专利名称：：自发形成的椭圆体磷脂单层囊泡的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于经靶向的药物递送的磷脂组合物和改良的治疗剂。药物试剂包含在磷质膜内，且递送通过膜融合蛋白来促进。更明确地，药物试剂包含在脂质体内，且使用与脂质体结合的鞘脂激活蛋白C(SaposinC)促进递送。背景脂质体是具有由一层或多层同心双分子层形成的脂膜包围的中心水性腔的微小嚢泡。脂质体可以是单层(只具有一层脂双分子层)、寡层(oligolamellar)或多层(具有多层双分子层)。它们的结构使得它们能够将亲水性物质整合入水性内部或将疏水性物质整合入脂5膜。作为用于药物施用的载体，脂质体在理论上具有许多有利方面。同样因为由非毒性组分(通常为非免疫原性、非刺激性和生物可降解的)组成，它们应当能够封装、保持、运输和释放许多种治疗剂至耙器官，从而减少有害副作用。脂质体可形成持续药物释放和递送至特定的细胞类型或身体的特定部位的基础。脂质体的治疗性用途还包括递送以游离形式存在时通常是有毒的药物。通常，通过使磷脂的混合物经历机械力来形成脂质体。例如，许多方法目前用于脂质体组合物的制备。这些方法包括例如溶剂透析、弗氏压碎器(Frenchpress)、挤出(extrusion)(使用或不使用冷冻-融化)、反相蒸发法、简单的冷冻-融化、超声处理、螯合物透析、均匀化、溶剂输注(solventinfusion)、」微乳化、自发形成、溶剂蒸发、弗氏压碎器技术、受控去垢剂透析等。参见，例如，Madden等人，ChemistryandPhysicsofLipids,1990。月旨质体还可通过需要振荡或涡旋的各种方法来形成。与脂质体相关的问题包括胶体不稳定性、大规模灭菌的难度和制造中批次之间的变异性。脂质体制备和制造通常包括有机溶剂的去除，然后挤出或均匀化。这些过程可能将脂质体组分暴露于可降解脂质和整合入脂质体的其他分子的极端条件例如提高的压力、提高的温度和高剪切条件。脂质体制剂的特征通常在于双分子层的大小和数目分布极不均匀。小规模上最优化的条件通常不能很好地放大，大规模批次的制备非常麻烦和费力。脂质体应用的另一个问题是脂体稳定性。悬浮液中的脂质体在^藏、加热以及添加各种添加剂后可聚集并且融合。因为这些稳定性问题，所以通常冻干脂质体。冻干非常昂贵且耗时。当重构时，大小分布通常增加并且封装的材料可能从脂质体渗漏出来。大多数(如果不是所有)已知的脂质体悬浮液不是热力学稳定的。相反，已知的悬浮液中的脂质体通过在它们的形成中使用的能量在动力学上被捕获至更高的能量状态。可以以加热、超声处理、挤出或均匀化的形式提供能量。因为非常高的能量状态试图降^f氐其自由能，所以已知的脂质体制剂经历有关聚集、融合、沉积和与脂质体结合的材料的渗漏的问题。因此可避免一些此类问题的热力学稳定的脂质体制剂是期望的。因此期望开发解决关于当前的脂质体制剂的这些问题的新方法和材料。发明概述本发明总地说来涉及用于形成用于治疗疾病或将活性剂递送至个体的脂质体群体的组合物，所述组合物包含a)至少一种长链阴离子磷脂；b)至少一种短链磷脂；c)和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽；其中当加入水性溶液时脂质体自发形成。在一个实施方案中，阴离子磷脂可选自二油酰磷脂酰丝氨酸(D0PS)、二油酰磷脂酰甘油(D0PG)、二油酰磷脂酰肌醇(D0PI)和二油酰磷脂酸(D0PA)。在另外的实施方案中，短链磷脂可选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰乙醇胺。组合物还可包含具有单峰(monomodal)、双峰或三峰单层嚢泡大小分布的脂质体群体，或包含扁圆和三轴椭圓体单层嚢泡。在另外的实施方案中，组合物，鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质是一种或多种选自鞘脂激活蛋白C、Hl、H2、H3、H4、H5或其混合物的蛋白质。在另外的实施方案中，形成脂质体的组合物包含D0PS、DPPC、DHPC和选自鞘脂激活蛋白C、Hl肽、H2肽、H3肽、H4肽、H5肽或其混合物的鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽。在另外的实施方案中，形成脂质体的组合物包含D0PS、DHPS和选自鞘脂激活蛋白C、Hl肽、H2肽、H3肽、H4肽、H5肽或其混合物的鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽。在另外的实施方案中，形成脂质体的组合物包含D0PS、DHPS、DPPC、DHPC和选自鞘脂激活蛋白C、Hl肽、H2肽、H3肽、H4肽、H5肽或其混合物的鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽。在另外的实施方案中，组合物还包含药学活性剂。附图概述并入并且组成本说明书的一部分的附图举例说明了本发明的一个或多个实施方案并且，与发明详述一起用于解释本发明的原理和实施。图1:人鞘脂激活蛋白C和其功能结构域的氨基酸序列。图2:0.1%D0PS/DPPC/DHPC的SANS数据。图3:0.1wt.%D0PS/DPPC/DHPC混合物的4务正的吉尼耶图(ModifiedGuinierplot)。图4:D0PS/DPPC/DHPC混合物(A和B),和掺杂Hl(C和D)以及掺杂H2(E和F)的混合物的代表性TEM图像。图5:提出的单层、三轴椭圆体双分子层嚢泡的模型。发明详述缩写SapC,鞘脂激活蛋白C;D0PG，二油酰磷脂酰甘油；D0PS,二油ife^l月旨^丝l,;PC，^月旨^Ja^(Phosphoatidyecholine);PG,磷脂酰甘油；PS，磷脂酰丝氨酸；DMPC，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱。定义在描述本组合物和方法之前，应理解本发明不限定于特定的方法、装置和制剂，因为这些，当然，可以进行变化。也应理解，本文中使用的术语只是为了描述特定实施方案，而不是意欲限定本发明的范围，所述本发明的范围只受附加的权利要求和其等同物的限定。除非上下文清楚另外指出，如本文和附加的权利要求中所使用的，单数形式"一个"、"一种"和"这个"、"这种"包括复数所指事物。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的相同的意义。虽然与本文中描述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可用于本发明的实施或测试，但现在描述示例性方法、装置和材料。术语"施用的"和"施用"通常是指对患者施用生物相容性材料，包括，例如，脂质和/或嚢泡组合物和清洗剂(flushagent)。因此，"施用的，，和"施用"是指，例如向血管内注射脂质和/或嚢泡组合物和/或清洗剂。术语"施用的，，和"施用"还可指递送脂质和/或嚢泡组合物和/或清洗剂至目的区域。如本文中所使用的，术语"氨基酸"或"氨基酸序列"是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列或任何这些序列的片段，和指天然存在的或合成的分子。当"氨基酸序列，，在本文中用于指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，"氨基酸序列"和类似的术语并不表示将氨基酸序列限定于与所述蛋白质分子相关的完全天然的氨基酸序列。术语"两亲性脂质"是指具有亲水性"头部"基团和疏水性"尾部"基团并且具有膜形成能力的分子。"类似物"是指本发明的肽的氨基酸序列中的置换或改变，所述置换或改变不会不利地影响肽的致融性质。因此，类似物可包含具有与本文中提供的肽大体上相同的氨基酸序列和其中一个或多个氨基酸残基已用化学上相似的氨基酸保守性置换的肽。保守性置换的实例包括非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个的置换。同样，本发明涉及极性(亲水性)残基例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及甘氨酸和丝氨酸之间的置换。此外，还涉及碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸对另一个的置换或酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸对另一个的置换。如本文中所使用的，术语"阴离子磷脂膜"和"阴离子脂质体"是指包含脂质组分且在生理pH下具有总的负电荷的磷脂膜或脂质体。"阴离子磷脂，，是指具有负电荷的磷脂，包括磷酸酯、硫酸酯和基于甘油的脂质。"生物活性剂"是指这样的物质，所述物质可用于性质上为诊断或治疗的应用，例如用于用来诊断疾病在患者中的存在或不存在的方法和/或用来治疗患者的疾病的方法。如本文中所使用的，"生物活性剂"还指能够在体外和/或体内发挥生物学效应的物质。生物活性剂可以是中性的或带正电荷或带负电荷的。合适的生物活性剂的实例包括诊断剂、药物制剂、药物、合成的有机分子、蛋白质、肽、维生素、类固醇和遗传物质，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。术语"包含在......中(内)"是指药物试剂被包封在磷脂膜内，以便保护药物试剂免受外部环境的影响。该术语可以与"封装"互换使用。"缺失"，如该术语在本文中所使用的，是指导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的不存在的氨基酸或核苷酸序列的变化。术语"衍生物"，如本文中所使用的，是指多肽序列或多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰可包括，例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。衍生的多核苷酸编码保持天然分子的至少一个生物学功能的多肽。衍生的多肽是例如通过糖基化或保持其所来源的多肽的至少一个生物学功能的任何其他方法修饰的多肽。术语"致融蛋白或多肽"，如本文中所使用的，是指当加入至两个分开的双分子层膜时可使它们融合成单个膜的蛋白质或多肽。致融蛋白迫使细胞或模型膜紧密接触并且使它们融合。如本文中所使用的，术语"插入"或"添加，，是指氨基酸或核苷酸序列中分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸至天然存在的分子中发现的序列的添加的变化。术语"脂质，，和"磷脂"可互换使用并且是指包含脂质、磷脂或其衍生物的结构，包括已知脂质在水性悬浮液中采用的多种不同结构排列。此类结构包括但不限于脂双分子层嚢泡、微团、脂质体、乳状液、嚢泡、脂质带(lipidribbon)或片。脂质可单独使用或以本领域技术人员用于提供特定应用所期望的特征的任何组合使用。此外，脂质构建和脂质体形成的技术方面在本领域内是熟知的并且本领域内常用的方法的任一种可用于本发明。"脂质组合物"是指通常在水性介质中包含脂质化合物的组合物。示例性脂质组合物包括悬浮液、乳状液和嚢泡组合物。"脂质制剂"是指还包含生物活性剂的脂质组合物。"脂质体"是指两亲化合物(包括脂质化合物)的通常球形的群集体(cluster)或聚集体，其通常以一层或多层同心层例如双分子层的形式存在。它们在本文中还可称为脂嚢泡(lipidvesicle)。术语"长链脂质"是指碳链长度为大约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24的脂质。在一个实施方案中，链长度选自18、19或20的链长度。可用于本发明的脂质的实例可在网址www,avanti1ipids.com上获得。可用于本发明的长链脂质的代表性实例包括但不限于下列脂质14:0PS1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DMPS);16:0PS1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DPPS);17:0PS1，2-双十七酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0PS1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DSPS);18:1PS1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(D0PS);18:2PS1，2-二亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；20:4PS1，2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；22:6PS1，2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16:0-18:1PS1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(POPS);16:0-18:2PS1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16:0-22:6PS1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-18:1PSl-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐);18:0-18:2PSl-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-20:4PS1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；18:0-22:6PS1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；16:0PC1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC);17:0PC1，2-双十七酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0PC1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC);16:1PC(顺)1，2-二棕榈油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:1反PC1，2-Dipalmitelaidoyl-sn-甘油—3-磷酸胆碱；18:1PC厶6(顺)l,2-Dipetroselinoy卜sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:2PC(顺)1，2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:3PC(顺)1，2-二亚麻酰-sn-甘油-3-确酸胆碱；20:1PC(顺)1，2-Dieicose呵卜sn-甘油-3-磷酸胆碱；22:1PC(顺)1，2-Dierucoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱；22:0PC1,2-二山嵛酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；24:1PC(顺)1，2-二神经酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:0-18:0PCl-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:0-18:1PC1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:0-18:2PC1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0-18:1PCl-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0-18:2PC1-石更脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:1-18:0PCl-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:1-16:0PCl-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；18:0-20:4PCl-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；16:0-18:1PG1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)(POPG);18:1PG1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐)(DOPG);18:1PA1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐(一钠盐)(DOPA);18:1PI1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)；16:0(D31)-18:1PI1-棕榈酰(D31)-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)；18:1PE1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE);18:2PE1，2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。如本文中所使用的，术语"核酸"或"核酸序列"是指核苷酸、寡核苷酸、多核普酸或其任何片段。"核酸"是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串。(多核苦酸与寡核苷酸区别在于其包含超过120个单体单位)。核苷酸是核酸聚合物的单体单位。该术语包括脱氧核糖核酸(DNA)和以寡核苷酸信使RNA形式存在的核糖核酸(RNA)、反义核酸、质粒DNA、质粒DNA的部分或来源于病毒的遗传物质。反义核酸是干扰DNA和/或RNA功能的多核苷酸。术语核酸是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串。天然核酸具有磷酸主链，人工核酸可包含其他类型的主链，但包含相同的碱基。核苷酸是核酸聚合物的单体单位。该术语包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。RNA可以以tRM(转运RNA)、siRNA(短干扰核糖核酸)、snRNA(核内小RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRM(信使RNA)、反义RNA和核酶的形式存在。DNA可以以质粒DNA、病毒DM、线性DNA或染色体DM或这些种类的4汙生物的形式存在。此外，此类形式的DNA和RNA可以是单链的、双链的、三链的或四链的。该术语还包括PNA(肽核酸)、siNA(短干扰核酸)、磷硫酰和天然核酸的磷酸主链的其他变体。如本文中所使用的，术语"基于核苷酸的药物试剂"或"基于核苷酸的药物"是指包含核苷酸、寡核苷酸或核酸的药物试剂或药物。"患者"或"受试者"或"个体"是指动物，包括哺乳动物，优选人。如本文中所使用的，"药物试剂"或"活性剂"或"药物"是指当对患者适当施用时能够诱导期望的治疗效果的任何化学或生物材料、化合物或组合物。一些药物以无活性形式销售，其在体内转化成具有药物活性的代谢产物。为了本发明的目的，术语"药物试剂"、"活性剂"和"药物"包括无活性的药物和活性代谢产物。术语"药学或治疗有效剂量或量"是指足以诱导期望的生物学结果的剂量水平。该结果可以是药物试剂的递送、疾病的体征、症状或病因的减轻或生物系统的任何其他期望的改变，活性剂的精确量取决于患者的身体状况、正在治疗的疾病的进展等。如本文中所使用的，术语"肽类似物"是指这样的肽，其氨基酸序列与天然肽的差异只在于保守性氨基酸置换，例如Leu对Val的置换或Arg对Lys的置换等，或差异在于位于不破坏肽的生物学活性(在该情况下，肽的致融性质)的位点上的一个或多个非保守性氨基酸置换、缺失或插入。肽类似物，如本文中所使用的，还可包含一个或多个氨基酸类似物、模拟氨基酸的结构的分子、和/或在天然分子而非肽或肽类似物中发现的天然氨基酸作为其序列的部分或全部。如本文中所使用的，术语"鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质和多肽"包括但不限于天然存在的鞘脂激活蛋白A、B、C和D。该短语术语还包括合成的鞘脂激活蛋白衍生的蛋白质和肽和肽类似物，其具有相似或大体上相似的生物学活性，例如，组织膜结构的膜相互作用、脂质结合和转运功能、脂质呈递、膜重建、膜锚定等。鞘脂激活蛋白C和从其产衍生的多肽可用于本发明的一个实施方案。该术语还包括片段例如本文中描述的和/或本领域已知的Hl、H2、H3、H4或H5片段和其生物学活性等同物。术语"短链脂质，，是指碳链长度为4、5、6、7、8、9、10、11或12的脂质。在一个实施方案中，碳链长度是6、7、8、9或10。在一个实施方案中，碳链长度是6、7或8。带负电荷的短链脂质的实例可在网站www,avanti1ipids.com上获得。可用于本发明的短链脂质的实例包括但不限于下列06:OPS(DHPS)1，2-二己酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；08:QPS1，2-二辛酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)；03:0PC1,2-二丙酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；04:0PC1，2-二丁酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；05:0PC1，2-二戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；06:0PC(DHPC)1,2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；O7:0PC1，2-二庚酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；08:0PC1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；09:0PC1，2-二壬酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；06:0PG1，2-二己酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](钠盐);08:0PG1，2-二辛酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)；06:0PA1，2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸盐(一钠盐)；08:0PA1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸盐(一钠盐)；06:0PE1，2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；08:0PE1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。如本文中所使用的，术语"短干扰核酸"、"siNA"、"短干扰RNA"、"siRNA"、"短干扰核酸分子"、"短干扰寡核普酸分子"或"化学修饰的短干扰核酸分子，，是指能够例如通过以序列特异性的方式介导RNA干扰"RNAi，，或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。在示例性实施方案中，siNA是包含自我互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中反义区域包含与要下调表达的靶核酸分子中的核香酸序列或其部分互补的核苷酸序列，有义区域包含相应于(即，在序列上大体上相同于)所述靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。"siNA"是指其为短长度双链核酸(或任选其更长的前体)并且在靶细胞中没有不可接受的毒性的小干扰核酸，例如siRNA。本发明内有用的siNA的长度在某些实施方案中最优化为大约21至23bp长的长度。然而，有用的siNA包括siRNA的长度不存在特定的限制。例如，最初可以以前体形式将siNA呈递至细胞，所述前体形式显著不同于当递送至靶细胞时或之后存在并发挥基因沉默活性的siNA的最终或加工形式。siNA的前体形式可以例如包括前体序列元件，所述前体序列元件在递送时或递送后^皮加工、降解、改变或切割，从而产生在细胞内具有介导基因沉默的活性的siNA。因此，在某些实施方案中，本发明内的有用的siNA将具有例如大约100-200个碱基对，50-100个碱基对或少于大约50个碱基对的前体长度，其将在耙细胞中产生具有活性的经加工的siNA。在其他实施方案中，有用的siM或siNA前体长度为大约10至49bp、15至35bp或大约21至30bp。如本文中所使用的，术语"自发形成的"意欲包括本领域中已知的意义，其中脂质体的形成需要对磷脂的混合物施用最小的机械力或不施用机械力，但应理解，机械力的施用，例如通过涡旋或混合，可用于促进脂质体组合物的形成。术语"稳定的"或"经稳定的"，如本文中所使用的，表示嚢泡可基本上抵抗降解，包括例如，嚢泡结构或封装的气体或气态前体的丧失，持续有用的一段时间。通常，用于本发明的嚢泡具有期望的贮存期限，通常在正常环境条件下保持其原始结构体积的至少约90%至少大约2至3周的时间。在优选形式中，囊泡的期望的稳定时间是至少大约1个月，更优选至少大约2个月，更优选至少大约6个月，更优选大约18个月和更优选达到大约3年。本文中描述的嚢泡，包括填充有气体和气态前体的嚢泡，甚至在不利的条件例如高于或低于在正常环境条件下经历的温度和压力下也可以是稳定的。"嚢泡"是指球状实体，其特征通常在于存在形成一个或多个内空间的一层或多层壁或膜。可以例如从脂质(包括本文中描述的各种脂质)、蛋白质性质的材料、聚合材料(包括天然、合成和半合成的聚合物)或表面活性剂配制嚢泡。优选嚢泡是包含从脂质配制的壁或膜的嚢泡。在这些优选嚢泡中，脂质可以以单分子层或双分子层的形式存在，并且单分子层或双分子层脂质可用于形成一层或多层单分子层或双分子层。在超过一层单分子层或双分子层的情况下，单分子层或双分子层可以是同心的。脂质可用于形成单层嚢泡(由一层单分子层或双分子层组成)、寡层嚢泡(由大约2或大约3层单分子层或双分子层组成)或多层嚢泡(由超过大约3层单分子层或双分子层组成)。类似地，从蛋白质或聚合物制备的嚢泡可包含一层或多层同心壁或膜。从蛋白质或聚合物制备的囊泡的壁或膜可以大体上是均质的(均匀的)或它们可以是多孔的或半多孔的(semi-porous)。本文中描迷的嚢泡包括通常称为例如脂质体、微团、泡嚢(bubble)、微泡嚢、微球体、由脂质、聚合物、蛋白和/或表面活性剂包被的泡嚢、微泡嚢和/或微球体、微球、气凝胶(aerogel)、包合物(clathrate)结合的嚢泡等的此类实体。嚢泡的内空间可充满液体(包括，例如，水性液体)、气体、气态前体和/或固体或溶质材料，包括，例如，靶向性配体和/或生物活性剂(如果想要的话)。描述本公开内容的主题总体上涉及可在将水性溶液与选择的磷脂组合后自发形成的单层磷脂嚢泡例如脂质体。嚢泡是易于形成的，稳定的、非渗漏的(即，不释放它们的内容物)并且涵盖宽广的大小范围。可将鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白，例如鞘脂激活蛋白C和/或SapC的Hl和H2区域整合入磷脂囊泡。本文中描述的磷脂嚢泡或脂质体用于治疗疾病。包含脂质和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽的脂质体可在另外的药物试剂不存在的情况下用作治疗剂，例如用于治疗疾病状态例如癌症，或可进一步用于递送和施用药学活性剂，特别是当穿过生物膜的递送是有利的时候。简而言之，本发明的脂质体通常包含一种或多种长链、阴离子脂质和一种或多种鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽，其中脂质的独特组合使得脂质体能够自发形成。在一个实施方案中，脂质体由一种或多种阴离子长链脂质、一种或多种短链磷脂以及一种或多种鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽或其类似物或书f生物的组合组成。在另外的实施方案中，本发明的脂质体还可包含一种或多种药物试剂以将该试剂递送至需要该治疗的个体。通常，制备本文中描述的脂质体的方法包括步骤提供一种或多种干燥磷脂和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽或其类似物或衍生物；加入水性溶液以形成混合物；使混合物形成脂质体。在可选的实施方案中，该方法可包括步骤提供一种或多种干燥磷脂和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽；加入有机溶剂以形成第一混合物；冷冻干燥第一混合物；向第一混合物中加入水性溶液以形成第二混合物；使第二混合物形成脂质体。一种或多种干燥磷脂可包含至少一种阴离子长链磷脂和/或至少一种短链磷脂。鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽可以是鞘脂激活蛋白C或片段例如Hl、H2、H3、H4或H5。在本发明的另一个实施方案，蛋白质-脂质组合物的pH是酸性的。在本发明的另一个实施方案中，组合物的pH在大约6.8至2之间。在本发明的另一个实施方案中，组合物的pH在大约5.5至2之间。在另一个实施方案中，pH在大约5.5至大约3.5之间。在另一个实施方案中，用酸处理干燥形式的蛋白质和脂质组合物。在一个实施方案中，酸是酸性緩沖液或有机酸。在另一个实施方案中，以足以质子化至少一部分蛋白质的水平加入酸，其中组合物具有大约5.5至大约2的pH。在另一个实施方案中，以足以充分质子化蛋白质的水平加入酸，其中组合物具有大约5.5至大约2的pH。在另外的实施方案中，然后充分中和已用足以质子化至少一部分蛋白质的酸处理的蛋白质和脂质组合物干粉的pH。在一个实施方案中，用中性pH緩沖液中和pH。在一个实施方案中，用足以控制所得的脂质体大小的中性pH緩冲液中和pH。在另一个实施方案中，用足以控制所得的脂质体大小的中性pH緩冲液中和pH，从而提供具有大约200纳米的平均直径的脂质体。在另一个实施方案中，脂质体具有50至350纳米的平均直径。在另一个实施方案中，脂质体具有150至250纳米的平均直径。在另一个实施方案中，向组合物中加入緩冲液以提供大约5至大约14，优选大约7至14，更优选大约7至大约12，更优选大约7至大约10,和甚至更优选大约8至大约10的终组合物pH。本发明的脂质体和相关方法的独特特征在于脂质体可在水性溶液加入后自发形成，从而不需要机械力的应用。此外，所得的脂质体群体具有大约数年或更长时间的长贮存期限。这样，在本发明的一些实施方案中，本领域技术人员可容易地提供基于脂质体的递送系统或治疗而使用减少的试剂和设备的财务投资，并减少对毒性试剂的暴露和与此类试剂的处理相关的花费。致融蛋白或多肽鞘脂激活蛋白，小(大约80个氨基酸)热稳定性糖蛋白的家族，是鞘糖脂的分解代谢途径中的几种溶酶体酶的体内水解活性所必需的(参见Grabowski，G.A.，Gatt，S.,和Horowitz,M.(1990)Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25,385-414;Furst，W.，和Sandhoff,K.,(1992)Biochim.Biophys.Acta1126,1-16;Kishimoto，Y.，Kiraiwa,M.，和(VBrien，J.S.(1992)J.Lipid.Res.33，1255-1267)。鞘脂激活蛋白家族的4个成员A、B、C和D是从单个前体蛋白鞘脂激活蛋白原蛋白质水解而来的(参见Fujibayashi，S.，Kao，F.T.，Hones,C，Morse,H.，Law,M.，和Wenger，D.A.(1985)Am.J.Hum.Genet.37，741-748;O'Brien,J.S.，Kretz，K.A.，Dewji，N.,Wenger，D.A.，Esch，F.，和Fiuharty，A.L.(1988)Science241,1098-1101;Ro函n,E.G.,和Grabowski，G丄(1989)Genomics5，486-492;Nakano，T.，Sandhoff，K.，Stumper,J.,Christomanou,H.，和Suzuki,K.(1989)J.Biochem.(Tokyo)105，152—154;Reiner,0.，Dagan，0.，和Horowitz,M.(1989)J.Mol.Neurosci.1，225-233)。已报导了鞘脂激活蛋白A、B、C和D的全部氨基酸序列以及鞘脂激活蛋白原的基因組结构和cDNA序列(参见Fujibayashi，S.，Kao，F.T.，Jones,C,Morse,H.，Law,M.，和Wenger，D.A.(1985)Am.J.Hu瓜.Genet.37，741-748;(TBrien，J.S.，Kretz，K.A.，Dewji，N.，Wenger，D.A.，Esch，F，和Fluharty，A.L(1988)Science241，1098-1101;Ro服n，E.G.，和Grabowski,G.A.(1989)Genomics5，486-492)。由于起始密码子的突变而导致的鞘脂激活蛋物的li&积(参见Schnabel，D.，Schroder,M.，Furst,W.,Klien，A.，Hurwitz，R.，Zenk，T.，Weber，J.，Harzer，K.，Paton，B.C.,Poulos,A.，Suzuki,K.，和Sandhoff，K.(1992)J.Biol.Chem.267，3312-3315)。鞘脂激活蛋白定义为鞘脂激活蛋白或辅酶。结构上，鞘脂激活蛋白A、B、C和D具有大约50-60%的相似性，包括6个严格保守的半胱氨酸残基(参见Furst，W.,和Sandhoff,K.，(1992)Biochim.Biophys.Acta1126，1-16)，所述半胱氨酸残基形成其位置相同的3个结构域内二硫桥(参见Vaccaro，A.M.,Salvioli，R.，Barca，A.，Tatti，M.，Ciaffoni，F.，Maras，B.，Siciliano，R.,Zappacosta，F.，A薩esano，A.，和Pucci，P.(1995)J.Biol.Chem.270，9953-9960)。所有鞘脂激活蛋白在N端序列半部分中包含一个具有保守位置的糖基化位点，但糖基化对于它们的活性不是必需的(参见Qi.X.，和Grabowski,G.A.(1998)Biochemistry37，11544-11554;Vaccaro,A.M.,Ciaffoni，F.，Tatti，M.，Salvioli,R.，Barca，A.,Tognozzi,D.，和Scerch，C.(1995)J.Biol.Chem.270，30576-30580)。此外，鞘脂激活蛋白A具在C端半部分中具有第二个糖基化位点。当在溶液中时，所有鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白样蛋白和结构域包含"鞘脂激活蛋白折叠"。该折叠是多个ot-螺旋束基序，特征在于3个保守的二疏化物结构和数个两亲性多肽。尽管在溶液中存在该共有的鞘脂激活蛋白-折叠结构，但鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白-样蛋白在通过特异性水解酶增加溶酶体鞘脂(SL)和鞘糖脂(GSL)降解中具有不同的体内生物学功能。由于这些作用，鞘脂激活蛋白在溶酶体鞘脂和鞘糖脂代谢的控制中占据中心位置。在该功能不存在的情况下，葡糖神经酰胺在大脑中积累，从而导致戈谢病(Gaucherdisease)，(参见Pimpols,T.;Pineda,M.;Gir6s，M.L.;Ferrer,I.;Cusi，V.;Chab&s,A.;Sammarti，F.X.;Vanier，M.T.;Christomanou，H.ActaNeuropatol.1999,97,91-97)。由鞘糖脂(GSL)的积累引起的另一个疾病是异染性脑白质营养不良(metachromaticleukodystrophy)，其也可由,溶酶体酶和鞘'月旨激活蛋白激活剂的缺乏而引起，(参见Zhang,X.L.;Rafi,M.A.;DeGala，G.;Wenger，D.A.ProcNatlAcadSciUSA1990，87，1426-1430;Schnabel,D.;Schroder,M.;Sandhoff，K.FEBSLett1991，284,57-59)。除了其在酶促激活中的特异性作用外，SapC还能够具有促神经突发生(neuritogenic)活性、神经节苷脂和GSL的膜间转运、脂质抗原呈递和膜融合诱导活性。应当指出，与PSULV结合的SapC的静脉内施用也已用于证明将荧光标记的磷脂转运入中枢神经系统的能力。因此，组合的SapC-PS复合物似乎有助于对于神经学和脑疾病的治疗是特异性的新药和基因递送系统。用于本发明的合适的致融蛋白质和多肽包括但不限于鞘脂激活蛋白家族的蛋白例如鞘脂激活蛋白C。还包括的是鞘脂激活蛋白C的同源物，其中所述同源物具有至少80%的序列同源性，或至少90°/的序列同源性，这样所述片段具有相似或大体上相似的生物学活性。由于20编码鞘脂激活蛋白c的遗传密码子的简并性，本领域技术人员将容易地理解100%的序列同源性不是实施本发明所必需的。肽或肽类似物的实例包括Ser-Asp-Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-lvys-Glvi-Ile-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro(SEQ.ID.No.1);Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Gu-Val-Thr-Lys-Leu-Ie-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-I]e-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-C》's-Ser-Lys-Leu-Pro(SEQ.TD.No.2)，和其4汙生物、类似物、同源物、片段和混合物。还包括的是下式的多肽h陽u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu-Lys-GIu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,其中h=疏水氨基酸，包括Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe和Ala;以及u=不带电荷的极性氨基酸，包括Thr、Ser、Tyr、Gly、Gin和Asn。人SapC的功能结构域示于图1。标示了6个半胱氨酸(粗体的)和N-糖基化共有序列(*)。相应地标记了两个螺旋结构域HI(YCEVCEFLVKEVTKLID)和H2(EKEILDAFDKMCSKLPK)。缩写MBD和FD分别代表膜结合结构域和致融结构域。致融结构域位于SapC分子的氨基端半部分，其包括HI和H2肽。已使用原子力显微镜(AFM)检查了SapC和其两个螺旋结构域肽HI和H2对脂膜的去稳定化(destabilization)和重建的影响。AFM显示SapC可使酸性膜去稳定和重建，从而在表面上形成更厚的"斑"，最终导致双分子层的溶解。SapC导致的膜的去稳定化也始于缺陷处，这表明高曲率缺陷促进了膜的去稳定化。相反地，单独的HI和H2都对膜结构没有显著的影响。H2倾向于与存在膜缺陷处的脂质相互作用，然后聚集成杆状结构。虽然AFM结果显示SapC和其HI和H2片段对支持的膜的影响，但这些蛋白对嚢泡稳定性和形态学的潜在的影响还不清楚。此处，SANS用于在SapC、H1和H2存在和不存在的情况下表征嚢泡。该技术显示与嚢泡大小、形状和多分散性相关的介观结构(mesoscopicstructural)信息和与膜厚度相关的纳米观(nanoscopic)信息。磷脂膜和脂质体的形成脂质体是由同心脂质双分子层组成的微小嚢泡并且，如本文中所使用的，是指由排列在球状双分子层中的两亲性脂质组成的小嚢泡。结构上，脂质体的大小和形状在长管至球体的范围内变动，尺寸在数百埃至毫米的级分的范围内变动。无论总体形状如何，双分子层通常组织为密闭的同心薄层，水性层将各薄层与其相邻层分开。嚢泡大小通常在直径大约20至大约30,OOOnm的范围内。脂质体至靶组织例如增殖的细胞团、肿瘤性组织、炎性组织、发炎的组织和感染的组织的特异性递送可通过选择适合于将治疗剂递送至所述靶组织的脂质体大小来实现。例如，具有180nm的平均直径的脂质体可能不在实体瘤中积累；具有140nm的平均直径的脂质体可在相同实体瘤的外周积累，具有110nra的平均直径的脂质体在该实体瘤的外周和中心部分积累。通常，脂质体通过使脂质的混合物经历机械力来形成。例如，许多方法目前用于脂质体组合物的制备，所述方法例如溶剂透析、弗氏压碎器、挤出(使用或不使用冷冻-融化)、反相蒸发法、简单的冷冻-融化、超声处理、螯合物透析、均匀化、溶剂输注、微乳化、自发形成、溶剂蒸发、溶剂透析、弗氏压碎器技术、受控去垢剂透析等。参见，例如，Madden等人，ChemistryandPhysicsofLipids,1990。脂质体还可通过包括振荡或涡旋的各种方法来形成。然而，提供其中可自发形成脂质体而无需使用机械力的方法和组合物的能力是有益的，因为不需要另外的设备和步骤，从而减少了与它们的制备相关的时间和花费。本发明解决了该需要。低多分散性、自发形成的单层嚢泡(ULV)可在包含长和短酰基链的三元磷脂混合物的相位图中发现(参见，例如，Nieh，M.-P.;Harroun，T.A.，Raghunathan5V.A.，Glinka5J.;J.KatsarasBiophys.J.2004,86，2615-2629;Egelhaaf，S.U.;22Schurtenberger，P.Phys.Rev.Lett.1999，82，2謝-2807;Nieh，M.-P.;Raghunathan，V.A.，Kline,S.R.;Harroun，T.A.;Huang,C-Y.;Pencer，J.;Katsaras，J.Langmuir2005，21，6656-6661)。ULV通过增力口温度(参见Lesieur，P.;Kiselev，M.A.;Barsukov，L.I.;Lombardo，D.J.Appl.Cryst.2000，33，623-627;Nieh，M.-P.;Harroun，T.A.jRaghunathan，V.A.'，Glinka,C.J.，Katsaras,J.Phys.Rev.Lett.2003，91,158105)或稀释双分子层化的盘状微团(参见V.A.，Glinka;C.J.;J.KatsarasBiophys.J.2004，86，2615-2629)来形成，其中短链脂质多价螯合入(sequesterinto)双分子层化的盘的高曲率轮缘使其边缘能量减少至最小。盘状双分子层化的微团至ULV的转变在相应于长链脂质的凝胶-液晶的温度(主要转变温度(maintransitiontemperature))下发生，这暗示着长链和短链脂质之间的增加的溶混性水平导致短链脂质从盘的边缘扩散，从而使线张力增加和使刚性模量减小。该系列事件引起单分散性ULV的形成。(参见Fromherz，P.Chem.Phys.Lett.1983，94，259-266)。这些ULV在长时间即数周内是稳定的(参见Nieh，M.-P.;Harroun,T.A.;Raghunathan，V.A.;Glinka,C.J.;Katsaras,J.Phys.Rev.Lett.2003，91，158105)，从而被认为是作为药物载体的良好候选物。用于脂质体的自发形成的组合物和方法形成脂质体的一个方法包括使用长链和短链脂质，其中两种脂质都是双饱和的掺杂少量酸性长链脂质例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)的两性离子磷脂。在本公开内容中，描述了自发形成的脂质体的一个实施方案的形态学。在该实施方案中，用于自发形成脂质体的脂质混合物包括二棕榈酰和二己酰磷脂酰胆碱(分别为DPPC和DHPC)和酸性、长链脂质二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)，但本领域技术人员易于理解，可对该组合进行不同的改良和置换以达到本发明范围内的其他合适的实施方案。该混合物还包括至少一种鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽或其变体或类似物。可通过进行下列步骤来制备自发形成的脂质体1)提供干燥脂质和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽的混合物；2)向混合物中加入水性溶液；3)使混合物形成脂质体，其中脂质体是稳定的并且不需要加入机械力来实现它们的形成。在一个实施方案中，脂质包含至少一种长链阴离子脂质。在另一个实施方案中，脂质包含至少一种阴离子长链脂质和至少一种短链脂质。鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽可选自鞘脂激活蛋白C(SEQIDNo.2)、H1(SEQIDNo.3)、H2(SEQIDNo.4)、H3(SEQIDNo.5)、H4(SEQIDNo.6)、H5卿IDNo.7)和其混合物。鞘脂激活蛋白原示于SEQIDNo.1。鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质还可包含鞘脂激活蛋白C、Hl、H2、H3、H4、H5的类似物或书于生物，和其混合物。水性溶液可以是能够溶解脂质和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽以使脂质体自发形成的任何生理相容性溶液。水性溶液的非限定性实例包括例如水、去离子水、盐水和磷酸盐緩冲盐水(PBS)。加入水性溶液后总蛋白质和脂质的摩尔浓度是大约300uM或大约400uM或大约500uM或达到1000uM。水性溶液的pH是大约7.4或大约7.0-7.6，或大约6.8至大约7.8。在加入水性溶液后，脂质和蛋白质混合物自发形成脂质体。然而，本领域技术人员将理解，可对混合物进行涡旋或混合以加速或促进脂质体的形成。在可选的实施方案中，该方法可包括步骤提供一种或多种干燥磷脂和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽；加入有机溶剂以形成第一混合物；冷冻干燥第一混合物；将水性溶液加入至第一混合物以形成第二混合物；使第二混合物形成脂质体。一种或多种千燥磷脂可包含至少一种阴离子长链磷脂和/或至少一种短链磷脂。鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽可以是鞘脂激活蛋白C或片段例如Hl、H2、H3、H4或H5。在该实施方案中，有机溶剂可以是任何合适的有机溶剂，例如，，f又丁醇(优选的)、异丙醇、1-丙醇、乙醇、乙醚、曱醇或DMSO。在冷冻干燥之前，有机溶剂包含大约80-90%或大约70-95%或大约50-95°/。的终第一混合物。在加入用于形成脂质体的水性溶液之前，第一混合物可贮存数月或数年。带负电荷的长链脂质例如D0PS而非仅仅两性离子脂质的使用据认为最优化鞘脂激活蛋白C或其片段例如Hl和H2肽与酸性脂质聚集体之间的相互作用，其独特地适合用于脂质体的自发形成，提供用于形成用于治疗疾病的脂质体的新型和有用的方法。在可选的实施方案中，带负电荷的长链脂质可选自二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1，2-二油酰-磷脂酰肌醇(D0PI)和1，2-二油酰磷脂酸(DOPA)或其组合。本发明的带负电荷的长链脂质可以是具有长度大约14至大约24个碳的，或长度大约18至大约20个碳的碳链的任何长链磷脂。脂质的穷举列表可在www.avantilipids.com获得。本领域技术人员理解哪种脂质可用于本发明。虽然可使用长链和短链脂质的任何组合，但一些组合产生更稳定的脂质体。例如，虽然不意欲于限定本发明，但下列方面可指导从其形成脂质体的组合物的选择当使用长度大约20至大约24个碳的长链时，具有大约6至大约8的长度的短链脂质可用于提高脂质体稳定性。当使用大约14至大约18的长链长度时，具有大约6至大约7的长度的短链脂质可用于提高脂质体稳定性。虽然脂质的这些组合产生更稳定的脂质体，但其他组合也可成功地使用，并且不希望被放弃。通过加入本文中所述的短链和长链脂质来进一步最大化稳定的ULV形成的潜力。短链脂质可以是本领域技术人员所理解的任何合适的短链脂质。在一个实施方案中，例如，短链脂质是中性短链磷脂酰胆碱脂质例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。短链脂质还可以是短链磷脂酰丝氨酸脂质例如DHPS。如本文中所描述的，通过加入短链脂质，形成的脂质体群体通常是单分散性的。不加入短链脂质，群体是多分散性的，所得的脂质体的大小和形状是变化的。作为加入短链磷脂的结果，可以获得单分散性群体，从而提高了控制所得制剂的药物动力学和生物利用度的能力。在一个特定的实施方案中，用于合成鞘脂激活蛋白-c脂质体的脂质混合物包含带负电荷的脂质二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS),其中加入少量的中性长链脂质二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和中性短链脂质二己酰磷脂酰胆碱(DHPC)。在该特定的实施方案中，[D0PS]:[DPPC]摩尔比范围在1:1至10:1之间，([DPPC]+[DOPS])/[DHPC]等于大约4。在可选实施方案中，DHPC由DHPS取代或与DHPS组合。可使用本领域已知的电荷和长度相应的任何脂质。包含掺杂有少量鞘脂激活蛋白C的脂质的该组合物的样品不会去稳定，但对于具有更高浓度的鞘脂激活蛋白C的系统，大的聚集体可从溶液中沉淀出来，显示膜的去稳定化。DOPS/DPPC/DHPC样品在24个月的时期内是稳定的，表明中性长链脂质和短链脂质的加入提高了聚集体的稳定性。然而，如本文中所描述的，可按照本发明使用长链和短链脂质的任何组合。表1举例说明了可用于进行本发明的方法的长链和短链脂质的非限定性实例。表l.长链和短链磷脂的组合。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>此外，脂质链上饱和烃的存在或不存在影响脂质体的稳定性。例如，使用链长度为大约18或更大的脂质，磷脂可以是饱和的或不饱和的，优选是不饱和的。对于更短的长链脂质例如具有大约14至大约16个碳的脂质，脂质可以是不饱和的，但饱和脂质的使用产生提高的本发明的性能。脂质比例的非限定性实例如下。组合物中所选择的中性磷脂对所选择的带负电荷的磷脂的摩尔比是大约1:IO(大约10%的中性磷脂)，或大约l:5(大约20%的中性磷脂)或大约1:1(50%的中性磷脂)。组合物中所选择的长链磷脂对所选择的短链脂质的摩尔比为大约4:1(大约20%的短链)，和可以是大约10:1(10%的短链)至大约3:1(大约33%的短链)。在一个实施方案中，长链对短链的比的一个实例如下([中性长链脂质]+[酸性长链脂质])/[中性或阴离子短链脂质]为大约4。作为另一个实例，在一个实施方案中，混合物中D0PS对DPPC的摩尔比为大约10-8比l，或大约7-6比1或大约5-3比1或大约1-2比1，并且([DPPC]+[DOPS])/DHPC=大约4。在其他实施方案中，([中性长链脂质]+[酸性长链脂质])/[中性或阴离子短链脂质]可以是大约2至大约IO或大约3至大约8或大约4至大约7。用于本发明的合适的脂质可选自本领域内已知的或如www.avantilipids.com上所提供的任何脂质。本发明的脂质体还可包含一种或多种已被捕获在水性内部或双分子层之间或被双分子层内的捕获疏水分子捕获的药物试剂和/或显像剂。几种技术可用于使用脂质体将封装的药物靶向所选择的宿主组织，并且远离敏感组织。此类技术包括操纵脂质体的大小、它们的净表面电荷和它们的施用途径。本发明的脂质体还可通过被动递送途径递送。脂质体的被动递送包括不同施用途径(例如，静脉内、皮下、肌内和局部)的使用。各途径在脂质体的定位中产生差异。本发明的脂质体对于治疗剂或显像剂的跨血脑屏障递送也是很理想的。本发明涉及借助其包含治疗剂的脂质体可用于将这些试剂递送至CNS的方法，其中试剂包含在由上面提及的脂质和鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白原或鞘脂激活蛋白的变体组成的脂质体中。通过使用本领域内普遍接受的方法，可通过IV注射、IM注射、经鼻递送或任何其他经血管的药物递送方法施用包含治疗剂的脂质体。不希望受理论束绰，关于鞘脂激活蛋白-介导的膜融合如何发生的一个可能的机制是通过蛋白质构象变化。在鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质中，鞘脂激活蛋白A和鞘脂激活蛋白C显示最高程度的氨基酸同一性/相似性。通过计算，预测两种蛋白质都折叠成两亲性螺旋束基序。通常，鞘脂激活蛋白-折叠是具有折叠成单个球形结构域的5个两亲性ct螺旋的超二级结构并且为两种蛋白所共有。在一个实施方案中，折叠沿着氨基端上定位在中心的螺旋，螺旋2和3从一侧以及螺旋4和5从另一侧向其倚靠堆叠。该折叠可提供用于膜相互作用的界面。鞘脂激活蛋白-介导的与阴离子磷脂膜的膜融合的机制据认为是两个步骤的过程。在第一步骤中，鞘脂激活蛋白的带正电荷的氨基酸(碱性形式)(赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg))和带负电荷的磷脂膜之间的静电相互作用导致这两个种类之间的结合(参见图1)。在第二步骤中，两个相邻鞘脂激活蛋白蛋白的螺旋之间的分子内疏水相互作用使两个膜靠得很近，足以发生膜的融合(参见图2)。因此，根据本发明，鞘脂激活蛋白，特别是鞘脂激活蛋白C与脂质的结合通常需要大约5.5或更低的pH范围，因为鞘脂激活蛋白C与膜的初始结合通过鞘脂激活蛋白C的带正电荷的碱性氨基酸残基与阴离子膜的静电相互作用产生。因此，为了获得大量静电相互作用，高度期望具有以它们的质子化形式存在的碱性氨基酸。这可以例如通过在将蛋白质或多肽与脂质混合物组合之前，向鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽加入酸性溶液来实现。可选地，从鞘脂激活蛋白家族的蛋白质衍生的相关融合蛋白和肽可以不具有该更低的pH范围限制，因而其他膜融合蛋白和肽的pH范围可在生理pH(大约7的pH)至更低的pH范围内变化。D0PS/DPPC/DHPC脂质体的结构分析使用以粉剂形式存在的DOPS(带负电荷的长链脂质)、DPPC(中性长链脂质)和DHPC(中性短链脂质)(可从AvantiPolarLipids,Alabaster,AL获得)而无需额外的纯化。对于DLS测量，[D0PS]:[DPPC]的摩尔比在1:1至10:1之间，且对于所有样品，([DPPC]+[D0PS])/[DHPC]=4。将干燥的脂质混合物以10wt.。/。的总脂质浓度溶解在过滤的超纯H20(MilliporeEASYpureUV)中并且通过涡旋和在4和50。C之间的温度循环来混合。关于包含蛋白质的脂质体的制备，使用IPTG-诱导的pET系统在大肠杆菌(E.coli)细胞中过表达SapC,并且从镍柱洗脱带His-标签的蛋白质。透析后，如下通过HPLC色谱进一步纯化蛋白质用0.1°/。三氟乙酸(TFA)平衡C4反相柱，进行10分钟，然后在60分钟内在0.1%的在乙腈中的TFA的线性(0-100%)梯度中洗脱蛋白质。收集主要蛋白质峰，然后冻干，同时如之前所述测定蛋白质的浓度。通过SynPepCorp.(California,USA)合成HI(YCEVCEFLVKEVTKLID)和H2(EKEILDAFDKMCSKLPK)肽，并将其以1.5mg/mL的浓度溶解在D20中。然后将具有[D0PS]/[DPPC]=10和([DPPC]+[麼S])/DHPC=4的0.1wt.%的脂质溶液以12:1的体积比加入至两种肽溶液(1.5mg/mL)中，和以1:1的体积比加入至SapC溶液中，从而产生62.5|iM的终肽(或SapC)浓度([脂质]/[肽]的摩尔比=22/1),比诱导膜去稳定化所需的SapC更高的浓度。还制备只包含6.25iaM的SapC([脂质]/[SapC]=220/1)的样品以用于比较目的。在产生SapC-ULV复合物中，表征组合物对DOPS/DPPC/DHPCULV系统(适合于研究SapC-膜相互作用的系统)的影响。特别地，通过动态光散射(DLS)、透射电子显微术(TEM)和SANS测量法测定该脂质混合物的聚集形态学。然后用SANS表征H1、H2和SapC对这些ULV的影响。对于在肽不存在的情况下的聚集体，DLS和TEM的结果确认存在具有大约200和大于500nm的直径的ULV的双峰群体，这与使用扁圆椭圓体嚢泡和三轴椭圆体壳的形状因子(FormFactor)的组合的SANS数据的拟合一致。SANS数据显示，SapC在高浓度(62.5jaM)下促进ULV的聚集，然而在更低的浓度(6.25jaM)下，ULV结构不受搅乱。HI和H2都诱导膜厚度的少量减少。虽然HI肽未表现出改变ULV大小或它们的大小分布，但H2移动了存在的两种ULV聚集体之间的平衡。定性地，这些结果符合之前的AFM发现。为了测定所得的脂质体的结构和稳定性，首先将均匀化的10wt.%溶液逐渐稀释成5、2、1、Q.5和0.lwt.y。的样品。在DLS测量之前，将0.1wt.。/。贮存脂质样品稀释5、50和200倍，并使用N4+颗粒大小分析仪(sizer)(Coulter,Miami,FL)对其进行分析。通过使用该方法，确定稀释系统对颗粒的大小没有影响。关于SANS实验，对[D0PS]/[DPPC]=10的样品使用相同的样品制备方案，除了使用D20(99.9%，ChalkRiverLaboratories,ChalkRiver,ON)而非H20来获得具有0.5wt.。/。的总脂质浓度的样品外。然后使用由等体积的0.IN醋酸钠(NaAc)和0.IN醋酸(HAc)组成的酸性緩冲液将0.5wt.%的样品进一步稀释成0.1和0，05wt.%的混合物。所得的溶液在D20中具有4.78±0.02的pH值并且在用D20稀释12倍时保持稳定。在位于美国国家标准局(NationalInstituteofStandardsandTechnology)(NIST)中子研究中心(CenterforNeutronResearch)(NCNR，Gaithersburg，Maryland,USA)的30mNG7SANS仪器上进行SANS实验。使用8.09A波长(入)的中子、中子聚焦透镜和长样品至检测器距离(SDD-15.3m)以获得最低的散射矢量(scatteringvector)[q-4丌/入.sin(6/2)，其中6是散射角]。还使用两个其他的SDD(5和1m)，对于所有3个SDD，涵盖了从0.002至0.35A—i的组合q范围。就检测器的灵敏性、背景、空室散射(emptycellscattering)和样品透射校正Raw2-D数据。然后围绕光束中心循环平均(cicularlyaverage)校正的数据，从而产生惯用的1-D数据。然后使用已知的入射束通量(incidentbeamflux)将这些数据i文入绝对强度量表(absoluteintensityscale)。通过平均10-20个高q数据点的强度来测定不连贯的平台(incoherentplateau)，然后从减少的数据中扣除。使用N4+亚微米颗粒大小分析仪(Coulter,Miami,FL)通过光子相关光谱23,24(photoncorrelationspectroscopy)测定ULV大小。30发现大嚢泡是多分散性的，具有20至800nm的直径。在90°的角度上获得数据，使用大小分布法(sizedistributionprocess)(SDP)用自相关函数对数据进行分析。ANOVA分析用于测定统计学显著性，误差条表示标准差。j吏用在80kV加速电压下工作的HitachiTEM(H-7600,HITACHI,Japan)获取TEM图象。将各样品的小滴置于用支持方华(formvar)膜包被的镍网(200目，厚度30至75nm，ElectronMicroscopySciences,PA)。在进行TEM分析前，将网在室温下置于滤纸上2小时。在高放大倍率下最优化背景，而在低放大倍率(50-1，OOOX)下定位目的区域。可看到单个囊泡放大50，OOO倍。使用配有适当的图象采集软件的双重AMTCCD数码(2Kx2K，16bit)相机拍摄TEM显孩t照片。因为SapC只在酸性条件下，在带负电荷的不饱和脂质(即，DOPS)存在的情况下起作用，"因而本系统主要由DOPS和更少量的DPPC和DHPC组成。不同的[DOPS]/[DPPC]摩尔比的样品的DLS结果(表l)显示，只有[DOPS]/[DPPC]-10的样品展示双峰大小分布，而剩余的样品包含至少3个群体。为此，只将[DOPS]/[DPPC]-IO的样品用于进一步观察SapC、H1和H2对这些ULV结构的影响。DLS数据还显示，DOPS/DPPC/DHPC样品的结构在12个月的时期内是稳定的(表2)。这是与超声处理的D0PS相比，DPPC和DHPC的加入显著增加这些聚集体的稳定性并且提供它们可用于实践应用的可能性的证据。注意，从DLS结果计算的ULV的表观大小或流体力学半径(hydrodynamicradii)基于ULV是球形的4叚设。如文献中详细描述的，"对于扁长的或扁圆的嚢泡，嚢泡轴比的精确测定需要通过DLS和静态光散射(SLS)分别测量嚢泡的流体力学半径和回转半径。对于椭圆体嚢泡，表观流体力学半径将导致在ULV质量或表面积中对扁圆或扁长嚢泡分别产生少量(<10%)低估或高估。表2.来自溶液中DOPS/DPPC/DHPC聚集体的DLS数据的流体力学半径(nra)，其中([DOPS]+[DPPC])/DHPC=4。括号表示各聚集体的群<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>图2显示醋酸D20緩冲液中0.1wt.。/。的脂质混合物([D0PS]/[DPPC]=IO)和掺杂Hl和H2的脂质混合物的SANS数据。较低水平的SapC(6.25)LiM)未表现出扰乱ULV的大小或它们的膜结构(与非掺杂混合物相同)。在高SapC水平(62.5iuM)的情况下，掺杂SapC的脂质系统形成从溶液中沉淀出来的大聚集体(对SANS不顺从)，该观察与之前研究一致，表明SapC使膜去稳定化。"因此，我们只关注于Hl和H2对嚢泡的结构的影响。0.1%DOPS/DPPC/DHPC(三角形)、掺杂Hl的(正方形)和掺杂H2的(圆圈)混合物的SANS数据示于图2中。实线代表对所述数据的最佳拟合。由箭头标示的两个宽峰是存在于系统中的相关长度的结果。点线和虛线分别是用于拟合0.1%的非掺杂系统的三轴椭圆体和扁圆壳模型的结果。示于图2中的非掺杂SapC的样品的散射曲线共有共同的特征，即它们包含围绕q~0.01和0.03A^的两个宽峰，表明系统中存在两个相关长度。为更好地理解这些峰的起源，还检查0.05wt.。/。的纯脂质混合物。0.05wt.%的样品的SANS数据可扩大至与0.1wt.%的样品数据交叠，表明这两个宽峰是聚集体形态学固有的而不是颗粒间相互作用的结果。对于q〉0.06A_1,这3个数据组中强度的差异(图2)是难以区分的。用于所有3个样品的修正的吉尼耶图3°的分析(也称为Kratky-Porod图),其中ln(I.q2)在5x10—3至2.5xl(T2A—2范围内与^具有线性关系，显示存在薄层结构。图3显示0.1wt.%D0PS/DPPC/DHPC混合物(圓形)、掺杂Hl的系统(三角形)和掺杂H2(正方形)的系统的修正的吉尼耶图。线代表对数据的最佳拟合。然后从乘以VIi的斜率的平方根得到双分子层的厚度。最佳拟合结果显示非掺杂的混合物形成最厚的双分子层(37.7±0.7)A，而掺杂Hl和H2的双分子层略薄(分别为35.8±0.8和36.2±0.6A)。对于q<0.06A—\掺杂Hl的系统的散射曲线，与掺杂H2的系统相比，与非掺杂的脂质混合物的散射曲线相似，表明在用Hl肽掺杂膜时，在聚集体形态学中没有显著的变化发生。该观察也与之前的AFM报导相符，其中发现Hl对1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰丝氨酸(P0PS)双分子层没有影响。在掺杂H2的样品的SANS数据的情况下，在低q区域(q<0.003A—"数据的斜率和两个峰的宽度和强度中观察到与纯脂质混合物的SANS数据的定性差异。获得所有3个样品的TEM图象，观察具有两个形态学群体的颗粒。图4显示DOPS/DPPC/DHPC混合物(A和B)以及掺杂Hl的(C和D)和掺杂H2的(E和F)混合物的代表性TEM图象。三轴椭圆体嚢泡即A、C和E大小都相似(投影截面积150-200nmx600-800nm)，对于扁圓嚢泡也是这样，投影半径大约100-150nffl。按照单层三轴椭圆体嚢泡的数学模型，这些尺寸与SANS数据的最佳拟合结果相符，所述数学模型如下单层三轴椭圆体嚢泡的模型描述为沿着三个主轴具有不同核心长度a核心、b核心和c核心(a核心<b核心<c核心)的椭圆体壳(图4)。沿着轴的壳体长度a壳、b壳和c壳分别定义为(a核心+7)、(b核心+/)和(c核心+/),其中/是双分子层厚度。注意，该近似值未假定在整个ULV中沿着双分子层法线方向(normaldirection)双分子层的厚度恒定。三轴椭圆体壳的形状因子在所有可能的方向上是平均的，从而P三轴(q)可表达为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中乂；是一阶球形贝塞尔函数(Besselfunction)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>代表壳或核心)，V,g、和V核心分别是椭圆体的总体积和核心体积。pD2Q和p脂质表示D20和脂质的散射长度密度。对于扁圆椭圆体嚢泡，形状因子P扁圃(q)可通过使c核心-b核心来获得。因此，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>此外，Schultz函数f(a)用于描述较短的轴(即，a".)的分布，如下所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中〈a〉是a的平均数。/7是定义为cj/〈a〉的多分散性，其中cj是a的标准差。p的合理值在0-1的范围内。45Gamma函数r(1/力用于标准化Schultz函数的积分。将Eq.A-3置于Eq.A-l的内积分(innerintegration)内，即<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>非相互作用嚢泡(扁圓的和三轴椭圆体)的总散射强度可定为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中①脂质和①扁圃分别是溶液中总脂质和扁圆壳的体积分数。用IG0R程序代码写出拟合方法，其通过NISTSANS组开发的数据分析包来修正。提出的用于单层、三轴椭圆体双分子层嚢泡的模型示于图5。示出了亲水(头部基团)和疏水(烃尾部)区域。在扁圓嚢泡的情况下，b等于C。一个形态学具有半径大约150-200認的环形2-D投影，然而其他形态学具有长轴和短轴分别为600至800nm和100至200nm尺寸的伸长的椭圆体投影。该结果与DLS数据相符；然而，双峰分布可以是球形和椭圓体嚢泡的混合物或扁圆和三轴椭圆体嚢泡的混合物，这取决于颗粒沿着与投影垂直的轴的厚度。因为前者(球形和椭圆体嚢泡的混合物)不拟合我们的SANS数据，因此，我们用公式表示包括扁圆和三轴椭圆体囊泡壳的模型以拟合SANS结果。(参见单层三轴双分子层嚢泡的数学模型，见上文)。扁圆形态学具有两个等长的长轴和一个多分散短轴(示于图4B、D、F)，然而三轴椭圆体形态学具有三个不等长的轴(图4A、C、E)。该模型需要8个拟合参数(fittingparameter)，即三轴椭圓体壳的3个轴，扁圆壳的2个轴，扁圆形态学的较短的轴的多分散性、双分子层的厚度和三轴对扁圆的群体比。然而，来自TEM和DLS测量以及Kratky-Porod分析的结果使我们能够限制双分子层的厚度和在扁圓壳的情况下两个长轴的长度，以及三轴椭圆体壳的两个较长的轴。这留下较短的轴的长度、扁圆壳的较短轴的多分散性和三轴对扁圆的群体比作为自由拟合参数(freefittingparameter)。最佳拟合结果显示，扁圆和三轴椭圆体具有厚度为40±5A的双分子层，比从修正的吉尼耶图获得的结果略大。三轴椭圆体的最短轴和扁圆形态学的短轴分别是250土20A和100士10A。这些特征在SANS数据中产生了宽峰(大约0.01和大约0.03A,。此外，扁圆形态学的长轴长度(大约150nm)和椭圆体形态学的两个较长的轴的长度(大约200和500nm)的最佳拟合数据与图4中显示的TEM结果相符。在掺杂H2的混合物的情况下，发现扁圆椭圓体的百分数群体为大约40±10%,然而对于非掺杂或掺杂Hl的混合物，其为大约60±10%。在掺杂H2的系统中观察到更高强度的第一峰(大约0.OlA力(表明更多的三轴椭圆体嚢泡群体)的事实与最佳拟合结果相符。因此H2肽似乎促进形成三轴椭圆体囊泡。总之，所有三种技术表明两种形态学(即三轴和扁圆椭圆体)的存在。35用于通过使用SapC和SapC片段(H1和H2)形成ULV系统的DPPC/DHPC/D0PS混合物令人惊讶地显示脂质混合物的出人意料的行为。基于我们之前的实验结果，3我们的最初期望的是发现形成单分散、球形ULV的适当条件。然而，如我们上面所提及的，我们发现，虽然DPPC/DHPC/D0PS确实形成ULV，但通过DLS检查的该混合物的大小分布是多峰的。在双峰分布的ULV的情况下，我们发现各群体具有非球体形状和狭窄的大小分布。该观察使我们推测本ULV形成的机制与在DMPC/DHPC/DMPG混合物中发生的机制不同。在之前的研究中，我们发现低多分散性ULV的形成需要加热来自低温双分子层化的微团(双层微团(bicelles))形态学的系统。发现ULV的大小取决于双层微团的大小并且最可能受这样的因素如轮缘线张力能量(rimlinetensionenergy)、双分子层的弯曲刚度和双层微团聚结的速度调控。此外，DMPC/DHPC/DMPG双层微团—ULV的转变与DMPC的凝胶4液晶的转变密切相关，所述转变在大约23。C下发生。如果DPPC/DHPC/DOPS展示相似的行为，那么可能在-ll。C(在该温度下dops的脂肪酸链经历熔化转变)附近或低于-irc下发现双层微团形态学。因为在高温下稀释DMPC/DHPC/DMPG混合物导致具有宽广的大小分布的ULV形成，3因此我们推断此处的ULV形成机制与之前研究的机制不同。现有技术教导，当稀释时和作为集体膜波动(collectivemembranefluctuation)的结果，纯D0PS层堆叠完全解开，从而形成多分散ULV，这教导不要使用DOPS来形成脂质体的双峰群体。因此，虽然纯D0PS悬浮液也可形成ULV,但我们可通过此处形成发生的机制来驳回它。我们推测观察到的非球形ULV通过使中性短链DHPC聚集在ULV的高曲率区域来稳定，同时长链DPPC提供稳定的双分子层所需的必需刚性。本公开内容显示了出人意料的发现，即虽然观察到双峰的ULV大小分布，但单独群体的多分散性相当低。这可能是因为这两种群体代表可自由交换材料的平衡、最低能量状态，或可能是因为单独的ULV是能够在这两种形态学之间来回转变的动态结构。形态学自由转化的观点已在理论上得到预言并且也类似于之前的实验观察(其中扁长游离嚢泡转化成扁圆嚢泡，反之亦然)。"'35'36椭圆体ULV形态学也是出人意料的，但其可以是膜侧向不均匀性的后果。最近已通过SANS显示，包含饱和和不饱和脂质的三元混合物可展示侧向分离(lateralsegregation)。"此外，已发现，作为通过凝胶—液晶转变的不断增加的温度的函数，巨大ULV中的复杂的球形-多角形-椭圆体转变。38表面上多角形的形状(图4B)推测是由这两相之间的側相分离引起，其中D0PS和DHPC脂质在L。相中，而DPPC在凝胶相中。此外，由于不同的脂质种类具有不同的烃链长度，因此各结构域可有助于测定椭圆体的各个轴的长度。就我们所知，之前未曾报导过来自纯磷脂系统或脂质混合物的单分散性三轴椭圆体嚢泡，虽然有通过肌动蛋白的聚合诱导球形嚢泡转化成扁圆或不规则形状的嚢泡的实例。我们推测所述结果可归因于膜内的侧相分离。与高q数据的最佳拟合产生38至40A的双分子层厚度。因为椭圆体壳模型假定沿着主轴双分子层的厚度恒定，且穿过双分子层的散射长度密度均一，双分子层厚度的值可预期略大于从更详细的模型获得的值。修正的吉尼耶图表明，与掺杂Hl和掺杂H2的ULV相比，非掺杂的ULV具有更厚的双分子层。这证明虽然Hl和H2对双分子层具有减薄作用，但它们不使双分子层去稳定。Wang等人已报导Hl和H2可抑制SapC诱导的膜融合，这暗示着它们可能与SapC—样在相同的DOPS位点上结合，从而减少SapC与膜的相互作用。他们的结果还显示Hl在抑制膜融合方面比H2更有效。这与Hl对双分子层减薄具有更大作用的事实相符。之前的AFM研究已显示，H2在膜上形成斑块，所述斑块经推断为聚集在双分子层缺陷区域的杆状结构。SANS数据显示，在用H2掺杂后，与非掺杂和掺杂Hl的ULV相比，颗粒形态学从扁圆形向三轴ULV群体转移。因为已知短链DHPC在膜中产生缺陷，因此该脂质混合物可为H2与三轴椭圆体ULV结合提供合适的环境，从而导致三轴椭圓体ULV的优先形成。通过使用SANS、TEM和DLS,表征根据D0PS/DPPC/DHPC的混合物推测的各种形态学。观察到两种低多分散性的形态学，即扁圆和三轴椭圆体ULV。此处，ULV形成机制似乎与之前报导的不同，并且显示即使在经历凝胶—液晶的转变的长链脂质不存在的情况下亦可形成低多分散性的ULV。SANS结果显示HI和H2不使双分子层形态学去稳定，结果与之前的AFM数据相符，但H1对双分子层的减薄具有更大的作用。此外，H2肽的加入确实增加了三轴对扁圆椭圆体嚢泡的比，推测是由于各种脂质组分的溶混性的变化导致的。在另一方面，SapC的加入使膜去稳定，导致大聚集体从溶液中沉淀。不断增加的证据表明脂质体嚢泡是许多治疗剂的有效载体。然而，特定系统在治疗疾病中的功效和其商业生存能力是最重要的。在本公开内容中，证实包含磷脂酰丝氨酸的ULV自发形成，其是高度稳定的和低多分散性的。所述方案适合于结合SapC的ULV的大规模工业化生产，适合用于开发然后可就治疗剂的体内运输对其进行检测的SapC-PSULV复合物。本发明的长链脂质可以是具有长度大约14至大约24个碳，或长度大约18至大约20个碳的碳链的任何长链磷脂。脂质的穷举例表可在www,avantilipids,com上获得。本领域才支术人员理解哪种脂质可用于本发明。虽然可使用长链和短链脂质的任何组合，但一些组合产生更稳定的脂质体。例如，虽然不意欲于限定本发明，但下列方面可指导从其形成脂质体的组合物的选择当使用长度大约20至大约24个碳的长链时，可将具有大约6至大约8的长度的短链脂质用于提高的脂质体稳定性。当使用大约14至大约18的长链长度时，可将具有大约6至大约7的长度的短链脂质用于提高的脂质体稳定性。虽然脂质的这些组合产生更稳定的脂质体，但其他组合也可成功地使用，并且不希望被放弃。图2举例说明可用于产生更稳定的脂质体的磷脂组合的实例。然而，这些实例并不意味着磷脂的其他组合不能用于本发明。表2长链和短链磷脂的组合的非限定性实例长链磷脂长度短链磷脂长度(碳的数目)(碳的数目)14至244至816至225至718至206至720至247至814至184至6此外，脂质链上饱和烃的存在或不存在影响脂质体的稳定性。例如，使用具有大约18或更大的链长度的脂质，磷脂可以是饱和的或不饱和的，优选不饱和的。对于较短的长链脂质例如具有大约14至大约16个碳的脂质，脂质可以是不饱和的，但饱和脂质的使用产生提高的本发明的性能。另外的试剂使用除了上述生物相容性脂质和聚合物外的物质的组合物制备微球体也是本发明的一部分，只要所制备的微球体满足本文中所示的稳定性和其他标准。可加入丙二醇以通过促进脂质颗粒的分散和溶解来除去混浊。丙二醇还可用作增稠剂，其通过增加微球体膜或外壳上的表面张力来促进微球体的形成和稳定。丙二醇还可用作包被微球体的膜或外壳从而提供额外的稳定性的额外的层。作为此类其他基本或辅助稳定化合物的例子，存在可使用的常规表面活性剂，例如美国专利4，684，479和5,215，680。另外的辅助和基本稳定化合物包括这样的试剂如花生油、芥花油(canolaoil)、橄榄油、红花油、玉米油或通常已知可吸收的、按照本说明书中所示的要求和说明适合用作稳定化合物的任何其他油。此外，用于制备混合微团系统的化合物可适合用作基本或辅助稳定化合物，此类化合物包括但不限于月桂基三甲基溴化铵(十二烷基-)、鲸蜡基三甲基溴化铵(十六烷基-)、肉豆蔻基三甲基溴化铵(十四烷基-)、烷基二甲基苄基氯化铵(烷基-C12、C14、C16)、苄基二曱基十二烷基溴化铵/千基二甲基十二烷基氯化铵、节基二曱基十六垸基溴化铵/千基二甲基十六烷基氯化铵、千基二甲基十四烷基溴化铵/千基二甲基十四烷基氯化铵、十六烷基-二曱基乙基溴化铵/十六烷基-二曱基乙基氯化铵或十六烷基溴化吡咬/十六烷基氯化吡啶。已发现，可按照大小、溶解性和热稳定性通过在本文中描述的各种另外的或辅助稳定剂中进行选择，来控制用于本发明的脂质体。此类试剂不^又可以通过它们与脂质包衣的物理相互作用而且还可以通过它们修饰脂质体表面的粘性和表面张力的能力影响微球体的这些参数。因此，用于本发明的脂质体可以有利地进行修饰和进一步稳定，例如通过加入许多种(a)粘性调节剂的一种或多种来进行，所述粘性调节剂包括但不限于糖类和它们的磷酸化和磺酸化衍生物；和聚醚，优选其具有在400和100，000之间的分子量；二和三羟基烷烃和它们的聚合物，优选其具有在200和50,000之间的分子量；(b)乳化剂和/或增溶剂也可与脂质结合用于获得期望的修饰和进一步的稳定；此类试剂包括但不限于阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、甘油一酯和二酯、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188、泊洛沙姆184和泊洛沙姆181)、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚氧乙烯10-油醚、聚氧乙烯(20)十六烷基-十八烷基醚、硬脂酸聚烃氧(40)酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单椋榈酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡；(c)可与脂质一起使用的悬浮剂和/或增粘剂包括但不限于阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、乳浆剂、卡波姆934P、羧甲基纤维素、钙和钠和钠12、卡拉胶、纤维素、葡聚糖、明胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、硅酸铝镁盐、羟乙基纤维素、羟丙基曱基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环乙烷、聚维酮、海藻酸丙二酯、二氧化硅、海藻酸钠、黄蓍胶、黄原胶、oc-d-葡萄糖酸内酯、甘油和甘露醇；(d)还可使用合成的悬浮剂例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙二醇和聚山梨醇酯；和(e)可包括张力提高剂(tonicityraisingagent);此类试剂包括但不限于山梨醇、丙二醇和甘油。可用于产生水性环境的稀释剂包括但不限于水，去离子水或含有多种溶解的盐的水等，其将不干扰稳定的微球体的产生和维持或它们作为MRI造影剂的用途;和常用的盐水和生理盐水。用作用于制备填充有气体和气态前体的囊泡的稳定材料的生物相容性聚合物可以是天然、半合成(经修饰的天然)或合成来源的。如本文中所使用的，术语聚合物表示由两个或更多个重复单体单位，优选10个或更多个重复单体单位组成的化合物。短语半合成聚合物(或经修饰的天然聚合物)，如本文中所使用的，表示以一些方式进行了化学修饰的天然聚合物。适合用于本发明的示例性天然聚合物包括天然存在的多糖。此类多糖包括例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如，例如菊粉)、左聚糖、墨角藻聚糖、卡拉胶、galatocarolose、果胶酸、果胶，包括直链淀粉、普鲁兰多糖、糖原、支链淀粉、纤维素、右旋糖苷、糊精、右旋糖、聚右旋糖、石耳素、壳多糖、琼脂糖、角质素、软骨素(chondroitan)、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶、淀粉和各种其他天然同聚物或杂聚物、例如包含一种或多种下列醛糖、酮糖、酸或胺的同聚物或杂聚物赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、lucose、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤藓酮糖(erytirulose)、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、葡糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸，和其天然存在的衍生物。因此，合适的聚合物包括例如蛋白质，例如白蛋白。示例性半合成聚合物包括羧甲基纤维素、羟曱基纤维素、羟丙基曱基纤维素、曱基纤维素和甲氧基纤维素。适合用于本发明的示例性合成的聚合物包括聚乙烯(例如，聚乙二醇、聚氧乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯(polyethyleneterephthlate))、聚丙烯(例如，聚丙二醇)、聚氨酯(例如，聚乙烯醇(PVA)、聚氯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮)、聚酰胺包括尼龙、聚苯乙烯、聚乳酸、氟化碳氢化合物、氟化碳(例如，聚四氟乙烯)，和聚曱基丙烯酸曱酯，和其衍生物。当本公开内容与本领域内已知信息例如美国专利5，205，290(其公开内容以其全文通过引用合并入本文)中描述的和提及的信息结合时，一旦使用本公开内容，用于制备嚢泡的、使用聚合物作为稳定化合物的方法对于本领域技术人员来说将是很显然的。可选地，可在组合物的制剂中包含一种或多种抗菌剂和/或防腐剂例如苯甲酸钠、季铵盐、叠氮化纳、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(butylatedhydroxyanisole)、丁羟曱苯、氯丁醇、脱氢醋酸、乙二胺、石克代甘油、苯甲酸钾、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、亚硫酸氢钠、二氧化硫和有机汞盐。当稳定的嚢泡用于在侵袭环境下例如血管内或腹膜内成像时，这样的灭菌(其还可通过其他常规方法例如通过辐射来完成)将是必需的。基于本公开内容，灭菌的合适的方法对于技术人员来说将是显然的。二糖除了上述另外的组分外，可在加入水性溶液之前向干燥脂质混合物中加入二糖或可将二糖与水性溶液一起加入以提高脂质体的稳定性。合适的二糖的非限定性实例包括但不限于海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、半乳糖、葡萄糖、果糖或乳糖。通常，二糖以每10mg总蛋白大约50至大约100mg的糖，即大约1:10的蛋白质对二糖的比例包含。抗膜齐'J(AntimeffibraneAgent)此外，已知为抗癌(或"抗膜")剂的其他脂质可用于所述组合物和方法。例如，依地福新(Edelfosine)(sn-ET-18-0CH3或1-0-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，米替福新(Miltefosine)(十六烷基磷酸胆碱)或其他磷脂例如溶血磷脂、心磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、鞘氨醇、脑苷脂、胆固醇、此类脂质的经修饰的形式一起使用，上述脂质的任何组合可加入至本文中描述的组合物。示例性组合物可包含SapC(100jaM)+D0PS(280nM)+依地福新(20|iM);或SapC(100iaM)+DOPS(290/aM)+依地福新(IOjaM)。依地福新的量可在大约2至大约50jaM之间；DOPS的量可在大约250pM至大约298jLiM之间，其中SapC为大约100jaM。另一个示例性范围包括l:3:0.2至l:10:0.7的SapC:D0PS:依地福新的摩尔比。当描述SapC时，应当理解，本文中描述其他鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽可进行置换或可组合4吏用。虽然已结合其最优选实施方案描述了本发明，但另外的实施方案也在本发明的范围和精神内。本发明的优选装置仅仅意欲于举例说明本发明，而非限定随后的权利要求中定义的本发明的范围。权利要求1.用于形成脂质体群体的组合物，其包含a)至少一种长链阴离子磷脂；b)至少一种短链磷脂；c)和鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽；当加入水性溶液时脂质体自发形成。2.权利要求l的组合物，其中所述至少一种阴离子磷脂选自二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰甘油(D0PG)、二油酰磷脂酰肌醇(D0PI)和二油酰磷脂酸(D0PA)。3.权利要求l的组合物，其中所述至少一种短链磷脂选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰乙醇胺。4.权利要求l的组合物，其中所述脂质体群体具有单峰、双峰或三峰的单层嚢泡大小分布。5.权利要求l的组合物，其中所述脂质体群体由扁圆和三轴椭圆体单层嚢泡组成。6.权利要求l的组合物，其中所述鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质是一种或多种选自鞘脂激活蛋白C、Hl、H2、H3、H4、H5或其混合物的蛋白质。7.用于形成脂质体的组合物，其包含D0PS、DPPC、DHPC和选自鞘脂激活蛋白C、Hl、H2、H3、H4、H5或其混合物的鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽。8.权利要求4的组合物，其中DOPS对DPPC的比在大约2至大约20的范围内。9.权利要求1的组合物，其中所述脂质体由二油酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱和己酰磷脂酰胆碱组成，其中阴离子长链脂质、中性长链脂质和短链脂质的量受式([中性长链脂质]+[阴离子或中性长链脂质])/(阴离子或中性短链脂质)在大约2至大约10的范围内控制。10.上述权利要求中任一项的组合物，其还包含药学活性剂。11.制备脂质体群体的方法，其包括步骤a.提供至少一种阴离子磷脂、至少一种长链磷脂和至少一种鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽；b.力口入水性溶液；c.将所述至少一种阴离子磷脂、至少一种长链磷脂和至少一种鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质或多肽与所述水性溶液组合，从而自发形成具有单峰、双峰或三峰的单层嚢泡大小分布的脂质体群体。12.权利要求15的方法，其中所述至少一种阴离子磷脂选自二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰甘油(D0PG)、1，2-二油酰-磷脂酰肌醇(D0PI)和1,2-二油酰石粦脂酸(DOPA)。13.权利要求15的方法，其中所述至少一种短链磷脂是磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱。14.权利要求15的方法，其中所述至少一种短链磷脂选自DHPC、DHPS或其混合物。15.权利要求15的方法，其中所述脂质体群体由扁圆和三轴椭圆体单层嚢泡组成。16.权利要求15的方法，其中所述鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白质是一种或多种选自鞘脂激活蛋白C、Hl、H2、H3、H4、H5或其混合物的蛋白质。17.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPC和鞘脂激活蛋白C。18.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPC和Hl。19.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPC和H2。20.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPC和H5。21.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPC、鞘脂激活蛋白C、HI和H2。22.权利要求15的方法和鞘脂激活蛋白C。23.权利要求15的方法:其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、證S其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPS和Hl,24.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPS和H2,25.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPS和H5。26.权利要求15的方法，其中所述脂质体包含DOPS、DPPC、DHPS、鞘脂激活蛋白C、H1和H2。27.上述权利要求中任一项的方法，其中D0PS对DPPC或DHPS的比等于大约2至大约20。28.上述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质体由二油酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱和己酰磷脂酰胆碱组成，其中阴离子长链脂质、中性长链脂质和短链脂质的量受式([中性长链脂质]+[阴离子长链脂质])/[短链脂质]等于大约2至大约IO控制。29.权利要求28的方法，其中所述短链脂质是阴离子或中性的。30.上述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质体还包含药学活性剂。全文摘要本发明总体上涉及用于脂质体的自发形成的组合物和方法，其中所述组合物包含与短链脂质和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)衍生的蛋白质或多肽组合的阴离子长链脂质。通过施用单独的或与另外的治疗剂组合的脂质体，所述脂质体可用于治疗疾病。文档编号A61K9/127GK101541307SQ200780043876公开日2009年9月23日申请日期2007年10月19日优先权日2006年10月20日发明者J·凯特萨拉斯,M-P·纽,X·齐申请人:儿童医院医疗中心