预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物的制作方法

专利名称：预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物的制作方法
预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物 发明描述
本申请要求2006年8月4日提交的美国临时申请No. 60/835,742 和2006年11月8日提交的美国临时申请No. 60/864,914的优先权。上 述各申请的全部内容在此引入作为参考。
背景技术：
总的来说，本公开涉及在NOD小鼠中预防和/或逆转自身免疫糖 尿病病症的反义方法。这包括通过注射微球投送AS-寡核苷酸以获得引 起负调节活性的治疗效果，具体是在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模 型中。微球使用完全水性的条件制造，该微球中结合有一种或多种反 义(AS)寡核苷酸。
微粒、微球和微囊是固体或半固体的颗粒，其直径小于1毫米， 也可以小于100微米，它们可以由各种不同的材料形成，包括合成聚 合物、蛋白和多糖。微球已经被用于许多不同的应用中，主要是分离、 诊断和药物投送。
有许多不同的技术可用于从合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多 糖制造这些颗粒，包括相分离、溶剂蒸发、乳化和喷雾干燥。 一般来 说，聚合物形成这些微球的支撑结构，而目标药物结合在聚合物结构 中。用于形成微球的示例性聚合物包括在Ruiz等的美国专利No. 5,213,812、 Reid等的美国专利No. 5,417,986、 Tice等的美国专利No. 4,530,840、 Tice等的美国专利No. 4,897,268、 Tice等的美国专利No. 5,075,109、 Singh等的美国专利No. 5,102,872、 Boyes等的美国专利 No. 5,384,133、 Tice等的美国专利No. 5,360,610、以及南方研究所 (Southern Research Institute)的欧洲专利申请公布No. 248,531中描述的乳酸和乙醇酸的均聚物或共聚物(PLGA);在Ilium的美国专利No. 4,904,479中描述的嵌段共聚物例如Tetronic 908和泊洛沙姆 (poloxamer) 407;以及在Cohen等的美国专利No. 5,149,543中描述
的聚磷腈。使用例如这些聚合物生产的微球表现出荷载效率差，通常 仅能在聚合物结构中结合少量百分比的目标药物。因此，为了获得疗 效，通常必须施用相当大量的这些类型的微球。此外，这些聚合物一 般是疏水性的，对目标药物的溶解有负性影响。在这种情况下使用的 典型聚合物包括聚乳酸乙醇酸(PLGA)。
医疗团体的目标是将核酸投送到动物细胞中以治疗各种疾病，包 括糖尿病。在许多方法中，通过加入转染剂，能够相对有效地将核酸 投送到培养细胞中(体外)。此外，在体内，当给动物投送核酸时， 内源核酸酶的存在将导致核酸高速降解。
除了保护核酸免受核酸酶消化之外，核酸投送载体还必需表现出 低毒性，必须被细胞有效摄取，并且具有定义明确的、容易制造的配 方。临床试验中显示，用于投送的病毒载体在体内能导致严重的不利、 甚至是致命的免疫应答。此外，这种方法有可能在体内有致突变效应。 通过将核酸复合在不同配方的脂质复合物(例如脂质体或阳离子脂质 复合物)中进行投送，可能具有有毒的效应。核酸与各种聚合物或与 肽的复合物显示出不一致的结果，并且这些配方的毒性还没有解决。 核酸还已经被包裹在聚合物基质中进行投送，但是在这些情况下颗粒 的粒度范围广，并且治疗性应用的有效性还没有被证实。这些早先的 方法能产生与这里所希望的目标相反的效果，包括免疫系统的刺激。 例如，当PLGA被掺入到颗粒中时，PLGA的存在刺激了免疫系统。
因此，对于解决核酸投送中的问题存在着需求，对于微球的开发 和制造微球的新方法有正在发展的需求。关于微球的详细情况，特别 是关于它们的制备和性质的详细情况，可以在Scott等的美国专利No. 6,458,387， Woiszwillo等的美国专利No. 6,268,053、 No. 6,090,925、 No.5,981,719和No. 5，599，719， Woiszwillo的美国专利No. 5,578,709以及 Brown等的美国申请公布No. 2006/0024240中找到。这些以及所有在 本文中指明的参考文献在此引为参考。
发明简述
按照本公开，寡核苷酸作为微球投送。据信这样的投送方法阻止 了核酸酶接近微球内的核酸。进行反义(AS)寡核苷酸的微球投送以 诱导树突状细胞耐受，特别是在NOD小鼠模型中。使用水性条件制造 微球，使得反义(AS)寡核苷酸被结合。这些微球用于抑制基因表达， 并用于在NOD小鼠中体内预防和/或逆转自身免疫糖尿病病症。
在本公开的一个方面，合成了靶向CD40、 CD80和CD86转录物 的三种AS-寡核苷酸，制备了寡核苷酸混合物的水溶液，并与水性聚合 物溶液合并。形成含有寡核苷酸的微球，通过注射将它们投送到NOD 小鼠中。
在本公开的一个方面，提供了用于在哺乳动物中逆转1型糖尿病 的方法，包括施用微球组合物，其中组合物中的微球含有与选自CD40、 CD80和CD86初级转录物的初级转录物及其组合是反义的并与它们定 向结合的寡核苷酸。该寡核苷酸选自SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:2或 SEQIDNO:3，或事实上可以是任何其它以CD40、 CD80和CD86为耙 标的寡核苷酸。
本公开的另一个方面涉及保护哺乳动物胰腺卩细胞免于自身免疫 破坏的方法，包括在哺乳动物中注射微球组合物，其中组合物中的微 球含有与选自CD40、 CD80和CD86初级转录物的初级转录物及其组 合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸。
另一个方面是在哺乳动物中减少T细胞介导的胰腺炎症和/或胰腺 卩细胞死亡的方法，包括给哺乳动物施用微球组合物，其中组合物中的
6微球含有与选自CD40、 CD80和CD86初级转录物的初级转录物及其 组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸，其中组合物以在哺乳动 物中有效缓解1型糖尿病症状的量施用。在更加限定的方面，该组合 物在1型糖尿病临床发作之后施用。在备选的方面，该组合物在1型 糖尿病临床发作之前施用。在这些治疗性方面，与施用前哺乳动物的 血糖水平相比，组合物的施用使哺乳动物中的血糖水平归于正常。
施用组合物可以再生哺乳动物的(3细胞群，或终止P细胞种的进 一步恶化，或这二者。
组合物可以以任何形式施用，在某些示例性方面，以注射形式施 用。在特定方面，组合物与胰岛素一起组合施用。在使用组合疗法时， 可以在施用微球组合物之前、同时或之后施用胰岛素。
其它方面还涉及在患有新发作或临床前期自身免疫糖尿病的对象 中保护剩余的卩细胞团的方法，包括给对象施用含有微球的组合物， 该微球中含有与CD40、 CD80和CD86初级转录物是反义的并与它们 定向结合的寡核苷酸，其中组合物的施用将哺乳动物的P细胞团维持 在糖尿病发作前存在的细胞团的至少15%。对象可以是人类对象。对 象可以是人类儿童。治疗方法可以包括重复施用组合物，并且重复施 用增加了哺乳动物的P细胞团。
在具体定义的方法中，微球的30y。以及多达70。/。w/w是寡核苷酸。 这样的组合物通常可以在微球组合物中含有比例为1:1:1的反义CD40: 反义CD80:反义CD86。
通过下面的具体说明，本发明的这些以及其它的方面、目标、特 点和优点，包括其各种组合，将得到明显和清楚的理解。
附图简述在本说明的过程中，将对附图进行参考，其中
图la和lb是AS-寡核苷酸和聚L-赖氨酸聚阳离子微球的扫描电
镜照片。
图2a和2b是显示本公开的微球制剂性质的图。图2a是显示微球 制剂大小的图。图2b是显示微球制剂的表面电荷的图。
图3是微球分解(deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC色谱图。
图4是显示了与用错义(scrambled)寡核苷酸微球或只用PBS载 体治疗的动物相比，在用本发明的反义寡核苷酸微球(AS-MSP)治疗 多次的NOD小鼠中对糖尿病的防止的绘图。
图5是显示了与用错义寡核苷酸微球或只用PBS载体治疗的动物 相比，在用本公开的AS-MSP治疗一次的NOD小鼠中对糖尿病的防止。
图6a-6d是用苏木精和曙红染色(图6a和c; H+E)或对胰岛素 进行染色(图6b和6d)的对照NOD小鼠胰腺组织切片的光学显微镜 照片。
图7a-7d是用苏木精和曙红染色(图7a和c; H+E)或对胰岛素 进行染色(图7b和7d)的AS-MSP治疗的NOD小鼠胰腺组织切片的 光学显微镜照片。
图8显示了从本公开的AS-MSP治疗的小鼠或对照动物获得的T 细胞的FACS分析。
图9显示了相对荧光强度(RFI)图，证实了来自以本公开的 AS-MSP治疗的动物并与脾细胞一起培养的T细胞的增殖。


图10显示了 RFI图，证实了来自AS-MSP治疗的无糖尿病NOD 小鼠的T细胞在同系的被辐照脾细胞和卵清蛋白的存在下的体外增殖。
图11显示了 RFI图，证实了来自AS-MSP治疗的无糖尿病NOD 小鼠的T细胞在同系胰岛裂解物的存在下体外增殖受抑制。
图12是新发作糖尿病小鼠用含有反义或错义寡核苷酸的微球治疗 的血糖水平图。
图13A显示了用患有新发作糖尿病的小鼠进行实验的时间线，图 13B和13C是用AS-MSP或对照进行治疗的新发作糖尿病小鼠的平均 血糖水平图。图14A-C显示了 NOD小鼠中1型糖尿病表型的逆转。这些图显 示了在施用AS-MSP后，哺乳动物的血糖水平在15天内回复到正常(正 常水平用虚线显示，大约为200 mg/dL)，并且甚至在停止AS-MSP的 施用后(第30天)仍维持正常。
图15描绘了自身免疫糖尿病的治疗性逆转的模式。
说明性实施方案的描述
按照需要，在这里公开了本公开的详细实施方案；但是，应该理 解，公开的实施方案仅仅是本公开的示例，它可以以各种形式体现。 因此，本文公开的具体细节不应该被解释为是限制性的，而仅仅是作 为权利要求书的基础，以及作为给本领域专业人员讲授的代表性基础， 以便以实际上任何适合的方式多样性运用本发明。
I型糖尿病是一种自身免疫疾病，其中胰腺，具体来说是产生胰岛 素的内分泌(3细胞，存在着进展性炎症。在发病前，炎症首先使内分 泌P细胞功能障碍。在人类自身免疫(l型)糖尿病的非肥胖型糖尿病 (NOD)小鼠模型中，单次注射微球制剂明显延迟了疾病的发作。尽 管不希望受到任何具体理论的束缚，但据信在疾病发作前，微球被注 射位点的驻留性和迁移性树突状细胞摄取，然后移动到邻近的淋巴结 中。还认为在被治疗的受体中，发生了耙向推定P细胞抗原的T细胞 的体外增殖降低。在免疫缺陷的NOD-SCID小鼠中，通过用同系T细 胞和树突状细胞重建然后再施用微球，可以发生CD4+ CD25+推定的调 节T细胞优势增加。因此，基于微球的治疗性组合物可以调节树突状 细胞活性并动员调控网络进行预防。
能够防止糖尿病发作的治疗方法是合乎需要的。当临床发病后显 著数量的卩细胞已经被破坏时，能够遏制或逆转疾病的治疗性组合物 也是合乎需要的。在新发作糖尿病的小鼠中重复用药使高血糖归于正 常，并逆转了疾病。逆转一般表示使个体，例如人类或其它哺乳动物， 表现出接近正常的血糖水平。不受任何具体理论的束缚，据信在"逆转"期间，疾病诱导的T细胞炎症和细胞死亡被抵制了。
一个实施方案通过配制和注射本文描述的、以CD40、 CD80和 CD86转录物为耙标的反义(AS)寡核苷酸微球，逆转了自身免疫胰岛 素依赖性糖尿病。针对转录物的反义寡核苷酸的具体例子公开在本文 的实施例中。应该理解，也可以设计其它与CD40、 CD80和CD86转 录物有效结合的反义寡核苷酸，以获得本文描述的效果。还应该理解， 这样的寡核苷酸可以结合本领域已知的修饰，包括但不限于巯基化 (thioation)、甲基化和甲氧乙基化，并且这些修饰的位置和数量可以 被改变，以获得最优效果。这些寡核苷酸被设计用于诱导免疫耐受， 这样导致在NOD小鼠模型中产生胰岛素的P细胞的破坏被逆转。
在NOD小鼠以及人类中，1型糖尿病被证实是由于产生胰岛素的 胰腺p细胞被自身免疫破坏。在临床发病时，人类通常具有10-20%以 下的残留(3细胞团。散在的任何该残留细胞团可以产生足以调节葡萄 糖水平的残余胰岛素水平。此外，逆转P细胞破坏可以导致(3细胞群 的部分再生。提供本公开的含有寡核苷酸的微粒是为了干扰p细胞的 自身免疫破坏。
应该认识到，能够被激活的树突状细胞(DC)是在所有组织中发 现的强抗原呈递细胞，它们存在于皮肤下。这些抗原呈递树突状细胞 的功能是通过活化T细胞作为免疫应答、包括自身免疫应答的引发物， 特别是在淋巴结中。尽管不希望受到理论的束缚，但据信CD40、 CD80 和CD86对于自身免疫应答是重要的，这些分子的下调被认为促进了自 身免疫的低应答性。此外，某些细胞因子例如干扰素和白介素，因为 低应答性而降低。
在制备用于在小鼠中治疗自身免疫糖尿病的微球中，可以将一种、 两种或三种AS-寡核苷酸溶解在水性溶液中，并与水溶性聚合物和聚阳 离子合并。溶液通常在大约60-70°C温育，冷却到大约23°C，并除去过量的聚合物。
核酸通常占微球的大约30到大约100重量％，平均粒度不超过大 约50微米，通常不超过大约20微米，并可以不超过大约IO微米。它 们通常如下制备。制备寡核苷酸的水溶液。在要制备含有三种寡核苷 酸的微球时，将三种寡核苷酸溶液等份合并。每种溶液含有这三种寡 核苷酸类型的一种。含有寡核苷酸的终溶液通常含有大约10 mg/ml寡 核苷酸。
在特定的实施例中，微球制剂含有65%、 70%、 75%、 80%, 85%、 90%w/w或更多的寡核苷酸载量。在这样的实施方案中，组合物具有 6-10% w/w的聚L-赖氨酸含量。此外，微球的水分含量是变化的，可 以为大约4%。寡核苷酸以1:1:1的反义CD40:反义CD80:反义CD86
的比率存在。
将它们与10mg/ml聚阳离子储存液的等份合并。聚阳离子的例子 是聚赖氨酸和聚鸟氨酸。其它包括聚乙烯亚胺(PEI)、谷醇溶蛋白、 鱼精蛋白、聚乙烯吡咯垸酮(PVP)、聚精氨酸、乙烯胺、以及带正电 荷多糖的衍生物例如带正电荷壳聚糖，及其组合。聚阳离子溶液中聚 阳离子:寡核苷酸的体积比可以从大约1:1到大约4:1。常用的聚阳离子 包括聚L-赖氨酸'HBr (最高达70,000道尔顿，可以从Bachem获得) 和聚L-鸟氨酸'HBr (例如11,900道尔顿，可以从Sigma获得)。
还制备了聚合物溶液。它们可以用作相分离增强剂。适合的聚合 物的例子包括线性或分支的聚合物、共聚物和嵌段共聚物。这些聚合 物可以是水溶的、半水溶的、与水混溶的的或可溶于与水混溶的溶剂 中的。聚合物的例子包括可药用添加剂，例如各种不同分子量的聚乙 二醇(PEG)，如PEG 200、 PEG 300、 PEG 3350、 PEG 8000、 PEG 10000、 PEG 20000等，以及各种不同分子量的泊洛沙姆例如泊洛沙姆188和 Pluronic FI27或Pluronic F68。常用的聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。另一种聚合物是羟乙基淀粉。其它的两亲性聚合物也可以单独或组合 使用。相分离增强剂也可以是非聚合物，例如丙二醇和乙醇的混合物。
在典型的实施方案中，可以制备聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的 聚合物溶液，并与其它溶液合并。加热、冷却、离心和清洗多次提供 水性悬浮液，通常被冷冻和冻干，以形成含有寡核苷酸和聚阳离子的 微球的干粉。
微球适合通过注射途径体内投送，例如静脉内、肌内、皮下、腹 膜内、鞘内、硬膜外、动脉内、关节内等。其它可以实施的投送途径 包括例如局部、口、直肠、鼻、肺、阴道、颊、舌下、经皮、经粘膜、 耳或眼内。
不受任何具体理论的束缚，据信含有本文例举的反义寡核苷酸的
微球下调细胞表面分子CD40、 CD80和CD86。注射微球，据信树突状 细胞主动摄取寡核苷酸微球。这些寡核苷酸抑制了树突状细胞中细胞 表面细胞分子CD40、 CD80和CD86的表达。在NOD小鼠中，施用这 些开发后的反义寡核苷酸微球，有效地逆转了糖尿病。
下面的实施例说明了本公开的某些特点和优点，以对本公开进行 进一步的说明。实施例不应该被视为限制或局限了本发明。
实施例1
合成了三种靶向CD40、 CD80和CD86初级转录物的AS-寡核苷 酸。在本实施例中施用的AS-寡核苷酸序列显示如下，其中星号表示骨 架中巯基化的位点
Seq ID 1 : CD 40-AS: 5'-C* AC* AG*C C*GA* GG*C* AA* A
GA*C* AC*C A*T*G C*AG* GG*C* A-3'
Seq ID 2: CD80-AS: 5'-G*GG* AA* A G*CC* AG*G A* AT* CPAG* AG* CC*A A*TG A-3'
Seq ID 3: CD86-AS: 5'-T*GG* GT*G C*TT* CC*G T* AA* GT*T C*TG* GA* A C*AC* G*T*C_3，
通过将各含有一种类型寡核苷酸的三种寡核苷酸溶液等份合并， 制备寡核苷酸混合物的水性溶液，形成三种类型寡核苷酸的10 mg/ml 溶液。在去离子水中制备了 10mg/ml的聚L-赖氨酸'HBr溶液(聚L-赖氨酸'HBr最高为70,000道尔顿，Bachem， King of Prussia, PA)。将 聚L-赖氨酸'HBr以1:1的体积比加入到寡核苷酸溶液中。将混合物轻
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CA)中含有12.5。/。PVP (聚乙烯吡咯垸酮，40,000道尔顿，Spectrum Chemicals, Gardena, CA)和12.5% PEG (聚乙二醇，3,350道尔顿， Spectrum Chemicals, Gardena, CA)的25%聚合物溶液，如下0.75 mlAS隱 寡核苷酸，0.75 ml聚L-赖氨酸'HBr， 3.0 ml PEG/PVP，总体积为4.50 ml。
将批料在70。C温育30分钟，然后冷却到23。C。冷却后，溶液变 得浑浊，微球形成。然后将悬浮液离心，除去过量的PEG/PVP。通过 将沉淀重新悬浮在去离子水中来清洗得到的沉淀，然后离心并除去上 清液。清洗步骤重复三次。将水性悬浮液冷冻并冻干，以形成含有寡 核苷酸和聚L-赖氨酸的微球的干粉。
图la和b显示了两种不同放大倍数的1:1比例的聚L-赖氨酸:寡核 苷酸微球的代表性扫描电镜照片(SEM)。制造了 0.5-4pm大小、平均 粒度大约2.5pm的微球。图2a显示了通过激光散射揭示的按照本公开 制造的一种微球制剂的大小分布。图2b显示了通过光散射测定的微球 制剂表面电荷(；电势)。图3显示了在微球分解后用于定量反义寡核 苷酸组分的载量和评估其完整性的反相(RP)HPLC方法。使用CD86、 CD40、 CD80寡核苷酸和聚L-赖氨酸(PLL; MW 30-70kD)来配制微 球。然后使用聚L-天冬氨酸(PAA)对PLL的竞争性置换DNA寡核 苷酸来使微球分解。PAA被选作在260nm处没有吸收并且不干扰在260nm处对寡核苷酸定量的聚氨基酸试剂。在RP-HPLC图谱，如图3 中，每个峰下的面积与微球中荷载的每种寡核苷酸的量成比例。如图3 中所示，峰的高度表明在微球中每种寡核苷酸大致相等的载量。微球 中寡核苷酸的载量经计算为重量的大约65%到大约80%。图3还显示 了寡核苷酸的完整性没有受到微球配制过程的影响，这由分解后峰的 狭窄分布表明。
实施例2
在本实施例中，显示了覆盖本公开的预防方面的试验结果。如图4 所示，在5-8周龄的NOD小鼠中单次施用AS-MSP延迟了糖尿病发作。 对两组雌性NOD小鼠(5-8周龄)单次皮下注射配制成本公开的微球 的反义寡核苷酸(AS-MSP)。制剂以被认为含有每种反义寡核苷酸 (抗CD40、抗CD80和抗CD86)的1:1:1混合物50貼的量进行注射。 其它组的小鼠注射错义序列的微球(SCR-MSP)或PBS介质(对照 NOD)。每周通过尾部静脉穿刺测量血糖。在两次连续读数>280-300 mg/dL后，证实糖尿病。图4显示了两个独立治疗组群的累计存活率。
图5显示在5-8周龄的NOD小鼠中多次施用AS-MSP防止了糖尿 病发作。对NOD雌性小鼠(5-8周龄)连续8次单剂皮下注射(每周 一次)配制成本公开的微球的反义寡核苷酸。注射(每种反义寡核苷 酸的1:1:1的混合物或错义寡核苷酸50吗)每周给予一次，为期8周， 在第13周停止。其它组的小鼠注射错义序列的微球(SCR-MSP)或 PBS介质(对照NOD)。图5显示了治疗的动物的累计存活率。
图6a和6b显示了没有接受治疗、因此自发发展成自身免疫性的 小鼠(糖尿病NOD小鼠)的胰腺组织切片，用苏木精和曙红染色(H+E; 图6a)或对胰岛素进行染色(图6b)。图6c和6d显示了用SCR-MSP 制剂治疗的小鼠(与用特异性AS-MSP治疗的组平行开始注射)的胰 腺组织的切片。这些切片也用苏木精和曙红染色(H+E;图6c)或对 胰岛素进行染色(图6d) 。 SCR-MSP小鼠都发展出糖尿病。图7a和7b显示了在不到8周龄时治疗(预防模型)和用本公开
的反义微球治疗的小鼠的胰腺组织切片，用苏木精和曙红染色(H+E;
图7a)或对胰岛素进行染色(图7b)。
图8中显示，来自AS-MSP治疗的NOD小鼠的T细胞表现出 Foxp3+ CD25+推定的1Veg细胞的优势增加。图8A显示用于FACS分析 的门(gating)。图8B显示从脾脏富集的Foxp3+CD25+T细胞的百分 率，图8C显示来自集合淋巴结的百分率，所述淋巴结来自ASMSP无 糖尿病组群随机选择的ASMSP治疗的无糖尿病小鼠或来自用错义序 列微球(SCR-MSP)治疗的或用PBS介质治疗的动物。
图9显示了来自ASMSP治疗的无糖尿病NOD小鼠的T细胞在与 同系脾细胞共培养时的增殖。来自ASMSP治疗的无糖尿病NOD小鼠 的T细胞通过富集柱获得，并与来自于Balb/c、 C57BL6或同系无糖尿 病NOD小鼠(IO周龄)的Y射线辐照过的脾细胞共培养。在四天后使 用Cyquant试剂测量增殖。Spl是指同系的辐照过的脾细胞。
图IO显示了来自ASMSP治疗的、无糖尿病NOD小鼠的T细胞 在同系的辐照过的脾细胞和卵清蛋白的存在下的体外增殖。T细胞从在 ASMSP无糖尿病组群中随机选择的ASMSP治疗的无糖尿病小鼠的脾 脏或集合淋巴结富集。
图11显示了来自ASMSP治疗的、无糖尿病NOD小鼠的T细胞， 在同系的胰岛裂解物的存在下在体外表现出增殖抑制。T细胞从图4 描述的ASMSP无糖尿病组中随机选择的ASMSP治疗的无糖尿病小鼠 的脾脏或集合淋巴结富集。辐照过的NOD脾细胞(来自IO周龄的无 糖尿病NOD小鼠)被用作抗原呈递细胞，平行培养物用NIT-1裂解物 (l吗/ L)(或PBS介质)脉冲。对于人类试验中糖尿病抑制疗法的最终结果(translation)的主要 顾虑是治疗方法的抗原特异性(以及因此的细胞特异性)，以及治疗 是否造成全面的非特异性抑制。为了解决这些问题，将从图4显示的 组群中随机选择的无糖尿病小鼠处以安乐死，以确定脾脏和淋巴结T 细胞对同种异体抗原、规定(nominal)抗原(以完整的卵清蛋白的形 式)和来自NOD衍生的胰岛瘤细胞系NIT-l的细胞裂解物形式的同系 卩细胞衍生抗原的增殖。尽管胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)是在机理 和目的上有牵连的候选自身抗原，但启动自身抗原的本质仍然不清楚。 然而，可以合理地认为它应该是P细胞驻留性的。因此，源自于NOD 胰岛瘤的NIT-1细胞系被用作P细胞抗原的来源，与来自AS-MSP治 疗的无糖尿病NOD小鼠的T细胞共培养，以确定抗原特异性低应答性 的可能性。从这些研究可以看到，对规定的和同种异体抗原的T细胞 增殖得到了维持，而在与NIT-1细胞裂解物共培养中存在T细胞低增 殖。
此外，为了确定共培养上清液中的细胞因子，我们观察到来自 AS-MSP治疗的无糖尿病NOD小鼠的T细胞，即使在NIT-1裂解物的 存在下，也明显减少TNFa的产生。尽管在AS-MSP治疗的小鼠的T 细胞的共培养物中，IFNy的生产略有减少，但它与在NIT-1裂解物存 在下、与PBS治疗小鼠的T细胞的共培养物没有统计学上的可区别性。 最后，该分析不能检测到上清液中IL-4、 IL-IO或TGFP的存在。
实施例3
还测试了反义寡核苷酸微球在早期发作NOD小鼠中逆转糖尿病 症状的能力。这些实验的时间线显示在图13A中。通过测试血糖水平 并鉴定血糖水平大于400mb/dL的动物，选择了具有早期发作的NOD 小鼠。给选出的动物胰岛素粒，使血糖水平正常，低于300 mg/dL的正 常水平。撤销胰岛素，开始进行一系列肠胃外微球注射。6只动物每周 两次注射含有CD40、 CD80和CD86反义寡核苷酸的微球。另外10只 动物注射含有不针对CD40、 CD80和/或CD86的错义序列的寡核苷酸混合物的微球。对于这两组动物来说，每次注射都在100微升注射液
的微球中含有50吗寡核苷酸。错义组动物中的两只由于身体状况差在
实验结束前被安乐死。在开始进行注射方案后，血糖水平每周取样两
次。在实验过程中动物不禁食。结果在图12中作图，其中指示符(1) 表示开始用胰岛素颗粒，指示符(2)表示除去胰岛素颗粒并开始每周 两次MSP注射。应该注意在图12中报道的最高血糖值是700 mg/dL， 这对应于所用测量计的最大读数，应该理解为700 mg/dL数据点表示血 糖读数为700 mg/dL以上。接受含有CD40、 CD80和CD86反义寡核 苷酸混合物微球的组中所有的动物(ASMSP1到ASMSP6)与接受带有 错义寡核苷酸的微球的动物(SCRMSP1到SCRMSP10)相比，显示出 明显较低的葡萄糖水平。此外，该ASMSP组的6只动物中4只显示出 血糖水平低于400 mg/dL，这一般被认为是糖尿病发作的阈指标。
在图13A中显示了实验的时间线。对每组的平均非空腹血糖(图 13B)和平均空腹血糖水平(图13C)进行了作图(+/- SEM)。在某 些小鼠中，如图13A所示撤销了 ASMSP的施用。如图13B和13C所 示，在新发作糖尿病的NOD雌性小鼠中施用多轮AS-MSP，相对于未 治疗动物(对照)、用PBS治疗的动物或用错义寡核苷酸(SCR-MSP) 微球治疗的动物来说，改善了血糖水平并产生稳定的空腹血糖正常， 即使是在撤去AS-MSP后。
图7c和7d显示了在糖尿病发作后用反义制剂治疗的NOD小鼠的 胰腺组织切片，并显示了疾病的逆转。切片用苏木精和曙红染色(H+E; 图7c)或对胰岛素染色(图7d)。
三种不同的AS-寡核苷酸可以被结合在PROMAXX微球中，这样 的微球可以用作组合物，通过诱导免疫调节性树突状细胞预防和/或逆 转新发作的自身免疫糖尿病。事实上，单次注射组合物延迟了疾病发 作，而在新发作糖尿病的小鼠中重复用药使高血糖归于正常，表明了 疾病的逆转。在这些研究中，每日施用胰岛素，直到血糖低于300mg/dL。然后在皮下施用AS-MSP下停用胰岛素。在示例性给药方案中， 动物每周两次施用每公斤体重2mgAS-MSP，为期3-4周。对无糖尿病 的NOD小鼠进行监测。
在图14A-C中，证实了给NOD小鼠施用AS-MSP使所述小鼠的
血糖水平回复到正常水平，并且所述血糖水平的正常化维持一段较长 的时期。如图14B和14C所示，在停止施用胰岛素后0到30天之间施 用AS-MSP。在停用胰岛素后第15天，血糖水平回复到正常，并保持 正常水平直到监测期结束(第55天)。
在图15中显示了自身免疫糖尿病的治疗性逆转的影响的图示。如 果P在图15中显示的新发作"蜜月"期施加ROMAXX治疗的话，预 计将会保留10-20%的仍具有功能的(3细胞，从而导致对糖尿病的控制 并减少患者对胰岛素的依赖。
应该理解，已经描述的本公开的实施方案是说明本公开的原理的 某些应用。对于本领域的专业人员来说，可以在不背离本公开的真实 精神和范围下进行大量的修改。本文描述的各种特点可以以任何组合 使用，而不限于在本文具体概括的明确组合。
权利要求
1. 在哺乳动物中逆转1型糖尿病的方法，包括施用微球组合物，其中在所述组合物中的微球含有与选自CD40、CD80和CD86初级转录物的初级转录物及其组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸。
2. 权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸选自SEQIDNO: 1、SEQ IDNO:2或SEQ IDNO:3及其组合。
3. 保护哺乳动物胰腺p细胞免于自身免疫破坏的方法，包括在所 述哺乳动物中注射微球组合物，其中所述组合物中的所述微球含有与 选自CD40、 CD80和CD86初级转录物的初级转录物及其组合是反义 的并与它们定向结合的寡核苷酸。
4. 在哺乳动物中降低胰腺的T细胞介导的炎症和/或胰腺P细胞死 亡的方法，，包括给所述哺乳动物施用微球组合物，其中所述组合物 中的所述微球含有与选自CD40、 CD80和CD86初级转录物的初级转 录物及其组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸，其中所述组合 物以在所述哺乳动物中有效缓解1型糖尿病症状的量施用。
5. 权利要求1、 3或4的方法，其中所述组合物在1型糖尿病临 床发作之后施用。
6. 权利要求1、 3或4的方法，其中所述组合物在1型糖尿病临 床发作之前施用。
7. 权利要求1、 3或4的方法，其中所述组合物的施用使得所述 哺乳动物中血糖水平与所述哺乳动物在施用前的血糖水平相比正常 化。
8. 权利要求1、 3或4的方法，其中所述方法包括施用含有微球 的组合物，所述微球含有与CD40、 CD80和CD86初级转录物是反义 的并与它们定向结合的寡核苷酸。
9. 权利要求1、 3或4的方法，其中所述组合物的施用使所述哺 乳动物的卩细胞群再生。
10. 权利要求l、 3或4的方法，其中所述组合物以可注射的形式 施用。
11. 权利要求l、 3或4的方法，其中所述组合物与胰岛素组合施用。
12. 权利要求ll的方法，其中所述胰岛素在所述微球组合物施用 之前、同时或之后施用。
13. 在患有新发作或临床前期自身免疫糖尿病的对象中保护剩余 P细胞团的方法，包括给所述对象施用含有微球的组合物，所述微球含 有与CD40、 CD80和CD86初级转录物是反义的并与它们定向结合的 寡核苷酸，其中所述组合物的施用将所述哺乳动物的P细胞团维持在 至少大约15%。
14. 权利要求13的方法，其中所述方法包括重复施用所述组合物， 并且所述重复施用增加所述哺乳动物的p细胞团。
15. 权利要求1、权利要求3、权利要求4或权利要求13的方法， 其中所述微球的70y。w/w是寡核苷酸。
16. 权利要求15的方法，其中所述微球组合物中反义CD40:反义 CD80:反义CD86的比率是1:1:1。
全文摘要
本发明采用微球形式投送AS-寡核苷酸以诱导树突状细胞耐受，特别是在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中。微球结合了反义(AS)寡核苷酸。方法包括使用反义方法在NOD小鼠中体内逆转自身免疫糖尿病病症。寡核苷酸被定向结合于初级转录物CD40、CD80、CD86以及它们的组合。
文档编号A61K48/00GK101500616SQ200780028951
公开日2009年8月5日 申请日期2007年8月6日 优先权日2006年8月4日
发明者尼克·吉安努卡基斯, 拉里·R·布朗, 金伯利·A·吉利斯 申请人:巴克斯特国际公司;巴克斯特医疗保健股份有限公司;高等教育联邦体系所属匹兹堡大学