专利名称：显示trop-2表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和产生，以及这些 CDMAB在治疗性和诊断性方法中的用途，所述CDMAB任选地与一种 或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。
背景技术：
TROP-2是细胞表面糖蛋白，在大部分癌以及一些正常人组织中表 达。它最初被定义为两种抗人绒毛膜癌细胞系BeWo的鼠单克隆抗体识 别的分子，所述单克隆抗体识别人滋养层细胞上的抗原(Faulk 1978)。由 于其他研究者独立地发现了相同的分子，导致出现多种名称描述相同的 抗原。因此，TROP-2还被称为GA733-1和上皮糖蛋白-1 (EGP-1) (Basu 1995, Fornaro 1995)。
TROP-2基因是无内含子的基因，被认为利用RNA中间物通过同源 基因GA733-2(亦称为上皮糖蛋白-2， EpCAM和TROP-2)的逆转座 (retroposition)形成。TROP-2基因被定位于染色体lp32 (Calabrese 2001)。 TROP-2的蛋白组分分子量大约为35 kD。随着其胞外结构域的异质N-连接的糖基化，其分子量可以增加llkD至13kD。在胞外结构域存在许 多能够形成二硫桥位点的半胱氨酸残基。TROP-2是蛋白激酶C(Ca2+依 赖的蛋白激酶)的底物，已表明该胞内丝氨酸303残基被磷酸化(Basu 1995)。还表明TROP-2与抗TROP-2抗体的交联转导钙信号，其显示为 细胞质Ca2+的增加(Ripani 1998)。这些数据支持信号转导是TROP-2的 生理功能，尽管迄今为止还没有鉴定出生理学配体。最近已经表明 TROP-2表达和癌症之间的关系，因为在利用cDNA孩i阵列技术的大规模 基因表达分析中(Santin2004),鉴定出TROP-2是与正常卵巢上皮细胞相 比，在卵巢浆液性乳头状癌中过表达最高的一类基因的一员。
利用许多不同的TROP-2抗体，通过免疫组织化学(IHC)和流式细胞
13术研究，已经阐明了 TROP-2的表达谱。利用人绒毛膜癌细胞系BeWo 免疫小鼠产生抗TROP-2抗体162-25.3和162-46.2，并研究它们与一系列 肿瘤和淋巴样细胞系以及外周血单核细胞的反应性。在该研究中两种抗 体看起来均是滋养层特异性的，染色4个被测绒毛膜癌细胞系中的3个， 而在间接免疫荧光FACS分析中没有其它淋巴或者肿瘤细胞系(代表纤维 肉瘤、宫颈肉瘤、结肠癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、红白血病)被染色。 此外，没有正常外周血细胞被染色。检测抗体的福尔马林固定的石蜡-包 埋胎盘组织切片和肝、肾、脾、胸腺和淋巴结组织的冷冻正常切片的染 色。胎盘组织切片被两种抗体染色，而其他正常组织没有被染色(Lipinski 1981)。这两种抗体被严格地报告用于体外诊断研究。
利用低分化的卵巢癌OvCa4343/83的粗细胞膜制品免疫小鼠来产生 抗TROP-2抗体MOv 16。检测MOv 16与良性和恶性卵巢肿瘤的一系列 冷冻组织切片的反应性。MOv 16与54个恶性卵巢肿瘤中的31个反应， 而与16个良性卯巢肿瘤中的2个反应。在被测的5个卵巢粘液性肿瘤中， MOv 16完全不反应。还检测了 MOv 16与非卵巢恶性肿瘤冷冻切片的反 应性，其中发现MOvl6与189个乳腺癌切片中的117个以及18个肺癌 切片中的12个结合。MOvl6对被测的16个非上皮肿瘤(包括脂肪肉瘤， 软骨肉瘤，内皮瘤，组织细胞瘤和无性细胞瘤)完全不起反应。当对冷冻 的正常组织切片进行;^测时，MOvl6与乳腺、胰腺、肾和前列腺切片具 有反应性。据报道MOvl6反应性对肺、脾、皮肤、卵巢、曱状腺、腮腺、 胃、喉、子宫和结肠切片是阴性的，虽然使用的组织切片数量没有被报 道。该作者注意到使用冷冻组织切片是因为MOv 16与石蜡包埋的组织不 反应(Miotti 1987)。该抗体也只净皮才艮道用于体外i貪断研究。
利用粗细胞膜制品免疫小鼠来产生抗TROP-2抗体Rs7-3G11(RS7), 所述细胞膜制品来源于手术取出的人肺的原代鳞状细胞癌。利用IHC检 测RS7对人胂瘤和正常组织的冷冻切片的染色。RS7与40个切片中的 33个结合，所述切片代表乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、前列腺癌和鳞 状细胞癌的肿瘤。对于正常组织，RS7与乳H结肠、肾、肝、肺和前 列腺组织的20个切片中的16个结合，而脾组织的5个切片中没有一个被染色。该研究中作者注意到肿瘤的抗原密度似乎高于正常上皮组织的
(Stein 1990)。
在肿瘤和正常组织上进行了 RS7组织特异性的其他研究。在一组冷 冻肺瘤切片上检测了 RS7, RS7与77个切片中的65个结合，所述切片 代表肺、胃、肾、膀胱、结肠、乳腺、卵巢、子宫和前列腺的肿瘤。与5 个被测的淋巴瘤没有结合。在一组85个冷冻的人正常组织切片上检测了 RS7，所述切片组由总共24种组织类型组成。13种正常组织(肺、支气管、 气管、食管、结肠、肝、胰腺、肾、膀胱、皮肤、曱状腺、乳腺和前列 腺)中的39个切片被RS7染色。该研究的作者注意到在观察到阳性染色 的组织中，反应性通常限于上皮细胞，主要在导管或腺。还注意到该研 究限于冷冻切片，因为观察到RS7对福尔马林固定的石蜡-包埋的切片不 起反应(Stein 1993)。
利用合成肽免疫小鼠制备多克隆抗TROP-2抗体，所述合成肽对应 位于人TROP-2细胞质结构域169和182之间的氨基酸位置。在组织阵 列载玻片上检测多克隆抗体，所述载玻片包含福尔马林固定的人食管增 生和癌组织。55个癌样品中的IO个显示与多克隆抗体的强染色，而轻度 增生组织的染色很弱，表明表达水平可能与恶性转化有关(Nakashima 2004)。
总的说来，由不同抗TROP-2抗体得到的IHC反应模式是一致的。 癌症中的表达主要见于癌，而大部分癌是反应性的。在正常组织中，表 达看起来限于上皮来源的细胞，有一些证据表明癌的染色要强于相应正 常上皮组织的染色。
除了用于IHC研究外，抗体RS7还在体内模型中被检测，其初步实 验包括棵鼠异种移植模型中的肿瘤靶向研究。已表明静脉内注射的放射 标记的RS7在载有Calu-3 (肺腺癌)或者GW- 39 (结肠癌)肿瘤的小鼠的肿 瘤中特异积聚(Stein 1990)。还进行了进一步的研究，研究了放射标记的 RS7在异种移植系统中的生物分布并研究了 RS7作为免疫偶联物的治疗 潜能。在该研究中，在载有Calu-3人肺腺癌异种移植物的棵鼠中研究了 1311-标记的RS7 F(ab')2的治疗效果。在Calu-3细胞接种小鼠三周后，当 肺瘤达到大约0.3克-0.9克的大小时，用单次静脉内剂量的1.0 mCi
15^I-RS7-F(ab')2或者1.5 mCi ^I-RS7-F(ab')2治疗6只-7只小鼠的^L并将 其与未治疗对照小鼠的类似组作比较。1.0 mCi ^I-RS7-F(ab')2的单次剂 量导致肿瘤生长抑制大约5周，而1.5mCi ^I-RS7-F(ab')2的单次剂量导 致肿瘤消退，并且直到放射性抗体注射后第八周，平均肿瘤大小仍不超 过治疗前的大小。接受1.5 mCi ^I-RS7-F(ab')2剂量的小鼠平均体重减轻 18.7%,表明存在与治疗有关的毒性。该研究未^r测用棵RS7或者RS7 的F(ab')2片段治疗的效果(Stein 1994a)。另 一项研究在MDA-MB-468乳 腺癌异种移植模型中检测了 131I-RS7的效果。用单次静脉内剂量的250 微居里131I-RS7或者250微居里131I-Ag8 (同种型配对对照抗体)治疗数组 小鼠(每组10只)，所述小鼠载有大约0.1 cm3的MDA-MB-468肿瘤。用 单次静脉内剂量的30微克未标记的RS7或者Ag8治疗数组小鼠(每组6 只)。在用^I-RS7治疗的动物中观察到肿瘤的完全消退(除了一只动物显 示肺瘤的短暂再现)，这种现象在11周的观察期间一直持续。在"4-Ag8 治疗的小鼠中也观察到肿瘤消退，但是只观察到肿瘤消退2周至5周， 而在研究的剩余时段内肿瘤持续或者继续生长。接受未标记RS7或者Ag8 的小鼠的肿瘤生长没有被抑制，而且RS7治疗小鼠的平均肿瘤体积与Ag8 治疗小鼠相比看起来不存在任何差异。另两组小鼠(每组10只)接受稍微 更高单次剂量的275微居里131I-Rs7或者275微居里131Ag8的治疗，并且 与未治疗小鼠的类似组进行比较，所述小鼠载有更大的大约0.2 cm3-0.3 cm3的MDA-MB-468肿瘤。每周测量肿瘤体积，共15周。尽管在这个例 子中131I-RS7治疗小鼠与未治疗小鼠相比在肿瘤生长方面存在显著差异， 但是^I-RS7与Wl-Ag8治疗小鼠相比在肿瘤生长方面没有显著差异，说 明一部分效果可能归因于辐射的非特异作用。未在包含0.2 cm3-0.3 cm3 肿瘤的小鼠中检测未标记的抗体(Shih 1995)。
还有其他大量研究检测了 RS7作为免疫偶联物的效果，以试图选择 用于放射免疫治疗的最佳放射标记(Stein 2001a, Stein 2001b， Stein 2003)。还产生了 RS7的人源化形式，但是其只在临床前的异种移植模型 中作为放射偶联物被检测(Govindan2004)这些研究表现与先前描述的用 RS7的研究类似的积极效果，但是在一项研究中，即使按照先前确定的 最大耐受剂量递送力文射标记的RS7，毒性仍然存在，导致一些小鼠死亡
16(Stein 2001a)。尽管这些研究利用放射标记的RS7在小鼠实现了异种移植 肿瘤的有效治疗，但是棵RS7没有被评价。
用神经氨酸酶预处理的H3922人乳腺癌细胞免疫小鼠产生抗 TROP-2单克隆抗体BR110(如美国专利第5,850,854号所公开，参考现有 专利部分)。利用人冷冻组织样品，通过免疫组织学显示BR110与广泛范 围的人癌样品反应，包括肺、结肠、乳腺、卵巢、肾、食管、胰腺、皮 肤、肺和扁桃体的那些。没有检测人正常组织的切片。体外研究证明 BR110对人类癌细胞系H3396或者H3922没有ADCC或者CDC活性。 对人类癌细胞系在H3619、 H2987、 MCF-7、 H3396和H2981进行体外研 究，分析BR110-免疫毒素的细胞毒性。被测细胞系的ECso分别是0.06、 0.001、 0.05、 0.09和大于5 jiig/mL。没有公开棵BR110抗体的细胞毒性 数据。没有公开棵或者免疫偶联的BR110的体内数据。
已经产生了大量耙向TROP-2的其他抗体，例如MR54、 MR6和 MR23(其通过用卵巢癌细胞系Colo 316免疫小鼠产生(Stein 1994b))和抗 体T16(其通过用T24膀胱癌细胞系免疫小鼠产生(Fradet 1984))。这些抗 体的用途受限于TROP-2抗原的生化特征和细胞系以及组织表达研究。 没有关于这些抗体在体外或者体内抗癌效果的报道。RS7是在临床前癌 症模型中被检测治疗效果的唯一抗体，并且其用途限于放射性同位素的 载体。没有关于任何棵TROP-2抗体在体外或者体内的临床前癌症模型 中显示治疗效果的报告。
用作癌症疗法的单克隆抗体每个显示癌症的个体都是独特的，就 像人的身份不同一样其癌症也不同于其他癌症。尽管这样，现有疗法在 相同阶段用相同方式治疗患有相同类型癌症的所有患者。这些患者中的 至少30%在一线治疗中失败，从而导致额外的疗程以及治疗失败、转移 和最终死亡的可能性增加。优良的治疗方法应该是对于特定个体的个体 化疗法。现有唯一的个体化疗法是手术。化疗和放疗无法针对患者量体 裁衣，而手术本身在大部分情况下不足以产生治愈。
随着单克隆抗体的出现，开发个体化疗法的可能性变得更加现实， 因为每种抗体可以针对单一表位。此外，有可能制备抗体的组合，所述 组合针对表位的集合，所述集合唯一地限定出特定个体的肿瘤。在意识到癌性细胞和正常细胞之间的显著差异是癌性细胞包含对转 化细胞特异的抗原后，科学界长期以来认为可以将单克隆抗体设计为通
过特异结合这些癌症抗原特异地靶向转化细胞；因此相信单克隆抗体可 以用作消灭癌细胞的"魔力子弹"。但是，现在已经广泛意识到没有单一 的单克隆抗体可以在癌症的所有实例中起作用，并且单克隆抗体作为类 可以被用作靶向癌症治疗。根据当前公开的本发明的教导而分离的单克 隆抗体已经显示以有益于患者的方式调节癌性疾病过程，所述方式例如 通过减轻肿瘤负荷，所述分离的单克隆抗体在本文将多样地称为癌性疾 病调节抗体(CDMAB)或者"抗癌症"抗体。
目前，通常供癌症患者选择的治疗方法很少。癌症疗法的系统化方 法改善了全世界的存活率和发病率。但是，对于特定个体，这些改善的 统计数据不一定和他们个人状况的改善必然相关。
因此，如果提出方法学能够使医师独立于相同群组中的其他患者来 治疗每种肿瘤，那么这将允许使疗法仅仅针对一个人量体裁衣的独特方 法。理论上这种疗法过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足长 期感受到的需要。
过去，多克隆抗体已经被用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的 成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但很少获得持久的症状緩 解或者反应。此外，与化疗相比，缺乏再现性，也没有额外的益处。诸 如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的实体瘤也已经用人血液、黑猩猩血清、 人血浆和马血清进行治疗，但是相应的结果是不可预见和无效的。
对于实体瘤有很多单克隆抗体的临床试验。在20世纪80年代，利 用抗特异抗原或者基于組织选择性的抗体对人乳腺癌进行了至少4次临 床试验，在至少47例患者中只产生了 l例应答者。直至1998年，才有 成功的临床试验，该试—验联用了人源化抗Her2/neu抗体(赫赛汀 (Herceptii^))和顺铂。在这次试验中，评价了 37例患者的应答，其中大 约1/4具有部分应答率(partial response rate),另外1/4具有轻微或者稳定 的疾病进展。应答者中的中位进展时间(median time to progression)为8,4 个月，中位应答持续时间(median response duration )为5.3个月。
1998年赫赛汀被批准与泰素(Taxo。一线联用。临床研究结果显示，
18与只接受泰素(3个月)的组相比，接受抗体疗法加泰素(6.9个月)的患者的 中位疾病进展时间增加。中位存活时间也有轻微的增加；赫赛汀加泰素 治疗方式为22个月，泰素单独治疗方式为18个月。此外，所述抗体加 泰素联合组与单独的泰素相比，完全应答者(8%对2%)和部分应答者(34 % 对15%)的数目均有所增加。但是，用赫赛汀和泰素治疗相对于单用泰 素治疗导致更高的心脏毒发病率(分别为13%对1%)。并且，赫赛汀疗法 只对过表达(通过免疫组织化学(IHC)分析来测定)人表皮生长因子受体 2(Her2/neu)的患者和大约25%的患有转移性乳腺癌的患者有效，所述人 表皮生长因子受体2是目前还没有已知功能或者生物上重要配体的受体。 因此，对于患有乳腺癌的患者来说仍然存在远远没有得到满足的需要。 甚至那些从赫赛汀治疗获益的患者依然需要化疗，因此仍然(至少在一定 程度上)不得不面对这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及同时抗糖蛋白和糖脂靶的抗体。对 腺癌具有一定特异性的诸如17-lA的抗体，已经进行了超过60例患者的 2期临床试验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他试验中，在使用另 外的环磷酰胺的实验步骤的52例患者中，使用17-lA4又产生1例完全应 答和2例轻微应答。迄今为止，17-lA的III期临床试验没有证明其作为 III期结肠癌辅助疗法的改善功效。使用最初批准用于成像的人源化鼠单 克隆抗体也没有产生肿瘤消退。
近期才在使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究中得到一些阳性结 果。2004年，爱必妥(￡116111^@)被批准用于表达￡0 11的转移性结肠直 肠癌患者的二线治疗，所述患者对基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受 的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，爱必妥与依立替康联用 的应答率分别为23%和15%,中位疾病进展时间分别为4.1个月和6.5个 月。相同双臂II期临床研究和另一单臂研究的结果表明，单用爱必妥治 疗的应答率分别为11%和9%，中位疾病进展时间分别为1.5个月和4.2 个月。
因此，爱必妥与依立替康联合治疗在瑞士和美国，以及爱必妥单独 治疗在美国，都已经被批准作为依立替康一线疗法失败的结肠癌患者的 二线治疗。因此，类似赫赛汀，在瑞士的治疗只被批准作为单克隆抗体和化疗的联用。此外，在瑞士和美国的治疗只是被批准作为患者的二线
疗法。2004年，阿瓦斯丁(AVASTIN⑧)也被批准与静脉内基于5-氟尿嘧啶 的化疗i[关用作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果证明， 用阿瓦斯丁加5-氟尿嘧啶治疗的患者比单独用5-氟尿嘧咬治疗的患者的 中位存活时间延长(分别为20个月对16个月)。但是，还是和赫赛汀和爱 必妥一样，治疗只被批准作为与单克隆抗体和化疗的联用。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌也继续存在差 的结果。近期对于非小细胞肺癌最有希望的的结果来自II期临床试验， 其中治疗涉及偶联到细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(SGN-15; dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)与化疗剂泰素帝(Taxotere)联用。泰素帝是唯一 经FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。原始数据显示相对于单用泰素 帝，总体存活率提高。该研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15与泰 素帝联用，而剩余的1/3接受单独的泰素帝。对于接受SGN-15与泰素帝 联用的患者，中位总体存活时间为7.3个月，与"M目对，接受单独的泰素 帝的患者为5.9个月。接受SNG-15加泰素帝的患者在1年和18个月时 的总体存活率分别为29%和18%，与^目比，接受单独的泰素帝的患者 分别为24%和8%。已计划进一步的临床试验。
临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体只获得某种有限的成功。这些 抗体中几乎没有进行到临床试验，到目前为止没有一个净皮批准或者在III 期临床试验中被证明为有利结果。
缺乏对促进疾病发病机理的30,000种已知基因的产物中的相关靶标 的鉴定，阻碍了用于治疗疾病的新药的发现。在肿瘤学研究中，潜在的 药物靶标经常被选出，就因为它们在肿瘤细胞中过表达。然后，筛选如 此鉴定的靶标与大量化合物的相互作用。对于可能的抗体疗法，这些候 选化合物一般^f汁生自单克隆抗体生成的传统方法，所述方法如Kohler和 Milstein规定的基本原则(1975, Nature, 256， 495-497， Kohler和Milstein)所 述。从用抗原(例如全细胞，细胞部分，纯化抗原)免疫的小鼠收集脾细胞， 并与永生化杂交瘤伴侣融合。对所获杂交瘤细胞进行筛选，选取分泌与 所述靶标结合最紧密的抗体的杂交瘤。利用这些方法产生并根据其亲和 力选择到了许多针对癌症细胞的治疗性和诊断性抗体，包括赫赛汀和利妥昔单抗。这种策略的缺点是双重的。首先，关于组织特异性致癌过程 知识的匮乏和所获过分简单化的方法，限制了对于治疗性或者诊断性抗 体结合的合适靶标的选择，所述方法例如利用过表达选择，借此来鉴定 这些靶标。其次，以下假设不一定总是正确的，即通常与受体以最大亲 和力结合的药物分子起始或者抑制信号的可能性最高。
尽管在乳腺癌和结肠癌的治疗中取得了 一些进展，但对作为单一 药 剂或者协同治疗的有效抗体疗法的鉴定和开发已经不足以应对所有类型 的癌症。
现有专利
美国专利第5,750,102号公开了方法，其中用MHC基因转染来自患 者肿瘤的细胞，该基因可从患者的组织或细胞中克隆。然后用这些转染 的细胞免疫患者。
美国专利第4,861,581号公开了方法，其包括以下步骤获取单克隆 抗体，该抗体对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分是特异的， 对细胞外成分没有特异性；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与哺乳动 物的组织接触，该哺乳动物已接受杀伤肿瘤细胞的治疗；及，通过测量 该标记抗体与退化的肺瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的有效 性。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权人认识到恶性细胞是 这类抗原的方便来源。
美国专利第5,171,665号提供了新的抗体及其制备方法。具体地，该 专利教导单克隆抗体的制备，该抗体的性质是与人类肿瘤(例如肠和肺的 肿瘤)相关的蛋白抗原强烈结合，而与正常细胞的结合弱得多。
美国专利第5,484,596号提供了癌症治疗的方法，其包括手术切除 人癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射所述肿瘤细胞， 使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备能够抑制原发性肿瘤复发，同 时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利教导可与肿瘤细胞表面抗原反应的 单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行以及下列等等提到的，专利权 人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，该单克隆抗体对人类肿瘤 表现出活性特异的免疫治疗。
21美国专利第5,693,763号教导具有人类癌细胞特性且不依赖于来源的 上皮组织的糖蛋白抗原。
美国专利第5,783,186号涉及诱导表达Her2的细胞凋亡的抗Her2抗 体，产生该抗体的杂交瘤细胞系，用该抗体治疗癌症的方法和包括所述 抗体的药物组合物。
美国专利第5,849,876号描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞 系，该抗体是针对/人肿瘤细胞和非肿瘤细胞来源纯化的粘液素抗原。
美国专利第5,869,268号涉及生成产生特异针对所需抗原的抗体的人 类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单抗。该专 利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗HD人类单克隆抗体的制备。
美国专利第5,869,045号涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、 抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，因为该分 子可与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且还因为该抗体具有结合 后在癌细胞内内化的能力，这使其对形成抗体-药物和抗体-毒素偶联物尤 其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒性质。
美国专利第5,780,033号公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的用 途。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，所述 自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为自身抗体来自"老 年哺乳动物"，所以就不要求自身抗体实际上来自受治患者。除此之外， 该专利公开了来自老年哺乳动物的天然和单克隆抗核自身抗体及产生单 克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
美国专利第5,850,854号公开了特异性抗体BRllO，其针对 GA733-1。该专利公开了 BR110作为免疫毒素偶联物的体外功能。对于 该抗体没有公开作为棵抗体的体外功能。对于该抗体也没有公开体内功 能。
美国专利第6,653,104号要求保护免疫毒素-偶联物抗体，包括但不限 于RS7,其针对一大批抗原，所述抗原包括但不限于EGP-1。所述免疫 毒素限于具有核糖核酸酶(ribonucleolytic)活性的那些。但是，实施例只公 开了针对CD22的特异性免疫毒素-偶联抗体LL2。该申请没有^^开RS7 的体外或者体内功能。美国申请第20040001825A1号公开了针对EGP-1的特异性抗体 RS7。该申请公开了 RS7作为放射标记偶联物的体外功能。对于该抗体， 没有公开作为棵抗体的体外功能。该申请还公开了通过顺序给药》文射标 记的和未标记的偶联物而得到的RS7的体内功能。但是，该研究只限于 一例患者，不清楚任何观察到的功能是否归因于未标记的抗体。没有通 过给药棵抗体得到的RS7的体内功能。
发明概述
本申请利用美国专利第6，180，357号教导的制备患者特异性抗癌抗体 的方法，以分离编码癌性疾病调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗 体可以被制备为特异性的针对一种肿瘤，由此使得癌症治疗的个体化成 为可能。在本申请上下文中，具有细胞杀伤(细胞毒性)或者细胞生长抑制 (抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在下文中将被称作细胞毒性的。这些抗 体可用于帮助癌症的分期和诊断，并且可用于治疗肿瘤转移。还可以通 过预防性治疗利用这些抗体预防癌症。与传统药物发现规范产生的抗体 不同，利用这种方式产生的抗体可以靶向之前未显示参与恶性组织的生 长和/或存活的分子和通路。此外，这些抗体的结合亲和力满足细胞毒性 事件启始的要求，所述事件不一定顺从于更强的亲和力相互作用。此外， 将标准的化疗模式，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而 集中所述化疗剂的应用，也在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、 细胞毒性部分、酶例如生物素偶联酶、细胞因子、干扰素、靶或者报告 基团或者血原性细胞偶联从而形成抗体偶联物。CDMAB可以单独使用 或者与一种或者多种CDMAB/化疗剂联用。
个体化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来改变。可能出现的 临床情景是在肿瘤出现时获取肿瘤样品并入库。通过该样品，从预存在 的癌性疾病调节抗体组中对肿瘤进行分型。患者将会按常规分期，但是 提供的抗体可以用于对患者进一步的分期。可以用存在的抗体立即对患 者进行治疗，可以使用本文概述的方法或通过使用结合本文公开的筛选 方法的噬菌体展示文库制备对肿瘤具有特异性的抗体组。将生成的所有 抗体加入抗癌抗体文库，因为其它胂瘤可能与正在接受治疗的肿瘤具有
23一些相同的表位。按照本方法产生的抗体可用于治疗任意数量患者的癌 性疾病，所述患者具有结合这些抗体的癌症。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的疗法作为多模式治 疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌性细胞是相对无毒的事 实允许大剂量抗体组合的使用，所述组合或者单独使用，或者与常规疗 法联用。高治疗指数还允许短时程重复治疗，这将降低治疗抗性细胞出 现的可能性。
如果患者耐受治疗的初始阶段或发生转移，可以重复产生肿瘤特异 性抗体的过程用于再治疗。此外，可以将抗癌抗体与从该患者获得的红 血细胞偶联并回输用于转移的治疗。对转移性癌症很少有有效的治疗且 转移通常预示着导致死亡的不良后果。但是，转移性癌症常常是充分血 管化的且红血细胞对抗癌抗体的递送具有在肿瘤部位聚集抗体的作用。 甚至在转移前，大部分癌细胞的存活依赖于宿主的血液供应，与血红细 胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤也是有效的。可选择地，抗体可以与其它 造血细胞偶联，所述细胞例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀 伤细胞等等。
有5类抗体且各类抗体与由其重链赋予的功能关联。 一般认为由棵 抗体杀伤癌细胞是由抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖的 细胞毒性(CDC)介导的。例如鼠IgM以及IgG2a抗体可以通过与补体系 统中的C-l成分结合激活人的补体，由此激活补体活化的经典途径，该 途径可导致肿瘤裂解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体一般为IgM 和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性 细胞，由此造成单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀 伤。人的IgGl和IgG3同种型抗体均介导ADCC。
通过Fc区介导的细胞毒性需要效应细胞它们对应的受体或者蛋白， 例如NK细胞、T细胞和补体的存在。当缺乏这些效应机制时，抗体的 Fc部分是无活性的。抗体的Fc部分可能具有在体内影响抗体的药代动力 学的性质，但在体外这不是有效的。
我们测试抗体的细胞毒性分析没有显示任何效应才几制存在，并且是 在体外进行的。这些分析中没有效应细胞(NK，巨噬细胞或者T细胞)或者补体的存在。因为通过一起添加的物质可以完整的定义这些分析，所 以每种组分都可以被定性。此处使用的分析只包含靶细胞、培养基和血 清。所述靶细胞不具有效应物功能，因为它们是癌细胞或者成纤维细胞。 如果没有具有效应物功能性质的外源细胞，将不存在具有该功能的细胞 元件。所述培养基不包含补体或者任何细胞。按照供应商的描述，用于 支持耙细胞生长的血清不具有补体活性。此外，在我们自己的实-验室里 我们证实了所用血清中没有补体活性。因此，我们的工作证实了抗体的
作用完全归因于通过Fab介导的抗原结合的作用。实际上，观察到所述 耙细胞只与Fab在一起并且只与Fab相互作用，因为所述靶细胞不具有 Fc的受体。尽管与靶细胞进行实验的杂交瘤分泌完整的免疫球蛋白，但 是与所述细胞相互作用的免疫球蛋白的唯一部分就是Fal>所述Fab作为 抗原结合片段。
对于目前要求的抗体和抗原结合片段，提交的本申请已经证明了细 胞的细胞毒性，如
图1中的数据所显示。正如上面所述和此处通过客观 证据证实的，该作用完全归因于Fab与肿瘤细胞的结合。
本领域存在充分的证据证明抗体介导的细胞毒性归因于抗体与靶抗 原的直接结合，而不依赖于由Fc募集的效应机制。上述观点的最佳证据 是没有补充细胞(supplemental cells)或者补体(以正式排除那些机制)的体 外实验。已经利用完整的免疫球蛋白或者诸如F(ab)'2片段的抗原结合片 段进行这类实验。在这些类型实验中，抗体或者抗原结合片段能够直接 诱导靶细胞的凋亡，例如抗Her2和抗EGFR抗体，这两种抗体都已经得 到美国食品医药管理局(US FDA)批准用于癌症治疗。
抗体介导癌症杀伤的另一个可能机制是通过利用能够催化位于细胞 膜及其结合的糖蛋白或者糖脂中不同化学键水解的抗体，即所谓的催化
抗体o
有另外三种抗体介导的癌细胞杀伤机制。第一种机制是将抗体用作 疫苗以诱导机体产生针对驻留于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种 机制是将抗体用于靶向生长受体并干扰它们的功能或者下调该受体以有 效地使其功能丧失。第三种机制是这类抗体对细胞表面部分直接结合的 作用，这可以导致直接的细胞死亡，例如死亡受体的结合，所述死亡受体例如TRAIL Rl或者TRAIL R2，或是与诸如aVj3 3等的整合素分子结 合。
癌症药物的临床应用基于该药物在可接受的风险范围下对患者的有 益效果。在癌症治疗中，存活率通常是最重要的获益目标，但是除了延 长生命外，还存在大量其他公认的益处。在治疗对存活率没有负面影响 时，这些其他益处包括症状的减轻、防止不良事件、延长复发或者无疾 病存活的时间和延长进展时间。这些标准被普遍接受，像美国食品药品 管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物(Hirschfeld " a/., Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002)。除了这些标准 外，还充分认识到还有其他指标可以预示这些类型的益处。部分地，美 国F.D.A.授予的快速审批程序承认了存在很可能预测患者获益的替代指 标。到2003年末，有16种药物被这种程序批准，其中4种已经进入全 面审批，即，后续研究已证明如替代指标所预示的直接患者获益。确定 对实体瘤的药物作用的一个重要指标是通过测量对治疗的反应来评价肿 瘤负荷(Therasse & a/" Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤 反应评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)公布，该工作组由国际癌症专家组成。正如RECIST标准 的客观疗效显示的，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切作用的药 物易于最终对患者产生直接的益处。通常，能够更直接地评价和记录临 床前设置的肿瘤负荷。因为临床前研究可以转化成临床设置，所以在临 床前模型中延长患者存活率的药物应该有最大的预期临床效用。与临床 治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负担的药物也对疾 病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗结果中最关注 的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，显然，降低肿瘤负荷也能 导致直接的益处，并具有临床作用，其与疾病进展的延迟、生存时间的 延长或两者都有关系(Eckhardt & a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(发 展的治疗学耙化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003， pages 209-219)。
26本发明描述了 AR52A301.5的开发和使用，并且在细胞毒性分析、动 物模型未建立和建立的肿瘤生长以及延长患有癌性疾病的患者的存活时 间方面鉴定其效果。本发明代表了癌症治疗领域的进展，因为它第一次 描述了与靶分子TROP-2上存在的一个或者多个表位特异结合的物质， 所述物质作为棵抗体具有抗恶性肿瘤细胞而不是正常细胞的体外细胞毒 性质，并且所述物质作为棵抗体在人类癌症的体内模型中还直接介导肿 瘤生长的抑制和存活时间的延长。这对于任意其他先前描述的抗TROP-2 抗体是一个进展，因为没有一种显示具有相似的性质。它还提供了本领 域内的悉艮，因为其首次清楚证明了 TROP-2直接参与某些类型肿瘤的 生长和发展相关的事件。它还代表了癌症疗法的进展，因为其具有在人 类患者中表现类似抗癌性质的潜力。另 一个进展是在抗癌症抗体文库中 包含这些抗体，这将通过确定不同抗癌抗体的合适组合，提高靶向表达 不同抗原标志物的肺瘤的可能性，以便最有效的靶向和抑制所述肿瘤的 生长和发展。
总而言之，本发明教导了 AR52A301.5抗原作为治疗剂靶标的用途， 当给药时能够降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，还能够导 致-故治疗哺乳动物的存活延长本发明还教导了 CDMAB(AR52A301.5), 它的衍生物，以及其抗原结合分段和其细胞毒性诱导配体的用途，来靶 向它们的抗原以降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，并延长 具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的存活。此外，本发明还教导了在癌 性细胞中检测AR52A301.5抗原的用逸其可用于具有表达该抗原的肿瘤 的哺乳动物的诊断、疗法预测和预后。
因此，本发明的目的是利用产生抗癌性细胞的癌性疾病调节抗体 (CDMAB)的方法来分离杂交瘤细胞系和相应的由所述杂交瘤细胞系编码 的分离的单克隆抗体和其抗原结合片段，所述癌性细胞来自特定个体或 者一种或者多种特定癌细胞系，其CDMAB对癌细胞是细胞毒性的但同 时对非癌性细胞相对无毒。
本发明的另一个目的是教导癌性疾病调节抗体，其配体和其抗原结 合片段。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补 体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是它们 催化细胞化学键水解的能力的功能。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其可用于癌症诊断、 预后和监视的结合分析中。
本发明其他的目的和优点通过本发明下述的以示例和举例的方式给 出的说明、和一些实施方式将变得明显。
附图简述
图1比较了抗细胞系OCC-l、 OVAR-3和CCD-27sk的杂交瘤上清的 细胞毒性百分比和结合水平。
图2列表显示AR52A301.5和抗EGFR抗体对照对癌症和正常细胞 系的结合。该数据以高于同种型对照的倍增的平均荧光强度表示。
图3包括针对数种癌症和非癌细胞系的AR52A301.5和抗EGFR抗 体的代表性FACS直方图。
图4显示预防性BxPC-3胰腺癌才莫型中AR52A301.5对肿瘤生长的作 用。垂直线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-标准误。
图5显示预防性BxPC-3胰腺癌模型中AR52A301.5对体重的作用。 数据点表示平均值+/-标准误。
图6显示建立的BxPC-3胰腺癌模型中AR52A301.5对肿瘤生长的作 用。垂直线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-标准误。
图7显示建立的BxPC-3胰腺癌模型中AR52A301.5对体重的作用。 数据点表示平均值+/-标准误。
图8显示预防性PL45胰腺癌模型中AR52A301.5对肿瘤生长的作 用。垂直线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-标准误。
图9显示预防性PL45胰腺癌模型中AR52A301.5对存活的作用。
图10显示预防性PL45胰腺癌模型中AR52A301.5对体重的作用。 数据点表示平均值+/-标准误。图11显示预防性PC-3前列腺癌模型中AR52A301.5对肿瘤生长的 作用。垂直线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-标准误。
图12显示预防性PC-3前列腺癌;漠型中AR52A301.5对存活的作用。
图13显示预防性PC-3前列腺癌模型中AR52A301.5对体重的作用。 数据点表示平均值+/-标准误。
图14显示预防性Colo 205结肠癌才莫型中AR52A301.5对肿瘤生长的 作用。垂直线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-标准误。
图15显示预防性Colo 205结肠癌模型中AR52A301.5对体重的作 用。数据点表示平均值+/-标准误。
图16.来自MDA-MB-231细胞(泳道l)的全细胞膜部分的样品以及 来自PC-3(泳道2)和CCD-27sk(泳道3)细胞系的全细胞裂解产物的样品的 Western印迹。用AR47A6.4.2和AR52A301.5作为探针检测印迹。分子 量标记标在左侧。
图17.利用AR47A6.4.2(泳道l)和同种型对照(泳道2)与 MDA-MB-231细胞系的全细胞膜部分免疫沉淀制备的免疫复合物的 Western印迹。并且没有与MDA-MB-231的全细胞膜部分孵育的偶联抗 体的Protein G-Sepharose珠子被用作阴性对照(泳道3和4)。利用 AR47A6.4.2、 AR52A301.5 (杂交瘤上清)、IgG2a同种型对照或者不用一 抗作为探针检测复制的印迹。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE电 泳分析样品。分子量标记标在左侧。
图18.重组人TROP-2的Western印迹。各条泳道分别用 AR52A301.5(泳道l)和AR47A6.4.2(泳道3)以及同种型对照抗体(泳道2 和4)作为探针检测。
图19.在变性和非变性条件下，用AR52A301.5作为探针检测糖基化 (G)和去糖基化(D)的MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组人 TROP-2(rhTROP-2)。
图20.在变性和非变性条件下，用抗人TROP-2作为探针检测糖基 化(G)和去糖基化(D)的MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组人 TROP誦2(rhTROP-2)。图21.在变性和非变性条件下，用1B7.11IgGl同种型对照作为探 针检测糖基化(G)和去糖基化(D)的MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组 人TROP-2(rhTROP-2)。
图22.重组人TROP-2的Western印迹，利用不同的一抗溶液检测。 泳道3至7用分别与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克/mL、 500微克/mL 和1000孩￡克/mL未生物素化的AR52A301.5混合的生物素化 AR52A301.5作为探针检测。泳道9至13用分别与0.5微克/mL、 5微克 /mL 50微克/mL 500微克/mL和1000微克/mL未生物素化的AR47A6.4.2 混合的生物素化AR52A301.5作为探针检测。泳道15至19用分别与0.5 微克/mL、 5微克/mL、 50微克/mL、 500微克/mL和1000微克/mL未生 物素化的8A3B.6混合的生物素化AR52A301.5作为探针检测。泳道8和 14与阴性对照溶液孵育，并且泳道8不在第二溶液中孵育。泳道l、 2和 20只与TBST孵育。
图23.重组人TROP-2的Western印迹，利用不同的一抗溶液检测。 泳道3至7用分别与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克/mL、 500微克/mL 和1000微克/mL未生物素化的AR52A301.5混合的生物素化AR47A6.4.2 作为探针检测。泳道9至13用分别与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克 /mL、 500微克/mL和1000微克/mL未生物素化的AR47A6.4.2混合的生 物素化AR47A6.4.2作为探针检测。泳道15至19用分别与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克/mL、 500微克/mL和1000微克/mL未生物素化的 1B7.11混合的生物素化AR47A6,4.2作为探针检测。泳道8和14与阴性 对照溶液孵育，并且泳道8不在第二溶液中孵育。泳道l、 2和20只与 TBST孵育。
图24列表显示在正常人组织微阵列上AR52A301.5对阳性和阴性对 照的IHC比较。
图25显示在正常人组织微阵列中使用AR52A301.5(A)或者同种型 对照抗体(B)获得的脾组织的结合模式以及使用AR52A301.5(C)或者同种 型对照抗体(D)获得的脑组织的结合模式的代表性显微照片。放大率是 200x。图26列表显示来自不同的正常人组织微阵列的AR52A301.5对不 同人肿瘤和正常组织切片的IHC比较。图27.显示在不同的人类胂瘤组织微阵列中使用AR52A301.5(A)或 者同种型对照抗体(B)获得的乳腺肿瘤组织的结合模式和使用 AR52A301.5(C)或者同种型对照抗体(D)获得的前列腺肿瘤组织的结合模 式，以及使用AR52A301.5(E)或者同种型对照抗体(F)获得的胰腺肿瘤组 织的结合模式的代表性显微照片。放大率是200 x 。
图28列表显示来自不同的正常种属组织微阵列的AR52A301。5对不 同的人类和其他种属正常组织切片的IHC比较。
图29.显示在不同的多种属组织微阵列中使用AR52A301.5(A)或者 同种型对照抗体(B)获得的正常人类肾组织的结合模式和使用 AR52A301.5(C)或者同种型对照抗体(D)获得的正常短尾猴肾组织的结合 模式，以及使用AR52A301.5(E)或者同种型对照抗体(F)获得的正常恒河 猴组织的结合模式的代表性显微照片。放大率是200 x 。
图30. AR52A301.5的鼠科序列测定中使用的所有寡核苷酸引物(SEQ IDNOS:9-46)的序列.。
图31. AR52A301.5 Vh和Vl区RT/PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳。
图32. AR52A301.5 VH-R VH-E和VL-G的PCR集落筛选的琼脂糖 凝胶电泳。
图33. AR52A301.5 Vl氛基酸序列(SEQ ID NO:8)。图34. AR52A301.5 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
发明详述
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都 有其指定的含义。
术语"抗体"使用其最广泛的涵义，且特别包括，例如单一的单克 隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，脱免疫的、鼠科的、嵌合的或 人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、双体 (diabodies)、三体(triabodies)、免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文使用的术语"单克隆抗体"指从一群基本上同质的抗体中获得 的抗体，也就是说，包括这群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量 存在的可能的自然发生的变异。单克隆抗体针对单一抗原部位是高度特
31异性的。而且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制 剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一的决定基。除了特异性之 外，单克隆抗体在合成方面也是有优势的，其合成可以不受其他抗体的 污染。修饰语"单克隆的"指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征， 而不能解释为需要通过任何特定方法的抗体产生。例如，本文使用的单
克隆抗体可以通过由Kohler & a/.， ？Va似w， 256:495 (1975)首次描述的杂交 瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第 4,816,567号)。"单克隆抗体"也可以从噬菌体抗体文库中分离，使用的 才支术在例如Clackson & fl/" 7Vart^e， 352:624- 628 (1991)和Marks " a/， 《/. Mo/.历o/， 222:581-597 (1991)中描述过。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或 其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、 Fab'、 F(ab'》和Fv 片段；微型双体(diabodies);线形抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结 构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整"抗体指不但包含轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域
CH1、 CH2、 Ch3，还包含结合抗原的可变区的抗体。恒定结构域可以是 天然序列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列的 变体。优选地，完整抗体有一个或多个效应功能。
依据完整抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为 不同的"种类"。主要有五类完整的抗体IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM， 其中几种可进一步分成"亚类，，(同种型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为a s， e, 7和/*。 不同种类的免疫J求蛋白的三维空间结构和亚结构是^^知的。
抗体"效应功能"指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨 基酸序列变体的Fc区)的生物活性。抗体效应功能的实例包括Clq结合； 补体依赖的细胞毒作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作 用(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。 "抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用"和"ADCC"指细胞介导的反 应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如天然杀伤(NK) 细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后导致该耙细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达F(ryRIII，而 单核细胞表达Fc^I，F(ryRI1和Fc^RIIL关于造血细胞FcR表达的总结 见Ravetch and Kinet， ^""i/. i ev. 7mmw"o/ 9:457-92 (1991)464页的表3。为 了评价目标分子的ADCC活性，可以进行例如美国专利5,500,362或 5,821,337描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括外 周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，目标 分子的ADCC活性可以在体内评^f介，例如在诸如Clynes & a/. (USA) 95:652-656 (1998)中7>开的动物才莫型中。
"效应细胞"指表达一种或多种FcR、执行效应功能的白细胞。优 选地，这些细胞至少表达F(ryRIII，并执行ADCC效应功能。介导ADCC 的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细 胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。 效应细胞可以从其天然来源中分离，例如乂人本文中描述的血液或PBMC 中分离。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合于抗体Fe区的受体。优选的 FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体Cy受 体)的受体，并包括Fc7RI、 Fc7RII和Fcy RIII亚类的受体，其包括这些 受体的等位基因变体和可选择的剪接形式。FctRII受体包括Fcr^IIA ("激活性受体")和F(ryRIIB("抑制性受体")，两者的M酸序列相似， 主要不同在于其胞浆结构域。激活性受体FcyRIIA在其胞浆结构域含有 基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。抑制性受体FctRIIB在其胞浆 结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。(参见综述m. in Dagron, i ev. 7mmimo/. 15:203-234 (1997)。 FcR综述于Ravetch and
Kinet， 及ev. /m则wo/ 9:457-92(1991); Capel & a/.， /mmi/wo膨ZAo^s
4:25-34 (1994)和de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。本发 明中的术语"FcR"包括将来要被鉴定的FcR在内的其他FcR。该术语 也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer "a/., 7m附i/wo/, 117:587 (1976)和 Kim & a/" </ Tmmimo/. 24:2429 (1994》。
"补体依赖性细胞毒作用"或"CDC"指分子在补体存在下，裂解
33靶的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了关联抗 原的分子(比如，抗体)的结合而起始。为了评价补体激活，可以进行如 Gazzano-Santoro W a/" / 7mmwwo/。 Me&o^ 202:163 (1996)中描述的CDC分析。
术语"可变的"指可变结构域某些部分的序列在抗体间高度不同， 并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变化并 不是均匀分布在抗体的可变结构域内。在轻链和重链的可变结构域内， 变化集中在所谓的高度可变区的三个区域内。可变结构域内更加高度保 守的部分被称为骨架区(FR)。每个天然的重链和轻链可变结构域，包含 主要采用/5-片层构型的四个FR，其由三个高度可变区连接在一起，形成 环状连接，在一些情况下形成部分/3-片层结构。每条链的高度可变区由 FR以密切靠近的方式结合一起，并与其他链的高度可变区一起，有助于 抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat & fl/, Se^/e"ces o/iVoto'ra o/ 7mmwwo/ogzca/ /"&ms《f瘦夢《^f蛋^的#/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ))。恒定结构域并 不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应功能，例如参与抗体 在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中的作用。
本文使用的术语"高度可变区"指抗体上负责与抗原结合的氨基酸 残基。高度可变区通常包括"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例 如轻链可变结构域的氨基酸残基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及 重链可变结构域的氨基酸残基31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3); Kabat W a/， 5^wewces o/尸ratoVw o//mmwwo/og/cfl/ 7wtems,(^瘦夢《 /力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和/或"高变环"区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基 2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重链可变结构域的26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk丄Mo/. 5zo/. 196:901-917 (1987》。 "骨架区"或"FR"残基指除了本文定义的高变区残基之外的那些可变 区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为"Fab"片段的 抗原结合片段和一个残余的"Fc"片段，每个"Fab"片段都有单一的抗 原结合部位，"Fc"片段的名称反映了其易结晶的能力。抗体经胃蛋白酶处理后，产生F(ab')2片段，其有两个抗原结合部位，仍能够与抗原交联。 "Fv"是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区 域由以非共价键的方式紧密结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二 聚体构成。以这种每个可变结构域的三个高变区相互作用的构型决定 VH-VL 二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原 结合特异性。然而，即便单一的可变结构域(或只含有三个抗原特异性高 变区的一半的Fv)仍能够识别和结合抗原，虽然比完整结合位点的亲和性 低。Fab片段也含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。 Fab' 片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的tt末端多了几个氨基酸 残基，包括来自抗体4交链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中指 代Fab',其中恒定结构域的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最 初的F(ab')2抗体片段以Fab'片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他 的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任意脊推动物的抗体的"轻链，，都可以归于两种截然不同的所 谓k和X链中的一种，k和X链的分类基于其恒定结构域的氨基酸序列。 "单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vt结构域，其中 这些结构域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含VH和 结构域之间的多肽连接子，使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv 的综述参见Pltickthun in 尸/^廳co/ogy o/M "oc/o"a/爿""'6o^s(单克 隆抗体药理学)，vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer曙Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。
术语"双体(diabodies)"指带有两个抗原结合位点的小型抗体片 段，其在相同多肽链上(VjrViJ含有与轻链可变结构域(VO连接的重链可 变结构域(VH)。使用连接子，该连接子过短不能在同一条链上使两个结构 域成对，这些结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对，由此产生了 两个抗原结合位点。例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger"a/., A^/A^/. <SW. t/&4， 90:6444-6448 (1993)中对于双体作了更详细的描述。
术语"三体(triabodies)"或者"三价三聚体(trivalent trimers)"是指 3条单链抗体的组合。利用Vl或者VH结构域的氨基酸末端构建三体即，不含任何连接子序列。三体具有3个Fv头，所述多肽以环状、首尾相接 的方式排列。三体的可能构象是平面的，3个结合位点位于一个平面上， 互相成120度角。三体可以是单特异性、双特异性或者三特异性的。
"分离"抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗 体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗性用途的物质， 可能包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶质。因为抗体的天然环 境中的至少 一种组分将不存在，所以分离抗体包括重组细胞内部的原位 抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
"结合"目的抗原(例如，TROP-2抗原)的抗体是指能够对该抗原有 充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶向表达该抗原的细胞时，可以作为 治疗或诊断试剂。如果抗体是结合TROP-2的抗体，那么它通常会优先 结合TROP-2，而不是其它受体，这不包括偶然的结合，诸如非特异性的 Fc接触或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋 白有明显的交叉反应。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是 公知的，可包括但并不局限于诸如FACS、细胞ELISA和Western印迹 等分析。
如本文使用的，"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"的表述可以交替 使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为 的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内 筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。在上下文中，将 清楚地有意使用不同的指代。
"治疗"既指治疗性处理，也指预防性或防止的措施，其目的就是 预防或减緩(减轻)靶向的病理状态或病症。需要治疗的个体不仅包括那些 将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体，还包括那些已经存在 所述病症的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经被诊断为患 有该病症或可倾向于或易感于该病症。
术语"癌症"和"癌性"是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特 征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、 胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些肿瘤更多具体的实例包 括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌的胃 癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝 细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌， 唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，曱状腺癌，肝癌，肛癌，阴 茎癌，还有头颈部癌。
"化疗剂"是可用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括诸如 噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；例如白消安(busulfan)、英丙 舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替喊(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙 啶类；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、 三亚乙基硫代磷酰胺和三曱基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙 烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine);如瘤可宁 (chlorambucil),萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard) 等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、 雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas);如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、 重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素 (camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、 麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、 potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、 杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类的抗生素；曱氨碟呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二曱叶酸、氨曱喋呤、蝶罗呤、三曱 曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、辟u米噤呤、辟^鸟嘌呤类噤呤 类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱 氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁 睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表斩b雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药 物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶 酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；
37bestrabucil;比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟 氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖咬；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡 柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；锗螺 胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地 辛；达卡巴溱；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖香("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N,J.)和多西他赛(泰素帝, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥； 吉西他滨；6-硫鸟噪呤；巯嘌呤；曱氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物； 长春喊；铂；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌； 长春新碱；长春瑞滨；去曱长春碱；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；柔 红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins;卡培他滨；以及 上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或^f汙生物。调节或抑制激素对 肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，像抗雌激素药物，例如， 包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、 曲沃昔芬、雷诺昔芬、LY117018、奥那司酮、托瑞米芬(法乐通)；抗雄激 素物质，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；以 及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或^f汙生物。
用于治疗目的的"哺乳动物"指任何一种可归于哺乳类的动物，包 括人类、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物 园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选 地，本文的哺乳动物指人类。
"寡核苷酸"指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其可利用已 知的方法化学合成(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学，利用例如 发表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技术或利用Froehler & a/, M/c/. JczVfe Wm., 14:5399-5407, 1986描述的脱氧核苦H-磷酸盐中间 物)，然后用聚丙烯酰胺凝胶纯化。根据本发明，非人类(例如鼠科)免疫球蛋白的"人源化"和/或"嵌
合"形式是指包含特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片IS:(例 如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或者抗体的其他抗原结合子序歹'J)的抗体，其导
应答相对于原先抗体的降低，所述抗体还包含^源于所述非人免疫球蛋 白的再现预期效果的必需部分(例如CDR(s>抗原结合区、可变域等等)， 并同时保留与所述非人免疫球蛋白相当的结合特性。在绝大多数情况 下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，所述受者抗体的互 补决定区(CDR)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、 大鼠或兔等的非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况 下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所 替代。此外，人源化抗体可以包括既不在受者抗体也不在引入的CDR或 FR序列中的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人 源化抗体包括基本上全部的至少一个，通常是两个可变区，其中全部或 基本上全部的CDR区对应非人类免疫3求蛋白的CDR区，且全部或基本 上全部的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体也 最适宜包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc》通常是人类免疫球蛋白 的恒定区。
"脱免疫化"抗体是对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的 免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现脱免疫化。任何本领域技术 人员公知的脱免疫化技术都可以使用。例如，在发表于2000年6月15 日的WO 00/34317中，描述了 一项使抗体脱免疫原性的适当的技术。
诱导"凋亡，，的抗体是通过任意方式诱导程序化细胞死亡的抗体， 所述程序化细胞死亡可由示例但并不限于膜联蛋白V的结合、半胱天冬 酶(caspase)活性、DNA的断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或 膜嚢(称为凋亡小体)的形成的方式导致。
本文使用的"抗体诱导的细胞毒性"表示来源于杂交瘤上清或者抗 体的细胞毒作用，所述杂交瘤上清或者抗体由IDAC保藏的保藏号为 141205-03的杂交瘤产生，所述作用与结合程度不是必然相关。本说明书自始至终，杂交瘤细胞系，以及从其制备的分离的单克隆
抗体，或者用它们的固有命名法命名，AR52A301.5，或者用它们的保藏 命名(Depository Designation), ID AC 141205-03 。
本文使用的"抗体-配体"包含对靶抗原的至少一个表位显示结合特 异性的部分，其可以是完整的抗体分子、抗体片段以及具有至少一个抗 原-结合区或者其部分(即，抗体分子的可变部分)的任意分子，例如，Fv 分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、双特异抗体、融合蛋白或者任 意遗传工程化的分子，它们特异识别并结合至少 一个被分离的单克隆抗 体结合的抗原表位，所述分离的单克隆抗体由命名为IDAC 141205-03 (IDAC 141205-03抗原)的杂交瘤细胞系产生。
本文使用的"癌性疾病调节抗体，，(CDMAB)是指以有益于患者的方 式调节癌性疾病过程的单克隆抗体及其抗体-配体，例如通过降低肿瘤负 荷或者延长荷瘤个体的存活。
"CDMAB相关的结合剂"，就其广义来说，应被理解为包含但不 限于，任意形式的人或者非人抗体、抗体片段、抗体配体等等，它们竟 争性结合至少一个CDMAB靶表位。
"竟争性结合剂，，应被理解为包含任意形式的人或者非人抗体、抗 体片段、抗体配体等等，它们对于至少一个CDMAB靶表位具有结合亲 和力。
欲被治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移性瘤以及耐药性肿瘤。耐药性 肿瘤包括对单独的化疗剂治疗、单独的抗体治疗、单独的放疗或者其组 合没有应答或者具有抗性的肿瘤。耐药性肿瘤还包括看起来被这类药剂 的治疗抑制，但一直到治疗后五年、有时到十年或者更长的时间仍然复 发的肿瘤。
能够被治疗的肿瘤包括未被血管化或者基本上未被血管化的肿瘤以 及血管化的肿瘤。能够被相应治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌，肺癌， 结肠直肠癌，胰腺癌，神经胶质瘤和淋巴瘤。这类肿瘤的一些实例包括 表皮样瘤，鳞状瘤，例如头和颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳 腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非小细胞肺肿瘤在内，胰腺肿瘤，曱状 腺瘤，卵巢肿瘤和肝肿瘤。其他实例包括皮肤多发性出血性肉瘤，CNS新生物，成神经细胞瘤，毛细血管成血管细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤， 黑素瘤，胃肠癌和肾癌和肉瘤，横紋肌肉瘤，恶性胶质瘤，优选的多形 性胶质母细胞瘤和平滑肌肉瘤。
本文使用的"抗原结合区"表示识别靶抗原的分子的部分。 本文使用的"竟争性抑制"表示能够识别并结合决定簇位点，在常
Mi元体相互竟争分析中，由命名为IDAC 141205-03的杂交瘤细胞系产生 的单克隆抗体(IDAC 141205-03抗体)针对所述决定簇位点(Belanger L., Sylvestre C.和Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟争和夹心法的曱月台蛋 白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48,15)。
本文使用的"靶抗原"是IDAC 141205-03抗原或者其部分。 如本文所用，"免疫偶联物"指以化学或生物学方式与细胞毒素、 放射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂结合的诸如抗体的任何分子 或CDMAR该抗体或CDMAB可以在所述分子的任一部位与细胞毒素、 放射性试剂、抗肺瘤药或治疗剂连接，只要它能够与其靶标结合。免疫 偶联物的实例包括抗体毒素化学偶联物和抗体-毒素融合蛋白。
合适作为抗肿瘤剂的放射性试剂是本领域技术人员已知的。例如， 使用1311或者211At。利用常规技术将这些同位素与抗体结合(例如 Pedley等，Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993))。可选的，与抗体结合的抗肿瘤 剂是活化前体药物的酶。可以给药一种前体药物，所述前体药物在到达 胂瘤位点前一直保持其惰性形式，当给药抗体复合物时在肿瘤位点所述 前体药物就转变成其细胞毒素形式。实际情况下，对患者施用抗体-酶偶 联物，并使其定位于被治疗的组织区域。然后给患者施用前体药物，这 样的话前体药物在被治疗的组织区域转化成细胞毒类药物。可选的，与 抗体偶联的抗胂瘤剂是细胞因子例如白介素-2(1-2>白介素-4 (IL-4)或者 肿瘤坏死因子ce (TNF-oc)。所述抗体将细胞因子靶向至到肿瘤，这样的 话细胞因子介导肿瘤的损伤或者破坏，并且不影响其他组织。在DNA水 平利用常规重组DNA技术将细胞因子与抗体融合。还可以使用干扰素。
41本文使用的"融合蛋白"表示任意嵌合蛋白，其中抗原结合区与生 物学活性分子连接，例如，毒素，酶，荧光蛋白，发光标记物，多肽标 签，细胞因子，干扰素，靶向或者报告部分或者蛋白药物。
本发明还包括与靶向或者报告部分连接的本发明的CDMAB。靶向 部分是结合对(binding pairs)的第一个成员。例如抗肿瘤剂被偶联到这类 结合对的第二个成员，从而指向抗原-结合蛋白结合的位点。这类结合对 的一个常见实例是抗生物素蛋白和生物素。在优选的实施方式中，生物 素被偶联到本发明CDMAB的靶抗原，/人而为抗肺瘤剂或者偶J[关抗生物 素蛋白或者链霉亲和素的其他部分提供靶标。可选的，生物素或者另一 种这样的部分与本发明CDMAB的靶抗原连接，并在例如it断系统中用 作报告分子，在所述诊断系统中产生可检测信号的试剂与抗生物素蛋白 或者链霉亲和素偶联。
产生可检测信号的试剂在体内和体外可用于诊断目的。信号产生剂 产生通过外部手段可以检测的测量信号，通常是电磁辐射的测量。在很 大程度上，信号产生剂是酶或者生色团，或者通过荧光、磷光或者化合 光来发光。生色团包括在紫外或者可见区吸收光的染料，并且可以是酶 催化反应的底物或者降解产物。
此外，本发明CDMAB在本领域公知的体内和体外研究或者诊断方 法中的用途也包括在本发明的范围内。为了实现本文涉及的诊断方法， 本发明还可以包括试剂盒，所述试剂盒包含本发明的CDMAB。这类试 剂盒通过检测个体细胞中CDMAB靶抗原的过表达，可用于鉴定个体患 某种类型癌症的风险。
诊断分析试剂盒
本文涉及利用本发明的CDMAB以诊断分析试剂盒形式来确定肿瘤 的存在。通常根据一种或者多种肿瘤特异抗原的存在来检测患者的肿 瘤，所述肺瘤特异抗原例如生物样品中的蛋白和/或编码这种蛋白的多核 苷酸，所述生物样品例如血液、血清、尿液和/或肿瘤活检，所述样品从 该患者获得。所述蛋白用作表明特定肿瘤存在或者缺失的标志物，所述特定肿瘤 例如结肠、乳腺、肺或者前列腺肿瘤。还涉及所述抗原可应用于其他癌
性肿瘤的检测。结合剂的诊断分析试剂盒的内容物由本发明的CDMABs 或者CDMAB相关结合剂组成，能够检测生物样品中与所述试剂结合的 抗原水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA的 水平，所述mRNA水平也提示癌症的存在或者缺失。为了使结合试验是 诊断性的，将产生相对于正常组织中存在的抗原水平，有统计上显著意 义的抗原水平的数据，使得结合的识别可以确定无疑地诊断癌性肿瘤的 存在。按照本领域普通技术人员已知的，利用结合剂检测样品中的多肽 标志物，大量形式可用于本发明的诊断分析。例如，如Harlow和Lane i兌明的，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。还涉及前述诊断分析形式的任意和全部组合、变更或者修饰。
通常通过以下步骤确定患者中癌症的存在或者缺失(a)将患者的生 物样品与结合剂接触；(b)检测样品中与结合剂结合的多肽的水平；和(c) 将多肽水平与预先确定的临界值(cut-off value)比较。
在说明性的实施方式中，所述分析将涉及利用固定在固相支持物上 的基于CDMAB的结合剂，以结合并乂人样品的剩余部分清除所述多肽。 然后利用包含报告基团并与所述结合剂/多肽复合物特异结合的检测剂来 ;险测结合的多肽。说明性的检测剂可以包括与多肽或者抗体或者其他试 剂特异结合的基于CDMAB的结合剂，而所述多肽或者抗体或者其他试 剂与所述结合剂特异结合，例如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或者外 源凝集素。在选择性的实施方式中，可以使用竟争分析法，其中多肽用 报告基团标记，并在结合剂与样品孵育后将所述多肽结合固定的结合 剂。该样品组分抑制所述标记多肽与所述结合剂结合的程度表示所述样 品与固定结合剂的反应性。适用于这种分析的多肽包括全长肿瘤-特异性 蛋白和/或其部分，所述结合剂对该部分具有结合亲和力。
所提供的诊断试剂盒包括固相支持物，所述固相支持物可以采用本 领域普通技术人员已知的可以结合蛋白的任意材料形式。合适的实例可 以包括微量滴定板中的试验孔或者硝化纤维素膜或者其他合适的膜。此 外，支持物可以是珠子或者盘子，例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或者塑料例如聚苯乙烯或者聚氯乙烯。支持物还可以是^t性粒子或者光导纤维传
感器，例如在美国专利5,359,681中公开的那些。
本文还涉及利用本领域技术人员已知的各种技术(这在专利和科学文 献中有详尽的描述)，将结合剂固定在固相支持物上。术语"固定"是指 非共价(例如吸附)和共价连接，在本发明的上下文中，可以是试剂和支持 物上官能团的直接联接，或者是经由交联剂的连接。在优选但非限制性 的实施方式中，优选通过吸附至^f效量滴定板的孔或者膜进行的固定。通 过在合适的緩沖液中，将结合剂与固相支持物接触合适的时间可以实现 吸附。接触时间随温度而变，通常在大约1小时和大约1天之间的范围 内。
通常通过支持物与双功能试剂的起始反应实现结合剂与固相支持物 的共价连接，所述双功能试剂与支持物和官能团均发生反应，所述官能 团例如结合剂上的羟基或者氨基。例如，利用苯醌或者通过支持物上的 醛基与结合伴侣的胺以及活性氢的缩合，结合剂可以被共价连接到具有 合适聚合物涂层的支持物(参见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991 ，在A12 A13)。
本文还涉及诊断分析试剂盒采用双抗体夹心分析的形式。首先通常 将已经固定于固相支持物上的抗体(例如当前公开的CDMAB)与微量滴 定板的孔接触进行这种分析，这样的话样品内的多肽可以结合固定的抗 体。然后从固定的多肽-抗体复合物中去除未结合的样品，并添加包含报 告基团的检测剂(优选能够结合多肽上不同位点的二抗> 然后利用适于特 异性报告基团的方法来确定仍然与固相支持物结合的检测剂的量。
在一个特定实施方式中，涉及抗体被固定在如上所述的支持物上， 并利用本领域普通已知的任意合适的封闭剂(例如牛血清白蛋白或者 Tween 20 (Sigma Chemical Co.， St. Louis， Mo.))来封闭支持物上剩余的 蛋白结合位点。然后将固定的抗体与样品孵育，多肽将与所述抗体结合。 孵育前，可以用合适的稀释剂例如磷酸盐緩冲液(PBS)稀释所述样品。通 常，选择合适的接触时间(即，孵育时间)以符合足以检测样品中多肽存在 的时间要求，所述样品取自患有特异选定的肿瘤的个体。优选的，所述 接触时间实现的结合水平是结合和未结合多肽之间达到平衡时结合水平的至少大约95%。本领域普通技术人员清楚实现平衡需要的时间可以轻 易的通过分析所述时段内存在的结合水平来确定。
还涉及通过用合适的緩冲液清洗固相支持物可以去除未结合的样 品。然后向固相支持物中添加包含报告基团的二抗。然后将片企测剂与固 定的抗体-多肽复合物孵育足以检测结合多肽的时间。
随后，去除未结合的检测剂，并利用报告基团检测结合的检测剂。 用于检测报告基团的方法必需是对所选报告基团的类型特异的，例如对 于放射性基团，闪烁计数或者放射自显影方法通常是合适的。光谱方法 可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。可以利用与不同报告基团(通 常是放射性或者荧光基团或者酶)偶联的抗生物素蛋白检测生物素。通常 通过底物的添加(通常是特定的时间段> 继之以反应产物的光谱或者其他 分析来检测酶报告基团。
为了利用本发明的诊断分析试剂盒来确定癌症例如前列腺癌的存在 或者缺失，通常将从报告基团检测的信号与对应于预先确定的临界值的 信号进行比较，所述报告基团仍结合在固相支持物上。例如，用于癌症 检测的说明性临界值可以是从固定的抗体与来自非癌患者的样品孵育时 获得的平均信号。通常，如果样品产生的信号超过预定临界值大约3个 标准差，则该样品被认为是癌症阳性的。在替代实施方式中，按照Sackett 等(Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985， p. 106-7)的方法，利用Receiver Operator Curve可以 确定临^H1。在这种实施方式中，可以从真正的阳性率(即，敏感性)和假 阳性率(100%特异性)的配对曲线中确定临界值，所述曲线对应于诊断试 验结果的每种可能的临界值。曲线上最接近左上角(即，包括最大区域的 值)的临界值是最准确的临界值，如果样品产生的信号高于该方法确定的 临界值，则所述样品被认为是阳性的。或者，临界值可以沿着曲线向左 移动，以最小化假阳性率，或者向右移动，以最小化假阴性率。通常， 如果样品产生的信号超过该方法确定的临界值，则该样品被认为是癌症 阳寸生的。
本文涉及利用所述试剂盒的诊断分析将采用流动或者试纸条^^r验的 形式进行，其中结合剂被固定在诸如硝化纤维素的膜上。在流动试验中，当样品穿过膜时，样品内的多肽与固定的结合剂结合。当包含第二结合 剂的溶液流过膜时，所述标记的第二结合剂与结合剂-多肽复合物结合。 然后如上所述检测结合的第二结合剂。在试纸条检验形式中，与结合剂 结合的膜的一端浸于包含样品的溶液中。所述样品沿着膜迁移通过包含 第二结合剂的区域，然后到达固定结合剂的区域。第二结合剂在固定抗 体的区域的浓度指示癌症的存在。在结合位点产生的图谱，例如线，将 提示是阳性试验，所述图语是可见的。这种图谱的缺失指示是阴性结果。 通常，当在上述形式的双抗体夹心分析中生物样品包含足以产生阳性信 号的多肽水平时，选择固定在膜上的结合剂的量以产生视觉上可辨别的
图i普。用于当前诊断分析的优选结合剂是本文描述的目前公开的抗体、 其抗原结合片段和任意CDMAB相关的结合剂。固定在膜上的抗体的量 是能够产生诊断分析的任意量，其范围从大约25纳克至大约l微克。通 常这类试验可以用非常小量的生物样品进行。
此外，由于本发明的CDMAB具有鉴定其靶抗原的能力，所以 CDMAB可以用于实验室研究。
为了更充分的理解本文描述的发明，提供下列说明。 本发明提供特异识别和结合IDAC 141205-03抗原的CDMAB (即， IDAC 141205-03 CDMAB)。
所述分离的单克隆抗体(由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交 瘤产生)的CDMAB可以采用任何形式，只要它具有抗原结合区，所述抗 原结合区竟争性抑制杂交瘤IDAC 141205-03产生的分离的单克隆抗体与 其耙抗原的免疫特异结合。因此，与IDAC 141205-03抗体具有相同结合 特异性的任意重组蛋白(例如，融合蛋白，其中抗体与第二种蛋白例如淋 巴细胞活素或者肿瘤抑制生长因子组合)也属于本发明的范围。
在本发明的一个实施方式中，CDMAB是IDAC 141205-03抗体。 在其他实施方式中，CDMAB是抗原结合分段，其可以是具有IDAC 141205-3抗体的抗原-结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、 Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、双特异抗体、异种抗体或者任意重组 分子。本发明的CDMAB靶向于IDAC 141205-03单克隆抗体靶向的表位
46本发明的CDMAB可以被修饰，即，通过分子内的#^酸修饰，从 而产生衍生物分子。化学修饰也是可以的。通过定向突变、亲和力成熟 的方法、噬菌体展示或者链替换的修饰也是可以的。
通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基以及筛选具有所需特 征的抗原结合位点，可以修饰或者改进亲和力和特异性(例如，Yang等，J. Mol. Biol.， (1995) 254: 392-403)。 一种方法是随才几化个别残基或者残基的 组合，这样的话在相同抗原结合位点的群中，在特定位置可以发现从两 个到二十个氨基酸的亚群。或者，通过错配(errorprone)PCR方法可以在 一定的残基范围内诱导突变(例如，Hawkins等，J. Mol. Biol。， (1992) 226: 889-96)。在另一个实例中，可以在大肠杆菌的突变菌抹中传代包含重链 和轻链可变区基因的噬菌体展示载体(例如，Low等，J. Mol. Biol.， (1996) 250: 359-68)。这些诱变方法用以说明本领域技术人员已知的众多方法。
增加本发明抗体亲和力的另 一种方法是进行链洗牌(shuffling)，其中 重链或者轻链与其他重链或者轻链随机配对来产生具有更高亲和力的抗 体。所述抗体的不同CDRs也可以用其他抗体的相应CDRs来洗牌。
衍生物分子将保留所述多肽的功能性性质，即，具有这类取代的分 子将仍然允许所述多肽与IDAC 141205-03抗原或者其部分结合。
这些氨基酸取代包括在本领域中公知的"保守"氨基酸取代，但 并不局限于此。
举例来说，某些被称为"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能够在蛋 白中经常出现，但并不改变该蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已 建立的法则。
这些改变包括任一异亮氨酸(I》缬氨酸(V)和亮氨酸(L)取代任何其他 的这些疏水氛基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺 (Q)取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦 然。其他的取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和其 在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换， 丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的曱硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异 亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发 生部位氨基酸残基的明显特征是其带电，这两种氨基酸残基的不同pK的差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是"保 守的"。
实施例1
杂交瘤制备-杂交瘤细胞系AR52A301。5
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR52A301.5于2005年12月14 日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC),位于加拿大马尼托巴省 R3E 3R2温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部微生物局，保藏号为 141205-03。据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤 销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。如果该保藏不能分发活样 品，保藏物将被替换。
为了制备产生AR52A301.5抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制备冷冻 的人卵巢肿瘤组织(宫内膜样腺癌；Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASY (Qiagen， Venlo, Netherlands)佐 剂轻轻混合后备用。通过腹腔内注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂 来免疫五到七周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周，用新鲜制备 的含2百万个细胞的50-60微升抗原-佐剂腹腔注射加强AR52A301.5免 疫的小鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与
NSO-l骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆融合的上
、、善 /a 。
为了检测杂交瘤分泌的抗体是IgG,还是IgM同种型，进行ELISA 分析。将4。C包被緩沖液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐緩冲液，pH9.2-9.6)中的 浓度为2.4 /xg/ml的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L),按100jiil/孔加入ELISA 板过4艾该ELISA板用洗涤緩冲液(PBS + 0.05% Tween)洗三之按100/il/ 孔加入封闭緩冲液(5%奶洗涤緩沖液)，室温1小时，随后用洗涤緩冲液 洗三次。按100jLtl/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育l小时。该板用洗 涤緩冲液洗三次，按100jid/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化 物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含1%奶的PBS稀释)。室温孵育1小 时后，该板用洗涤緩沖液洗三次。按100/d/孔加入TMB溶液，室温孵育 1-3分钟。按50jiil/孔加入2M H2S04，终止颜色反应，用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。如图1所示，AR52A301.5杂交 瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型 分型试剂盒(HyCuIt Biotechnology, Frontstraat, Netherlands)进行分型 (isotyping)实验。向包含大鼠抗小鼠亚类特异抗体的检测条(test strip)中添 加500微升緩冲溶液。向^r测管(test tube)中添加500孩t升杂交瘤上清， 并通过温和搅拌浸没。直接利用大鼠单克隆二抗来检测捕获的小鼠免疫 球蛋白，所述大鼠单克隆二抗被偶联到胶体微粒。这两种蛋白的组合产 生用于分析同种型的可见信号。抗癌抗体AR52A301.5为IgGl, k同种 型。
经过一轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，；险测杂交瘤上清中与靶 细胞结合的抗体。检测了 2种人卵巢癌细胞系，和1种人正常皮肤细胞 系分别是OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk。除了 OCC-l以外的所有细 胞系得自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Collection, ATCC, Manassas, VA)。 OCC-l卵巢癌细胞系购自渥太华地区癌症中心 (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON)。
接种的细胞在使用前先固定。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2 的PBS洗涤三次。每孔加PBS稀释的2。/。多聚曱醛100 jLil，室温10分 钟，然后倒掉。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS再洗涤三次。 每孔加100 in 1溶于洗涤緩冲液(PBS + 0.05% Tween)的5%奶进行封闭， 室温1小时。该板用洗涤緩沖液洗三次，按75 jul/孔加入杂交瘤上清， 室温孵育l小时。用洗涤緩沖液将该板洗三次，按100 jil/孔加入辣根过 氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含1%奶的 PBS稀释)。室温孵育l小时后，该板用洗涤緩冲液洗三次，每孔加入100 ialTMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入50 m 1 2M H2S04终止反应， 用Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。如图1列表所 示，结果表示为与实验室制备(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背 景的倍数，事先已经证明该对照不与所检测的细胞系结合。来源于杂交 瘤AR52A301.5的抗体显示与卵巢癌细胞系OVCAR-3的结合。但AR52A301.5没有显示可^r测水平的与正常皮肤细胞系CCD-27sk的结 合。
进行抗体结合试验的同时，在OCC-l 、 OVCAR-3和CCD-27sk这 些细胞系上检测了杂交瘤上清的细胞毒作用。Calcein AM得自分子探针 (Molecular Probes, Eugene, OR)。按照下面列出的变化根据制造商的说明 书进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行接种。2天后，将 来自杂交瘤微量滴定板的75微升上清转移到细胞板，在5% C02培养箱 中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入IOO jul叠氮钠(NaN3)或者放线菌 酮。经过5天处理后，翻转倒空所述板的液体并吸干。通过多通道挤瓶 将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS (Dulbecco，磷酸緩冲盐)分入每个 孔中，敲3次，翻转倒空，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS 稀释的50微升荧光钩黄绿素染料添加到每个孔中，在5% C02培养箱中 37。C孵育30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板才几读板，数据用 Microsoft Excel进行分析。结果列表于图1。来源于AR52A301.5杂交瘤 的上清对OVCAR-3产生24%的特异细胞毒性。这是从阳性对照放线菌 酮得到的细胞毒性的53%。图1的结果表明AR52A301.5的细胞毒作用 与其对癌细胞类型的结合水平成正比。与OCC-l细胞相比，OVCAR-3 细胞中产生的细胞毒性水平更高，这与OVCAR-3细胞中更高的结合水平 一致。如图l所示，AR52A301.5在CCD-27sk正常细胞系中不产生细胞 毒性。已知的非特异性的细胞毒性剂放线菌酮和叠氮钠产生了预期的细 胞毒性。
实施例2 体外结合
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville， ON)中培养杂交瘤来制 备AR52A301.5单克隆抗体，每周两次收集和再接种。然后是利用蛋白G 琼月旨糖4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)的标准抗体纯化步骤。利用脱免疫、人源化、嵌合或者小 鼠的单克隆抗体也在本发明的范围内。通过流式细胞术(FACS)评价AR52A301.2与下列细胞系的结合胰 腺(BxPC-3、 AsPC-l和PL45)、结肠(DLD國1、 Lovo、 SW1116、 HT-29和 Colo-205)、乳腺(MDA-MB-468和MCF-7)、前列腺(？03和011- 145)、 肺(NCI-H520和A549)、食管(T.Tn)、曱状腺(SW579)、头和颈(FaDu)和 卵巢(OCC-l、 C-13、 OVCA-429、 Sk-OV-3、 OV2008、 Hey、 A2780國cp、 A2780-S和OVCAR-3)癌细胞系，以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888丄u) 的非癌细胞系。全部细胞系，除了大部分卵巢癌细胞系之外，均购自美 国典型培养物保藏中心(ATCC, Manassas， VA)。 C-13、 OV2008、 Hey、 A2780-cp、 A2780-S、 OCC-l和OVCA-429卵巢癌细胞系购自渥太华地 区癌症中心(Ottawa, ON)。
首先用DPBS(不含Ca"和MgW)洗涤细胞单层来制备用于FACS的细 胞。然后在37°C使用细胞离解緩沖液(INVITROGEN， Burlington, ON)从 细胞培养板移出细胞。经离心和收集后，细胞重悬于4。C的包含MgCl2、 CaCb和2。/。胎牛血清的DPBS(染色培养基)并计数，等分为合适的细胞密 度，离心以沉淀所述细胞，并在20 jiig/mL待测抗体(AR52A301.5)或者 对照抗体(同种型对照，抗EGFR)存在的条件下重悬于4'C的染色培养 基，冰上30分钟。在添加AlexaFluor546偶联的二抗前，用染色培养基 洗涤细胞一之然后在4°C添加溶于染色培养基的Alexa Fluor 546偶联抗 体30分钟。然后最后一次洗涤细胞，重悬于固定培养基(包含1.5%多聚 曱醛的染色培养基)。在使用FACSarray 系统软件(BD Biosciences, Oakville， ON)的FACSarray 上运行样品来评价细胞的流式细胞采集。 通过调节前散射(FSC)和侧散射(SSC)检测器上的电压和振幅来设置细胞 的FSC和SSC。通过运行未染色的细胞来调节荧光(Alexa-546)通道的检 测器，以便细胞具有一致的峰，中位荧光强度约为l-5单位。对于每种样 品，获得大约10,000个门控事件(染色的固定细胞)用于分析，结果显示 于图3。
图2以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。AR52A301.5抗 体的代表性直方图汇编为图3。 AR52A301.5显示与胰腺癌细胞系 BxPC-3(29.4倍)、乳腺癌细胞系MDA-MB-468(22.7倍)、头颈癌细J包系 FaDu(59.8倍)、卵巢癌细胞系OV2008、 OVAR-3和C-13(32.7倍、22.1倍和38.7倍)以及结肠癌细胞系Colo-205和DLD-1(38.6倍和82.8倍)的 强结合。在卵巢癌细胞系Hey、 OCC-1、 OVCA-429和OVCAR-3(分别是 5.9倍、17.8倍、3.4倍和22.1倍)，乳腺癌细胞系MCF-7(16.0倍)，前列 腺癌细胞系PC-3和DU-145(5.0倍和3.9倍)，食管癌细胞系T.Tn(18.6 倍)，结肠癌细胞系HT-29(6.7倍)和胰腺细胞系PL45(12.9倍)中也观察到 结合，并且观察到与肺癌细胞系NCI-H520(2.1倍)和非癌肺细胞系 Hs888丄u(2.6倍)的结合更弱。在这些条件下与来自皮肤的非癌细胞系 (CCD-27sk)的结合是检测不到的。这些数据证明AR52A301.5显示功能特 异性，因为尽管AR52A301.5与各种癌细胞系存在明显的结合，但其只存 在与 一些被测细胞系相关的细胞毒性。
实施例3
利用BxPC-3细胞的体内预防性肿瘤实验
实施例1和2证明AR52A301.5具有抗人类癌细胞系的抗癌性质，并 且在数种不同的癌症适应症中具有可检测的结合。参考图4和5， 6至8 周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于IOO微升盐水的5百万人 胰腺癌细胞(BxPC-3)。将所述小鼠随机分成3个处理组，每组5只。在 植入后当天，每组腹腔内注入稀释后体积为300孩￡升的20 mg/kg AR52A301.5测试抗体或者緩冲液对照，所述稀释使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀 释。然后在7周的时间段内以同样方式每周注射一次所述抗体和对照样 品。大约每7天用卡钳测量一次肿瘤生长，持续8周或者直到个别动物 达到加拿大动物关心委员会(CCAC)的终点。在整个研究期间每周一次 记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南处死所有的动物。
在人胰腺癌的体内预防冲莫型中AR52A301.5还预防肿瘤生长并降低 肿瘤负荷。移植后第55天，最后一次治疗给药后6天，AR52A301.5处 理组的平均肿瘤体积比緩冲液对照处理组的平均肿瘤体积小 70%(p<0.002;图4)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。图5显示的体重被用作健康状 况和发育停滞的表征。在组内，在整个研究期间对照组的体重只存在不显著的10%增加。同样，AR52A301.5处理组的体重也存在不显著的增 加；从平均19.6 g到21.2 g，增加8%。
总之，在该人胰腺癌异种移植模型中，AR52A301.5被良好耐受并且 降低肿瘤负荷。
实施例4
利用BxPC-3细胞的体内建立的肿瘤实验
为了进一步确定AR52A301.5在人胰腺癌BxPC-3模型中的效果，还 在建立的BxPC-3异种移植模型中枱r验了所述抗体。参考图6和7， 6至 8周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于IO(H鼓升盐水的5百万 人胰腺癌细胞(BxPC-3)。每周用卡钳测量肿瘤生长。当移植后33天大部 分群组的平均肿瘤体积达到85 mmS(范围/人56-11 l)时9只小鼠被随机分 配到2个处理组之一。每组腹腔内注入稀释后体积为300微升的20 mg/kg AR52A301.5测试抗体或者緩沖液对照，所述稀释使用含有2.7mMKCl、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀 释。然后按照相同方式每周给药所述抗体3次，共10次剂量，直到移植 后第53天。大约每7天用卡钳测量一次肺瘤生长，直到移植后第63天 或者个别动物达到CCAC终点。在整个研究期间每周一次记录动物的体 重。研究结束时，根据CCAC指南处死所有的动物。
在建立的人胰腺癌模型中AR52A301.5显著降低肿瘤负荷。第54无 AR52A301.5处理动物的平均肿瘤体积是对照处理动物平均肿瘤体积的 58%(p<0.002;图6)。这些结果相当于AR52A301.5的平均T/C为51%。
每周测量一次的体重被用作健康状况和发育停滞的表征。如图7所 示，研究结束时两个抗体处理组和对照之间的平均体重不存在显著差 异。此外，在整个研究期间所有组的体重都没有显著变化。
总之，在这种建立的人胰腺癌异种移植模型中，AR52A301。5被良好 耐受并且降低肿瘤负荷。AR52A301.5在人胰腺癌的预防性和建立的模型 中均显示效果。
实施例5利用PL45细胞的体内预防性肿瘤实验
实施例3和4证明AR52A301.5具有抗人胰腺癌细胞系的抗癌性质。 为了确定AR52A301.5抗另 一种人胰腺细胞系的效果，在PL45人胰^^癌 的异种移植模型中检验所述抗体。参考图8、 9和10, 8至IO周大的雌 性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于100微升PBS溶液的5百万人胰 腺癌细胞(PL45)。将所述小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入 后当天，每组腹腔内注入稀释后体积为300微升的20mg/kgAR52A301.5 测试抗体或者緩冲液对照，所述稀释使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀释。然 后在整个研究期间以同样方式每周注射一次所述抗体和对照样品。利用 卡钳大约每7天测量一次肿瘤生长。该研究在注射9次抗体后完成。在 整个研究期间每周一次记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南 处死所有的动物。
在人胰腺癌细胞的PL45体内预防模型中，AR52A301.5显著抑制肿 瘤生长。在第77天，即最后一次注射抗体后20天(图8)，当对照和抗体 处理组中几乎所有的小鼠仍然存活时，测定出与緩冲液处理组相比，利 用ARIUS抗体AR52A301.5的处理降低了 46.8%的PL45肿瘤生长 (p=0.00068， t-检验)。在第102天，即最后一次注射后45天，该研究仍 在进行，但在该时间点因为肿瘤体积已经从研究中去除了对照组的全部 小釓但是在这个时间点AR52A301.5处理组中40%的小鼠仍然存活(图 9)。
在整个研究期间没有明显的临床毒性症状。每周测量一次的体重是 健康状况和发育停滞的表征。在整个研究期间所有组的平均体重都增加 (图10)在第13天和77天之间，对照组增加的平均重量是3.39g(17.40/0) AR52A301.5处理组是2.86 g(14.5%)。在整个处理期间或者第77天，即 最后一次注射后20天，组与组之间不存在显著差异。
总之，在第77天的这种人胰腺癌异种移植模型中，AR52A301.5被 良好耐受并且显著降低肿瘤生长。与緩沖液处理相比，AR52A301.5处理 还显示增加存活。因此AR52A301.5在两种不同的人胰腺癌模型中均显示 效果。
54实施例6
利用PC-3细胞的体内预防性肺瘤实验
实施例3、 4和5证明AR52A301.5具有抗两种不同的人胰腺癌异种 移植模型的抗癌性质。为了确定AR52A302.5抗不同的人类癌症异种移植 模型的效果，还在PC-3前列腺癌异种移植模型中检验了所述抗体。参考 图11、 12和13， 8至IO周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射才直入溶于 100微升PBS溶液的5百万人前列腺癌細胞(PC-3)l将所述小鼠随机分成 2个处理组，每组10只。在植入后当天，每组腹腔内注入稀释后体积为 300微升的20 mg/kg AR52A301.5测试抗体或者緩沖液对照，所述稀释使 用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04 的稀释剂从原液浓度稀释。然后在整个研究期间以同样方式每周注射一 次所述抗体和对照样品。利用卡4甘大约每7天测量一次肿瘤生长。该研 究在注射8次抗体后完成。在整个研究期间每周一次记录动物的体重。 研究结束时，根据CCAC指南当到达终点时处死所有的动物。
在人前列腺癌的PC-3体内预防模型中，AR52A301.5抑制肿瘤生"^ 在第32天，即5次注射后(图11)，当对照和抗体处理组中几乎所有的小 鼠仍然存活时，测定出与緩冲液处理组相比，利用ARIUS抗体 AR52A301.5的处理降低了 30.9%的PC-3肿瘤生长&=0.01443, t-才企-验)。 在第47天，即最后一次注射前3天，该研究仍在进行，但在该时间点因 为肿瘤体积/损伤已经从研究中去除了对照组的全部小鼠。^f旦是，在这个 时间点AR52A301.5处理组中40%的小鼠仍然存活(图12)。
在整个研究期间没有明显的临床毒性症状。每周测量一次的体重是 健康状况和发育停滞的表征。平均体重保持相对稳定(图13)。在处理期 间和/或第32天，即5次注射后，组与组之间不存在显著差异。
总之，在这种人前列腺癌异种移植模型中，AR52A301.5被良好耐受 并且降低肿瘤生长。与对照组相比，抗体处理还显示存活益处。 AR52A301.5已经显示了抗两种不同的人类癌症适应症胰腺和前列腺的 效果。实施例7
利用Colo 205细胞的体内预防性肿瘤实验
实施例3、 4、 5和6证明AR52A301.5具有抗两种不同的人胰腺癌异 种移植模型和前列腺癌异种移植模型的抗癌性质。为了确定AR52A302.5 抗不同的人类癌症异种移植模型的效果，还在Colo 205结肠癌异种移植 模型中检验了所述抗体。参考图14和15， 8至10周大的雌性SCID小鼠 经右肋皮下注射4直入溶于IO(H敖升PBS溶液的5百万人结肠癌细胞(Colo 205)。将所述小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入后1天，每 组腹腔内注入稀释后体积为300微升的20 mg/kg AR52A301.5测试抗体 或者緩冲液对照，所述稀释使用含有2.7mMKCL lmMKH2PO伞137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀释。然后前两周每周给药 一次所述抗体和对照样品，之后3周每周给药两次。利用卡4甘大约每3-4 天测量一次肿瘤生长。该治疗在注射8次抗体后完成。在整个研究期间 当测量肿瘤时还记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南当到达 终点时处死所有的动物。
在人结肠癌的Colo205体内预防^t型中，AR52A301.5显著抑制肿瘤 生长。在第27天，即最后一次注射抗体前4天(图14),测定出与緩沖液 处理组相比，利用ARIUS抗体AR52A301.5的处理降^氐了 35.9%的Colo 205结肠肿瘤生长&=0.01872， t^企-验)。
在整个研究期间没有明显的临床毒性症状。每周测量一次的体重是 健康状况和发育停滞的表征。处理期间组与组之间的平均体重不存在显 著差异(图15)。
总之，在这种人结肠癌异种移植模型中，AR52A301.5被良好耐受并 且显著抑制肿瘤生长。AR52A301.5已经显示了抗三种不同的人类癌症适 应症胰l^、前列&泉和结肠的效果。在两种不同的人类癌症疾病的7>认 模型中均观察到治疗效果，表明该抗体在其他哺乳动物包括人的治疗中
的药理学和药物效益。 实施例8
抗体AR52A301.5与人TROP-2交叉反应的鉴定Western印迹结果表明AR52A301.5与抗体AR47A6.4。2(已知结合人 TROP-2;图16)识别的性质类似的条带发生交叉反应。为了进一步定性 AR52A301。5识别的抗原，在利用AR47A6.4.2与MDA-MB-231(MB-231) 细胞的全细胞膜部分制备的免疫复合物的Western印迹中使用 AR52A301.5抗体作为挥:针^r测。
从MB-231乳腺癌细胞的汇合培养物制备全细胞膜。从细胞团去除 培养基，并用磷酸盐緩冲液(PBS)清洗细胞。在平板振荡器上用解离緩冲 液(Gibco-BRL; Grand Island; NY)37。C解离细胞20分钟。收集细胞，并在 4°C 900g离心10分钟。离心后，通过PBS再悬浮清洗细胞沉淀并在4°C 900g再离心10分钟。然后将沉淀保存在-80。C直到需要时。为了制备细 胞膜，细胞沉淀被解冻并重悬于匀浆緩冲液中，所述緩沖液包含1片每 50 mL的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche; Laval QC),比例为每克细胞3 mL緩沖液。在水上利用polytron匀浆器对细胞悬液进行勻浆以便裂解细 胞。细胞匀浆在4。C 15,000g离心IO分钟以去除核微粒。收集上清，分 到各管中，然后在4。C 75，600g离心90分钟。小心去除上清，每个膜沉 淀重悬于大约5mL匀浆緩冲液中。汇集所有管的细胞膜沉淀，再裂解一 次，然后在4。C 75,600g离心90分钟。小心去除上清，称重沉淀。向沉 淀中添加包含1% Triton X-100的增溶緩冲液，比例为每克膜沉淀3 mL 緩冲氣通过在冰上用平台振荡器在300rpm振动1小时以溶解细胞膜。 细胞膜悬浮液在75,600g离心以沉淀不溶性物质。从管中小心去除包含溶 解膜蛋白的上清，测定蛋白浓度，-80°(:保存。
将MB-231的全细胞膜部分用1 x RIPA緩沖液稀释到1 mg/mL的蛋 白终浓度。将该样品分成两个等量部分。各部分与抗体偶联的蛋白G琼 脂糖在4匸孵育2小时，所述蛋白G琼脂糖与AR47A6.4.2或者8A3B.6 同种型对照抗体偶联。清洗后，每个抗体偶联的珠子样品被分成两个相 同的部分 一组IP样品，和一组偶联AR47A6.4.2和8A3B.6的"模拟IP" 珠子重悬于1 x非还原性SDS-PAGE样品缓沖液第二组重悬于1 x还原 性SDS-PAGE样品緩冲液。煮沸后，每种样品的相同部分上样于10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的重复泳道。SDS-PAGE之后，所述凝胶4皮 转移到PVDF膜上，并用溶于TBST的5%牛奶封闭，然后室温下与溶于封闭緩冲液的抗体AR47A6.4.2、 AR52A301.5、同种型对照抗体8A3B.6 孵育2小时，或者与不含一抗的封闭緩冲液孵育2小时。如上所述清洗 印迹，并与用封闭緩冲液稀释的辣根过氧化物酶-偶联山羊抗小鼠IgG( Fc 片段-特异性的)在室温下孵育1小时。如上所述清洗后，按照制造商的推 荐利用ECL Plus试剂显影所述印迹。该实验的结果(图17)显示抗体 AR52A301.5与被AR47A6.4.2免疫沉淀的抗原发生特异的交叉反应，并 且所述抗原与后 一抗体识别的抗原具有相同的表观分子量。该结果还显 示，当AR47A6.4.2在Western印迹中被用作探针时，通过用还原性 SDS-PAGE样品緩冲液煮沸AR47A6.4.2免疫复合物可以消除 AR47A6.4.2的交叉反应性。但是，还原条件下AR52A301.5与相同免疫 复合物的交叉反应性并没有被检测到受影响，表明两种抗体可能与相同 抗原上的不同表位发生交叉反应。尽管AR47A6.4.2识别的表位看起来是 二硫键依赖的构象表位但AR52A301.5识别的表位看起来是并不是这种 情况。
为了进一步确定抗体AR52A301.5识别的抗原的性质，利用 AR52A301.5和AR47A6.4.2作为揮:针检测非还原性SDS-PAGE条件下产 生的重组人TR0P-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN)的Western印迤该 实^r的结果显示(图18)AR47A6.4.2和AR52A301.5均特异性的与重组 TROP-2发生交叉反应。因此我们能够总结得出单克隆抗体AR52A301.5 识别的表位也包含在人TROP-2抗原内。
实施例9 去糖基化研究
为了确定糖基化对AR52A301.5结合的作用，在变性和非变性条件下 才姿照制造商的说明书(Enzymatic Deglycosylation Kit, Prozyme, San Leandro, CA)进行去糖基化反应。对于变性反应，0.4微克重组TROP-2 (rhTROP-2; R&D Systems, Minneapolis,画)或者100微克MDA- MB-231 膜蛋白(如上所述分离)用水稀释到30微升。添加10微升孵育緩沖液(5 x ， 0.25 M NaH2P04, pH 7.0)和2.5孩吏升变性液(2% SDS， 1 M /3-巯基乙醇)，并 将反应物煮沸5分钟。当反应物冷却到室温时，添加2.5微升去垢液(15%
58NP-40)和下列酶各1微升N-聚糖酶 PNGase F (> 5 U/mL)、 唾液酸酶 A (> 5 U/mL)， O-聚糖酶 (> 1.25 U/mL)、 /3(1-4)半乳糖苷酶(3 U/mL) 和i3-N-乙酰葡糖胺糖苦酶(40 U/mL)。还包括对照反应，其包含5微升 的水来替代去糖基化酶。对于非变性反应，0.4微克rhTROP-2或者100 微克MDA-MB-231膜蛋白用水稀释到35微升。添力口 IO微升孵育緩冲液 以及上面所列的酶各1微升。还包括对照反应，其包含5微升的水来替 代去糖基化酶。所有反应物在37。C孵育24小时。
去糖基化后，准备用于SDS-PAGE的反应物。向变性和非变性反应 物中分别添加16/M效升还原性或者非还原性上样緩沖液(4x)。样品煮沸 5分钟，然后冷却至室温。在四个重复的(quadruplicate) 12% SDS-PAGE 凝胶上样每种反应物各16.7微升。凝胶在150 V电泳，直到染料前沿流 出。然后在40 V过夜将蛋白转移到PVDF膜。膜用TBST(包含0.05% Tween-20的Tris緩沖盐水)制备的5%牛奶封闭1小时，然后与一抗孵育 2小时。各种一抗都用5%牛奶稀释到5微克/mL,除了抗人TROP-2以 外，其#1稀释到2孩i克/mL。印迹与AR52A301.5、抗人TROP-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN)或者1B7.11 (实验室生产)IgGl同种型对照之 一孵育。 一抗孵育以后，印迹用TBST清洗3次，每次10分钟。印迹与 用5%牛奶稀释到1:50,000的山羊抗小鼠IgG Fc HRP二抗孵育1小时， 然后用TBST清洗3次，每次10分钟。印迹利用ECL Plus Western印迹 检观'H式剂(GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)和X光显影剂显影。
图19-21分别显示用AR52A301.5>抗人TROP-2和1B7.11 IgG!同种 型对照作为探针4企测的3种印迹的结果。图19(用AR52A301.5作为探针 检测的印迹)显示与泳道1类似大小的条带。该条带在图20中检测不到(用 抗人TROP-2作为探针检测的印迹)。来自泳道2 (非变性和去糖基化的 MB-231全细胞膜部分)的样品反应条带显示转变为大约37 kDa,并且被 AR52A301J(图19)和商品化抗TROP-2抗体(图20)印迹识别，但不被同 种型对照(图21)识别。在任何印迹的泳道5或者6(变性和非去糖基化和 去糖基化的MB-231全细胞膜部分)中均未检测到条带，表明在还原条件 下所述抗体不与总细胞膜部分中的耙蛋白可检测的结合。
59在图19和20(分别用AR52A301.5和抗人TROP-2作为探针检测的印 迹)的泳道3和4(分别是非变性非去糖基化和去糖基化的rhTROP-2)中重 组人TROP-2表现为非常强、分子量非常高的条带(表观分子量大于 220kDa)，对应rhTROP-2 二硫键连接的多体。稍弱的条带出现在图19(用 AR52A301.5作为探针检测的印迹)泳道3的(非变性非去糖基化的 rhTROP- 2)大约70 kDa和泳道4(非变性和去糖基化的rhTROP-2)的大约 55kDa,对应rhTROP-2的单体形式。多体和单体条带的表观分子量分别 从大于220 kDa和70 kDa转变到小于220 kDa和55 kDa(泳道3和4>缘 于去糖基化导致的糖基丢失。在还原条件下(泳道7和8),检测到的 rhTROP-2只是更小的单体多肽，当用糖香酶混合物处理使表观分子量降 低大约20 kDa(图20)。图21(用同种型对照抗体1B7.11作为探针检测的 印迹)在任意泳道均不显示反应。
所有使用的抗人TROP-2抗体AR52A301.5和商品化的抗人TROP-2 抗体，均能识别MDA-MB-231全细胞膜制品中的人TROP-2抗原和纯化 的重组人TROP-2,无论在所述抗原用糖苷酶混合物处理之前还是之后。 该结果表明抗体可以识别非糖表位，可能是多肽表位，尽管不可能排除 结合是针对没有被该实验使用的特定糖苷酶混合物去除的糖基。
实施例10 竟争实验
为了进一步定性AR47A6.4.2和AR52A301.5的结合性质，通过 Western印迹进行抗体竟争实验以确定AR47A6.4.2和AR52A301.5是识 别TROP-2的类似表位还是不同表位。在非还原条件下，利用跨越两个 10%聚丙烯酰胺凝胶中的每个完整长度的制备孔梳将2微克重组融合多 肽(包含人TROP-2的胞外结构域和人IgGl的Fc区，由小鼠骨髓瘤细胞 系NS0 (R&D Systems, Minneapolis, MN)表达)上样于SDS-PAGE。在4。C 40V大约17小时将来自凝胶的蛋白转移到PVDF膜。室温下所述膜用溶 于TBST的5%脱脂乳在转动平台上封闭1小时。所述膜用大约20 mL TBST清洗两次，然后置于Western多扫描(multiscreen)装置，所述装置 产生二十个分离的通道，其中可以使用不同的探针溶液。之前，已经利用EZ-Link NHS-PEO固相生物素化试剂盒(Pierce， Rockford, IL)制备了生 物素化的AR47A6.4.2和AR52A301.5。通过将生物素化的AR47A6.4.2 或者生物素化的AR52A301.5与不同浓度的非生物素化抗体混合制备一 抗溶液。具体来说，在溶于TBST的3。/。脱脂乳中制备包含0.05微克/mL 生物素化AR52A301.5的溶液外加0.5微克/mL 5微克/mL 50微克/mL 500微克/mL或者1000微克/mL的非生物素化抗体。使用的非生物素化 抗体是AR52A301.5、 AR47A6.4.2和对照抗体8A3B.6 (抗蓝舌病病毒； IgG2a, k，实验室纯化)。利用上面所列的相同浓度AR52A301.5、 AR47A6.4.2和对照抗体1B7.11 (抗TNP; IgGl，k, 20 jli g/mL，实验室纯化) 制备包含0.05微克/mL生物素化AR47A6.4.2的溶氣向每个膜的两个通 道添加溶于TBST包括3%脱脂乳的阴性对照溶液。
室温下在转动平台上， 一抗溶液在膜的分离通道中孵育2小时。在 转动平台上每条通道用TBST清洗10分钟，共3次。所述膜的每条通道 使用包括0.01微克/mL过氧化物酶偶联链霉亲和素(Jackson Immunoresearch， West Grove PA)的第二溶液(溶于包含3%脱脂乳的 TBST)，除了每个膜的一条通道只使用溶于TBST的3%牛奶作为阴性对 照。室温下所述膜在转动平台上第二溶液中孵育1小时。在转动平台上 每条通道用TBST清洗10分钟，共3次。所述膜从多扫描装置移出，并 按照制造商的指导与增强的化学发光检测液(GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)赙育。然后将所述膜接触 胶片并显影。
图22和23显示抗体竟争实验的结果。在50微克/mL和更高非生物 素化AR52A301.5的浓度(1000 x过量的；图22泳道3-7)下生物素化 AR52A301.5的结合被完全抑制，而在500微克/mL和更高非生物素化 AR47A6.4.2的浓度(10000 x过量的；图23泳道9-13)下AR47A6.4.2的结 合被完全抑制。在包含lgG2a同种型对照抗体的任意样品中，生物素化 AR52A301.5的结合都不被抑制(图22泳道5-19),并且在包含IgGl同种 型对照抗体的任意样品中，生物素化AR47A6.4.2的结合也不被抑制(图 23泳道15-19)。这说明利用生物素化抗体与相同的非生物素化抗体混合 观察到的结合抑制归因于非生物素化抗体对抗原结合位点的占据，而不只是因为过量抗体的非特异性相互作用。在包含AR47A6.4.2的任意样品 中生物素化AR52A301.5的结合没有被完全抑制，并且在包含 AR52A301.5的任意样品中生物素化AR47A6.4.2的结合也没有被完全抑 制。但是在两个Western印迹中，在5微克/mL、 50微克/mL、 500微克 /mL和1000微克/mL的其他非生物素化TROP-2抗体中，各生物素化 TROP-2抗体的反应性弱于过量同种型对照抗体的相应泳ito这些结果表 明AR52A301.5的结合不阻止AR47A6.4.2与TROP-2的结合，反之亦然二 总的说来，竟争性Western印迹的结果表明AR47A6.4.2和AR52A301.5 识别的TROP-2分子的表位彼此不同，尽管一种抗体的结合影响另一种 的结合。
实施例11 人正常组织染色
进行IHC研究以定性AR52A301.5抗原在人正常组织的分布。载玻 片在冰(-20。C)丙酮中后固定10分钟，然后恢复到室温。载玻片在4。C冰 磷酸盐緩冲液(PBS)中清洗3次，每次2分钟，然后用3%过氧化氢清洗 10分钟以阻断内源过氧化物酶活性。载玻片然后用PBS清洗3次，每次 5分钟，继之以室温下在通用封闭液(Dako， Toronto, Ontario)中孵育5分 钟。AR52A301.5、抗人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35， Dako， Toronto, Ontario)、抗TROP-2克隆77220.11 (R&D System Inc., MN, USA)或者同 种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶， 一种在哺乳 动物组织中既不存在也不可诱导的酶Dako， Toronto, Ontario)用抗体稀释 緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)稀释到其工作浓度(每种抗体5微克/mL， 除了抗肌动蛋白是0.5微克/mL和商品化TROP-2是1微克/mL以外〉并 在室温下孵育过夜1小时。所述载玻片用PBS清洗3次，每次2分钟。 通过与提供的HRP偶联二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario) 在室温下30分钟观察/显现一抗的免疫反应性。在该步骤之后，用PBS 清洗所述载玻片3次，每次5分钟，随后加入DAB(3, 3'-二氨基联苯胺 四盐酸盐，Dako， Toronto, Ontario)生色团底物溶液以在室温免疫过氧化 物酶染色10分钟进行颜色反应。用自来水清洗所述载玻片以终止生色反
62应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)复染后，将所述 载玻片用梯度乙醇(75%-100%)脱水并用二曱苯清洗。用安装剂(Dako Faramount, Toronto, Ontario)在所述载3皮片上盖上盖^皮片。4吏用Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检查，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga, ON)获取并存储数字图像。由组织病理学 家对结果进行读取、评分和解释。
利用人正常组织筛选阵列(Biochain， Ca， USA)进行抗体与12种人 正常器官，卵巢、胰腺、曱状腺、脑(大脑，小脑)、肺、脾、子宫、宫颈、 心脏、皮肤和骨骼肌的结合。所述组织微阵列包含20种人正常器官；但 是，其中8种因为脱离或者背景染色是未受干扰。图24显示正常人组织 阵列AR52A301.5染色的结果概逸AR52A301.5显示对上皮组织(血管内 皮，曱状腺的嚢上皮，胰腺的腺泡和导管上皮，肺的肺泡上皮和皮肤的 表皮角质化细胞)的受限结合。所述抗体还显示对脾淋巴组织的疑似结 合，以及对脑神经组织的阴性结合(图25)。细胞定位是胞质和膜的，具 有弥散的染色模式。AR52A301.5比商品化抗TROP-2抗体显示对人正常 组织的更受限的结合。
实施例12 多肺瘤组织染色
进行IHC研究以定性AR52A301.5抗原在人类癌症中的分布。载玻 片从-80。C转移到-20。C。 1小时后，载玻片在冰(-20。C)丙酮中后固定10 分钟，然后恢复到室益载玻片在4。C冰磷酸盐緩冲液(PBS)中清洗3次， 每次2分钟，然后用3%过氧化氢清洗10分钟以阻断内源过氧化物酶活 性。载玻片然后用PBS清洗3次，每次5分钟，继之以室温下在通用封 闭液(Dako， Toronto, Ontario)中孵育5分钟。AR52A30U0、抗细胞角蛋 白7克隆OV-TL 12/30 (Dako, Toronto, Ontario)或者同种型对照抗体(针对 黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶， 一种在哺乳动物组织中既不存在 也不可i秀导的酶；Dako， Toronto, Ontario)在抗体稀释液(Dako， Toronto, Ontario)中稀释到其工作浓度(每种抗体均是5微克/mL,除了抗肌动蛋白 是0.5微克/mL和抗细胞角蛋白7是即用的以外)，并在室温下孵育1小时。所述载玻片用PBS清洗3次，每次2分钟。通过与提供的HRP偶联 二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)在室温下30分钟观察/显 现一抗的免疫反应性。在该步骤之后，用PBS清洗所述载玻片3次，每 次5分钟，随后加入DAB(3, 3'-二氨基耳关苯胺四盐酸盐，Dako， Toronto, Ontario)生色团底物溶液以在室温免疫过氧化物酶染色10分钟进行颜色 反应。用自来水清洗所述载玻片以终止生色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville, ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75%-100%) 脱水并用二曱苯清洗。用安装剂(DakoFaramount, Toronto, Ontario)在所 述载玻片上盖上盖玻片。对于胰腺阵歹U(Tri Star, Rockville, MD)进行相同 的实-睑步骤，除了下列改变以外。组织切片起初在室温下风干2小时， 用丙酮固定后再风干30分钟。内源过氧化氢利用溶于曱醇的3%过氧化 氢阻断15分钟；这步在一抗孵育后进行。
使用Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检 查，使用Northern Eclipse成4象软件(Empix, Mississauga， ON)获取并存储 数字图像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。
图26显示不同的人类肿瘤和它们对应的正常组织切片的 AR52A301.5染色结果的总结(8例结肠癌，9例卵巢癌和2例正常卵巢， 10例乳腺癌和3正常乳腺，9例肺癌和2例正常肺，13例前列腺癌和3 例正常前列腺，以及13例胰腺癌和4例正常胰腺)。所述组织分布于3 个不同的组织微阵列(Tri Star, Rockville, MD) AR52A301.5抗体分别显示 对4/8(50%> 7/9(78%> 7/10 (70%> 6/9 (67%> 12/13 (92%)和2/13 (15%) 的结肠、卵巢、乳腺、肺、前列腺和胰腺癌中等到强的结合(图27)。此 外，在3/8 (38%)、 1/9(11%)、 3/10(30%)、 3/9 (33%)和1/13 (8%)的结肠、 卵巢、乳腺、肺和胰腺癌切片中分别观察到疑似到较弱的结合。在所有 被测的肿瘤中，所述结合对胂瘤细胞是特异的。对于对应的正常组织， 抗体对2/2的卵巢和1/3的乳腺组织不显示结合。还观察到对1/2的肺和 4/4的胰腺正常组织的疑似到较弱的结合，对2/3的乳腺、1/2的肺和3/3 的前列腺正常组织的中等到强的结合。所述结合限于正常器官的上皮组 织。阳性对照抗体抗细胞角质化蛋白7或者抗肌动蛋白分别显示对上皮和肌肉组织的预期阳性结合。阴性IgG同种型对照不显示对任意被测组 织的可检测结合。
实施例13 多种属组织染色
进行IHC研究来定性AR52A301.5抗原在不同种属的冷冻正常组织 中的交叉反应性，以便选择一种临床前毒理学模型。SCID小鼠正常组织 (实^r室收集)的切片、大鼠正常组织阵列(Biochain，CA，USA)、多种属脑 阵列(Biochain， CA, USA)和多种属肝阵列(Biochain， CA， USA)从-80。C转 移到-20。C。 1小时后，所述载玻片在水(-20。C)丙酮中后固定IO分钟， 然后恢复到室温。载玻片在4。C冰磷酸盐緩冲液(PBS)中清洗3次，每次 2分钟，然后用3%过氧化氢清洗10分钟以阻断内源过氧化物酶活性。载 玻片然后用PBS清洗3;夂每次5分钟，继之以室温下在通用封闭液(Dako, Toronto, Ontario)中孵育5分钟。AR52A3015抗Grp94(Stressgen， Victoria, BC, Canada)、抗人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35， Dako, Toronto, Ontario)或 者同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶， 一种在 哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶Dako， Toronto, Ontario)用抗体 稀释緩冲液(Dako， Toronto, Ontario)稀释到其工作浓度(每种抗体5微克 /mL,除了抗肌动蛋白是0.5微克/mL以外)，并在室温下孵育1小时。所 述栽玻片用PBS清洗3;丸每次2分钟。通过与提供的HRP偶联二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)在室温下30分钟观察/显现一抗的免 疫反应性。在该步骤之后，用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟， 随后加入DAB(3， 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako, Toronto, Ontario) 生色团底物溶液以在室温免疫过氧化物酶染色10分钟进行颜色反应。用 自来水清洗所述载玻片以终止生色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75%-100%) 脱水并用二曱苯清洗。用安装剂(DakoFaramount， Toronto, Ontario)在所 述载玻片上盖上盖玻片。按照下列改良，对于人、短尾猴、兔、仓鼠和 恒河猴个体切片(Biochain， Ca, USA)进行相同的实验步骤。第一步，所 述组织切片在室温下风干30分钟，然后用冰PBS清;先无需丙酮固定(所
65述切片是制造商已经丙酮固定的)。内源过氧化氢利用溶于曱醇的3%过 氧化氢阻断20分钟；这步在一抗孵育后进行。
通过与提供的抗小鼠HRP偶联二抗(Dako Envision System ， Toronto, Ontario)在室温下30分钟观察/显现一抗的免疫反应性。使用 Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检查，使用 Northern Eclipse成像软件(Mississauga， ON)获取并存储数字图像。由组 织病理学家对结果进行读取、评分和解释。
确定抗体与下列组织的结合SCID小鼠正常组织(实验室收集的)， 大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、鸡、牛、马、狗和猪的脑组织(Biochain, Ca, USA)，大鼠、山羊、鸡和牛的肝组织(Biochain， Ca， USA)以及人、短尾 猴、恒河猴、兔、仓鼠和豚鼠个体组织切片(Biochain， Ca， USA)。阳性 对照抗体抗肌动蛋白(克隆HHF35， Dako, Toronto, Ontario)显示对肌肉 组织的预期特异结合。阳性对照抗体抗Grp94(Stressgen， Victoria, BC) 显示主要对上皮组织的预期阳性结合。同种型阴性对照抗体(Dako ， Toronto, Ontario)对被测组织通常不显示可检测的结合。在阴性对照中显 示明显背景染色的组织切片在判断时净皮排除。
图28列表显示人和不同种属正常组织的AR52A301.5染色结果。 AR52A301.5不显示对被测兔、小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、仓鼠、 鸡、母牛、马或者猪正常组织的结合。对于正常的狗组织，存在与相应 人组织中观察到的不一样的结合对于短尾猴正常组织来i兄AR52A301.5 显示与相应人组织中观察到对所有被测器官类似的组织特异性(图29), 除了卵巢之外，因为在短尾猴的卵巢中没有观察到结合。对于恒河猴正 常组织来说，AR52A301.5与相应人组织中观察到的对所有被测器官类似 的组织特异性(图2外应注意到恒河猴正常组织组小于短尾猴被检测的。 基于染色i普，短尾猴和恒河猴均被认为是AR52A301.5的合适毒理学模 型。
实施例14
AR52A301.5鼠科序列
1.0可变区基因克隆入测序载体为了促进抗体嵌合体的产生，编码重链和轻链可变区的基因分别被
克隆入商品化测序载体pGEM-T easy (Promega Corp" Madison, WI)。 1.1 mRNA的分离
利用Poly A Tract System 1000 mRNA提取试剂盒Promega Corp., Madison, WI)从汇合的Master细胞库(AR52A301.5)杂交瘤细胞培养物中 分离信使核糖核酸(mRNA)。 mRNA保存在-80。C直到以后需要4吏用时。 1.2可变区基因的RT-PCR扩增
进行独立的反应以扩增轻链和重链可变区。逆转录酶聚合酶链式反 应(RT-PCR)从mRNA模板合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)然后特异扩增 靶基因。
对于轻链5.0微升mRNA与1.0微升的20 pmol/微升MulgG k Vl-3， 引物OL040和5.5微升无核酸酶水(Promega Corp., Madison, WI)混合。 对于X轻链，5.0微升mRNA与1.0微升的20 pmol/微升MuIgGXVL-3^1 物OL042和5.5微升无核酸酶水(Promega Corp., Madison， WI)混合。对 于7重链，5.0微升mRNA与l.O微升的20 pmol/微升MuIgG V『3'引物 OL023和5.5微升无核酸酶水(Promega Corp.， Madison, WI)混合。所有 3种反应混合物置于设定为70°C的热循环仪预热块中5分钟。然后在添 加到4.0孩t升ImPrommII 5 x反应緩冲液(Promega Corp., Madison, WI)、 0.5微升RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corp., Madison, WI)、 2.0微 升25mM MgCl2 (Promega Corp., Madison, WI)、 1.0微升10 mM dNTP混 合物(Promega Corp" Madison, WI)和1.0微升Improm II逆转录酶(Promega Corp., Madison, WI)之前，所述反应混合物在冰上预冷5分钟。这些反应 混合物在室温下孵育5分钟，然后转移到设定为42°C的预热PCR块1 小时。这,更时间后，通过在70。C的PCR块中孵育15分钟以热灭活逆转 录酶。
然后利用引物库(引物序列参见图30; SEQIDNOS:9-46)特异扩增重 链和轻链序列。引物工作液组成如下
1. 5'单一引物(MuIgVH5'-A和B; MuIg/cVLh5'-A， B和C; MuIgXVL5，- A) 包含浓度为20微摩的各引物；2. 5'引物库(MuIgVH5'-C到F; MuIg/cVLh5'-D到G)包含浓度为5微摩 的各组成引物。
从cDNA扩增重链和轻链序列。通过向273.75微升无核酸酶水中添 加37.5微升10 x Hi-Fi扩展PCR緩冲液(Roche， Mannheim, Germany) 7.5 微升lOmM dNTP混合物(Invitrogen, Paisley, UK)和3.75微升Hi-Fi扩展 DNA聚合酶(Roche, Mannheim, Germany)来制备PCR主混合物。该主混 合物被分装成21.5微升的部分，加入置于冰上的15个薄壁PCR反应管 中。向其中6管添加2.5微升MuIgVH-3'逆转录反应混合物和1.0微升重 链5'引物混合物A到F。向另7管添加2.5微升Mulg k VL-3'逆转录反应 物和1.0微升轻链5'引物混合物A到G。向最后1管添加2.5微升Mulg 入Vt-3'逆转录反应物和l.O微升X轻链引物Mulg入VL5'-A。反应物置于 热循环仪块中，并加热到95。C2分钟。聚合酶链式反应(PCR)反应进行 40个循环94。C 40秋55°C 1分钟和72。C 30秒。最后PCR产物在72°C 加热5分钟然后保存在4。C利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN， Crawley, UK)纯化PCR产物。
图31显示RT-PCR反应的结果。重链反应物(泳道2-7)显示利用 MuIgVH5'-B(泳道3)与MuIgVH5'-E(泳道6)扩增的500bp处的强条带。轻 链反应物(泳道8- 15)显示利用正向引物MuIgK VL5'-G(泳道14)扩增的强 450bp产物条带。利用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Crawley,UK) 纯化来自这些反应的PCR产物。 1.3克隆入测序载体
利用pGEM-T easy载体系统I(Promega Corp., Madison, WI)，轻链G 以及重链B和E的纯化PCR产物分别被克隆入pGEM-T easy载体。通 过向5.0微升2 x连接緩冲液、1.0微升pGEM-T easy载体和1.0微升T4 DNA连接酶中添加3.0微升纯化的PCR产物来准备轻链和重链反应。按 照制造商的说明书，将质粒转化入亚克隆级的XLl-蓝色活性大肠杆菌 (Stratgene，LaJolla，CA)。对于所有的转化，使用2.0微升的连接反应。
将来自各反应的100微升转化细胞种于包含50微克/mL氨千青霉素 (Sigma， Poole, UK)的Luria肉汤(LB)琼月旨(Q-Biogene， Cambridge, UK)平 板。将所述平板倒置，并在37。C孵育过夜。从3块平板各挑选8个克隆用于接种20微升无菌水通过混合385.2 微升无菌水、25.5微升二曱基Sulphoximide(Sigma, Poole， UK)、 51微升 10 x Taq緩冲液(Invitrogen， Paisley, UK)、 10.2微升10 mM dNTP混合物 (Invitrogen， Paisley, UK)、 5.1孩i升50 pmol/微升引物OL001、 5.U敖升50 pmol/微升亏1物OL002和2.5微升Taq DNA聚合酶(Invitrogen， Paisley, UK) 来准备PCR主混合物。该主混合物被分装到24个PCR反应管，每份19 微升。向这些反应管的每管中添加1.0微升接种的菌落悬浮液。PCR反 应物置于热循环仪块中，并加热到95。C 5分钟。聚合酶链式反应(PCR) 反应进行25个循环94°C 1分钟，55°C 1分钟和72°C 1分钟。最后PCR 产物在72。C加热10分钟。然后在1%琼脂糖凝胶对5微升各个反应物进 4亍电泳。
图32显示来自 AR52A301.5 VH-B的8个菌落以及来自 AR52A301.5VH-E的8个菌落的PCR筛选反底8个VHB菌落中的7个， VhB-2到VHB -8 (泳道2-8)以及8个Vh-E菌落中的1个，VHE-2 (泳道ll) 对650bp产物条带是阳性的，指示500bp产物成功克隆入pGEM-T easy 载体剩余的VHB和7个VH-E反应物产生不同分子量的条带，指示500bp 插入物的阴性结果。
图32还显示AR52A301.5 VL-G的8个菌落的PCR筛选反应。8个 VlG菌落中的4个VlG-2、 VlG-5、 VlG-6和VlG-7 (泳道19、 22、 23 和24)对于600bp产物条带是阳性的，指示450bp产物成功克隆入pGEM-T easy载体。剩余的4个V^-G反应物产生不同分子量的条带，指示450bp 插入物的阴性结果。
选择来自每种连接的最多4个阳性菌落接种5 mL包含50 mg/L氨苄 青霉素(Sigma， Poole, UK)的2YT(Sigma, Poole， UK)肉汤。培养物在37°C 振摇孵育过夜。利用Qiagen, QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN， Crawley, UK)从各培养物提取质粒DNA。 1.4 DNA测序
来自9个AR52A301.5Vl和Vh克隆(Vl G-2， Vl G-5， Vl G-6， Vl G-7, VH B-2, VH B國3， Vh B-4, Vh B-5和VH E-2)的质粒DNA在Geneservice Ltd.
69DNA测序实验室(Cambridge， UK)进行测序。序列列于图33和34，其中 互补决定区(CDRs)用下划线表示。
图33显示SEQ ID NO:8，以及被指定为SEQ ID NOS:4-6的用下划 线表示的CDRs。
图34显示SEQ ID NO:7，以及被指定为SEQ ID NOS:l-3的用下划 线表示的CDRs。
按照Kabat等(1991)进行CDR定义和M酸序列编号。在图33和34 的氨基^列上方列出Kabat编号。在AR52A301.5轻链CDR3(图33)中 插入连字符以便匹配Kabat编号系统。
在利用5'引物MuIgKV^G扩增的所有4个克隆中均发现正确的 AR52A301.5Vl序列。在利用5'引物MuIgVH-B扩增的所有4个克隆中均 发现正确的AR52A301.5Vh序列。利用5'引物MuIgV『E扩增的产物序列 不匹配鼠科IgG序列。
实施例15 竟争结合剂的分离
给予一种抗体，本领域普通技术人员可以制备一种竟争性抑制 CDMAB例如竟争抗体这是识别相同表位的抗体(BelangerL等，C/z'"/ca C/n'm/ca^4cto 48: 15-18(1973))。这种方法可能需要用免疫原进行免疫，所 述免疫原表达抗体识别的抗原。样品可以包括但不限于组织、分离的蛋 白或者细胞系。可以利用竟争分析筛选所获杂交瘤，这是一种鉴定抑制 待测抗体结合的抗体的方法，例如ELISA、 FACS或者Western印迹。另 一种方法可以利用噬菌体展示抗体文库，用于筛选识别所述抗原至少一 个表位的抗体(Rubinstein JL等，Anal Biochem 314:294-300 (2003))。在两 种情况下，根据取代初始标记抗体与其靶抗原至少一个表位结合的能力 来筛选抗体。这类抗体因此将具有如初始抗体识别抗原至少一个表位的 特征。
实施例16
AR52A301.5单克隆抗体可变区的克隆通过AR52A301。5杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(VH)和轻 链(V。可变区序列被测定(实施例14)。为了产生嵌合和人源化的IgG，轻 链可变结构域和重链可变结构域可以被亚克隆入合适的载体用于表达。
在另一个实施方式中，通过在转基因动物中表达编码抗体的核酸， 可以产生AR52A301.5或者其脱免疫、嵌合或者人源化的形式，这样的话 可以表达和回收所述抗体。例如，所述抗体可以采用有利于回收和纯化 的组织特异方式表达。在这样的一个实施方式中，本发明的抗体在哺乳 期的乳腺中分泌表达。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。
(i) 单克隆抗体
利用常规步骤(例如，通过利用能够特异结合编码单克隆抗体重链和 轻链的基因的寡核苷酸探针)可以轻易地分离并测序编码单克隆抗体的 DNA(如实施例1所述)。杂交瘤细胞被用作这类DNA的优选来源。 一旦 被分离，所述DNA可以被放入表达载体，所述表达栽体然后被转入不另 外产生免疫球蛋白的宿主细胞例如大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓 鼠卯巢(CHO)细胞，或者骨髓瘤细胞，以便在重组的宿主细胞中实现单克 隆抗体的合成。所述DNA也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒 定区的编码序列取代同源鼠科序列。也可以在体外利用合成蛋白化学的 已知方法，包括那些涉及交联剂的方法，来制备嵌合或者杂交抗体。例 如，可以利用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键来构建免疫毒素。 用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和曱基 -4-mercaptobutyrimidate 。
(ii) 人源化抗体
人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些 非人类氨基酸残基经常被称为"进口"残基，其通常取自"进口"可变 域。可以利用Winter及其同事的方法通过用人类抗体的对应序列取代啮 齿类动物CDRs或者CDR序列来进行人源化(Jones等，Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann等，Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 等，Science 239:1534-1536 (1988);综述于Clark, Immunol. Today 21 :397-402(2000》。
71可以利用亲代和人源化序列的三维模型通过分析亲代序列和不同概 念的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是 现有的并且被本领域技术人员所熟知。已经有说明和展示被筛选的候选 免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些展示的探查 能够分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候
选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。用这种方法，可以选择FR残基 并与共有和进口序列组合，这样的话就可以实现需要的抗体特征，例如 对靶抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接地并且最基本地参与影响 抗原结合。
(iii)抗体片段
已经开发了用于产生抗体片段的不同技术。这些片段可以通过重组 宿主细胞产生(综述于Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11 :M8-557 (1999); Little等，Immunol. Today 21 :364-370(2000))。例如，Fab'-SH片段可以直 接从大肠杆菌中回收并进行化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等， Biotechnology 10:163-167 (1992))。在另一个实施方式中，利用亮氨酸拉 链GCN4促进F(ab';b分子的组装从而形成F(ab')2。按照另一种方法，可 以直接从重组宿主细胞的培养物中分离Fv、 Fab或者F(ab')2片段。
实施例17
包括本发明抗体的组合物
本发明的抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。包含本发明抗体的 用于预防/治疗癌症的组合物，是低毒的，并且可以釆用液体制剂的形式 或者作为合适制剂的药物组合物通过口服或者非肠胃(例如，血管内，腹 腔内，皮下，等等)给药人或者哺乳动物(例如，大鼠，兔，绵羊，猪，牛， 猫，犬，猿，等等)。本发明的抗体可只做为其自身来给药，或者作为合 适的组合物给药。用于给药的组合物可以包含药理学可接受的载体以及 本发明的抗体或者其盐，稀释剂或者赋形剂。这类组合物以适于口服或 者肠胃外给药的药物制剂形式提供。
用于肠胃外给药的组合物实例是注射制剂，栓剂，等等。所述注射 制剂可以包括以下剂型，例如静脉内、皮下、皮内和月几肉注射，滴注，关节内注射，等等。这些注射制剂可以利用公知的方法制备。例如，所 述注射制剂可以通过在通常用于注射的无菌水介质或者油介质中溶解、 悬浮或者乳化本发明的抗体或者其盐来制备。作为用于注射的水介质 有，例如，生理盐水，包含葡萄糖和其他辅料的等渗溶液，等等，其可 以与合适的增溶剂联用，例如醇(例如，乙醇)，多元醇(例如，丙二醇，
聚乙二醇)，非离子型表面活化剂(例如，聚山梨酯80, HCO-50(氢化蓖麻 油的聚氧乙烯(50mols)加合物))，等等。作为油介质，使用的有，例如， 芝麻油，豆油，等等，其可以与增溶剂联用，例如苯曱酸千酯，苯曱醇， 等等。这样制备的注射剂通常被装入合适的安瓿。通过将本发明的抗体 或者其盐与用于栓剂的常规基质混合，可以制备用于直肠给药的栓剂。 用于口服给药的组合物包括固体或者液体制剂，具体地，片剂(包括糖锭 剂和包膜片剂)，丸剂，颗粒，粉末制剂，胶嚢(包括软胶嚢)，糖浆剂， 乳液，悬浮液，等等。这类组合物可以通过公知的方法制备，并且可以 包含药物制剂领域常用的赋形剂、稀释剂或者赋形剂。用于片剂的赋形 剂或者赋形剂的实例是乳糖，淀粉，蔗糖，硬脂酸镁，等等。
方便地，用于上述口服或者肠胃外使用的组合物被制备成具有单位 剂量的药物制剂，所述单位剂量适于满足一次剂量的活性成分。这类单 位剂量制剂包括，例如，片剂，丸剂，胶嚢，注射剂(安瓿)，栓剂，等等。 每剂量单位形式包含上述化合物的量通常是5到500 mg;优选的，特别 是在注射剂形式中包含大约5到大约100mg的上述抗体，而在其他形式 中是10到250mg。
包含本发明抗体的上述预防/治疗剂或者调节剂的剂量可以根据被给 药的患者、目标疾病、状态、给药途径等等而改变。例如，当用于治疗/ 预防(例如，成人中的乳腺癌)目的时，以大约0.01到大约20mg/kg体重 的剂量静脉内给药本发明的抗体是有益的，优选的大约0.1到大约10 mg/kg体重，更优选的大约0.1到大约5 mg/kg体重，大约1到5次/天， 优选的大约l到3次/天。在其他肠胃外和口服给药中，给药药剂的剂量 可以对应上述给定的剂量。当病症特别严重时，所述剂量可以根据病症 增力口。给药的组合物可以包含药理学可接受的载体以及上述抗体或者其盐，稀 释剂或者赋形剂。可以采用适合口服或者肠胃外给药(例如，血管注射， 皮下注射，等等)的药物制剂形式提供这类组合物。如上所述的各种组合 物还可以包含其他活性成分。此外，本发明的抗体可以与其他药物联用， 例如，烷化剂(例如，环磷酰胺，异磷酰胺，等等)，代谢拮抗物(例如，
氨曱蝶呤，5-氟尿嗜咬，等等)，抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素，阿霉素， 等等)，植物-来源的抗肿瘤剂(例如，长春新碱，去乙酰长春酰胺，红豆 杉醇，等等)，顺铂，卡铂，鬼臼乙叉甙，依立替康，等等。可以同时或 者交错将本发明的抗体和上述药物给药患者。
本文描述的治疗方法，尤其是针对癌症的，还可以与其他抗体或者 化疗剂的给药同时进行。例如尤其当治疗结肠癌咏还可以给药抗EGFR 的抗体，例如ERBITUX⑧(西妥昔单抗)。证明ERBITUX⑧对于牛皮癣的 治疗也是有效的。用于联用的其他抗体包括，尤其当治疗乳腺癌时 Herceptin (曲妥单抗)，尤其当治疗结肠癌时AVASTIN ,和尤其当治 疗非小细胞肺癌时本发明抗体与其他抗体/化疗剂的给药可以通 过相同或者不同的途径，同时或者分别进行。
使用的化疗剂/其他抗体方案包括被认为最适于患者状态治疗的任意 方案。不同的恶性肿瘤可能需要使用特异的抗肿瘤抗体和特异的化疗 剂，这将根据患者间的基本情况来确定。在本发明优选的实施方式中， 化疗与抗体治疗同时进行，更优选的，化疗在抗体治疗后进行。但是应 该强调，本发明不限于任意特定的方法或者给药途径。
优势证据显示AR52A301.5通过TROP-2上表位的连接介导抗癌作用 并延长存活。在实施例8和9中已经显示，AR52A301.5抗体可用于免疫 沉淀来自表达细胞例如MDA-MB-231细胞的同源抗原。此外在实施例 1、 2和11-13中还显示，利用下列说明的技术，但并不限于FACS、细胞 ELISA或者IHC， AR52A301.5抗体可用于检测表达TROP-2抗原部分的 细胞和/或组织，所述TROP-2抗原部分与上述抗体特异结合。
因此，利用FACS、细胞ELISA或者IHC分析，可以显示免疫沉淀 的AR52A301.5抗原能够抑制AR52A301.5与这类细胞或者组织的结合。此外，就象AR52A301.5抗体一样，其他抗TROP-2抗体可用于免疫沉淀 和分离其他形式的TROP-2抗原，并且利用相同类型的分析，所述抗原 也可用于抑制这些抗体与表达该抗原的细胞或者组织的结合。
技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其 亏I用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该理解，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限 定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易 见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出多种变化，本发明并 不局限于本说明书中所显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看 出使本发明良好地适合实现所描述的目的并获得最终结果和益处，以及 其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化 合物、方法、操作和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于 示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本 发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限 定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保 护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实 施本发明的一些方式的的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易 见的，均在所附权利要求书的范围内。国际IDAC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(才'艮J居布达f風斯条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与活存声明的副本
1、 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris f哈里斯'瓦莱丽)
地址 ARIUS Research Inc.(阿里乌斯研究公司)，55 York Street Suite 1600,
Toronto, ON M5J 1R7(加拿大多伦多) 提交日期2005年12月14日
2、 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号 AR47A6.4.2
由该国际保藏机构给予的保藏号: 141205-05
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3、国际保藏机构IDAC授权代表^i
日期2005年12月14日国际IDAC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩斯条约第10.2条发布)
致
姓名s Ferris Lander
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1。 保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址ARIUS Research Inc.(阿里乌斯研究公司)，55 York Street, Suite 1600, Toronto, ONM5J 1R7(加拿大多伦多)
2。 保藏标识
由国际保藏机构给予的保藏号141205-05 保藏日期(或最近相关日期)2005年12月14日
3。 存活检测
于(最近的检测日期L对以上标识的微生物进行存活检测，
在以上指出的日期，所述微生物
0存活
□不再存活
进行存活检测的条件(在已请求该信息且检测结果为阴性时填写》
4.国际保藏机构授权代表签字:
日期2006年1月9日
77国P示ID AC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(根据布达佩斯条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与活存声明的副本
3、 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址 ARIUS Research Inc,(阿里乌斯研究公司)，55 York Street, Suite 1600,
Toronto, ONM5J 1R7(加拿大多伦多) 提交日期2005年12月14日
4、 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号-AR52A301.5
由该国际保藏机构给予的保藏号:
141205-03
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3、国际保藏机构IDAC授权代表^i
日期2005年12月14日国际ID AC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩其斤条约第10.2条发布)
致
姓名Ferris Lander
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1.保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址ARIUS Research Inc.(阿里乌斯研究公司)，55 York Street, Suite 1600, Toronto, ONM5J 1R7(加拿大多伦多)
3.保藏标识
由国际保藏机构给予的保藏号141205陽(B 保藏日期(或最近相关日期)2005年12月14日
3.存活检测-
于(最近的检测日期1_对以上标识的微生物进行存活检测，
在以上指出的日期，所述微生物
0存活 口不再存活
进行存活检测的条件(在己请求该信息且检测结果为阴性时填写)
4.国际保藏机构授权代表签字:
日期2006年1月9日
权利要求
1. 分离的单克隆抗体，所述抗体由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生。
2. 分离的单克隆抗体的人源化抗体或者由所述人源化抗体产生的抗 原结合片段，所述分离的单克隆抗体由IDAC保藏的保藏号为141205-03 的杂交瘤产生。
3. 分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者由所述嵌合抗体产生的抗原结 合片段，所述分离的单克隆抗体由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生。
4. 由IDAC保藏的保藏号为141205-03的分离的杂交瘤细胞系。
5. 引发抗体诱导的组织样品中癌性细胞的细胞毒作用的方法，所述 组织样品选自人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤，所述方法包括提供来自所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤的组织样品； 提供由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克 隆抗体，由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离单克隆 抗体的人源化抗体，由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的 分离单克隆抗体的嵌合抗体，或者上述抗体的CDMAB，所述CDMAB 的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；和将所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或者所述其CDMAB与所述组织样品4妄触；其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或者 所述其CDMAB与所述组织样品的结合诱导细胞毒作用。
6. 如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的CDMAB。
7. 如权利要求2所述的人源化抗体的CDMAB。
8. 如权利要求3所述的嵌合抗体的CDMAB。
9. 如权利要求l、 2、 3、 6、 7或8中任一项所述的分离的抗体或者 其CDMAB,所述抗体或者其CDMAB与选自细胞毒部分、酶、放射性 化合物、细胞因子、干扰素、靶向或报告部分以及造血细胞的成员偶联。
10. 在哺乳动物中减少对抗体诱导的细胞毒作用敏感的人胰腺、卵 巢、前列腺或者结肠肿瘤的方法，其中所述人胰腺、卵巢、前列腺或者 结肠肿瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原与IDAC保藏的保藏号为 141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB特异结合，所 述CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗 原的结合，所述方法包括给药于所述哺乳动物P争低所述哺乳动物的胰腺、 卵巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷有效量的所述单克隆抗体或者所述其 CDMAB。
11. 如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞 毒部分偶联。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
13. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB活化补体。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒作用。
15. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人 源化抗体。
16. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌 合抗体。
17. 与分离的单克隆抗体特异结合相同的一个或者多个表位的单克 隆抗体，所述分离的单克隆抗体由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂 交瘤产生。
18. 在哺乳动物中减少人胰腺、卵巢、前列腺或结肠肿瘤的方法，其 中所述人肿瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原与IDAC保藏的保藏 号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或者其CDMAB特异 结合，所述CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体 与其靶抗原的结合，所述方法包括给药于所述哺乳动物降低所述哺乳动 物的胰腺、卵巢、前列腺或结肠肿瘤负荷有效量的所述单克隆抗体或者 其CDMAB。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞 毒部分偶联。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或者其 CDMAB活化补体。
22. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或者其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒作用。
23. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人 源化抗体。
24. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌 合抗体。
25. 在哺乳动物中减少人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤的方法， 其中所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤表达抗原的至少一个表位， 所述抗原与IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克 隆抗体或者其CDMAB特异结合，所述CDMAB的特征在于具有竟争性 抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原的结合，所述方法包括给药于所 述哺乳动物降低所述哺乳动物的胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷 的有效量的、与至少一种化疗剂联用的所述单克隆抗体或者其CDMAB。
26. 如权利要求25所述的方法， 毒部分偶联。
27. 如^L利要求26所述的方法，素。
28. 如权利要求25所述的方法, CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细胞其中所述细胞毒部分是放射性同位其中所述分离的单克隆抗体或者其
29.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或者其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒作用。
30. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人 源化抗体。
31. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌 合抗体。
32. 确定选自人肿瘤的组织样品中癌性细胞存在的结合分析，所述癌 性细胞与具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生 的分离的单克隆抗体、由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生 的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者由IDAC保藏的保藏号为 141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异结合，所述 结合分析包括提供来自所述人肿瘤的组织样品；提供所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或者 其CDMAB中的至少一种，其与具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤 细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或者多个 表位；将所述提供的至少一种抗体或者其CDMAB与所述组织样品接触；和确定所述提供的至少一种抗体或者其CDMAB与所述组织样品的结合；从而指示所述癌性细胞在所述组织样品中的存在。
33. 单克隆抗体用于降低人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷的 用途，其中所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤表达抗原的至少一 个表位，所述抗原与IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分 离的单克隆抗体或者其CDMAB特异结合，所述CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原的结合，所述用途包括 给药于所述哺乳动物降低所述哺乳动物的人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷有效量的所述单克隆抗体或者其CDMAB。
34. 如权利要求33所述的方法, 毒部分偶联。
35. 如4又利要求34所述的方法,素。
36. 如;^又利要求33所述的方法, CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细胞其中所述细胞毒部分是放射性同位其中所述分离的单克隆抗体或者其
37. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或者其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒作用。
38. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人 源化抗体。
39. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌 合抗体。
40. 单克隆抗体用于降低人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷的 用途，其中所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤表达抗原的至少一 个表位，所述抗原与IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分 离的单克隆抗体或者其CDMAB特异结合，所述CDMAB的特征在于具 有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原的结合，所述用途包括 给药于所述哺乳动物降低所述哺乳动物的人胰腺、卯巢、前列腺或者结肠肿瘤负荷有效量的、与至少 一种化疗剂联用的所述单克隆抗体或者其CDMAB。
41. 如权利要求40所述的方法, 毒部分偶联。
42. 如^又利要求41所述的方法，素。
43. 如权利要求40所述的方法, CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细胞其中所述细胞毒部分是放射性同位其中所述分离的单克隆抗体或者其
44. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或者其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒作用。
45. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人 源化抗体。
46. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌 合抗体。
47. 有效治疗人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤的组合物，以组合的方式包括如权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或者56中任 一项所述的抗体或者CDMAB;所述抗体或者其抗原结合片段与选自细胞毒部分、酶、放射性化合 物、细胞因子、干扰素、靶向或报告部分及造血细胞的成员的偶联物； 和必要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对于治疗所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤 是有效的。
48. 检测人癌性肿瘤存在的分析试剂盒，其中所述人癌性肿瘤表达抗 原的至少一个表位，所述抗原与IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交 瘤产生的分离的单克隆抗体或者其CDMAB特异结合，所述CDMAB的 特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述试剂盒包括由IDAC保藏的保藏号为141205-03的杂交瘤产生的 分离的单克隆抗体或者其CDMAB，以及^r测所述单克隆抗体或者其 CDMAB是否结合多肽的装置，所述多肽在特定临界水平的存在能够诊 断所述人癌性肿瘤的所述存在。
49. 特异结合人TROP-2的单克隆抗体或者其CDMAB，其中所述分 离的单克隆抗体或者其CDMAB与人TROP-2的一个或者多个表位反应， 所述表位与由具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5 产生的分离的单克隆抗体反应的表位相同；所述单克隆抗体或者其 CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人 TROP-2靶抗原结合的能力。
50. 分离的单克隆抗体或者其CDMAB，所述分离的单克隆抗体与具 有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单 克隆抗体识别相同的一个或者多个表位；所述单克隆抗体或者其CDMAB 的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其一个或者多个靶 表位结合的能力。
51. 减少表达人TROP-2抗原至少一个表位的人胰腺、卵巢、前列腺 或者结肠肿瘤的方法，所述人TROP-2抗原与具有IDAC保藏号141205-03 的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体特异结合，所述方 法包括给药于患有所述人肿瘤的个体至少一种分离的单克隆抗体或者其CDMAB,所述分离的单克隆抗体或者其CDMAB与具有IDAC保藏号 141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体结合相 同的一个或者多个表位；其中所述一个或者多个表位的结合导致胰腺、卵巢、前列腺或者结 肠肺瘤负荷的减少。
52. 减少表iiATR0P-2抗原至少一个表位的人胰腺、卵巢、前列腺 或者结肠肺瘤的方法，所述人TR0P-2抗原的至少一个表位与具有IDAC 保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体 特异结合，所述方法包括给药于患有所述人肿瘤的个体至少一种分离的单克隆抗体或者其 CDMAB，所述分离的单克隆抗体或者其CDMAB与具有IDAC保藏号 141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体结合相 同的一个或者多个表位；与至少一种化疗剂联用；其中所述给药导致肺瘤负荷的减少。
53. 确定表达TROP-2的细胞存在的结合分析，所述TROP-2抗原被 具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的 单克隆抗体或者由所述分离的单克隆抗体产生的抗原结合片段特异识别，所述结合分析包括 提供细胞样品；提供具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体或者由所述分离的单克隆抗体产生的所述抗原结合 片段；将所述分离的单克隆抗体或者所述抗原结合片段与所述细胞样品接触；和确定所述分离的单克隆抗体或者其抗原结合片段与所述细胞样品的 结合；从而确定表达TROP-2抗原的细胞的存在，所述TROP-2与所述分离 的单克隆抗体或者所述抗原结合片段特异结合。
54. 与由具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2 产生的分离的单克隆抗体特异结合相同的一个或多个人TROP-2表位的 单克隆抗体，包括包括SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示互补决定区 氨基酸序列的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示互补决定区氨基酸序列的轻链可变区；或者其人TROP-2结合片段。
55. 与由具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2 产生的分离的单克隆抗体特异结合相同的一个或多个人TROP-2表位的 单克隆抗体，包括包括SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示互补决定区 氨基酸序列的重链可变g和包括SEQIDN0:4 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6所示互补决定区氨基酸序列的轻链可变区；以及来自人抗体的重链 和轻链的可变域骨架区或者人抗体共有骨架；或者其人TROP-2结合片段。
56. 特异结合人TROP-2的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括 SEQ ID NO:7所示的重链可变区氨基酸序列；和SEQ ID NO:8所示的轻 链可变区氨基酸序列；或者其人TROP-2结合片段。
57. 在哺乳动物中通过治疗人胰腺、卯巢、前列腺或者结肠肿瘤延长 存活和延緩疾病进展的方法，其中所述肿瘤表达与具有IDAC保藏号 141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离的单克隆抗体或者由 所述分离的单克隆抗体产生的抗原结合片段特异结合的抗原，所述方法包括给药于所述哺乳动物降低所述哺乳动物的肿瘤负荷有效量的所述单 克隆抗体，从而延緩疾病进展和延长存活。
58. 在哺乳动物中通过治疗人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤延长 存活和延緩疾病*的方法，其中所述肿瘤表达TROP-2，所述TROP-2 与具有IDAC保藏号141205-03的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的分离 的单克隆抗体或者由所述分离的单克隆抗体产生的TROP-2结合片段特 异结合，所述方法包括给药所述哺乳动物降低所述哺乳动物的肿瘤负荷 有效量的所述单克隆抗体，从而延緩疾病进展和延长存活。
59. 有效治疗人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤的组合物，以组合 的方式包括如权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或者56中任 一项所述的抗体或者CDMAB;和 必要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对于治疗所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤 是有效的。
60. 有效治疗人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤的组合物，以组合 的方式包括如权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或者56中任 一项所述的抗体或者CDMAB与选自细胞毒部分、酶、》文射性化合物、 细胞因子、干扰素、靶向或报告部分和造血细胞的成员的偶联物；和必要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对于治疗所述人胰腺、卵巢、前列腺或者结肠肿瘤 是有效的。
全文摘要
本发明涉及利用新的筛选范式产生癌性疾病调节抗体的方法。通过利用癌细胞的细胞毒性作为终点分离抗癌抗体，所述过程能够产生用于治疗和诊断目的的抗癌抗体。所述抗体可用于帮助癌症的分期和诊断，并且可用于治疗原发肿瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体可以与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶向或报告部分和造血细胞偶联。
文档编号A61K51/10GK101432422SQ200780014777
公开日2009年5月13日 申请日期2007年2月23日 优先权日2006年2月24日
发明者大卫·S·F·扬, 海伦·P·芬德利, 艾莉森·L·费里, 苏姗·E·哈恩, 路易斯·A·G·唐克鲁兹 申请人:阿里乌斯研究公司