专利名称：一种乙肝多肽疫苗及其应用的制作方法
一种乙肝多肽疫苗及其应用技术领域：
本发明涉及多肽疫苗领域，具体地说是一种具有治疗性作用的乙型肝炎多 肽疫苗，本发明还涉及该疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。背景技术：
乙型肝炎病毒是一种具有很强传染性的病毒，全球目前约有3亿5千万人 口感染乙型肝炎病毒，每年大约有1百万感染者死于乙型肝炎及由乙型肝炎诱 发的肝硬化，肝坏死和肝癌。乙型肝炎可以分为急性及慢性两种，95%左右急 性乙肝患者可以通过治疗而痊愈；5°/ 左右转变成慢性乙型肝炎。绝大多数的慢 性乙肝患者成为终生病毒携带者。中国是世界上罹患慢性乙肝最严重的国家。全国乙肝病毒表面抗原(HBsAg) 携带率平均10% (表面抗原携带者约1亿人)。全国人群乙型肝炎感染率高达 60% (约有6亿多人已被乙肝病毒感染过)。若不及时有效地清除乙型肝炎病毒 (HBV)，约25°/。的乙肝病毒携带者会发展为肝硬化，5-10°/。的患者会演变成肝 癌。目前人们对乙型病毒性肝炎主要采取预防手段，即接种乙型肝炎疫苗进行 预防。预防疫苗主要用于从未感染过的机体，因此天然结构的病毒蛋白可直接 作为疫苗抗原。但是已经开发出应用的乙型肝炎病毒疫苗，虽然能对HBV感染 起到良好的预防作用，但对感染HBV的机体，却难以发挥治疗和清除病毒的作 用。主要原因在于机体对乙肝病毒产生了特异性免疫耐受，免疫系统不能有效 地清除病毒。世界范围内对乙肝特别是无症状病毒携带者和慢性乙肝患者，一 直没有疗效确实及根治的方法，现有的干扰素等药物不仅价格昂贵，而且效率 低，容易复发。近年来，随着体外大量培养病毒技术、同位素标记技术和对病毒及亚结构 分析和纯化方法的发展，人们对病毒结构的认识日趋丰富。与此同时，将病毒 分解成各有效生物活性成分的方法也已出现。人们发现一些含类脂病毒(如流 感病毒、麻渗病毒和水泡性口炎病毒等)的表面成分或其蛋白的一部分肽段， 在免疫动物后会产生一定的保护性免疫。同时，蛋白质分析方法及免疫学都有 了长足的发展，这些新方法使我们可以迅速而又准确地确定病原体中可诱导免 疫应答的蛋白质及其片段，并产生了一种新疫苗-多肽表位疫苗。多肽表位疫 苗就是在具有抗原性的蛋白中选取单一表位或者多个表位进行组合，搭配，因 而可以在较小的分子中展现完整蛋白的免疫原性。合成多肽生产费用低且便于纯化，又不含诸如微生物培养物或其他病毒或白蛋白的残留物等生物成分。另一优点是多肽合成的重复性好，每批产品均可通过N端测序和氨基酸分析来控 制。所以其结构简单，易于生产而且高效、高特异性的特点使之成为当今疫苗 研发的热点。多肽疫苗是目前研究领域内较受重视的研究方向之一。尤其是病毒多肽疫 苗的研究取得了许多进展，结果令人鼓舞。1999年美国NIH公布了两种HIV-1 病毒多肽疫苗，对人体进行的I期临床试验结果，证实两种多肽能刺激机体产 生特异性抗体和特异性细胞免疫，并有较好的安全性。我国清华大学也证实 HIV-I膜蛋白内一段多肽有很强的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也显示有良好 的发展前景，国外学者从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一般多肽，它可 刺激机体产生保护性抗体。其它病毒的多肽疫苗及抗肿瘤、避孕多肽疫苗的研 究也取得了较大tt。美国Scripps研究所的F VChisari申请了四项美国专利，主要内容是关 于在HBV抗原上所确定的分别来源于核心抗原、表面抗原、多聚酶和X抗原的 CTL表位。目前国内文献所报道的以激活免疫系统为基础的乙肝多肽疫苗大都 集中于选用HBV病毒的蛋白的天然序列。当前，对HBV慢性持续感染状态尚无 根治的方法。如何打破机体慢性感染所形成的免疫耐受状态，治愈乙肝是抗 HBV治疗研究的重要课题。
发明内容本发明的目的就是为了克服目前乙肝疫苗的缺点，提供一种具有强细胞免 疫原性可以作为治疗用的、不易产生HBV感染免疫耐受、使用安全的疫苗；同 时，本发明还提供一种制备简单、易于构建、稳定性好的乙肝疫苗的制备方法， 本发明还涉及这种乙肝疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。抗原表位是抗原诱生特异性免疫应答的最小的结构和功能单位，包括B 细胞抗原表位、T辅助细胞表位和杀伤性T细胞表位。由于不同类型免疫应答 的下调、缺乏及紊乱是许多疾病的病因，因此以抗原表位为基础的疫苗设计日 益受到重视。在表位水平上对抗原性的认识已促成这样一种趋势基于抗原分 子的免疫干预手段已不再停留于病原体或天然抗原整体分子水平而开始向表 位水平过度。以表位为基础的疫苗包括多肽疫苗和以表位为基础的基因疫苗 等。HBV慢性感染的机制之一是机体不能诱生有效的特异性免疫应答，尤其是 病毒特异性的CTL应答。研究证实在HBV慢性感染中，特异性CTL的数量和活 性明显下降，不足以清除肝细胞内感染的病毒。由于机体的免疫机制清除感染 的肝炎病毒主务农赖于特异性的细胞免疫，而慢性感染者缺乏或下调了病毒特 异性的细胞免疫，因此，如何增强特异性细胞免疫，特别是诱生HBV特异性 CTL应答是治疗性疫苗设计的主要策略。本发明正是以多肽疫苗的方式入手，已知HBV基因中的表面蛋白抗原在HBV与肝细胞相应受体的粘附中起重要作用，而且在自然感染状态下，可能与 病毒清除密切相关，因此本发明选取表面蛋白的CTL抗原决定簇。HBV疫苗免疫比自然感染诱导的免疫应答范围窄，从而产生一种可能性， 即HBsAg中单个氨基酸置换可使这种HBV变异林能在疫苗免疫个体内复制，但 不能在自然免疫个体内复制。Wi lson等假设,对于预防HBV疫苗逃逸突变抹的 传播"需要含有能诱导抗常见HBV突变抹中和抗体的特异性表位的疫苗"。合 成多肽的方法符合这些要求，在单个剂量中可以包括不同序列，也可对疫苗进 行改变以加入新出现的变异序列。因此，本发明主要选取了能防止免疫逃逸和 免疫耐受的天然病毒表位的变异序列，且表位的筛选来自亚裔人种的病毒的主 要亚型。另夕卜，多表位的联合使用将有可能诱导出多重免疫效果，进一步地避免病 毒的逃逸。但是过多的表位一起使用将造成表位间的互相竟争与抑制作用，不 利于有效的CTL的诱生。因此，本发明选用了两种多肽表位，既可产生双价的 免疫原性，同时又避免了过多的表位间的竟争抑制作用。本发明的构建疫苗采用Fmoc多肽合成法，合成药学上可以接受两条多肽 主体；本发明还可以加入佐剂，如聚肌胞，阳离子脂质体，白细胞介素IL-12， GM-CSF, Y-千扰素等，也可以不加佐剂。所述的药物组合物可以通过常规的 免疫途径应用于人类，从而引发免疫应答。所述应用途径包括但不限于肌肉注 射、皮下注射、皮，注射、，静脉注射和鼻粘膜滴注等。 、 、。为慢性乙型肝炎治疗性多肽疫苗，用于打破HBV感染的免疫耐受，对慢性乙型 肝炎进行治疗。通过本发明后续的实施例表明，用本发明构建的多肽疫苗免疫 HLA-A2转基因小鼠产生了小鼠T细胞，能特异性地识别并清除带有HBV多肽 以及被乙肝表面蛋白标记的靶细胞。本发明的实施例还表明HBV核酸疫苗能特 异性诱导IFN-y的分泌。以下将结合附图和实施例详细说明本发明，应当说明的是，实施例是对本 发明的技术方案的进一步说明，但并不表明本发明仅限于这些实施例。
图1多肽体外活性;险测结果图2是本发明乙肝多肽疫苗免疫时间及方式图；图3是HBV-S2A和HBV-S5A诱导HLA-A2转基因小鼠的特异性的CTL扩增 的ELSP0T实验的直方图图4-5是HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾细胞导致HBV特异 性的CTL扩增分析图4是针对S2和S5的特异性的CTL扩增的直方图，图5 是4十对S2和S5的Tetramer实—睑和ELISP0T实—睑结果图。图6-8HBV-S2A和HBV-S5A特异性的CTL特异性地识别HBV天然多肽的试验结果图图6为特异性的CTL扩增的tetramer实验结果图，图7是针对S2A 的51铬释放实验结果图，图8为针对S5A的51铬释放实验的结果图。
具体实施方式实施例1T细胞抗原决定簇的筛选和改造本发明是基于表位的疫苗设计(英文译名为EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN, EBVD)。首先筛选靶抗原，通过高分辨率的免疫识别研究获得表位图 谱。以多种杀伤性T细胞实验进行功能篩选，选取具有较强免疫原性的杀伤性 T细胞的表位。再对其进行氨基酸的修饰与改造与修饰，采用计算机辅助疫苗设计" (Computers Aid Vaccine Design, CAVD)技术对改造和修饰进行分析。采用不同 的分析软件，如NetMHC3.0, HLA p印tide binding predictions, MHCPred, MHCform等软件，分析的主要方面有多肽的与MHC I类分子的结合能力， 结合能量以及浓度。才艮据软件分析的结合能力数值，结合能量的大小以及IC50的浓度值，筛 选获得十七个乙肝表面抗原HBsAg杀伤性T细胞抗原决定簇表位的类似物1) HBV画SIA: YLQAGFFLL2) HBV画S2A: VLQAGFFLV3) HBV國S3A: YLDSWWTSL4) HBV-S4A: ILLLCLIFV5) HBV-S5A: FLLTRILTV6) HBV画S6A: FIIFLFILV7) HBV-S7A: FLFILIXCV8) HBV國S8A: UXCLIFLV9) HBV國S9A: YLIXCLIFL10) HBV-S10A: YLLCLIFLL11) HBV-SUA: YLLDYQGML12) HBV-S12A: YMLPVCPLL13) HBV画S13A: YLSLLVPFV14) HBV-S14A: YMWYWGPSL15) HBV画S15A: YLSPFLPLL16) HBV-S16A: MMWYWGPSV17) HBV-S17A: VLLDYQGMV实施例2HBV-S5A多肽的合成工艺据多肽序列羧基端选 择不同的多肽树脂，如羧基端为颉氨酸，选择FmocVal-Wang-Resin(购于吉尔 生化)，如J^S端为亮氨酸，选择Fmoc Leu-Wang-Resin(购于吉尔生化)进行合 成。合成步骤如下9种带侧链保护基的Fmoc-氨基酸原料-固相合成-脱侧链保护基-HPLC纯化-冷冻干燥1. 氨基酸tt酸名称 Fmoc-L-Ala-OH Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH Fmoc-L-Gln(Trt)-OH Fmoc-L-Gly-OH Fmoc-L-Ile-OH Fmoc-L-Leu-OH Fmoc-L-Phe-OH Fmoc隱L-Thr(tBu)-OH Fmoc-L-Val-OH Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH Fmoc-L-Ser(tBu5誦OH Fm。c-L-Trp(Boc)國OH Fmoc陽L-Asp(OtBu)-OH Fmoc-L-CysCTr0-OH Fmoc-L-Met画OH Fmoc-L-Pro國OH2. 固相合成的过程 采用HBTU/HOBt法活化氨基酸，按照序列连接到氨基树脂上，共进行8步合成。以10mmole规;漠为例，称取树脂20克(树脂装载率为0.5mmole/g),倒入 多肽合成仪反应器内，按照目标多肽的氨基酸序列从C-端向N-端称取 40mmole相应的带保护基氨基酸，并排列在合成仪中。在室温条件下，按照电 脑程序分别自动进行完成8步合成反应。合成结束后，得到带侧链保护基的多肽树脂。取出多肽树脂，放入真空干燥器 中干燥2小时后称重。3. 脱保护基及沉淀来源Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. IncSynpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc将带保护基的目标多肽树脂置入带塞的三角烧瓶中，加入裂解试剂如下表:试剂 用量(mL) 水 12.5 三氟乙酸 470 三异丙基硅烷 12.5 二辟u乙醇 5恒温在25。C条件下，搅拌反应2小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三 氟乙酸洗涤，过滤合并入收集液。在搅拌下，滴加3000mL水乙醚(-10。C ), 得到白色沉淀，过滤，用少量冰乙醚洗涤粗品，并将粗品放入真空干燥器中干 燥过夜。4. HPLC纯化通过HPLC反相纯化制备得到目标多肽纯品三氟乙酸盐溶液(纯度>95% )。① 色语柱50mm*250mm Kromasil RP-18 10jnm 100A制备色谱柱② 流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液 B:O.P/o三氟乙酸乙腈溶液③ 上样溶液将多肽粗品(纯度约40~50%)用:0.1%三氟乙酸水溶液配成浓度为8.0mg/ml (按粗品计算)的溶液，并通过0.22jum滤膜过滤。
洗脱条件采用线性梯度洗脱，流速为120ml/min，紫外280nm;险测，洗脱梯度如下表时间 (min) 流动相B 0隱5 6% 5-40 6%-20% 40-45 20%誦40% 45-60 德 ⑤样品收集在20-35分钟期间，按照60ml/瓶分布收集洗脱主峰，并对各个样品液进行 分析检测。合并所有纯度大于98%的样品液。将纯化好的样品液通过HPLC反相换盐制备得到多肽粗品纯品乙酸盐溶液 (纯度>98% )。① 色谱柱50mm *250mm Kromasil RP-18 10 |i m 1OOA制备色镨柱② 流动相A:0.5。/o乙酸水溶液 B:0.5。/。乙酸乙腈溶液③ 上样溶液向多肽纯溶液加入等体积超纯水。④ 洗脱条件采用线性梯度洗脱，流速为120ml/min，紫外280nm检测，洗脱梯度如下表时间 (min) 流动相B 0-5 5% 5画20 5%-30%⑤ 样品收集 收集所有洗脱主峰溶液。 除去乙腈将多肽溶液倒入圆底烧瓶，25°C， -0.099 Mpa条件下旋转蒸发，除去所有 乙腈，剩余液体通过0.22pm滤膜过滤，留待冷冻干燥。5.冷冻干燥将目标多肽醋酸水溶液倒入真空冷冻干燥机样品盘内，按照电脑程序进行 冻干。实施例3多肽活性的活性检测实验采集HLA-A2的正常人的血液，Fioll-Hypaque法离心分离PBMC，用 RPMI160完全培养基(含10%胎牛血清)调节细胞浓度为1 x 107ml,体外培 养24h,待其恢复原生长状态后进行后续处理。将分离的得到的HLA-A2人PBMC制成单细胞悬液，以2 x l05/ml浓度悬 浮于RPMI1640培养液(含10%胎牛血清、10ng/ml抗原、30U/ml rhlL-2 )中， 分配于24孔细胞培养板内，持续培养1周后，以1000r/min离心10min，去 上清，用前述培养液重悬，用各种表位肽刺激，每周刺激1次，共两次，末次刺激24h后，离心收集细胞，用前述培养液调节细胞至1 x 107ml,用作效应 细胞。采用T2细胞作为靶细胞，生长状态良好的T2细胞，用前2h加入相应的 多肽(1 |ag/ml )预包被，用51Cr标记后，按照效靶比(E/T) 50: 1与效应细 胞共培养4h，培养结束后取上清检测Y计数值，如图1所示。实施例4 HBV-S2A和HBV-S5A诱导HLA-A2转基因小鼠的CTL活性为了评价HBV-S2A和HBV-S5A诱导的CTL应答的效力，用UV-B52(指 HBV-S2A多肽与HBV-S5A多肽)对HLA-A2转基因小鼠进行免疫。取 HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分别溶于lml PBS,给药前与等体积的lmg/ml 的聚肌胞(Sigma,弁CatP1530)混合后用lml的注射器经皮下注射给药。两组动 物分别在第1， 4， 15，和18天以多肽佐剂(对照)或25 pi UV-B52-S2A和25 |il UV-B52-S5A以^尔比1:1的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见图2。每 只小鼠注射的总剂量(4次)为脚g。在最后一次给药后两周，以双盲法收集脾细胞。将每只动物的脾脏收集至 一个含有5mlRPMI培养基的15ml的离心管中，并在管子上标记转基因小鼠的 编号。样品保存于冰上，并于收集的当天进行分析。将脾脏碾磨并制成单细胞 悬液。用密度梯度离心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分离单核细胞， 并在细胞培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至lxl(^细胞/ml。将每只小鼠的脾细胞收集后分为四组，在预包被了具有高亲和性的单克隆 抗体的ELISPOT的板中，每孔置来自免疫组或对照组的脾细胞lxl(^个，并 加入10jug/ml的HBV-S2A， HBV-S5A，对照多肽或者不加多肽共同进行孵育。 在37°C ， 5% C02and 100%湿度的培养箱中培养24小时后，溶解细胞并洗脱。 细胞因子在释放的区域被捕获并由 一个结合了生物素的抗细胞因子抗体标记。 经显色后形成一个黑点。用ELISPOT计数器计算斑点的数量，即活化的T细 胞的数量。经显色，在AID国际平板计数器上，用3.2.3版IFN-Y斑点计数软 件分4斤每只^皮免疫动物4十对每种抗原的y-IFN斑点。与对照组相比，在用HBV多肽类似物免疫的小鼠脾脏T细胞中，检测到 了高水平的多肽特异性的CTL活性。ELISPOT分析表明，HLA-A2转基因小 鼠对HBV-S2A和HBV-S5A产生了较强的免疫应答，10只小鼠的脾细胞均可 诱导IFN-y的产生(见图3)。而在注射多肽载体的动物(对照组)中，未产 生显著的应答(见图3)。实施例5 HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾细胞导致HBV特异性 的CTL扩增为了评价HBV-S2A和HBV-S5A诱导的CTL的数量的扩 能力，用UV-B52对HLA-A2转基因小鼠进行免疫。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg 分别溶于lml PBS,给药前与等体积的lmg/ml的聚肌胞(Sigma, #Cat. P1530) 混合后用lml的注射器经皮下注射给药。两组动物分别在第1， 4， 15，和18 天以多狀佐剂(对照)或25 pl UV-B52-S2A和25 pl UV-B52-S5A以摩尔比1:1 的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见图2。每只小鼠注射的总剂量(4次) 为100吗。在最后一次给药后两周，以双盲法收集脾细胞。将每只动物的脾脏收集至 一个含有5mlRPMI培养基的15ml的离心管中，并在管子上标记转基因小鼠的 编号。样品保存于冰上，并于收集的当天进行分析。将脾脏碾磨并制成单细胞 悬液。用密度梯度离心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分离单核细胞， 并在细胞培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至lxl(^细胞/ml。将每只小鼠的脾 细胞分成两份，每份lxl(^个细胞，与鼠-抗鼠CD8a(Ly-2)单克隆抗体(BD Biosciences, 553031 )和HBV-S2A tetramer或者鼠-抗鼠CD8a (Ly-2)单克隆 抗体(BD Biosciences, 55303l)和HBV-S5A tetramer共染色。用BD FACS Calibur流式细胞仪进行数据收集，并用cellquest软件进行淋巴细胞分类，计 算在CD8+CTL亚群中tetramer+的细胞的百分比。用天然的S2多肽刺激 UV-B25免疫后的小鼠脾细胞，6天后，检测培养物中CD8+HLA-A2/S2四聚 体阳性细胞的数量。免疫小鼠新鲜脾细胞中，该细胞的检测频率为0.19% (见 图4)。用天然S2刺激后，细胞数量显著增加，其频率为4.97%，扩增了 25 倍(见图5),而S5组的试验结果也与此相似，且频率更高，扩增倍数为33 倍。与之相比，对照组经S2或S5刺激后的小鼠脾细胞，频率未显著改变(见 图3)。实施例6 HBV-S2A和HBV-S5A特异性的CTL特异性地识别HBV天然多肽 的免疫原性分析为了检测HBV-S2A和HBV-S5A诱导的T细胞能否特异性识别天然的 HBV多肽，采用来自HBV-S2A和HBV-S5A免疫后的T细胞，用ELISPOT 法检测多肽特异性的IFN- Y释放，并用51铬放射分析检测多肽诱导的特异性 杀伤功能。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分别溶于lml PBS,给药前与等体积的 lmg/ml的聚肌胞(Sigma, #Cat. P1530)混合后用lml的注射器经皮下注射给药。 两组动物分别在第1, 4， 15,和18天以多肽佐剂(对照)或25 pl UV-B52-S2A 和25 pl UV-B52-S5A以摩尔比1:1的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见 图2。每只小鼠注射的总剂量(4次)为100ng。在最后一次给药后两周，以双盲法收集脾细胞。将每只动物的脾脏收集至 一个含有5mlRPMI培养基的15ml的离心管中，并在管子上标记转基因小鼠的编号。样品保存于冰上，并于收集的当天进行分析。将脾脏碾磨并制成单细胞悬液。用密度梯度离心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分离单核细胞， 并在细胞培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至lx107细l包/ml。将每只小鼠的脾细胞收集后分为四组，在预包被了具有高亲和性的单克隆 抗体的ELISPOT的板中，每孔置来自免疫组或对照组的脾细胞lxl(^个，并 加入10pg/ml的HBV-S2A, HBV-S5A,对照多肽或者不加多肽共同进行孵育。 在37°C , 5% C02 and 100%湿度的培养箱中培养24小时后，溶解细胞并洗脱。 细胞因子在释放的区域被捕获并由 一个结合了生物素的抗细胞因子抗体标记。 经显色后形成一个黑点。用ELISPOT计数器计算斑点的数量，即活化的T细 胞的数量。经显色，在AID国际平板计数器上，用3.2.3版IFN-Y斑点计数软 件分析每只^皮免疫动物4十对每种抗原的，IFN斑点。将5xl06个来自于对照组与免疫组的脾细胞与5xl()S个经脂多糖刺激72 小时后，伽玛照射和加载多肽的同源小鼠的脾细胞置24孔板中共同培养，48 小时后，加入1 ng/ml鼠重组IL-2。细胞培养6天后，从培养板中收集CTLs, 计数后将CTL分成三组，三组浓度分别为lxl07/ml, 3xl06/ml和lxl06/ml。每 组三孔，每孔加100ul置96孔板中置37。C备用。用T2细胞(来自美国模式 菌体收藏+心)做为靶细胞测定CTL的免疫原性。将3 x 106 T2细胞分成3 组， 一组不加多肽作为对照，另两组分别加入25吗HBV-S2A和HBV-S5A, 每组加入100uCi的51Cr， 37。C培养1个小时。标记和装载后，洗脱细胞三次， 再次制成悬浮液，浓度为1()S/ml。在上述含有CTL的U形板中，每孔加入100(^1 靶细胞。为了测定自发及最大释放量，每个耙位配制另外6个含有10(Hil把细 胞的孔。其中三孔加入100pl培养液，用于测定自发释;^文量；另三孔加入100|al 2%SDS，用于测定最大释放量。37。C培养4小时后收集上清液，用Y计数器 进行计数。按照以下方法对特异性裂解进行确定％特异释放=[(试验释放值 -自发释放值)/(最大释放值-自发释放值)]xlOO。/。。按以下方法表达数据X 轴表示效应靶位比；y轴表示相应的特异性裂解百分比。将试验组小鼠脾细胞 的结果与未免疫小鼠的脾细胞结果进行对比。如图6-8所示，HBV-S2A特异性的CTL能有效地交叉识别天然的S2多 肽和S5多肽，其中Tetramer实验显示针对S2A和S5A的特异性的CTL有明 显的扩增(见图6 )， 51铬释放实验显示这些特异性的CTL能导致耙细胞的裂 解(T2分别加入了天然的S2和S5 )。而这些CTL对不含多肽的T2对照细胞 无影响(见图7-8)。序列表< 110>珠海联邦制药股份有限公司<120〉一种新型乙肝多肽疫苗及其应用<160>17<210>1 <211>9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>1Tyr Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu 1 5<210>2 <211>9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>2Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Val 1 5<210>3 <211〉9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>3Tyr Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu 1 5<210〉4 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>4
lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Val 1 5
<210>5 <211〉9 <212>PRT
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Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr Val 1 5
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Phe lie lie Phe Leu Phe lie Leu Val 1 5
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Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Val 1 5
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Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Val 1 5
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Tyr Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Leu 1 5
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Tyr Met Leu Phe Val Cys Pro Leu Leu 1 5
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Tyr Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 1 5
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Tyr Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 1 5<210>15
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Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Val 1 5
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Val Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Val 1 权利要求
1、一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，含有多肽，多肽能刺激引起CTL反应，并且多肽序列中含有1个突变的氨基酸残基，突变位于肽段的N末端或C末端。
2、 根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗 含有一种或者一种以上多肽。
3、 根据权利要求1或2所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述 多肽的tt酸序列中含有9个氨基酸。
4、 根据权利要求3所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽 选自如下序列VLQAGFFLV、 YLQAGFFLL、 FLLTRILTV、 YLDSWWTSL、 FIIFLFILV、 FLFILLLCV、 ILLLCLIFV、 YLLLCLIFL、 LLLCLIFLV、 YLLCLIFLL、 VLLDYQGMV、 YLLDYQGML、 YMLPVCPLL、 YLSLLVPFV、 醒WYWGPSV、 YMWYWGPSL、 YLSPFLPLL。
5、 根据权利要求4所迷的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽 选自如下序列VLQAGFFLV, FLLTRILTV。
6、 根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述CTL 反应为乙肝病毒特异性的CTL反应。
7、 根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗 是药学上可接受的任意一种剂型。
8、 权利要求l-7中任意一项所述的乙肝多肽疫苗在制备治疗乙肝病毒 慢性感染持续状态及相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药 物的用途。
9、 根据权利要求8所迷的用途，其特征在于，所述乙肝病毒慢性持续 感染状态为慢性乙肝肝炎或乙型肝炎。
全文摘要
本发明公开了一种新型乙肝多肽疫苗及其应用。一种乙肝多肽疫苗，含有多肽，所述多肽能刺激引起CTL反应，并且所述多肽序列中含有1个突变的氨基酸残基，突变位于肽段的N末端或C末端。所述疫苗含有一种多肽或者一种以上多肽。所述乙肝多肽疫苗应用于制备治疗乙肝病毒慢性感染持续状态及相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物，可有效避免由天然病毒多肽序列引起的免疫耐受。
文档编号A61K39/00GK101618211SQ20081002921
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者曹春来, 肖拥军, 妍 郭 申请人:珠海联邦制药股份有限公司