专利名称：一种抗肿瘤中药组合物的质量控制方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，涉及一种抗肿瘤中药组合物的质量控制方法。
背景技术：
恶性肿瘤严重威胁人类健康与生命，其死亡率居各种疾病之首。目前，对恶性肿瘤的早期发现、早期诊断尚未妥善解决，亦缺乏有效的治疗方法。近二十余年来，中医药在防治肿瘤方面的作用越来越引起人们的重视。随着对中医药治疗肿瘤研究的深入，疗效的提高，应用中医药配合西医方法治疗恶性肿瘤已获得广泛开展。过去治疗恶性肿瘤“无瘤生存”的治疗目的，正向“带瘤生存”、提高生存质量的方向转变。充分发挥中医药的优势，可以调动宿主的潜能参与对肿瘤的调控，促进肿瘤患者的康复。
由藤黄20～60重量份，仙鹤草700～1000重量份，猪苓500～800重量份所制备的中药组合物具有扶正祛邪的功效，适用于治疗手术、放化疗前后与不宜手术及放化疗之恶性肿瘤患者，并且安全、无明显毒副作用。目前还未有完备的质量标准来控制该组合物制剂的质量，本发明提供了该组合物口服固体制剂的质量控制方法，能全面、有效的控制其质量，进一步保障该药物组合物的有效性和安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肿瘤中药组合物口服固体制剂的质量控制方法。
本发明所涉及的药物组合物的原料药组成及配比为藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份、猪苓500～800重量份，优选配比为藤黄40重量份、仙鹤草833重量份、猪苓667重量份。
按药剂学制剂方法，上述原料药制剂形式可为任何一种药剂上所说的剂型，包括但不仅限于颗粒剂、片剂、口服固体制剂、散剂、丸剂、口服液等。
该药物组合物的制备方法可以为 a.称取藤黄20～60重量份加95％乙醇回流提取三次，合并回流液，滤过，滤液浓缩得浸膏A； b.称取仙鹤草700～1000重量份、猪苓500～800重量份，加水煎煮三次，合并煎液，滤过，滤液浓缩得浸膏B； c.将浸膏A和浸膏B分别干燥至干膏，粉碎成细粉，合并，加入辅料，按照常规工艺制成各种剂型。
本组合物口服固体制剂的质量控制方法包括鉴别和含量测定。
一种由藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份和猪苓500～800重量份三味中药为原料药制成抗肿瘤药物组合物的口服固体制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中含量测定方法为 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为70～90∶10～20∶0.01～1的甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为350～380nm；理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000； 对照品溶液的制备取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.3～0.5mg的溶液，即得； 供试品溶液的制备取上述药物组合物口服固体制剂适量，精密称定，研细，取0.14～0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声3～15分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得； 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10～20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
一种由藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份和猪苓500～800重量份三味中药为原料药制成抗肿瘤药物组合物的口服固体制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中含量测定方法具体为 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为362nm；理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000； 对照品溶液的制备取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得； 供试品溶液的制备取上述药物组合物口服固体制剂适量，精密称定，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得； 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述含量测定方法中，组合物口服固体制剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg。
上述质量控制方法该方法还包括如下鉴别方法中的一种或两种 a、取上述药物组合物口服固体制剂内容物0.3～0.5克，研细，加甲醇2～10ml，超声处理20～40分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材5～15mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10～20∶0.5～3∶0.5～3的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
b、取上述药物组合物口服固体制剂1～5克，研细，加三氯甲烷20～60ml，超声处理5～20分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇20～60ml，水浴回流10～30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5～1.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材1～3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为3～8∶2～7∶0.5～2的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
上述质量控制方法具体可包括如下鉴别方法中的一种或两种 a、取上述药物组合物口服固体制剂0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
b、取上述药物组合物口服固体制剂3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
本发明质量控制方法还可以为 含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长为362nm，理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得对照品溶液；取组合物口服固体制剂适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。组合物口服固体制剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg。
鉴别a、取上述药物组合物口服固体制剂0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。b、取上述药物组合物口服固体制剂3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
该药物组合物主要扶正祛邪，应用于制备抗肿瘤药物。适用于治疗手术、放化疗前后与不宜手术及放化疗之恶性肿瘤患者，疗效显著，并且安全、无明显毒副作用。
本发明质量控制方法适用于该抗肿瘤药物组合物临床可接受的口服固体制剂，包括但不限于胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂等，优选胶囊剂，每日服用量相当于原生药量4g～8g。本发明质量控制方法分离效率高、稳定性好、分析速度快，是控制该抗肿瘤中药组合物口服固体制剂质量可靠的方法。本发明通过试验例进行具体阐述(以下称复方仙鹤草胶囊)。
试验例1.含量测定选择实验 处方中藤黄为君药，其中藤黄酸为其主要活性成分，因此选用藤黄酸为含量测定的指标成分。
仪器与试药 高效液相色谱仪SPD-10Avp；紫外检测器PDA2996；对照品藤黄酸(江苏汉邦科技有限公司提供，供含量测定用)；供试品复方仙鹤草胶囊(采用实施例1方法制备)，批号20060201，20060202，20060203。
(1)色谱条件的选择试验 ①检测波长的确定 根据紫外检测器检测，藤黄酸的紫外最大吸收波长为362nm，故选用362nm为检测波长。②色谱柱、柱温和流动相的考察 对系统适应性进行了以下试验考察，结果见表1。
表1.系统适应性考察试验结果
③提取溶剂和时间的考察 取本品内容物适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，分别用流动相和无水乙醇作提取剂，不同时间超声后测定结果见表2。
表2.提取剂及时间的考察
确定供试品溶液的制备 取本品内容物适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
色谱条件 色谱柱C18柱；柱温20℃；流动相甲醇∶水∶冰醋酸为83∶17∶0.1；流速1.0ml/min；检测波长362nm。
(2)专属性考察 取阴性样品(不含藤黄)约0.15g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果在藤黄酸相应处无吸收峰出现。(3)线性关系的考察 分别精密吸取对照品储备溶液(1.2mg/ml)适量，用流动相稀释成浓度为13.13μg/ml，26.25μg/ml，52.5μg/ml，105μg/ml，210μg/ml，420μg/ml的对照品溶液。各精密吸取20μl注入液相色谱仪，连续进样2次，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归计算，得回归方程Y＝26198X+53122，(相关系数r＝1，n＝6)。线性范围为13.13-420ug/ml，结果见表3。
表3.标准曲线绘制试验结果表
(4)精密度试验 照上述色谱条件，精密吸取对照品溶液(浓度为1.2mg/ml)20μl注入液相色谱仪，连续进样6次，测定。计算平均峰面积为1410951，其RSD值为1.41％，符合试验要求。结果见表4。
表4.精密度试验结果表
(5)重复性试验 取本品内容物适量(批号20060201)，研细，称取6份，每份约0.15g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备。照上述色谱条件，精密吸取各20μl注入液相色谱仪，连续进样2次测定。RSD值为1.18％，符合实验要求。结果见表5。
表5.重复性试验结果表
(6)稳定性试验 取本品内容物适量(批号20060201)，研细，取约0.15g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备，照上述色谱条件，精密吸取20μl注入液相色谱仪，每隔2.5h进样1次，测定供试品溶液12h的稳定性。其RSD值为.0.2％，符合实验要求。结果见表6。
表6.稳定性试验结果表
(7)加样回收率试验 取已知含量的样品(批号20060201)，研细，取约0.075g，精密称定，各加入已知含量的80、100、120％对照品贮备液。再按供试品溶液制备方法制备，共9份。精密吸取各20μl注入高效液相色谱仪，连续进样3次，测定。计算平均加样回收率为99.94％，其RSD值为1.57％，符合各实验要求。结果见表7。
表7.加样回收率试验结果表
(8)药材含量测定 取各药材粗粉约0.025g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，每次进样20μl测定。结果见表8。
表8.药材含量测定结果
(9)样品含量测定试验 ①对照品溶液的制备 精密称取置干燥器减压干燥48小时以上的藤黄酸对照品10.5mg，置25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.420mg/ml。
②供试品溶液的制备 取本品内容物适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
分别取批号20060201，20060202，20060203的样品3粒，研细，取约0.15g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，即得。精密吸取供试品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，连续进样2次，测定，即得。结果见表9。
表9.三批样品含量测定结果
实验结果可见该方法准确度较高，可用于复方仙鹤草胶囊中藤黄酸的含量测定。三批样品(20060201，20060202，20060203)其含量分别为7.09mg/粒、7.41mg/粒7.14mg/粒，平均含量为7.21mg/粒，药材藤黄酸含量为229.33mg/g，其制剂中藤黄酸的转移率分别为77.3％、80.7％、77.8％，平均转移率为78.6％。根据平均含量7.21mg/粒，考虑药材及工艺提取可能引起含量的浮动，因此将样品平均含量下浮20％，每粒藤黄酸的含量为5.77mg，取整数为5.8mg/粒作为限度，成品含量限度确定为即本组合物胶囊剂每粒含藤黄以藤黄酸(C38H44O8)计，不得少于5.8mg。
试验例2、复方仙鹤草胶囊的药效学实验研究 1、复方仙鹤草胶囊灌胃对小鼠移植瘤S180的抑制作用 试验材料 名称复方仙鹤草胶囊，批号20060201；环磷酰胺(CTX)，规格200mg/瓶，批号06060121，江苏恒瑞医药股份有限公司。
实验方法 取ICR种小白鼠50只，18-22g，雌雄各半，按移植性肿瘤研究法接种S180实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为5组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，ig给药，给药体积0.4ml/20g，每天一次，共给药7次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
结果表明，与空白对照组相比，复方仙鹤草胶囊(300，150mg/kg)组均可显著地抑制动物抑制性肉瘤S180的生长(P＜0.01)，同时对实验小鼠的体重影响较小。阳性药CTX组对S180肿瘤的抑制作用和对实验动物的体重影响显著(P＜0.01)。实验重复三次，结果相近。见表10。
表10复方仙鹤草胶囊ig对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10) *P＜0.05**P＜0.01与空日对照组比较 2、复方仙鹤草胶囊灌胃对小鼠移植瘤EC的抑制作用 实验方法 取上述规格小鼠50只按移植性肿瘤研究法接种EC实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为5组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，ig给药，给药体积0.4ml/20g 每天一次，共给药7次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
结果表明，与空白对照组相比，复方仙鹤草胶囊(300，150mg/kg)组均可显著地抑制动物抑制肿瘤EC的生长(P＜0.01)，同时对实验小鼠的体重影响较小。阳性药CTX组对EC肿瘤的抑制作用和对实验动物的体重影响显著(P＜0.01)。实验重复三次，结果相近。见表11。
表11复方仙鹤草胶囊ig对小鼠移植瘤EC的抑制作用(X±SD)(n＝10)
*P＜0.05**P＜0.01与空白对照组比较 3、复方仙鹤草胶囊灌胃对小鼠移植瘤Heps的抑制作用 实验方法 取上述规格小鼠50只按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为5组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，ig给药，给药体积0.4ml/20g 每天一次，共给药7次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
结果表明，与空白对照组相比，复方仙鹤草胶囊(300，150mg/kg)组均可显著地抑制动物抑制肝癌肿瘤Heps的生长(P＜0.01)，同时对实验小鼠的体重影响较小。阳性药CTX组对Heps肿瘤的抑制作用和对实验动物的体重影响显著(P＜0.01)。实验重复三次，结果相近。见表12。
表12复方仙鹤草胶囊ig对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n＝10)
*P＜0.05**P＜0.01与空白对照组比较 结论 复方仙鹤草胶囊(300，150，75mg/kg)灌胃(ig)给药对小鼠移植性肿瘤S180，EC，Heps的生长均有明显的抑制作用，其中复方仙鹤草胶囊(300mg/kg)ig对小鼠移植性肿瘤S180，EC，Heps的生长抑制率最高分别可达53.4％，55.98％和56.62％，同时对实验小鼠的体重影响较小。但同样条件下CTX对移植性肿瘤S180，EC，Heps的抑制作用和对实验动物的体重影响显著。
试验例3、本发明药物急性毒性实验 实验材料 复方仙鹤草胶囊，每克浸膏粉相当于9.49克生药材，批号20060201；0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液。
试验动物 健康ICR小鼠40只，清洁级，雌雄各半，体重18-22g；健康SD大鼠40只，清洁级，雌雄各半，体重130～150g。由浙江省实验动物中心供应，动物质量合格证SCXK(浙)2003-0001。
剂量组别及确定依据 根据小鼠、大鼠急性毒性预试结果及毒性反应情况，小鼠急毒预试口服复方仙鹤草胶囊全死剂量为10.0g/kg，全活剂量为6.0g/kg；大鼠急毒预试口服复方仙鹤草胶囊全死剂量为10.0g/kg，全活剂量为4.5g/kg。小鼠以组距0.84、大鼠以组距0.8分别设置以下剂量组别。
小鼠 第1组复方仙鹤草胶囊6.0g/kg 第2组复方仙鹤草胶囊7.1g/kg 第3组复方仙鹤草胶囊8.4g/kg 第4组复方仙鹤草胶囊10.0g/kg 大鼠 第1组复方仙鹤草胶囊5.1g/kg 第2组复方仙鹤草胶囊6.4g/kg 第3组复方仙鹤草胶囊8.0g/kg 第4组复方仙鹤草胶囊10.0g/kg 以上剂量组临用时用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制成不同浓度、同等容量的复方仙鹤草胶囊混悬液，供小鼠、大鼠灌胃用。给药容量小鼠0.8ml/20g体重；大鼠2.0ml/100g体重。
试验方法 取ICR小鼠40只，SD大鼠40只，随机分成以上各剂量组，每组10只，雌雄各半。各剂量组给药前禁食不禁水12小时以上(前一天晚上十八点三十分始禁食，次日上午九点前给药)。分别空腹灌胃给予以上各剂量组复方仙鹤草胶囊，给药后即刻观察动物的反应情况，包括动物外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便及其颜色、皮毛、鼻、眼、口有无异常分泌物以及死亡情况，死亡动物及时尸检，若肉眼观察有明显病变脏器则进行病理组织学检查。并给药第1天每隔30分钟到1小时观察1次，连续观察6h，以后每天观察1次，连续观察14天，记录动物毒性反应及死亡分布情况。根据死亡率用NDST统计软件处理，按Bliss法计算出小鼠、大鼠口服的急性半数致死剂量(LD50)及95％可信限值、列表表示。
试验结果 1.小鼠分别单次经口(po)(与临床给药途径一致)给予复方仙鹤草胶囊6.0、7.1、8.4、10.0g/kg剂量，给药即刻各组均未出现异常反应，给药2～3小时后出现药物样稀便、尿失禁(尿淋漓)、活动减少、闭眼等消化、泌尿及精神神经系统反应，给药后24小时和48小时分别观察，6.0、7.1、8.4g/kg剂量组各存活小鼠已逐步恢复正常活动。给药23小时后开始出现死亡，死亡时间在给药后23小时至72小时之间，各组死亡率分别为0％、30％、70％、100％。其反应出现率、反应程度、反应持续时间、死亡出现率和死亡出现时间均与剂量呈相应关系，剂量高反应重、出现时间早、持续时间长、死亡率也高，剂量低则相反。用NDST统计软件处理，按Bliss法计算得小鼠单次经口给予复方仙鹤草胶囊的急性半数致死剂量(LD50)及95％可信限值为7.7257(7.2403～8.2437)g/kg。死亡动物病理解剖肉眼检查，除胃内药物残留外未见明显异常，试验结束剖检所有存活小鼠也未见明显肉眼可见的脏器病理改变。
2.大鼠分别单次经口(po)给予复方仙鹤草胶囊5.1、6.4、8.0、10.0g/kg剂量，给药后即刻各组均未出现异常反应，给药30分钟～1小时后出现流涎、药物样稀便、尿失禁(尿淋漓)、活动减少、精神萎靡等消化、泌尿及精神系统反应，给药2小时后出现竖毛、弓背、俯卧等反应，给药6小时以后出现口腔鼻腔有血色分泌物现象，给药第2天后各剂量组大鼠均出现消瘦现象(尤其10.0g/kg剂量明显)。5.1g/kg剂量组给药后48小时，6.4、8.0g/kg剂量组给药后72小时各存活大鼠上述毒性反应逐渐消失。给药8小时后开始出现死亡，死亡时间在给药后8小时至72小时之间，各组死亡率分别为10％、30％、80％、90％。其反应出现率、反应程度、反应持续时间、死亡率和死亡出现时间均与剂量呈相应关系，剂量高反应重、出现时间早、持续时间长、死亡率也高，剂量低则相反。用NDST统计软件处理，按Bliss法计算得大鼠口服复方仙鹤草胶囊的急性半数致死剂量(LD50)及95％可信限值为6.9931(6.2545～7.819)g/kg。死亡动物病理解剖肉眼检查，除胃内药物残留外未见明显异常，试验结束剖检所有存活大鼠未见明显肉眼可见的脏器病理改变。试验例4、本发明药物长期毒性实验 试验材料 复方仙鹤草胶囊，每克浸膏粉相当于9.49克生药材，批号20060201，由中国药科大学研制提供；0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液。
试验动物 SD大鼠，清洁级，年龄5-6周龄，体重♂86～104g，±s94.9±4.6；♀85～103g，±s94.6±4.8；共120只，♀♂各60只。由浙江省实验动物中心供应，动物质量合格证号SCXK(浙)2003-0001。
剂量分组 高剂量组复方仙鹤草胶囊1.0g/(kg·d)×180d 中剂量组复方仙鹤草胶囊0.5g/(kg·d)×180d 低剂量组复方仙鹤草胶囊0.25g/(kg·d)×180d 对照组 0.5％CMC-Na溶液 10ml/(kg·d)×180d 以上各组临用前用0.5％CMC-Na溶液配制成不同浓度、同等容量的混悬液，供大鼠灌胃用，给药容量为1.0ml/100g体重，各组给药容量相同。
剂量确定依据 1.根据人临床拟用剂量1.953g/人·d(按60kg体重计算，即0.03g/kg·d)； 2.根据急性毒性预试验小鼠单次经口(po)给药全活剂量为6.0g/kg，大鼠单次经口(po)给药全活剂量为4.5g/kg。
试验方法 取清洁级SD大鼠120只，编号，雄性为奇数，雌性为偶数，按随机区组法分成四个试验组，即复方仙鹤草胶囊高、中、低三个剂量组和一个对照组，每组30只，雌雄各15只。试验前观察一周，记录大鼠的行为活动、摄食、饮水、精神、毛发、体重等。试验期间，每天上午同一时间经口灌胃(po)给药一次(与临床给药途径一致)，每周给药6天，连续180天(6个月)。每周称体重一次，随体重增减调整给药量。每天上午观察记录大鼠的一般体征(包括行为、运动功能、呼吸、毛色、口、眼、鼻、耳、粪、尿等)、摄食量、饮水量和死亡情况，发现有中毒反应的动物取出单笼饲养，重点观察，发现有死亡或濒死动物及时尸检，作大体观和病理组织学检查。
给药中期(给药三个月)、停药次日(给药六个月)及停药一个月(恢复期结束)分别进行血液学、血液生化学、脏器重量、系数及病理形态学和组织学检查。检查前禁食不禁水12小时以上(前一晚上二十点开始禁食，次日上午八点三十分左右采血)，用乙醚麻醉后，腹主动脉采血，EDTA-K2抗凝全血用莎莉全自动血细胞分析仪测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红素(HGB)、血小板(PLT)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布密度(RDW)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板比容(PCT)及淋巴细胞(Lym#)、中值细胞(Mid#)和粒细胞(Grn#)。用CA-100血凝仪测定凝血酶原时间(PT)。用煌焦油蓝试管染色法测定网织红细胞(Ret)。血清用HITACHI7020全自动生化分析仪及配对试剂测定天门冬氨酸转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、总蛋白(T.P)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T.BIL)、总胆固醇(T.CHO)，肌酸磷酸激酶(CK)、甘油三酯(TG)，用NOVA 10电解质仪及配对试剂测定Na+、K+、Cl-、TCa浓度。给药中期、停药次日和恢复期结束分别处死1/3大鼠作系统尸检和病理组织学检查，测定心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、甲状腺、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢的脏器重量和系数(％)；同时取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、脑、脊髓、胸骨、胸腺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、睾丸连附睾、前列腺作石蜡切片、HE染色，用尼康荧光摄影显微镜及病理组织学图像分析系统作病理组织学检查、观察和分析。以上各项观察指标(原始数据)均用NDST软件包及EXCEL相应的统计程序进行统计分析和处理，以统计学意义、一般反应情况、病理组织学检查结果结合本实验室建立的基础数据，综合评价试验结果。
试验结果 结果显示，在本试验剂量条件下，SD大鼠连续六个月分别经口给予批号为20060201的复方仙鹤草胶囊1.0、0.5和0.25g/(kg·d)剂量，其主要毒副反应为高剂量组部分大鼠活动减少、药物样稀便、尿淋漓、竖毛、脱毛、体重增长缓慢或减轻等毒副反应，对给药期间死亡大鼠的中毒靶器官主要为肝脏、肠、胃、胸腺、脾脏、淋巴结和骨髓；对活检大鼠的中毒靶器官为肝脏、小肠，并属可逆性影响(停药一个月检查未见类似情况)。中毒死亡剂量为1.0g/(kg·d)，安全剂量为0.5g/(kg·d)，无毒剂量为0.25g/(kg·d)。
具体实施例方式 以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1组合物胶囊剂的质量控制方法 藤黄40g、仙鹤草833g、猪苓667g，以上三味a.称取藤黄加95％乙醇回流提取三次，第一次6倍量、第二次3倍量、第三次3倍量，每次0.5小时，合并回流液，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏A。b.称取仙鹤草、猪苓，加水煎煮三次，第一次12倍量，第二次10倍量，第三次10倍量，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏B。c.将浸膏A和浸膏B分别干燥至干膏，粉碎成细粉，合并，加入辅料，制成1000粒胶囊剂，以下称复方仙鹤草胶囊。含量测定 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长为362nm，理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.42mg的溶液，即得对照品溶液；取复方仙鹤草胶囊20粒内容物，精密称定，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本组合物制剂中每粒含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于5.8mg。
鉴别 a.取复方仙鹤草胶囊内容物0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
b.取复方仙鹤草胶囊内容物3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
实施例2组合物片剂的质量控制方法 藤黄40g、仙鹤草833g、猪苓667g，以上三味a.称取藤黄加95％乙醇回流提取三次，第一次6倍量、第二次3倍量、第三次3倍量，每次0.5小时，合并回流液，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏A。b.称取仙鹤草、猪苓，加水煎煮三次，第一次12倍量，第二次10倍量，第三次10倍量，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏B。c.将浸膏A和浸膏B分别干燥至干膏，粉碎成细粉，合并，加入辅料，压制成1000片，以下称复方仙鹤草片。
含量测定 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长为362nm，理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.42mg的溶液，即得对照品溶液；取复方仙鹤草片适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本组合物片剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg。
鉴别 a.取复方仙鹤草片0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
实施例3组合物颗粒剂的质量控制方法 藤黄40g、仙鹤草833g、猪苓667g，以上三味a.称取藤黄加95％乙醇回流提取三次，第一次6倍量、第二次3倍量、第三次3倍量，每次0.5小时，合并回流液，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏A。b.称取仙鹤草、猪苓，加水煎煮三次，第一次12倍量，第二次10倍量，第三次10倍量，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏B。c.将浸膏A和浸膏B分别干燥至干膏，粉碎成细粉，合并，加入辅料，制成1000袋颗粒，以下称复方仙鹤草颗粒。
含量测定 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长为362nm，理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.42mg的溶液，即得对照品溶液；取复方仙鹤草颗粒适量，研细，取约0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本组合物制剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg。
实施例4组合物丸剂的质量控制方法 藤黄40g、仙鹤草833g、猪苓667g，以上三味a.称取藤黄加95％乙醇回流提取三次，第一次6倍量、第二次3倍量、第三次3倍量，每次0.5小时，合并回流液，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏A。b.称取仙鹤草、猪苓，加水煎煮三次，第一次12倍量，第二次10倍量，第三次10倍量，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃时相对密度为1.25-1.30的浸膏B。c.将浸膏A和浸膏B分别干燥至干膏，合并，粉碎成细粉，加入辅料，制1000丸，以下称复方仙鹤草丸。
鉴别 a.取复方仙鹤草丸0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
b.取复方仙鹤草丸3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
权利要求
1.一种由藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份和猪苓500～800重量份三味中药为原料药制成抗肿瘤药物组合物的口服固体制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中含量测定方法为
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为70～90∶10～20∶0.01～1的甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为350～380nm；理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.3～0.5mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取上述药物组合物口服固体制剂适量，精密称定，研细，取0.14～0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声3～15分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10～20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的一种由藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份和猪苓500～800重量份三味中药为原料药制成抗肿瘤药物组合物的口服固体制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中含量测定方法为
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为362nm；理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取上述药物组合物口服固体制剂适量，精密称定，研细，取0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求1或2所述的质量控制方法，其特征在于含量测定方法中，组合物口服固体制剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg。
4.根据权利要求1或2所述的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下鉴别方法中的一种或两种
a、取上述药物组合物口服固体制剂0.3～0.5克，研细，加甲醇2～10ml，超声处理20～40分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液；另取藤黄对照药材5～15mg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10～20∶0.5～3∶0.5～3的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点；
b、取上述药物组合物口服固体制剂1～5克，研细，加三氯甲烷20～60ml，超声处理5～20分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇20～60ml，水浴回流10～30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5～1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取仙鹤草对照药材1～3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为3～8∶2～7∶0.5～2的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
5.根据权利要求4所述的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下鉴别方法中的一种或两种
a、取上述药物组合物口服固体制剂0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液；另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点；
b、取上述药物组合物口服固体制剂3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
6.根据权利要求1或2所述的质量控制方法，其特征在于该方法为
含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为83∶17∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长为362nm，理论板数按藤黄酸峰计算应不低于3000；取藤黄酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得对照品溶液；取的本品20粒的内容物，精密称定，研细，取0.15g，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声6分钟，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液2.0ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得，本组合物口服固体制剂按日服用剂量计，含藤黄以藤黄酸C38H44O8计，不得少于23.2mg；
鉴别a、取上述药物组合物口服固体制剂0.4克，研细，加甲醇5ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，取上清液作为供试品溶液；另取藤黄对照药材10mg，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1的三氯甲烷-甲醇-三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置无斑点；b、取上述药物组合物口服固体制剂3克，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇40ml，水浴回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取仙鹤草对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶4∶0.8的甲苯-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，阴性样品在相应位置无斑点。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤中药组合物的质量控制方法，该组合物由藤黄20～60重量份、仙鹤草700～1000重量份和猪苓500～800重量份为原料药制成，本发明质量控制方法中含量测定采用高效液相色谱法测定组合物中藤黄酸的含量，并建立仙鹤草薄层色谱鉴别方法和藤黄薄层色谱鉴别方法。本发明质量控制方法分离效率高、稳定性好、分析速度快，是控制该抗肿瘤中药组合物口服固体制剂质量可靠的方法。
文档编号A61P35/00GK101554417SQ20081002332
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者钱一帆, 刘文英, 敏 冯, 华克伟, 建 沈, 朱韵韵 申请人:南京中科集团股份有限公司