在神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的制作方法

专利名称：：在神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能够在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的试剂、与其相关的方法及其应用。站旦冃豕由外周神经损伤引起的慢性神经病性疼痛是一种严重的临床问题，具有有限的治疗选择[1]。在损伤的和未损伤的初级传入神经元以及中枢(脊髓)致敏二者中的改变导致痛觉过敏(对疼痛刺激的加重型反应)、异常性疼痛(响应正常无害刺激的疼痛)和自发性疼痛。自从Hippocrates和Galer^'"以来，已有零星报道描述利用冷却产生痛觉缺失[4]。临床试验显示出冷却对慢性背痛、牙痛、手术后疼痛、和肌肉损伤的有益作用[5]。在传统中医和欧洲医学中，典型地使用产生冷觉感觉(coolsensation)的包含薄荷醇的制剂来减轻神经痛"'"。已经报道薄荷油减轻热引发的疼痛和疱疹后神经痛[8'9]，并且口服薄荷醇可以引起短期痛觉缺失[1()]。此外，在小鼠中，在热板实验和乙酸翻腾实验中，口服或脑室内施加薄荷醇减少感受伤害的反应[11]。最近分离了存在于初级感觉神经元中的TRP(瞬时型感受器电势(transientreceptorpotential))阳离子通道，这己经改变了我们对皮肤温度检测的理解。最佳表征的实例是辣椒素-和热-敏感TRPV1受体[12]，但是了解少得多的是冷(cool)-敏感TRPs[13]。TRPM8在无害较冷温度激活(在约18-19°C50%激活["])，并且通过薄荷醇和icilin激活[15，16。TRPM8通道由背根(DRG)和三叉神经节中的感觉神经元亚群表达^'16]，其中对冷却的反应充分与mRNA表达和薄荷醇敏感性相关[17'18'19]。由于皮肤冷却可以防止由传入刺激产生的疼痛[4]，似乎包含TRPM8的感觉神经元可能在中枢脊髓部位行使它们的止痛作用。TRPA1通道由从低于用于TRPM8的温度5-6匸起始的冷却温度[14]且由有害化学品如肉桂醛和芥子油[2()'21'23]激活，所述冷却温度。TRPA1也在DRG和三叉神经节中表达[14'22]，但是在缺乏TRPA1的小鼠中，发现冷敏感性不受影响[23]，因此TRPA1可能较少可能地用作冷却诱导的痛觉缺失的候选物。事实上，由于另一个关于TRPA1敲除小鼠的研究报道对有害冷却的减弱反应[24]，并且反义击倒研究表明在发展对强烈冷刺激的神经损伤-或炎症-诱导的痛觉过敏中的减少[25'26]，TRPA1更可能是感受伤害(疼痛)输入的候选调控子。脊髓神经元的谷氨酸受体-依赖性可塑性通常是慢性疼痛状态的基础，具有参与突触前和突触后位点的离子型和代谢型受体。尽管大部分谷氨酸受体是兴奋型的，但是组II/III代谢型受体(mGluR)亚型行使抑制性影响，这暗示它们可能潜在地支持冷却诱导的痛觉缺失的假说。事实上，组II和组IIImGluRs存在于大部分在传入末端的脊髓中，但是具有一些神经胶质和突触后表达[27'28]，并且它们的激活抑制神经损伤-和炎症-诱导的神经元反应和行为反应二者的致敏作用[29'3()'31'32'33]。本发明是基于这样的观察，即，在神经病性疼痛模型中，由外周或中枢施加TRPM8激活剂导致显著的止痛作用。此外，尽管己经报道适度冷却和薄荷醇(一种TRPM8激活剂)通过未详细说明的方式产生痛觉缺失，先前尚未在神经病性疼痛模型中确定TRPM8的激活导致一致的痛觉缺失。在神经损伤后，在DRG和浅层背角(superficialdorsalhorn)中的TRPM8水平升高。痛觉缺失局限在损伤-感应的反应，并且在反义击倒TRPM8后消除。外周施加icilin也缓慢地激活传导的传入，并且抑制与神经损伤在同侧的单背角神经元的增加的反应性。相反，激活TRPA1产生痛觉过敏(在首次用于实验的动物和神经损伤的动物中)。在由于炎症、传入脱髓鞘、以及在感觉传入中的TRPV1或TRPA1通道的激活引起的疼痛模型中，也观察到来自TRPM8激活的致敏作用特异性痛觉缺失。发明概述瞬时型感受器电势(TRP)阳离子通道将环境刺激如热、化学品和医药刺激在感觉神经元中转换成向内的电流，其然后激发适当的反应。TRPV1，TRPV2,TRPV3,TRPV4和TRPM8是温度感受器，其提供针对冷和热温度范围内.的反应。TRPM8在无害冷温度被激活(在约18-19。C50。/。激活)。许多TRP通道也是化学敏感性的，并且TRPM8可以在接触下述化合物后被激活，所述化合物诸如例如，^化(1-(2'-羟苯基)-4-(3"-硝基苯基)-1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮)，薄荷醇lR,2S,5R-(5-甲基-2-[1-甲基乙基]环己醇)，WS-12(2-异丙基-5-甲基-环己垸羧酸(4-甲氧基苯基)酰胺)和/或任何这些的变体、衍生物或同系物。本发明人已经发现激活TRPM8受体在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失。因此，TRPM8激活剂如本发明所述的那些可以有效用于治疗神经病性疼痛和/或治疗包括神经病性疼痛的病症或疾病。因此，并且在第一方面中，本发明提供瞬时型感受器电势(TRP)M8阳离子通道激活剂在制备用于在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的药物中的应用。在第二方面中，本发明提供治疗慢性神经病性疼痛的方法，所述方法包括向患有或经历慢性神经病性疼痛的患者施用有效量的TRPM8-激活剂的步骤。应该理解，术语"神经病性疼痛"是指由神经系统或外周神经系统(外周神经病性疼痛)中的主要损伤或功能障碍起始或引发的疼痛。因此，慢性神经病性疼痛是指由在神经系统或外周神经系统中的主要损伤或功能障碍引起的持续的或长期的神经病性疼痛。神经病性疼痛可以导致诸如痛觉过敏和/或异常性疼痛的病症，所述痛觉过敏是对疼痛剌激的加重型反应，所述异常性疼痛是无害刺激产生疼痛的病症。同样地，本发明可以提供治疗与诸如例如异常性疼痛的病症相关的慢性神经病性疼痛的方法。由于己知施加冷(其还己知为激活TRPM8)来治疗与异常性疼痛相关的慢性神经病性疼痛诱导疼痛，这是令人惊讶的。相反，使用本发明所述的TRPM8激活剂不诱导疼痛，而是减轻慢性神经病性疼痛的症状。另外，或者备选地，神经病性疼痛可以导致自发性疼痛。因此，能够在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的试剂的鉴定和后续的使用可以为这些病症提供有效的治疗。慢性神经病性疼痛是与中枢神经系统中的改变相关的现象，并且象这样，外周施加TRPM8激活剂能够在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的观察是出乎意料的。例如，TRPM8被薄荷醇且特别是(-)-薄荷醇激活，然而，其它化合物诸如1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物也激活TRPM8受体。同样地，诸如这些的化合物可以能够在慢性神经病性疼痛的情形中诱导痛觉缺失。一种示例性的TRPM8激活剂是1，2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物，idlin(1-(2'-羟苯基)-4-(3"-硝基苯基)-l,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮)。本领域熟练的技术人员容易理解这种及其它1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物的变体和衍生物可具有相似的作用，并且因此被术语"激活剂"所包括。更特别地，熟练的技术人员应该理解，icilin的化学结构可以在例如2'位置进行修饰，以包括独立选自由CrC4烷氧基，OH，N02，=0和NH2组成的组的成员。通过举例的方式，本发明应该理解成特别包括icilin衍生物甲氧基(MeO)-icilin(l-(2'-甲氧基苯基)-4-(3"-硝基苯基)-l,2,3，6-四氢嘧啶-2-酮)和l基(menthyl)-衍生物化合物WS-12(2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(4-甲氧基苯基)酰胺)。因此，在一个实施方案中，提供了1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物用于制备在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的药物的应用，其中例如，所述1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物是icilin或其衍生物(例如methoxy-icilin)或同系物。'在另一个实施方案中，提供了选自由下列各项组成的组的化合物在制备在慢性神经病性疼痛中用于诱导痛觉缺失的药物中的应用(i)盖基-衍生物化合物；和(ii)薄荷醇((+)或(-)-薄荷醇)。另外，应该理解，本发明所述化合物的其它优点在于，重复给药不会导致脱敏作用。换言之，尽管单次施用的止痛作用可能随着时间减弱，但是对另外一次或几次施用的反应保持完好。术语"慢性神经病性疼痛"可以视为包括多种具体的疼痛状态，并且应该被该术语涵盖的疼痛的那些类型的非穷尽性列表在下文提供。外伤-引发的神经病性疼痛这种具体类型的疼痛可以视为包括由对外周神经的物理外伤的结果引起的疼痛，例如作为损伤(意外或其它)的结果发生的，或例如作为外科手术的结果发生的疼痛，在外科手术中，神经可能被切断、挤压、縮窄、横切或拉伸(例如，臂丛损伤)。脱髓鞘-引发的疼痛这是一种由神经元的外周脱髓鞘导致的慢性疼痛状态，其可以作为脱髓鞘疾病诸如例如急性热病性多神经炎和进行性神经病性肌萎縮综合征(Charcot-Marie-Toothsyndrome)[34]的结果发生。炎性疼痛状态疼痛状态可以由软组织或关节中的炎症引起，并且可以包括供应骨和/或关节囊的外周神经的损伤。诸如关节炎的病症可以引起炎性疼痛状态。幻肢痛(phantomlimbpain)这种疼痛状态可能发生在已经经历了截肢的那些患者中。在这种情形中，患者感受到从被截肢的身体部分发散出来的疼痛，其完全或部分由神经病性元素组成。与癌症联系的神经病性疼痛在一些情形中，生长的肿瘤可能压縮或损伤神经，引起神经病性疼痛。化学治疗-引发的神经病某些化学治疗剂，例如用来治疗癌症或HIV的那些，可以损伤神经，引起神经病性疼痛。所述化学治疗剂包括，例如，长春花生物碱[35]。背痛慢性背痛状态可以由，例如，对外周神经的损伤或压力引起。骨痛和癌症-引发的骨痛在人类中，骨癌疼痛可以由原发骨瘤或更普遍地由来自乳腺癌、前列腺癌和肺癌的骨骼转移引起。骨痛是转移性骨病的最常见的并发症。这种疼痛可能由结构损伤、骨膜炎、神经压迫性损害和神经损伤引起。在骨内生长的肿瘤损伤并且破坏神经支配该骨的感觉神经传入，导致神经病性疼痛状态[36，37，38]。如前文所述，本发明描述了出乎意料的发现，即尽管慢性神经病性疼痛状态由在中枢神经系统水平发生的改变导致，但是在外周部位(即，远离中枢神经系统的部位，例如皮肤(即局部地))施用TRPM8激活剂可以诱导止痛作用。此外，先前未曾认识到在TRPM8激活剂和在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失之间的相关性，除了外周施加TRPM8激活剂之外，中枢、鞘内或硬膜外施用TRPM8激活剂也可以在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失。因此，有利地，TRPM8激活剂可以局部、鞘内(即，直接施用到髓腔内)或以硬膜外方式施用。因此，本发明的TRPM8激活剂可以配制成包括药用载体或赋形剂的无菌药物组合物。这样的载体或赋形剂是本领域的技术人员公知的，并且可以包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、葡萄糖、甘油、乙醇、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、磷脂酰胆碱、血清蛋白如血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯垸酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂肪等、或它们的组合。TRPM8-激活剂可以与另一种治疗组合施加。通过举例的方式，如上文所述，慢性神经病性疼痛可能由使用用于治疗癌症的化学治疗剂引起。象这样，通过结合化学治疗剂和包括TRPM8-激活剂的药物，可以可能地减少正在治疗癌症的人所经历的慢性神经病性疼痛的量。在使用具体的化合物、物质或药物(或其它形式的治疗)导致发展慢性神经病性疼痛的任何情形中，这样的组合都将是有益的。可以可能地通过某些形式的经皮递送装置经皮施用上文所述的TRPM8-激活剂。这样的装置是有利的，特别是用于施用能够在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的TRPM8-激活剂，因为相对于例如口服或静脉内药物，它们可以允许延长时间的治疗。经皮递送装置的实例可以包括，例如，适于通过患者的皮肤释放化合物或物质的贴片、敷料、绷带或糊剂。本领域技术人员应该熟悉可以用来经皮递送化合物或物质的材料和技术，并且示例性的经皮递送装置由GB2185187,US3249109,US3598122,US4144317,US4262003和US4307717提供。通过举例的方式，TRPM8-激活剂可以与某些形式的基质或基底诸如非水性聚合物载体组合，以使其适用于经皮递送系统。所述TRPM8-激活剂/基质或基底混合物可以通过使用机织物或编织物、非机织物、相对开放的网眼织物来生产可以释放性地附着在患者身体的特定区域的贴片、绷带、糊剂等而进一步加强。以这种方式，当与患者的皮肤接触时，所述经皮递送装置通过皮肤释放化合物或物质。在本发明的第三方面中，提供了检测潜在有效用于制备在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的药物的试剂的方法，所述方法包括下述步骤.-(a)使一种或多种检测试剂与TRPM8受体接触；并且(b)检测TRPM8受体的任何激活，以鉴定激活所述TRPM8受体的一种或多种试剂。通过举例的方式，上述方法可以用来鉴定可以局部施用以在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的试剂。本领域熟练的技术人员应该熟悉确定检测试剂是否已经激活TRPM8受体所需要的那些技术。例如，TRPM8受体的激活允许带正电荷的离子进入TRPM8-表达细胞，并且可以在电压钳实验中或通过钙荧光测定法电生理学测量为向内的电流。上文详细描述的方法还可以包括检测被发现激活TRPM8受体的试剂进行止痛作用的步骤。例如，为了确定通过上述方法鉴定的任一种或多种试剂是否在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失，所述一种或多种试剂可以在已知患有或经历慢性神经病性疼痛的受试者(例如，人或动物受试者)和/或在动物模型中进行检测。通过举例的方式，患有针对坐骨神经的慢性縮窄性损伤(chronicconstrictioninjury)(CCI)的啮齿动物可以提供适合的动物模型系统，在其中评估通过上文详细描述的方法鉴定的一种或多种试剂的止痛特性。在一个优选的实施方案中，检测被发现激活TRPM8受体的试剂的步骤可以包括将所述检测试剂局部施用给已知患有或经历慢性神经病性疼痛的受试者和/或局部施用给动物模型的步骤。优选地，所述试剂可以局部施用至皮肤。在第四方面中，本发明提供检测能够结合TRPM8受体的试剂的方法，所述方法包括下述步骤(iii)使一种或多种检测试剂与TRPM8受体接触；并且(iv)检测在所述检测试剂和所述TRPM8受体之间发生的任何结合。本领域技术人员应该熟悉确定检测试剂是否能够结合TRPM8受体所需要的那些技术。例如，己知的TRPM8结合剂的置换可以用来检测检测试剂的结合。在这样的情形中，一旦检测试剂已经与TRPM8受体接触，已知的TRPM8结合剂，例如抗体等，也可以暴露于所述TRPM8受体。如果所述己知的结合剂不与所述TRPM8受体结合，则可以表明所述检测试剂己经结合了所述TRPM8受体，即，它已经置换了所述已知的TRPM8结合剂。另外或者备选地，诸如条带移位分析的测定可以辅助检测一种检测试剂是否能够与TRPM8受体结合。另外，熟练的技术人员应该理解，将从在上述第三和第四方面所述的方法获得的任何结果与从对照系统获得的那些结果比较是需要的，在所述对照系统中，所述TRPM8受体不与所述一种或多种检测试剂接触。TRPM8受体可以在培养的细胞的表面上表达，因此提供细胞单层。另外或备选地，TRPM8受体可以通过重组系统或通过组织样品或活组织检査提供。备选地，动物例如啮齿动物可以用作TRPM8受体来源。在一个实施方案中，TRPM8受体可以由特定的细胞系如人前列腺癌细胞系，LNCaP表达。更具体地，从包括使用己知表达TRPM8的细胞系(诸如LNCaP)的测定获得的结果可以与从使用表达相对较少的TRPM8或完全不表达TRPM8的细胞系的相似测定获得的结果进行比较。此外，所述方法可以进一步包括使用TRPM8通道阻断剂。在本发明的第五方面中，提供了通过在本发明第三方面所述的方法鉴定的试剂用于制备在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的药物的应用。除了上述，本发明己经确定了TRPM8激活的止痛作用可以进行中枢调节。例如，并且不希望受到理论限制，TRPM8激活的作用可以依赖于能够调控如中枢神经系统的成分的受体。通过举例的方式，TRPM8激活可以导致谷氨酸的释放，并且象这样，在背角中的谷氨酸受体可以成为在慢性神经病性疼痛中诱导痛觉缺失的基础。因此，TRPM8-激活的作用可以依赖于特定类型的谷氨酸受体，即，组II/ni代谢型受体(mGluR)。象这样，在本发明的第六方面，提供了治疗患有或经历慢性神经病性疼痛的患者的方法，所述方法包括施用有效量的直接或间接激活组II/IIImGluR的试剂或化合物的步骤。另外，并且在另一个方面中，本发明提供能够直接或间接激活组n/inmGluRs的试剂用于制备在患有或经历慢性神经病性疼痛的患者中诱导痛觉缺失的药物的应用。通过举例的方式，能够直接激活组II/IIImGluRs的试剂可以包括组II/IIImGluR激动剂，例如，2R,4R-APDC,ACPT-III禾口/或AP-4。另外，能够间接激活组II/IIImGluRs的试剂可以包括诸如上述薄荷醇和/或1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮化合物(例如icilin)的试剂。发明详述现在将通过举例的方式并且参考附图描述本发明，所述附图显示图1在CCI后外周TRPM8激活和适度冷却是止痛性的。A,B,C,E)来自CCI动物的行为数据，表示为平均值土SEM，每图描述!1=6只动物。A)在将足浸没在含有80口Micilin或赋形剂的浅的3(TC水浴中之前和5分钟之后，对有害热的縮足潜伏期(pawwithdrawllatency)(PWL;s)和对机械刺激的縮足阈值(pawwithdrawlthreshold)(PWT;mN/mm2);O:同侧足加icilin，@:同侧+赋形齐U;对侧加icilin，園:对侧加赋形剂*表示显著的同侧-对侧差异，f表示与给药之前基线的差异(p<0.05)。B)浓度-反应曲线，其关于在将足浸没在2.5-500nMicilin中后10-15分钟计算的同侧对热(O)或机械("测试的致敏作用的逆转百分数的平均值土SEM。C)通过将足浸没在4mM(-)-薄荷醇中，并且通过更高浓度的较不有效的立体异构体(+)-薄荷醇和异薄荷醇(8和16mM)逆转同侧致敏作用。数值在将足由如A)所示的实验浸没历时10-25分钟计算。卞表示与给药之前基线的显著差异(p0.05)。D)在向感受域局部施用icilin之前、施用icilin后2分钟(最大作用)和12分钟之后，来自icilin-反应性C-纤维传入纤维亚群的典型电生理学记录。E)在将足浸没在指定温度范围内5分钟后的经过5分钟测量的机械性痛觉缺失。§表示在浸没期间的自发縮回反应，*表示与对侧足的显著差异，并且t表示与浸没之前基线的显著差异(p0.05)。图2TRPM8免疫反应性存在于DRG和脊髓中，由传入引起，并且在CCI同侧增加。(v)DRG的免疫印迹显示在正常大鼠DRG中具有电泳在U8kDa处的TRPM8蛋白和在约170,60和50kDa处的其它弱条带的完整凝胶，在来自反义处理的动物的DRG中具有特异性的128kDa条带的击倒。在其它对照中，当TRPM8抗体用来自TRPM8-表达细胞的膜预先温育时，所述128kDa的免疫反应性条带被去除，而假处理没有影响。印迹另外显示GAPDH上样对照。在来自TRPM8反义处理的动物的DRG中，TRPV1表达(在~90kDa的单一条带)没有改变。与对侧('con')和IDRG相比较，关于TRPM8蛋白的免疫印迹显示处在与神经损伤同侧('ipsi')的DRG中该特异性128kDa条带表达的清楚的增加，在GAPDH中没有改变。脊髓(SC)完整的溶解产物没有显示处在TRPM8水平上的可分辨的变化，然而，在未处理的微粒级分中观察到与神经损伤同侧的增加水平。B)显示来自首次用于实验的或TRPM8反义处理的大鼠的DRG的蛋白质印迹，所述大鼠使用在下述C)-F)中用于免疫组化的TRPM8抗体探测。用抗原性肽预处理所述抗体或TRPM8反义处理去除了在A128kDa的单一特异性的条带。C)将在背部脊神经根切断术后8天采集的L5脊髓部分针对外周蛋白(绿色)和TRPM8(红色)免疫染色，并且显示出在脊神经根切断术同侧这两种蛋白的显著减少。D)在来自CCI动物的脊髓背角中关于TRPM8(红色)和神经元标记NeuN(绿色)的免疫染色显示在CCI同侧TRPM8增加，在分布上没有改变，而NeuN水平不变。用于C)和D)的标尺是500pm。E,F)TRPM8(红色)与(E)NF-200(绿色)或(F)外周蛋白(绿色)在与神经损伤同侧或对侧的DRG部分中以及在I动物中的免疫组化共同定位。在首次用于实验的动物中，TRPM8主要位于外周蛋白-阳性C-纤维中，在有髓鞘(NF-200)细胞中具有很少或没有明显的表达。在神经损伤同侧，在小NF-200-阳性细胞中，TRPM8表达显著增加，而也观察到TRPM8:外周蛋白共同表达的较少增加。标尺为50pm。在E)和F)中的柱状图分别显示TRPM8:NF-200和TRPM8:外周蛋白的共表达百分数(平均值土SEM);实际的细胞计数显示在柱上部。在与CCI同侧的两种情形中均观察到在共表达百分数值中的统计学显著增加，p<0.05(*)。图3通过反义寡核苷酸特异性TRPM8击倒防止在CCI之后由icilin诱导的痛觉缺失。A,B)显示在与具有反义(11=12)或错义(11=10)处理的CCI动物同侧(O)或对侧O)针对有害热的縮足潜伏期(PWL,s)和针对机械刺激的縮足阈值(PWT;mN/mm2)。数据表示为平均值士SEM。A)在反义击倒TRPM8受体之后，没有观察到通常由局部icilin引发的痛觉缺失，这由在PWL和PWT中的显著的同侧-对侧差异CpO.05)的持续性表示。B)相反，在错义处理之后，与在未处理的CCI动物(图lA)中的基线数值(卞pO.05)相比，icilin在PWL和PWT反应中产生CCI-诱导的同侧致敏作用的显著逆转。C)在TRPM8反义或错义处理之后针对TRPM8和GAPDH蛋白水平探测的DRG组织的免疫印迹。TRPM8表达(以及在与CCI同侧正常观察到的表达增加，图2A)选择性地通过反义而非错义融合减少，而GAPDH水平不变。图4在CCI后中枢TRPM8激活是止痛性的，而TRPA1激活是痛觉过敏性的。显示与CCI同侦ij(0)或对侧—)的针对有害热的縮足潜伏期(PWL,s)和针对机械刺激的縮足阈值(PWT,mN/mm2)。*表示显著的同侧-对侧差异(*p<0.05)。数据表示为平均值士SEM，并且每次检测表示11=6只动物，除非另外指明。在箭头处对大鼠进行鞘内注射。与预先注射的数值相比(卞p0.05)，TRPM8激活剂，A)Icilin(10nmol),和B)(-)-薄荷醇(200nmol)二者均显著逆转同侧热和机械致敏作用。C)相反，鞘内施用TRPA1激活剂，即肉桂醛(75nmol)在CCI动物中产生两侧的痛觉过敏和异常性疼痛。S(pO.05)表示在同侧和对侧足的热和机械反射反应性中的统计学显著增力口。D)显示钌红(RutheniumRed)(0.25nmol)在CCI同侧抑制肉桂醛(75nmol)-诱导的超敏性，而不是icilin(10nmol)-介导的痛觉缺失。数值为平均值±SEM，n=4。与用药之前的基线比较的由于肉桂醛或icilin引起的PWL/PWT数值的统计学显著改变分别表示为(S)和CT)(p<0.05)，并且对于肉桂醛作用的钌红-逆转表示为(",p0.05)。图5在CCI之后由icilin诱导的痛觉缺失被组II和IIImGluR拮抗剂预防。(A-D)在CCI同侧(O)或对侧(國)，针对有害热的縮足潜伏期(PWL，s)和针对机械刺激的縮足阈值(PWT，mN/mm2)。数据表示为平均值iSEM，在每个情形中n=6只动物。(在箭头处)对大鼠进行鞘内注射。将icilin(10nmol)与A)组IImGluR拮抗剂LY341495(5nmo1)，B)组IIImGluR拮抗剂UBP1112(10nmol)或C)阿片样物质受体拮抗剂纳洛酮p5nmol)共同施用。A，B)当LY341495或UBP1112与icilin共同施用时，它们消除icilin的止痛作用，这由在与神经损伤同侧的致敏的(*p<0.05)PWT/PWL反应的持续性所表示。C)与icilin共同施用的纳洛酮不预防icilin-诱导的痛觉缺失，这在与神经损伤同侧的PWT和PWL反应中观察到(1"p<0.05)。*表示显著的同侧-对侧差异，卞表示药物显著的同侧止痛作用(p〈0.05)。D)局部施用的icilin(200pM，在3(TC)的止痛作用也被鞘内注射组II/IIImGluR拮抗剂所逆转。该图显示同时或不同时鞘内注射LY341495(5nmo1)或UBP1112(10nmo1)，或在单独的mGluR拮抗剂之后，在局部施用icilin5分钟后的15-30分钟测量的PWL或PWT的同侧/对侧差异的平均％逆转。E)在CCI同侧的单背角神经元的典型细胞外记录，其对应于在后足的皮肤感受域的连续的机动化刷拭(motorisedbrushing)和局部施用至所述感受域的相邻区域的icilin(200(^M，在3(TC)的作用。在12个神经元中的8个中观察到相似的结果，例如在层IIMV和层I二者中。神经元发放(firing)展示为针对时间绘制的动作电位/秒(Hz)。(i):在与神经损伤同侧的刷拭-激发的神经元发放一直受到局部施用的icilin的抑制，(ii):这种作用通过UBP1112在20-60nA的离子电泳而被逆转，(iii):在去除UBP11U发射电流之后观察到复苏。在神经损伤对侧的神经元不被icilin影响，并且局部赋形剂没有作用。另外，单独的UBP1112离子电泳或盐水电流对照没有显示出可分辨的作用。图6在CCI之后TRPM8-介导的痛觉缺失的可能机制基础的示意性描述。在这种简化的假设模型中，通过icilin、薄荷醇或适度冷却激活在传入亚群中的TRPM8导致谷氨酸的中枢突触释放，然后其通过突触前位于在损伤-激活的感受伤害传入上的或也可能突触后位于背角神经元上的抑制性组n/mmGluR受体作用，由此减弱神经病性致敏作用。图7局部施用TRPM8激活剂idlin在其他神经病性疼痛模型中引起痛觉缺失SNL、脊神经连接模型。神经病性疼痛的SNL模型根据Kim和Chung1992(疼痛(Pain)50:355-363)所述建立。关于热痛觉过敏的Hargreaves'检测按上述进行，并且将icilin(200inM)局部施用到同侧(O)禾口对侧("足。数值显示为平均值士SEM。t表示与神经损伤同侧的致敏作用的统计学显著性逆转(见图l)。在对侧肢体没有观察到对反射縮回反应的显著药物作用。图8局部施用其他的TRPM8激活剂，methoxy-icilin和WS-12,也在神经病性疼痛的CCI模型中引起痛觉缺失。在神经病性疼痛的CCI模型中，热痛觉过敏通过Hargreaves'检测评估，并且局部施用TRPM8激活剂(以30pM的浓度)(如在图l中)。数值显示为平均值士SEM，与神经损伤在同侧(O)或对侧O)。t表示与神经损伤同侧的致敏作用的统计学显著性逆转。图9局部施用另一种TRPM8激活剂icilin提供针对在神经病性疼痛CCI模型中引发的冷异常性疼痛的痛觉缺失。在神经病性疼痛的CCI模型中，冷异常性疼痛通过为从Peltier控制的足板的足轻弹(flick)-相关的足縮回的次数打分而进行评估，所述足板从对照(30°C)降低到适度的冷却(2(TC)的温度。局部施用idlin(200pM)(如在图l中)。数值表示为平均值士SEM，与神经损伤在同侧()。卞表示冷异常性疼痛的统计学显著性逆转。保持在3(TC的足板没有引起轻弹足縮回的基线水平的任何改变，并且这不受局部施用icilin的影响。图10在神经病性疼痛的CCI模型中每日重复性局部施用TRPM8激活剂icilin—直引起痛觉缺失，则表明缺乏适应性(habituation)。在神经病性疼痛的CCI模型中，热痛觉过敏通过Hargreaves'检测进行评估，并且在连续4天内局部施用icilin(200^M)(如在图1中)。数值表示为平均值士SEM，与神经损伤在同侧()或对侧(—。卞表示与神经损伤同侧的致敏作用的统计学显著性逆转。图11局部施用TRPM8激活剂，icilin在癌症-诱导的骨痛模型中引起痛觉缺失。1癌症-诱导的骨痛模型根据Medhurst等，2002疼痛(Pain)96:129-40所述建立。在A)中，按上述(图1)进行针对机械性异常性疼痛的vonFrey细丝检测，并且在B)中，通过在缓慢旋转旋转杆检测中计分异常延长的足举起的频率而评估在损伤的肢体中的运动-引发的疼痛。t表示与神经损伤同侧的致敏作用的统计学显著性逆转。材料和方法动物所有实验依据英国动物(科学方法(ScientificProcedures))法，1986和爱丁堡大学(UniversityofEdinburgh)的指南进行。所有实验使用重120-250g的成年雄性Wistar大鼠(Harlan,UK)。神经病性和炎性疼痛模型疼痛模型在氟烷麻醉下产生(Zeneca，Cheshire,UK)。对于神经病性疼痛的慢性縮窄性损伤(chronicconstrictioninjury)(CCI)模型，将4条绷带松散系上，以收縮在大腿中部水平的坐骨神经(如先前所述[39])。炎性疼痛模型通过向右后足的腹侧表面注射lOO(il完全弗氏佐剂(CFA,西格玛-奥得里奇有限公司(Sigma-AldrichLtd))而产生[39]。外周脱髓鞘-诱导的疼痛模型通过向坐骨神经病灶内(focal)施用溶血磷脂酰胆碱而产生[4()]。当进行药理学和电生理学实验和组织移除时，对于CCI在第IO-16天之间，对于CFA在第1-3天之间，并且对于溶血磷脂酰胆碱在第7-14天之间，观察到术后最大行为致敏作用。行为检测热敏感性通过测量响应针对后足中部足底无毛表面的有害热刺激(Hargreaves'热刺激剂，LintonInstrumentation,Diss,英国)的縮足潜伏期(PWL，s)进行评估。机械敏感性记录为针对校准的vonFrey细丝(Stoelting，Illinois,美国)的缩足阈值(PWT,mN/mm2)，如先前所述[39]。对有害冷的敏感性通过将动物放置在含有1cm深的4t:水的铝底的水浴中，并且计数足保持悬挂超过20秒的时间。鞘内施用药物下述药物在37°C以50pl的基于盐水赋形剂的体积进行鞘内施用icilin(在盐水中2.5-200pM，具有0.2%二甲基甲酰胺，DMF)，LY341495(在盐水中100^M)，UBP1112(在盐水中200pM),2R,4R-APDC((2R，4R)-4-氨基吡咯烷-2,4-二羧酸酯)，在盐水中300pM),ACPT-III((1R,3R,4S)-l-氨基环戊烷-l,3,4-三羧酸)，在盐水中3mM),AP-4,((L-(l)-2-氨基-4-膦酰基丁酸(phophonobutyricacid)),在盐水中3mM)，纳洛酮(在盐水中0.5mM),NMDA(在盐水中75^M)和ACPC(l-氨基环丙烷羧酸，在盐水中15PM)(TocrisCookson,Bristol,英国)，(-)-薄荷醇(1R，2S,5R-(-)-薄荷醇，在盐水中4mM),肉桂醛(在盐水中1.5mM)和钌红(在盐水中5^M)(西格玛-奥得里奇有限公司，英国)和蒜素(在盐水中0.5mM，具有0.5%的DMF)以及二硫化二烯丙基(DADS，在盐水中1mM，具有0,5%的DMF)(LKT实验室公司(LKTLaboratoriesInc.),StPaul,画，美国)。在处于行为致敏作用的最大水平的动物中，使用25-号针头微量调节注射器(BD生物科学(BDBiosciences),牛津，英国)，如先前所述[39]，在短暂的氟垸麻醉下将药物注射到L5/6鞘内空间。在注射后15分钟以允许从麻醉复苏[4()'41'42]，开始行为反射检测，并且此后每5分钟继续，直到读数恢复到基线水平(在每种情形中n-6)。我们及其他人[4()'41'42]发现经过15分钟完全从麻醉状态恢复。进行所有适当的控制，以消除由于赋形剂或注射方法引起的影响的可能性。在CCI和首次用于实验的动物中检测TRPM8通道激活剂icilin和(-)-薄荷醇。icilin的作用另外在具有CFA-诱导的炎症或具有溶血磷脂酰胆碱-诱导的脱髓鞘的动物中进行评估。还将icilin与p-阿片样物质受体拮抗剂纳洛酮、组II代谢型谷氨酸受体(mGluR)拮抗剂LY341495、或组HImGluR拮抗剂UBP1112共同施用。在CCI动物中评估这些拮抗剂单独的作用以及组IImGluR激动剂2R,4R-APDC和组IIImGluR激动剂ACPT-III与AP-4的作用。TRPA1通道激活剂肉桂醛，单独的和与icilin—起的，在CCI动物和首次用于实验的动物中检测。此外，TRPA1通道激活剂蒜素和二硫化二烯丙基在首次用于实验的动物中进行评估。icilin和肉桂醛在CCI动物中的作用也在另外存在钌红的条件下进行研究。局部施用药物Icilin以2.5-500(iM(在水中，具有0.2%DMF)的浓度施用，通过将CCI或首次用于实验的大鼠无限制性放置在1cm深(足以覆盖足)的水浴中5分钟，将水浴温度恒温控制在3(TC的温度，或通过非常轻微地麻醉大鼠，并且将后足浸没在含有5mlicilin(500(^M-5mM，具有在0.2%水性Tween-80中的45%二甲基甲酰胺的赋形剂)的小管中持续5分钟，然后进行感觉检测持续60-80分钟。还评估(-)-薄荷醇及其立体异构体异薄荷醇(1S，2R,5R-薄荷醇)和(+)-薄荷醇(lS,2R,5S(+)-薄荷醇)(4-16mM，在80%乙醇中)的作用。相关的赋形剂总是在相似的实验中进行评估。相反，肉桂醛(1.5mM，在水中)的作用以及肉桂醛与另外的icilin(80[iM，在水中，具有0.2%DMF)的作用在首次用于实验的动物中进行评估。icilin(80pM)的作用进一步在已经进行了击倒TRPM8的反义和错义处理的CCI动物中或紧接在鞘内注射了LY341495或UBP1112之后立即进行评估。通过皮下热敏电阻探针测量实际皮肤温度，并且发现在高于水浴温度约0.5i:处平衡。在不同温度(10-22'C，5分钟)的短暂的足浸没对CCI大鼠的影响通过机械检测评估。测量了在16°C冷剌激5分钟后，在CCI中鞘内LY341495或UBP1112对同侧致敏作用的逆转的作用。反射检测在刺激后5分钟开始，除非动物已经被麻醉，在这种情形中，允许15分钟进行恢复。在所有的药理学实验中检测6只重复的动物。背部脊神经根切断术为了确定在脊髓中的TRPM8表达是否主要是突触前还是突触后的，在椎板切除术暴露了背根之后，在麻醉下进行单侧L2-6背部脊神经根切断术。8天后，取出组织，并且处理进行免疫组织化学。蛋白质印迹实验通过先前所述的标准方法进行[39]，更详细的描述参见补充材料。免疫组织化学实验通过先前所述的标准方法进行[39]，更详细的描述参见补充材料。TRPM8的反义击倒反义和错义寡核苷酸是22-mers，在5'和3'末端的最后2个位置具有硫代磷酸酯键(MWG生物技术(MWGBiotech)，Ebersberg,德国)。相对于大鼠TRPM8基因开放阅读框的起点，反义从碱基-10延伸到碱基+12:5'C*T*CGAAGGACATCTTGCCGT*G*G3'，其中*表示硫代磷酸酯键。错义设计在残基3，11,14和22处适当具有C/G或A/T倒位，保持总的G/C含量。两条寡核苷酸的BLAST搜索没有表示出与任何已知的基因序列的显著互补性。将含有寡核苷酸(lpg/pl，在无菌盐水中)的14天或7天渗透性微型真空泵(分别用于CCI实验或首次用于实验的电生理学实验----AlzetMinipump,2002，2001型；CharlesRiver,英国)与在脊髓硬膜下插入到水平L5/6的导管连接，并且产生预测的0.5pl/h的输注速率。在微型真空泵植入的同时进行CCI外科手术。进行感觉检测，以评估在也已经经历CCI损伤的动物中的行为致敏作用的时间-过程。局部而不是鞘内施用icilin，以防止与输注导管的任何干扰。在4-5天的时间间隔后进行外周神经记录和组织收集，以允许用于蛋白击倒的时间。电生理学外周在首次用于实验的动物(n=7)中进行隐(感觉)神经的记录，以评估局部icilin对初级传入的影响。另外，对先前已经在第4-5天开始进行TRPM8反义或错义处理的动物进行记录。将大鼠麻醉(用0.6ml25%尿烷/100g,i.p.)，并且将隐神经暴露，并与其相连的静脉和动脉解离。在液态石蜡下的进一步解剖能够识别包括少量纤维的传入制备物。使用两极电极和外周刺激技术[43]，确定单鉴定的传入纤维的传导速率。在分离制备物之后，将icilin(200|iM，在水中，具有0.2%DMF),(-)-薄荷醇(4mM，在25。/。乙醇中)仙人掌毒素(lmM，在乙醇中)或单独的赋形剂施用到后肢感受域，并且使用Chart程序(版本3.6)记录神经元反应。中枢在CCI动物中进行脊髓背角神经元的记录，如前述[39]。在氟烷诱导后，在颈静脉和气管插入导管，并且递送静脉内麻醉剂a-氯醛糖(0.6mg/kg,Fisher)和尿烷(1.2mg/kg，西格玛(Sigma))，在整个实验过程中，需要时补充小剂量的a-氯醛糖。通过恒温调节的加热毯将核心体温保持在37-38。C。将动物放置在立体结构内，并且使用3对鹅-颈钳支持胸腰部脊柱。在L2-L5进行椎板切除术，并且在暴露的脊髓上递送琼脂(2%，在盐水中，处于37°C)，以增加机械稳定性。在记录区域上，去除琼脂和脊髓硬膜，并且向池内倒入液体石蜡。通过装满4MNaCl的7-管玻璃微电极的中间管(末端直径4-5mm,DC电阻5-8MQ)，记录来自单个多接受性神经元(multireceptiveneuron)的细胞外记录。在远端后肢上的毛囊神经支配的神经元的感受域通过无害刷拭刺激(brushstimulus)进行鉴定[39]。将icilin(200|uM，在水中，具有0.2%DMF)外周施用到各个记录的神经元的感受域，并且记录对旋转的刷子(rotatingbrush)的神经元反应的影响，并且使用Spike2程序(版本3.2,CED)进行分析。使用20nA-80nA的电流(神经孔BH2离子电泳系统(NeurophoreBH2ionophoresissystem),医学系统(MedicalSystems),GreatNeck,纽约)，将组IIImGluR拮抗剂UBP1112(20mM，在水中)，pH8.5,和对照1MNaCl，pH8.5从所述电极的侧管进行离子电泳，以测量对神经元针对icilin反应的影响。统计学使用Sigmastat软件(版本2.03)分析所有数据的统计学显著性，认为p值<0.05是显著性的。使用斯氏t检验评估在与神经损伤在同侧的足和对侧的足之间的热敏感性中的差异。药物治疗的任何作用通过单向重复测量ANOVA而后通过Dunnett'spost-hoc多比较检验进行分析。用于机械敏感性的等价的非参数检验是关于同侧对侧差异的Wilcoxon等级检验，和Friedman重复测量ANOVA，而后是关于给药前对照数值的变化的Dunn's检验。蛋白质印迹光密度测定值使用Wilcoxon检验进行比较，免疫组织化学细胞计数通过单向ANOVA分析，并且电生理学峰(spike)频率通过关于等级的单向ANOVA进行分析。蛋白质印迹同侧或对侧L4-L6背根神经节(DRG)取自CCI动物(n-6)，和取自I动物。DRG还取自首次用于实验的和已经进行反义或错义处理以击倒TRPM8表达的CCI动物(11=5)。将来自CCI动物的脊髓切成对半，并且来自首次用于实验的动物的样品也进行处理。在取出后，立即称重个体样品，并且匀浆。对于总裂解物制备，将组织在20体积的Laemmli裂解缓冲液(Tris(tris-羟甲基氨基乙烷，50mM,pH7.4，具有5%巯基乙醇和2%十二烷基硫酸钠(SDS))中匀浆，煮沸5分钟，并且冷冻。在使用脊髓样品的一些情形中，制备未加工的微粒级分，以与胞质蛋白相比较获得结合的膜的相对富集。将组织在20体积的冰冷的Tris缓冲液(50mM,pH7.4,含有1%蛋白酶抑制剂混合物III(Calbiochem,默克生物科学有限公司(MerckBiosciencesLtd.),Nottingham,英国)中匀浆，并且然后在4。C以11000g离心45分钟，之后将沉淀物溶解在Laemmli缓冲液中。按先前所述进行蛋白质印迹[39]。使用(NuPage系统，Invitrogen有限公司，Paisley,英国)在3-8%Tris-乙酸梯度凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白。将印迹用下列抗体温育针对TRPM8的兔多克隆抗体(针对TRPM8残基278-292和1090-1104(人)激发的抗体；1:500;AbeamLtd.，Cambridge,英国，或有时用针对TRPM8残基656-680(大鼠)激发的抗体；1:100;菲尼克斯肽(PhoenixPeptides),Belmont,CA,美国)，针对TRPV1的兔多克隆抗体(1:250,Chemicon国际有限公司(ChemiconInternationalLtd),Harrow,英国)，或针对甘油醛-S-磷酸脱氢酶(GAPDH，1:750;Chemicon)的小鼠单克隆抗体，并且利用口eurons口ra--连接的二抗和增强的化学发光检测免疫反应性条带。使用ScanAnalysis(Elsevier)程序进行蛋白条带的定量光密度测定分析。通过将所述抗体与来自异源表达TRPM8的细胞(或对照)的膜制备物或抗原性肽(或对照)预先温育，而进行抗原预吸附对照，以评估TRPM8抗体的特异性。使用GeneJuice试剂(Novagen,默克生物科学有限公司(MerckBiosciencesLtd.),Nottingham,英国)，用在pCMV6-XL4表达质粒中的人TRPM8或空载体(OriGene技术公司(OriGeneTechnologiesInc.),Rockville,MD,美国)转染COS7细胞，并且在48小时后使用。将细胞刮到包含1%蛋白酶抑制剂混合物III(Calbiochem)的冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并且匀浆(Ystml匀浆器)，然后以lOOOg离心10分钟(并且弃掉低速沉淀物)。然后，将上清以48，000g离心30分钟，并且将来自此次离心的沉淀物重悬在初次抗体缓冲液(2%BSA,0.1%吐温-20，在PBS中)中。将抗-TRPM8(残基278-292和1090-1104;人)抗体加入到TRPM8-表达或对照膜混悬液中，并且在使用前在4°C摇动16小时。在抗-TRPM8(残基656-680;大鼠)抗体的情形中，抗原性肽是可利用的，因此将抗体的等分试样用该肽(以lmg/180pl的储备浓度溶解在PBS中)预先温育，通过在4°C摇动16小时，以5吗肽1吗抗体的比例使用。对照等分试样仅用PBS处理。免疫组织化学从与CCI同侧或对侧、或从首次用于实验的或脊神经根切断的动物的腰段部分L5/6采集DRGs和脊髓。将组织在液氮中骤冷，并且包埋在OCT(CellPathplc.Powys.Wales，英国)中。切割恒冷箱切片(15pm)，并且解冻-封片在聚-L-赖氨酸载玻片(Merck-BDH)上。将载玻片在室温下在10%正常山羊血清,0.1MPBS，pH7.4,0.2%TritonX-100,4%鱼皮明胶中封闭1小时，并且用适当的在缓冲液(O.lMPBS,pH7.4,0.2%TritonX-IOO，4%正常山羊血清，4%鱼皮明胶)中的初次抗体温育过夜。使用的抗体为兔多克隆抗-TRPM8，针对残基656-680(大鼠)(菲尼克斯肽(PhoenixPeptides),l:450)激发，小鼠单克隆抗-NF-200(西格玛(Sigma),1:1000),小鼠单克隆抗-外周蛋白(Chemicon,1:250),小鼠单克隆抗-NeuN(Chemicon，1:500)。在评估用于免疫组织化学的TRPM8抗体的特异性的实验中，将抗体等分试样用抗原性肽或PBS对照预先温育，如上述。洗涤载玻片，用在排除TritonX-100的相同缓冲液(山羊抗-兔AlexaFluor5681:750,山羊抗-小鼠AlexaFluor488,1:500,分子探针(MolecularProbes),OR,美国)中的适当的荧光性二次抗体温育，洗涤，用To-Pro核染色剂(1:1000,To-Pro-3-碘化物，分子探针(MolecularProbes))进行染色，盖上盖玻片并且密封。对照切片按上述省略初级抗血清进行处理。切片用LeicaTCSNT共聚焦显微镜(LeicaMicrosystemsGMBH,德国)显现。使用图像工具软件(UTHSCSAImageTool版本3.0)进行图像分析，并且使用AdobePhotoshop7.0进行图解。在每组中从3只动物中的每一只对5-8张随机选择的DRG切片(分隔100pm)进行细胞计数，并且只计数具有清楚的核的神经元。结果表示为TRPM8-标记的细胞占来自所有切片的外周蛋白/NF-200标记的细胞总数的比例。结果外周激活TRPM8通道对神经损伤-诱导的反射致敏作用的逆转为了模拟潜在的临床应用，我们通过将具有坐骨神经慢性縮窄性损伤(CCI)的大鼠放置在具有1cm深的药物溶液的水浴中而向足局部施用icilin，保持在3(TC，以避免对局部皮肤温度的任何影响。5分钟后，icilin(80pM)，而非赋形剂(0.2%二甲基甲酰胺，在水中)引起显著的针对热和机械刺激的CCI-诱导的行为反射致敏作用的逆转(图1A)。从2.5^M直到最大500nM观察到浓度-依赖型影响，对对侧或首次用于实验的反应没有影响(图1B)。在高得多的icilin浓度处，在与CCI在同侧和对侧以及在首次用于实验的大鼠中，我们观察到倾向于增加反射敏感性的起始(表l)，其仅在最高检测浓度5mM在机械和(延迟后)在热检测中是统计学显著的。表1:局部施用的icilin针对神经病性致敏作用的止痛作用在非常高的浓度恢复到一般伤害性作用<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>药物对反射反应的显著影响表示为t表示从基线的显著增加，表明icilin的止痛作用，§表示从基线值的显著减少，表明痛觉过敏作用。这种作用不同于在低浓度icilin的突出的痛觉缺失，因为它不是对致敏的状态特异性的，并且可能是由于与其它靶点或非特异性作用的弱相互作用引起的。致敏的反应的特异性逆转也由另一种选择性TRPM8激活剂，(-)-薄荷醇(4mM)引起。立体异构体异薄荷醇和(+)-薄荷醇，它们是效力低几倍的TRPM8的激动剂[44'45]，也以8mM和16mM的浓度产生致敏的反应的逆转(图1C)。预测icilin激活含有TRPM8的传入，因为我们在局部施用icilin后记录在隐神经传入中的发放活性(图1D)。解剖神经，以产生少量的精细传入(fineafferent)的制备物，其具有达到2.6ms"的传导速率(表示C-和A5-纤维传入[46])。施用到后肢感受域的icilin(200pM)在所记录的精细传入的21.6%(40/185)中引起发放频率的显著增加，发放频率从基线4.5±2.5Hz增加到31.6士3.4Hz，平均7倍增加，到最大影响的平均时间是3.3±0.5分钟。Idlin不产生快速的脱敏作用，这与一些报道[47]—致，而与另一些报道[48]不一致。一直观察到恢复。从多毛的和无毛的皮肤二者均获得相似的结果。大的有髓鞘的机械性刺激感受器(传导速率6.8-15ms—1，1^43)未受影响。与TRPM8-介导的机制一致，将足浸没在16-20。C5分钟也产生统计学显著的机械性痛觉缺失(图1E)。来自皮下热敏电阻探针的记录显示在相似条件中5分钟后深层皮肤温度比水浴温度高0.5°C。这一温度处于预测激活TRPM8的范围内，并且刺激无害的冷-敏感性纤维。低于14°C的浸没温度(在除了TRPM8之外还有其它冷感受器也可能被激活的范围内)引起局限在后足浸没期间的主动伤害性縮回反射，这与对伤害性冷纤维的已知的温度激活范围一致[49]。TRPM8在传入浅层背角(superficialdorsalhorn)的定位在神经损伤后增加的表达。通过免疫印迹和免疫组织化学研究TRPM8在DRG和脊髓中的存在和定位。在将DRG迅速匀浆在Laemmli裂解缓冲液中并且SDS-PAGE后，免疫印迹用针对TRPM8残基278-292和1090-1104(人)激发的兔多克隆抗体[5()]探测，显示出在约128kDa(TRPM8的预测分子量)的单一的、强条带，在约170,60和50kDa观察到弱条带(图2A)。抗原-预先吸附和反义-击倒对照均与该抗体在所用的条件下识别处于约128kDa的TRPM8的特异性一致。将所述抗体用来自转染了TRPM8表达质粒的COS7细胞的膜预先温育，消除了处于128kDa的条带，而用来自转染了空载体的细胞的膜假预先吸附没有消除该条带(图2A)。相对应地，将TRPM8反义寡核苷酸鞘内递送到首次用于实验的(非CCI)大鼠持续5天，也导致对该128kDa条带的几乎完全的击倒(图2A)，而错义对照寡核苷酸无效(见下文)。鞘内递送的荧光-标记的寡核苷酸己经显示出在初始递送后4小时就能有效地透入DRG[51]。所述弱条带，至少在50和60kDa处的条带，在每种情形中保持存在，并且因此可能描述所述抗体在这些条件下的非特异性相互作用。对于其它对照，我们表明TRPV1免疫反应性不受用TRPM8反义试剂处理的影响，并且持家酶GAPDH(36kDa)在每条泳道中均匀存在(图2A)。在神经损伤之后，特别是在同侧，在128kDaTRPM8-免疫反应性条带的表达中存在显著的增加，但是在对侧的DRG没有显著增加(图2A)，而关于GAPDH的免疫反应性没有改变。在CCI的同侦ij，TRPM8表达作为GAPDH的百分数的光密度测定比例为80.7±4.1，其显著大于在CCI对侧观察到的比例(49.3±3.2)和在首次用于实验的DRG中观察到的比例(50.7士2.7)，(平均值士SEM,n=5-6)。L4-5脊髓提取物表现出TRPM8免疫反应性存在于中间，并且在制备了未加工的微粒级分(以11,000g离心45分钟)后，这些也表现出与损伤在同侧的表达的一致的增加。与CCI在同侧的光密度测定数值为首次用于实验的数值的198±6.7%(p〈0.05;平均值士SEM,n=5)，而对侧数值为125±7.1%(p>0.05)。使用针对TRPM8残基656-680(大鼠)的兔多克隆抗体进行免疫组织化学[52]，它的特异性通过抗原预先吸附和反义击倒对照进行评估。在用肽抗原预先温育之后，消除了在离散的DRG细胞亚群中观察到的标记(没有观察到阳性细胞，在12张500pr^的切片上计数，与下列平均值相比较5.3±0.4TRPM8-阳性细胞/500pm2具有抗体假处理的DRG切片，禾口5.1±0.5TRPM8-阳性细胞/500pm2具有未处理的抗体的DRG切片，分别在12张切片上计数)。在免疫印迹中，抗体还标记在首次用于实验的DRG组织中的约128kDa的单一条带，其通过用肽抗原预先吸附或通过在前5天鞘内输注TRPM8反义而被消除(图2B)。脊髓的免疫组织化学染色显示脊髓中的TRPM8主要表达在浅层背角中，如同C-纤维标记、外周蛋白(图2C)，并且在背部脊神经根切断术(L2-6)后，在同侧失去大部分的TRPM8(以及外周蛋白)的免疫反应性(减少约80-90%)，这表明脊髓TRPM8主要来源于传入。为了确认免疫印迹发现，在与损伤同侧的背角中，TRPM8-样免疫反应性水平增加(约70-80%)，但是保持与在首次用于实验的动物中的水平相似的分布(图2D)。为了确定传入TRPM8表达的增加是否发生在特定的DRG细胞亚群中，我们研究了TRPM8与有髓鞘传入(神经丝-200;NF-200[53])和无髓鞘传入(外周蛋白[4()])的标记的共同定位。在首次用于实验的大鼠中，TRPM8免疫反应性主要限制在无髓鞘DRG细胞亚群中(8.3±0.2%的外周蛋白-阳性细胞；34/408细胞)并且仅最低限度地表达在有髓鞘的、，-200-阳性细胞中(1.3±0.5%;6/445细胞)。然而，在CCI后，在同侦!j，TRPM8表达在NF-200-和外周蛋白-阳性细胞中均分别显著增加到7.9±1.2%(31/390细胞)和15.5±0.8%(64/412细胞)。来自首次用于实验的相对应的对侧数值没有改变，为2.0±0.4%(14/346细胞)和9.2±0.4%(42/452细胞)(图2E，F)。数据收集自3只CCI和3只首次用于实验的动物，在l5-21张切片上计数。其它TRPM8-表达NF-200-阳性细胞是小的(平均直径，19/7±0.8,)，推测为AS有髓鞘神经元网。每张切片上的NF-200-或外周蛋白-阳性细胞的直径或NF-200-或外周蛋白-阳性DRG神经元的数目没有显著差异。作为icilin-诱导的痛觉缺失的调节剂的TRPM8的分子鉴定为了说明TRPM8在icilin痛觉缺失中的特异性参与，我们进一步使用反义寡核苷酸击倒策略。鞘内递送TRPM8反义或错配的对照寡核苷酸13天，以与在CCI后发展的致敏作用相似。CCI-诱导的行为反射致敏作用的发展不受影响，包括热痛觉过敏和机械性异常性疼痛(图3A，B)以及冷异常性疼痛(对照CCI动物在手术后9-11天表现出与神经损伤在同侧的足从4。C水中抬起，最大为8.1士0.5秒，而在反义-处理的CCI动物中对应的数值为7.6士0.6秒)。相反，通过用反义(图3A)而非错义(图3B)试剂处理，消除了通常由应用到足的80pMicilin产生的神经病性反射致敏作用的逆转(图1A)。在反义-和错义-处理的动物中，在icilin处理后10-25分钟的同侧致敏作用的逆转的平均值士SEM。/。如下对PWL分别为7.7士7.4%和82.8±6.9%，并且对PWT分别为9.4±8.2%和58.7±8.2%;用错义-处理的而非反义-处理的动物，保持idlin的显著作用(p0.05)。当反义渗透性泵耗尽时，然而动物仍然是神经病性的(在手术后18天插入14天微型泵和CCI)，针对icilin的反应恢复为对于PWL83.7±10.1%的致敏作用逆转，并且对于PWT为54.0±7.2%。击倒的效用通过SDS-PAGE/免疫印迹评估。128kDaTRPM8-免疫反应性条带在同侧和对侧DRG中的表达被所述反义试剂极大减少，并且通常在神经损伤同侧观察到的TRPM8表达的增加被防止(图3C)。错义试剂没有作用(图3C)，表现出与在未处理的CCI动物中相似的TRPM8表达(图2A)。在错义-处理的动物中，TRPM8:GAPDH比例为77.9士2.0%(与CCI在同侧)和52.9±2.1%(与CCI在对侧)，类似于相对应的对照数值(图2A和上述)，而在反义-处理的动物中，数值要低得多(分别为19.8±2.2%和14.9士2.1%，平均值±SEM，n=5)。为了证实TRPM8的反义击倒导致传入的相关功能变化，在插入泵后4-5天，对接受鞘内递送TRPM8反义或错义寡核苷酸的首次用于实验的动物进行隐神经记录。在接受反义的动物中，由局部icilin(20(HiM)引发的发放频率的增加强烈减小。仅有3/34个记录的缓慢传导纤维(8.8%)表现出响应于药物的部分激活，发放由基线5.8±1.4增加到约2倍至12.7±0.6HZ，比较在首次用于实验的动物中超过20%的精细传入中观察到7倍的增加。相反，错义动物在40个记录的纤维中有25%表现出发放频率的7倍增加，从基线3.3±0.7增加到23.1±3.2Hz，类似于来自首次用于实验的动物的结果。类似地，在错义-处理的动物中，局部(-)-薄荷醇(4mM)在平均发放频率中产生约8倍的增加(从4.5±2.9增加到38.9±7.6Hz)，激活20%的纤维(35个鉴定的所记录的传入)。这与在反义-处理的动物中没有明显激活的传入相比较(平均发放频率在背景为4.0士1.8Hz，在药物施用后4.8士1.9Hz，28个鉴定的所记录的传入)。然而，TRPM8反义处理没有改变局部施用的仙人掌毒素(lmM)的影响，仙人掌毒素是一种有效的TRPV1激动剂，作用为对照。在反义-处理的动物中，仙人掌毒素在激活的传入中引发发放频率的6倍增加(从4.5士0.7的基线增加到最大反应的25.9±1.8Hz，在28个被记录的中有16个被激活的传入)，其与在错义-处理的动物中的反应(在发放频率中表现出平均5倍的改变，由4.6±2.8改变为24.8士3.1Hz)类似。中枢鞘内施用TRPM8激活剂还抑制神经病性致敏作用。由于TRPM8存在于初级感觉神经元的中枢末端以及它们的外周末端上(图2B,C,[5"5])，我们研究了接近屮枢末端鞘内施用TRPM8激活剂是否将也产生痛觉缺失。在热和机械检测中，鞘内注射icilin(10nmol)产生CCI-诱导的行为反射致敏作用的强有力的逆转(图4A,p〈0.05，直到55分钟)。在CCI大鼠中鞘内注射(-)-薄荷醇(200nmol)也引起致敏反应的显著逆转，持续35-40分钟(图4B)。由于icilin对TRPM8的更高的效力和功效[15]，其它实验主要利用icilin作为代表性的TRPM8激活剂。在热和机械检测中，icilin产生的剂量-依赖型止痛作用均局限在神经损伤一侧，其在0.125nmol是统计学显著的，并且在lOnmol增加到几乎完全的致敏作用逆转。非线性曲线-拟合表明icilin对PWL和PWT的最大作用相似(分别91.6±9.9和82.6±6.8%逆转致敏)，ECso值(50%最大作用的剂量；分别为0.17±0.02和0.31±0.02nmol)也是如此。与TRPM8激活剂的作用完全相反，TRPA1激活剂肉桂醛P，75nmo1，鞘内注射)在热和机械检测中显著增加反射反应性，并且在神经损伤对侧以及在同侧均有效(图4C)。肉桂醛的致敏作用通过共同注射钌红(0.25nmol)而被防止，钌红可以阻断TRPA1通道[22'58]，而鞘内注射的icilin的止痛作用不受影响(图4D)。在首次用于实验的动物中也观察到肉桂醛的致敏作用，在PWL中减少36.9土7.9%,并且在PWT中减少41.9±6.7%。利用2种其它的TRPA1激活剂[57'58蒜素(251111101)和二硫化二烯丙基(50nmol)产生相似的作用，对于蒜素(25nmo1)，其中相对应的减少分别为33.2±5.9%和20.7±8.2%，对于二硫化二烯丙基(50nmo1)，等价数值为25.9±7.0%禾口28.5±6.2%(平均值±SEM,n=3-6)。相反，TRPM8激活剂，icilin(10nmol)和(-)-薄荷醇(200nmol)在首次用于实验的动物中没有作用(数据未显示)。局部施用肉桂醛(1.5mM)在I动物中还产生行为反射的两侧致敏作用(在PWL中平均减少32.0±8.6%,和在PWT中平均减少20.2±8.2%，p<0.05,n=6)。这对应于在足底内注射肉桂醛后报道的舔和摇晃行为以及PWL中的减少,。在其它实验中，我们研究了由TRPA1激活剂或其它疼痛模型引起的致敏疼痛行为是否对icilin-诱导的痛觉缺失敏感。由鞘内或局部肉桂醛引起的致敏作用被鞘内icilin显著减弱(表2)。表2:在不同疼痛模型中通过鞘内icilin施用逆转致敏作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>(vi)在手术疼痛模型中，或在肉桂醛-诱导的反应的情形中，显著的同侧-对侧差异，与之前基线的差异表示为(p0.05)。显著的icilin(lOnmol,i.t)-诱导的致敏作用逆转表示为(卞,p<0.05)。局部肉桂醛的作用另外被局部icilin(20(VM,数据未显示)逆转。由坐骨神经的病灶内脱髓鞘,或足底内注射完全弗氏佐剂(CFA)引起的致敏作用也被鞘内icilin显著抑制(表2)。Icilin逆转神经病性致敏作用的中枢机制包括mGlu组II/III受体。由于局部icilin提高在精细传入中的活性(图1D)，并且鞘内和局部的icilin均逆转神经损伤-诱导的致敏作用，所以在icilin作用中，中枢-介导的事件可能是重要的。预测icilin-反应性传入释放谷氨酸，因此我们假设在背角中的抑制性谷氨酸受体可能是icilin-诱导的痛觉缺失的基础。组n/IIImGluRs可以促进这样的作用，原因在于在炎性、神经病性和急性疼痛模型中它们是防感受伤害的[29，3()'31]，并且抑制致敏状态中的初级传入和脊髓神经元之间的传输[32'33]。组IImGluR位于n层初级传入末端上，特别是在小的疼痛性传入上[27'6()]，尽管一些发现是突触后的并且在神经胶质上[28]。还发现组IIImGluRs突触前位于背角中，并且45。/。与IB4或物质P(小感受伤害神经元的标记[59])共表达。为了评估组II/nimGluRs的激活是否可能模拟神经病性致敏作用的icilin逆转，我们分别鞘内注射选择性组II或IIImGluR激动剂2R,4R-APDC或ACPT-III禾nAP-4。2R,4R-APDC(15nmol)在CCI同侧(注射后15-30min)引起72.1±6.4%的热逆转和56.0±10.9%的机械反射致敏作用逆转，对对侧反应没有影响。ACPT-III和AP-4(分别150nmol)也逆转热致敏作用(分别为83.6±6.3%禾口60.8±6.7%),以及机械致敏作用(65.7士11.4%和60.7±8.0%)，同样对对侧没有影响(在每种情形中，p<0.05)。此外，选择性组n和组IIImGluR拮抗剂LY341495(5nmo1，图5A)和UBP1112(lOnmol,图5B)分别防止icilin作用(10nmo1,图4A)。类似地，由鞘内(-)-薄荷醇(200nmol,图4B)产生的痛觉缺失被鞘内LY341495和UBP1112逆转。只用(-)-薄荷醇，在注射后20-30分钟的平均致敏逆转百分数对PWL为86.1士8.1%,且对PWT为80.6±4.2%，使用薄荷醇和LY341495，对PWL为22.0±6.9%，且对PWT为7.1±7.1%，使用(-)-薄荷醇和UBP1112，对PWL为9.2±6.9%，且对PWT为0.0±0.0%(n=6)。单独的LY341495和UBP1112均无任何作用(数据未显示)，这表明组II/IIIniGluRs在CCI后表现出很少紧张性的激活，但是特异性地在icilin的下游使用。相反，鞘内共同施用p-阿片样物质受体拮抗剂纳洛酮(25nmol)和icilin没有作用(图5C)，这表明icilin痛觉缺失是阿片样物质-独立型的。为了避免非特异性药物相互作用的任何可能性，我们还局部施用了icilin(200pM)，但是鞘内施用mGluR拮抗剂。图5D显示在这种情形中的icilin对热和机械致敏作用的逆转同样被LY341495或UBP1112防止。将皮肤冷却至16。C的止痛作用(图1E)也被鞘内施用的LY341495(5nmol)或UBP1112(10nmol)防止。在存在任一种药物的条件下，由冷却引起的同侧CCI-诱导的PWT减少的平均逆转百分数为0.0±0.0%(n=5)。为了证实icilin在单个脊髓神经元水平的止痛作用，我们进行大层I和III/IV神经元(其结合伤害性和非伤害性输入)的体内细胞外记录。向CCI同侧的外周感受域区域局部施用icilin(200pM)引起对机动旋转刷(motorisedrotatingbrush)的增加的神经元反应的抑制(图5E)。在受icilin影响的12个神经元的8个(2个在层I，6个在层III/IV)中，刷-诱导的反应减少为37.4±5.5%，pO.OOl)。赋形剂没有作用。对侧神经元不受影响(是对照的111.9±8.9%;n=6)。作为关于反射研究的一种组II/IIImGluR拮抗剂的实例，将UBP1112以20-60nA的电流在所记录的背角神经元附近进行离子电泳。UBP1112逆转icilin的作用；刷-诱导的发放速率回复到对照数值的80.2±9.3%(图5E)，但是单独的UBP1112没有作用，盐水电流对照也没有作用。由于一些组II/IIImGluRs可能是突触后的，我们想知道icilin能否在CCI动物中逆转由鞘内施用的NMDA引起的行为反射反应性的另外的致敏作用。Icilin(10nmol)清楚地减弱由鞘内注射的3.75nmolNMDA加0.75nmol其共激动剂位点激活剂ACPC诱导的另外的同侧致敏作用。在热检测中的同侧PWL数值在基线为10.1±0.6s，并且减少到7.9士0.3s(在注射NMDA/ACPC后15-30分钟)，但是在额外存在icilin的条件下增加到14.9±0.6s。对侧的数值没有被icilin或NMDA/ACPC改变。在机械检测中的同侦UPWT数值在基线为1504.2±105.3mN/mm2，在注射NMDA/ACPC后为891.6±27.3mN/mm2，并且共同注射icilin后为3482.7±174.3mN/mm2(平均值±SEM,n=6)。对侧数值同样没有改变。因此，由icilin引发的中枢事件的成分可能是突触后的，尽管注意到功能性NMDA受体也可能存在于传入末端上是重要的[61]。讨论关于解释冷却-诱导的痛觉缺失的机制了解很少，但是最近己在体感传入中鉴定了许多冷-敏感性离子通道，包括TRPM8""。现在，我们表明TRPM8激活逆转神经损伤-诱导的超敏性。TRPM8可以被薄荷醇激活[15'16]，所述薄荷醇在热板和乙酸翻腾实验中是止痛性的，尽管薄荷醇可以在非常高的剂量产生疼痛[62'63]。这里，在神经病性疼痛的CCI模型中，局部或鞘内施用的(-)-薄荷醇产生行为性痛觉缺失(behaviouranalgesia),最可能通过激活TRPM8而产生。使用另一种TRPM8激活剂icilin观察到相似的作用[15]。如使用薄荷醇，发现非常高剂量的icilin引起致敏作用的一般化增加，这影响CCI动物的两侧，并且以相似的方式影响首次用于实验的动物(表l)。重要地，在比引起非特异性感觉变化的那些浓度低200倍的浓度处观察到icilin的止痛作用。TRPM8特异性参与神经病性致敏作用的逆转通过在鞘内输注TRPM8反义寡核苷酸而击倒TRPM8的表达后消除了icilin痛觉缺失而得以证实。此外，通过皮肤冷却至20-16t:而模拟止痛模式，20-16X:为激活TRPM8通道的范围tW。Icilin和薄荷醇在处于3(TC的溶液中皮肤施用，因此避免对皮肤温度的任何可能的药物作用。单独的TRPM8反义对针对有害热、机械刺激或强冷的CCI-诱导的致敏反应没有作用(图3)，与在备选的神经病性疼痛模型中进行的观察相似[26]。由于选择性TRPA1激活剂肉桂醛、蒜素和二硫化二烯丙基不但在CCI后而且在首次用于实验的动物中引起相反的致敏作用/痛觉过敏，所以TRPA1通道在痛觉缺失中的作用似乎是不可能的。icilin的止痛作用仅在致敏的疼痛状态中观察到，但是不限于神经损伤，原因在于由外周炎症、传入脱髓鞘和TRPA1激活引起的致敏作用也被减少。局部施用的icilin的显著行为和电生理学作用显示icilin可以充分穿过皮肤以刺激外周传入，并且表明这种或相关药物的可能的临床用途。含有TRPM8的冷却-反应性传入的精确性质尚不清楚。AS-和C-纤维亚群对~15-30"和<15°(:的不同冷温度范围有反应性[55'37]。无害冷却(15-30。C)在灵长类中激活A&和C-纤维亚群，但是在啮齿动物中几乎仅激活无髓鞘的纤维[64]。相反，强有害的冷通过无髓鞘的多模式伤害性感受器进行信号传导，所述伤害性感受器还响应热和机械刺激[49]。TRPM8激活剂薄荷醇激活冷-敏感性纤维，并且在20-30'C范围内致敏刺激-诱导的反应[65'66]。体外TRPM8研究将这一通道鉴定为适度冷温度的可能的传感器[19]。在DRG和三叉神经培养物中，针对薄荷醇，冷却(15-3(TC)和TRPM8mRNA表达的反应均是紧密相关的[17，18，19]。TRPM8在小的且假定为AS-或C-纤维的5-20%的DRG细胞体上表达[15'16]，而不在大的有髓鞘的纤维上表达。我们观察到TRPM8的免疫反应性通常与外周蛋白-阳性C-纤维亚群相关，但是仅最低程度地与NF-200-阳性传入相关，而高敏感性cRNA杂交表明一些TRPM8mRNA存在于达到19%的鄉-200-阳性传入中[67]。在大鼠中，发现有助于热伤害性和炎症致敏的辣椒素-和热-敏感性TRPV1通道问存在于肽能传入(85。/。)和非肽能(异凝集素-B4，IB4-阳性)细胞中[68]。TRPM8不与肽能或IB4-阳性传入直接相关""，但是通常存在于含有NGF受体，TrkA的那些中,。不同的组已经报道关于TRPM8和TRPV1的mRNA的共表达或DRG的薄荷醇/辣椒素反应性为29-50%[15''9'6()]或接近零[14，16'69]。总之，似乎TRPM8可能通常在独特的冷-反应性传入群体中表达，并且可能还在某些伤害性感受器中以一定程度表达。我们的发现进一步鉴定了在外周蛋白-阳性C-纤维中的增加的表达，但是在小NF-200-阳性的假设的AS-纤维中诱导表达fW,这表明TRPM8表达的可塑性可能参与icilin在神经病性疼痛中的痛觉缺失。在另一种备选的神经病性疼痛模型(连接L5脊神经或事实上在CFA之后)中，没有报道TRPM8的DRG表达中的变化Ps'261，这表明特定模型的特异性方面，诸如在CCI后在DRG中同时存在损伤的和未损伤的传入，可能对TRPM8的上调是重要的。还已经被假定为冷受体的TRPA1，似乎起着完全不同的作用，在首次用于实验的动物中引起反射性疼痛行为，以及在神经病性状态中增加热和机械反应性。这可能与在神经损伤后的临床观察相对应，其中适度冷剌激被感觉为疼痛的[1]。TRPA1主要存在于感觉神经节中的小细胞中[14'22]，并且可能在神经损伤和炎症的同侧增加[25'26]。据报道，神经损伤和炎症诱导的对有害冷(5°C)的痛觉过敏通过反义击倒TRPAl而被减少Ps'^。因此，对TRPA1基因的靶点破坏的纯合突变小鼠表现出针对选择性TRPA1激活剂的减少的反射縮回反应，和减少的有害热的致敏性，以及由这些试剂引起的无害机械性反应的致敏性[23]。然而，TRPA1在有害冷反应中的作用被破坏，来自不同TRPA1一动物品系的结果表明减弱的或未改变的致冷板退縮反应(coldplatew池drawlresponse)[23，24]。因此，TRPA1在冷感觉中的精确作用仍是不清楚的，但是在本发明中，在其它研究中，TRPA1清楚地以促疼痛(pro-nociceptive)方式作用[2￡)'23'57'58]。尽管icilin可以以低效力在TRPA1通道相互作用[14]，但是在本发明中TRPM8激活剂的止痛模式完全不同于TRPA1激活剂的促疼痛模式。据报道，TRPM8/TRPA1在传入中共同表达的程度是最低的[14'67]。由icilin和薄荷醇以及由将皮肤冷却至16"C诱导的痛觉缺失显示为是中枢调控的，并且依赖于组II/nimGluRs。缺少纳洛酮的作用表明对经典阿片样物质痛觉缺失的独立性。此外，在所用的剂量，mGluR组II/III拮抗剂选择性逆转icilin和薄荷醇在致敏的反应中的痛觉缺失，单独使用时没有任何作用。已知组II/inmGluRs抑制伤害性反应,G'31，32，331，并且我们表明，在神经病性疼痛中，组II/nimGluR激动剂选择性抑制致敏的反应。组II和nimGluR亚型均在初级传入中表达，尤其是在IB4-阳性细胞中表达[27。在背角中，激活组II/IIImGluRs可以抑制传入-引发的电位[32]，原因在于组IImGluRs突触前和突触后地存在于初级传入突触上[28]，而组IIImGluRs主要是突触前的[69]。据报道，在培养物和在切片中，薄荷醇增加在DRG和背角神经元之间的一些突触处的mEPSC频率[54'55]，假设其与含有TRPM8的传入的激活(图1D)和增加的谷氨酸释放相对应。图6显示从表达TRPM8的传入释放的谷氨酸可以调控icilin-诱导的痛觉缺失的模型的示意性描述，其中所述调控通过作用在组II/IIImGluRs(突触前地位于伤害性传入上，并且突触后也是可能的)上，以导致疼痛相关的致敏作用的减弱(图5E)和行为性痛觉缺失(图5D)。结论综上所述，这些新颖的发现表明，外周和中枢激活TRPM8均可以产生特异性逆转由外周神经损伤引发的行为反射致敏作用的止痛作用。这种作用由非常低浓度的局部施用的TRPM8激活剂产生，表明其容易在临床情形中应用的可能性。其它致敏的疼痛状态，除了由神经损伤诱导的那些之外，类似地对由TRPM8激活引起的逆转敏感，这强调了TRPM8激活剂和TRPM8作用的下游中枢调控剂如组II/IIImGluRs作为开发新型止痛剂的耙标的可能的价值。参考文献1.Woolf,C丄，和Mannion,R丄(1999).神经病性疼痛病因、症状、机制禾口管理(Neuropathicpain:aetiology,symptoms,mechanisms,andmanagement).柳叶刀(Lancet)353，1959-1964.2.Sprengell,C.(1735).希波克拉底希波克拉底的格言，以及Celsus的句子；解释和参考相当多的作者...向其加入关于一些不能被古人充分区别的一些重大疾病的格言。第二版，校正并且非常多扩充的(Hippocrates:TheAphorismsofHippocrates,andthesentencesofCelsus;withexplanationsandreferencestothemostconsiderablewriters...Towhichareadded,aphorismsuponseveraldistempers,notwelldistinguishedbytheancients.Secondedition,correctedandverymuchenlarged.)Kt.London[s.n.].3.Siegel，R,E.(1970).关于感觉感知的Galen:其千预视觉、听力、嗅觉、味觉、触觉和疼痛以及它们的历史来源的学说，观察和实验(Galenonsenseperception;hisdoctrines,observationsandexperimentsonvision,hearing,smell,taste,touchandpain,andtheirhistoricalsources).Basel:Karger.4.Bini,G.，Cmccu，G.,Hagbarth,K.E,,Schady，W.，禾卩Torebjork,E.(1984).摆动和冷却对由神经内电刺激引发的疼痛的止痛作用(Analgesiceffectofvibrationandcoolingonpaininducedbyintraneuralelectricalstimulation).疼痛(Pain)18,239-248.5.Sauls,J.(1999).冷对疼痛的功效事实还是谬论？(Efficacyofcoldforpain:factorfallacy)OnlineJKnowlSynthNurs6,8.6.Wright，A.(1870).薄荷油作为局部止痛剂(Oilofpeppermintasalocalanaesthetic).柳口十刀(Lancet)2464,726.7.Blumenthal,M.,Busse,W.R.，Goldberg,A.，Grue匿ald，J.,Hall,T.,Riggins,C.W.,Rister,R.S"编.Klein,S.，Rister,R.S.,翻译(1998).完整的德国授权E专论一对草药的治疗指导(TheCompleteGermanCommissionEMonographs—772era/eM"-cGW<ietoZ/erZ^/AfWc/"as0.Austin(TX):美国植物性药材委员会(AmericanBotanicalCouncil);波士顿综合医药通讯(Boston:IntegrativeMedicineCommunication).8.Gobel,H.，Schmidt,G.&Soyka,D.(1994).薄荷油和桉树油制剂对神经生理学和实验痛觉测定的头痛参数的影响(Effectofpeppermintandeucalyptusoilpreparationsonneurophysiologicalandexperimentalalgesimetricheadacheparameters).头痛(Cephalalgia)14,228-234.9.Davies,SJ.,Harding,L.M.,和Baranowski,A.P.(2002).使用薄荷油的治疗后神经痛的新疗法(Anoveltreatmentofpostherpeticneuralgiausingpeppermintoil).疼痛临床杂志(ClinJPain)18,200-202.10.Green,B.G.&McAuliffe,B.L.(2000).辣椒素剌激的薄荷醇脱敏作用。矢豆期抗i^害'性j乍用白勺i正t居(Mentholdesensitizationofcapsaicinirritation-Evidenceofashort-termanti-nociceptiveeffect).生理学行为(PhysiolBehav)68,631-639.11.Galeotti，N.,DiCesareMannelli,L.，Mazzanti，G.，Bartolini,A.&Ghdardini,C.(2002).薄荷醇天然止痛化合物(Menthol:anaturalanalgesiccompound).神经科学通信(Ne画sciLett)322,145-148.12.Caterina,M丄，Leffler,A.,Malmberg，A.B.,Martin,W丄，Trafton，J.,Petersen-Zeitz,K.R.,Koltzenburg，M.,Basbaum,A丄，禾口Julius,D.(2000).在缺乏辣椒素受体的小鼠中的减弱的伤害感受和疼痛感觉(Impairednociceptionandpainsensationinmicelackingthecapsaicinreceptor).禾斗学(Science)288,306-313.13.McKemy,D.D.(2005).有多么冷？TRPM8和TRPA1在冷感觉中的分子逻辑性(HowcoldisitTRPM8andTRPA1inthemolecularlogicofcoldsensation).分子疼痛(MolPain)1,16.14.Story,G.M.,Peier，A.M.,Reeve,A丄，Eid,S.R.,Mosbacher,J,，Hricik,T.R.，Earley，T丄，Hergarden，A.C.，Andersson，D.A.,Hwang，S.W.等，(2003).一种在伤害感受神经元中表达的TRP-样通道ANKTM1被冷温度激活(ANKTM1,aTRP-likechannelexpressedinnociceptiveneurons,isactivatedbycoldtemperatures)细胞(Cell)112,819-829.15.McKemy，D.D.，Neuhausser,W.M.&Julius,D.(2002).冷感受器的鉴定揭示TRP通道在热敏中的综合作用(IdentificationofacoldreceptorrevealsageneralroleforTRPchannelsinthermosensation).自然(Nature)416,52-58.16.Peier,A.M.,Moqrich,A.,Hergarden,A.C.，Reeve,A.J,，Andersson,D.A"Story,G.M.,Earley，T丄,Dragoni，I.，Mclntyre,P,,Bevan,S.，禾卩Patapoutian:A.(2002).感应冷刺激和薄荷醇的一种TRP通道(ATRPchannelthatsensescoldstimuliandmenthol).细胞(Cell)簡，705-71517.Nealen，M丄.,Gold,M.S.,Thut，P.D.&Caterina，M丄(2003).TRPM8mRNA在来自大鼠的冷反应性三叉神经元亚组中表达(TRPM8mRNAisexpressedinasubsetofcold-responsivetrigeminalneuronsfromrat).神经生理学杂志(JNe腦physiol)90,515-520.18.Thut，P.D.,Wrigley,D.，Gold,M.S.(2003).在大鼠三叉神经节中的体外冷传导(Coldtransductioninrattrigeminalganglianeuronsinvitro).神经科学(Neu画ience)119,1071-1083.19.Babes，A.,Zorzon,D.&Reid,G.(2004).在大鼠背根神经节中的两个冷-敏感神经元群体以及它们通过神经生长因子的调节(Twopopulationsofcold-sensitiveneuronsinratdorsalrootgangliaandtheirmodulationbynervegrowthfactor).欧洲神经科学杂志(EurJNeurosci)20,2276-2282.20.Bandell,M"Story,G.M"Hwang,S.W.,Viswanath,V"Eid，S.R.,Pe加s,MJ.,Earley,T丄，禾QPatapoutian,A.(2004).有害的冷离子通道TRPA1被刺激性化合物和缓激肽激活(NoxiouscoldionchannelTRPA1isactivatedbypungentcompoundsandbradykinin).神经元(Neuron)41,849-857.21.Jordt，S.E.,Bautista，D.M.，Chuang,H.H.,McKemy,D.D.,Zygmunt,P.M.，Hogestatt,E.D.,Meng,I.D.,和Julius,D.(2004).芥子油和大麻素通过TRP通道ANKTM1刺激感觉神经纤维(MustardoilsandcannabinoidsexcitesensorynervefibresthroughtheTRPchannelANKTM1).自然(Nature)427，260-265.22.Nagata,K.,Duggan，A.，Kumar,G.&Garcia-Anoveros，J.(2005).疼痛和听觉通道TRPA1的疼痛感受器和毛细胞转导特征(Nociceptorandh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