)本实验测定LPS刺激后小鼠血清NO的水平。结果表明GSTpi通过抑制氧化自由基NO的增高来抵御全身反应综合征(SIRS)的发展。③髓过氧化物酶(MP0)是白细胞中的一种炎性标志物，组织中MPO活性的增加反应了白细胞的浸润。本实验测定LPS刺激后肺组织中MP0的活性。结果表明GSTpi抑制肺组织中MP0的活性，说明其阻止全身反应综合征(SIRS)的发展。④诱生型一氧化氮合酶(iN0S)是SIRS中N0产生的关键酶，巨噬细胞iN0S表达的增加是炎症发展的标志，本实验表明GSTpi能明显抑制LPS所致巨噬细胞系RAW264.7细胞iNOS的表达，表明其阻止炎症反应的发展。⑤环氧化酶-2(C0X—2)是体内前列腺素合成的限速酶，与炎症反应密切相关，本实验表明GSTpi能明显抑制LPS所致巨噬细胞系RAW264.7细胞COX—2的表达，进一步表明其阻止炎症反应的发展。3、有益效果本发明的有益效果是提供了用重组蛋白纯化技术得到的人谷胱苷肽-S-转移酶pi的新用途，为炎症的治疗特别是全身性炎症反应综合症找到了一种新型有效药物。人谷胱苷肽-S-转移酶pi在炎症治疗中的应用，不仅能有效控制炎症，避免其进一步发展；而且对机体免疫系统的影响较小；作为一种内源性蛋白，给药后不会引起免疫反应，副作用极小。四图l、His-tag重组蛋白纯化技术纯化人谷胱苷肽-S-转移酶pi图2、GSTpi对LPS所致小鼠死亡率的影响图3、GSTpi对LPS所致炎症小鼠血清中NO含量的影响图4、GSTpi对LPS所致炎症小鼠肺部MPO活性的影响图5、WesternBlotting检测GSTpi、Y7F对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS合成的抑制作用图6、WesternBlotting检测GSTpi对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2合成的抑制作用五具体实施方式实施例1、带组氨酸标签的人谷胱甘肽S-转移酶(Hise-hGSTpi)重组蛋白的纯化方法1)实验仪器及材料菌株E.coh'DH5a和E.co7iBL21(DE3)，质粒pET-28a、HisBind蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司，恒温振荡培养箱，超声破碎仪，4'C层析柜。2)实验步骤方法一第一步将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.co力'BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素100mg/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂15g，用去离子水定容至1升，36-38'C振荡培养12h,挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/LLB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g,用去离子水定容至l升，36-38'C振摇培养16h，然后取1mL接种到100mLLB液体培养基，37。C振摇培养2~4h，ODMO达到0.50.6时,加异丙基e-半乳糖苷至终浓度为0.4mM，继续振摇培养4-5h，12,500g离心10min收集菌体；第二步按每g菌体沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12,500g，4。C离心15min后取上清，上清与经结合缓冲液预平衡过的IDA-N;T树脂在4°C结合40min，用以上结合缓冲液洗涤柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HCl，60mM咪唑，PH7.9洗涤缓冲液洗涤2次，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，1M咪唑，PH7.9的洗脱缓冲液洗脱3次；第三步合并3次洗脱液上清，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，ffl7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸钾，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析测定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM10^04的PBS缓冲液透析测定蛋白浓度，用凝血酶水解切割Hise标签，获得纯化的人谷胱甘肽S-转移酶hGSTpi。方法二第一步将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.co7iBL21/DE3菌株接种于含卡那霉素IOOmg/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨IOg,酵母提取物5g，NaCl10g,琼脂15g，用去离子水定容至1升，36-38""C振荡培养12h,挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/LLB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用去离子水定容至l升，36-38'C振摇培养16h，然后取1mL接种到100raLLB液体培养基，37。C振摇培养24h，OD朋。达到0.50.6时，加异丙基P-半乳糖苷至终浓度为0.4mM,继续振摇培养4-5h,12，500g离心10min收集菌体；第二步按每g菌体沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04的PBS缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12,500g,4'C离心15min后取上清，将上清与谷胱甘肽亲和层析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C结合30min，PBS缓冲液洗涤柱3次，用含50mMTris-HC1:pH8.0，10raM谷胱甘肽的洗脱液洗脱2次。第三步合并3次洗脱液上清，用PBS缓冲液透析。3)实验结果由图l可以看出，釆用以上方法纯化得到的人谷胱甘肽S-转移酶(hGSTpi)重组蛋白纯度高、产量高，且空气氧化形成的无活性二聚体少。实施例2、GSTpi对LPS所致小鼠死亡率的影响1)实验仪器与材料LPS(Sigma)使用时用IXPBS配制，GSTpi(本实验室纯化)使用时用IXPBS配制；无菌注射器；雄性清洁级ICR小鼠购于南京医科大学。2)实验步骤取雄性20土2gICR小鼠腹腔注射LPS(37.5mg/kg)后30min，分别腹腔给药GSTpi(2mg/kg)，观察并记录LPS组和LPS+GSTpi组小鼠的存活率。3)实验结果由图1可以看出GSTpi可以提高LPS引起小鼠炎症后的存活率。LPS刺激40小时后，LPS组小鼠存活率仅有30X而腹腔给予GSTpi后，小鼠存活率提高到了60%(LPS+GSTpi组)。表l.QSTpi別t"LPS引起炎近巨后<、鼠存活^^的影响(％)0510152025303540455055606570LPS100100100958080707070707070707070LPS+GSTpi100100100957545353030303030303030动物数每组20只。实施例3、GSTpi对LPS所致炎症小鼠血清中NO含量的影响1)实验仪器与材料LPS(Sigma)使用时用1XPBS配制，GSTpi(本实验室纯化)使用时用1XPBS配制；无菌注射器；雄性清洁级ICR小鼠购于南京医科大学；NO试剂盒(硝酸还原酶法)，购于南京建成生物。2)实验步骤取雄性20士2gICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立内毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi组腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M组腹腔注射GSTpi的4M变体，分别在4、8和12小时眼眶取血采集小鼠血液样本，1000rpm/min离心取血清，参照NO试剂盒方法，检测血清中NO含量。3)实验结果由图2可以看出，LPS引起动物炎症反应后，血清中NO含量显著升高且随着LPS刺激时间的延长，NO含量持续升高。GSTpi可以抑制NO的分泌，在12小时显示了显著的抑制效果；相反，GSTpi的4M变体则不具有这种抑制作用，该组动物血清中NO含量与LPS组无显著差异。^\-__^间(h)4812LPS112.42±86.181061.11±33.921884.7±40.87LPS+GSTpi265.62±46.551123.40±64.931327.45±131.77*LPS+GSTpi4Mmutant229.80±14.461052.81±106.901688.37±100.39结果由均值土标准差表示，*P<0.05，与LPS组比较，n=5。实施例4、GSTpi对LPS所致炎症小鼠肺部MPO活性的影响1)实验仪器与材料LPS(Sigma)使用时用IXPBS配制，GSTpi(本实验室纯化)使用时用IXPBS配制；3%戊巴比妥钠；无菌注射器；雄性清洁级ICR小鼠购于南京医科大学；'MPO试剂盒，购于南京建成生物。2)实验步骤选取雄性20g左右ICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立内毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi组腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M组腹腔注射GSTpi的4M变体，分别在4、8、12和16小时麻醉动物打开胸腔，剪开左心房后经右心室注入100ml生理盐水冲洗肺部，待冲洗干净后摘取肺。玻璃匀浆器研磨后用超声破碎仪破碎细胞，参照MPO试剂盒检方法，测肺组织匀浆中MPO活性。3)实验结果由图3可以看出，LPS引起动物炎症反应后，肺部MPO活性显著升髙且随着LPS刺激时间的延长，MPO活性持续升髙。GSTpi可以抑制MP0活性，LPS刺激动物后30min腹腔注射GSTpi后动物肺部MPO活性被抑制，在4、8、12和16小时均有显著抑制效果。相反，GSTpi的4M变体的这种抑制作用要小的多，在LPS的刺激下，该组动物肺部MPO活性仍然趋于升高。表3.GSTpi对LPS所致炎症小鼠肺部MPO活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果由均值士标准差表示，**P<0.01，与LPS组比较，n=5。实施例5:WesternBlotting检测GSTpi、Y7F对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS合成的抑制作用1)实验仪器与材料电泳仪BioRad;LPS(Sigma)使用时用IXPBS配制，GSTpi(本实验室纯化)使用时用IXPBS配制，GSTpiY7F变体(本实验室纯化)使用时用IXPBS配制；培养液DMEM(GIBCO);血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7细胞系购于中科院上海细胞所。2)实验步骤将RAW264.7细胞以105个/孔的密度接种于24孔板。细胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(:02条件下培养。当细胞密度达到70-80%时，加入终浓度为100ng/ml的LPS,30分钟后，加入终浓度分别为5ug/ml的GSTpi或Y7F,以未经处理的细胞为阴性对照组。继续培养12小时后弃上清，冷PBS洗两遍，冰上裂解细胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting检测iNOS蛋白量。3)实验结果由图4可以看出未经LPS处理的细胞无iNOS表达，经LPS处理后，细胞iNOS表达量明显增高，而加入GSTpi后可显著抑制LPS诱导的iNOS的表达，且表现为剂量依赖性；但是GSTpi变体Y7F由于7位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，失去酶活，不能抑制LPS诱导的iNOS的合成。此实验结果说明GSTpi抑制NO合成的机制是通过抑制LPS诱导的iNOS的表达且其抑制作用依赖本身酶活。实施例6:WesternBlotting检测GSTpi对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2合成的抑制作用1)实验仪器与材料电泳仪BioRad;LPS(Sigma)使用时用IXPBS配制，GSTpi(本实验室纯化)使用时用IXPBS配制，培养液DMEM(GIBCO)，血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7细胞系，购于中科院上海细胞所2)实验步骤将RAW264.7细胞以105个/孔的密度接种于24孔板。细胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(]02条件下培养。当细胞密度达到70-80%时，加入终浓度为100ng/ml的LPS，分别于1、2、4、6、8、IO小时后，加入终浓度为5yg/ml的GSTpi，以未经处理的细胞为阴性对照组。继续培养12小时后弃上清，冷PBS洗两遍，冰上裂解细胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting检测COX-2蛋白量。3)实验结果由图5可以看出未经LPS处理的细胞无COX-2表达，经LPS处理后，细胞COX-2表达量明显增高，而加入GSTpi后可显著抑制LPS诱导的COX-2的表达。此实验结果说明GSTpi可通过抑制COX-2表达来抑制前列腺素的分泌，从而抑制炎症反应及组织损伤。权利要求1、人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合症疾病药物中的应用。2、人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。全文摘要本发明涉及人谷胱苷肽-S-转移酶pi的新用途，具体涉及采用His-tag重组蛋白纯化技术纯化的人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合症疾病以及由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。6xHis-tag标签分子量小，不会影响被修饰蛋白质的生理pH值，在大部分情况下不会改变被修饰蛋白质的免疫原性，结构和功能，也不会干扰蛋白的分泌；人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗炎症药物中的应用，不仅能有效控制炎症，避免其进一步发展，而且对机体免疫系统的影响较小，作为一种内源性蛋白，给药后不会引起免疫反应，副作用极小。文档编号A61K38/45GK101239184SQ20071030623公开日2008年8月13日申请日期2006年7月19日优先权日2006年7月19日发明者泓张,殷志敏,沈佳胤,宇王,兰罗申请人:南京师范大学