专利名称：一种信号芋螺毒素突变体多肽化合物lt14a-7及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽化合物，其制备方法及其作为药物的应用，属于生物领域。
背景技术：
芋螺属于软体动物门，腹足纲，芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域， 因外形呈圆锥形或芋头状而得名，表面常有各色花纹，壳口窄长。芋螺是比较年轻的生物， 化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期海洋捕食性软 体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐 射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在(Terlau and Olivera, 2004)。
芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约700种芋螺，芋螺是海洋无脊椎动物中进化最 成功的生物之一。芋螺虽然种类很多，但他们都是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习 性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。 食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70%左右。三种芋螺中食鱼芋螺毒液的毒性最高， 食虫芋螺的毒性最低。
芋螺毒液是芋螺捕食与防御的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒 素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常为由7 41个氨基酸残基组成小分子多ftC。 大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素 比较(40 80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密， 生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽 前体，约为70-100个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。这些成熟肽分别选择性的作 用于钙、钠、钾离子通道，或者乙酰胆碱、NMDA、 5-羟色胺等受体，许多已经成为神经生理 学研究的工具药。但是，目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒 液研究的相对较少。
二十世纪八十年代初，美国犹它大学01ivemBM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系 统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫， 骨架)，可分为不同的超家族。至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素己 申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有 广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试
剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的co-CTXMWA (SNXin，商品名Ziconotide)， 因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治 疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了m期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个 衍生于od-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更 强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。 此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已 完成I期临床试验。
另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控 型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工 具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
天然信号芋螺毒素ltl4a是一个由13个氨基酸组成的多肽，具有拮抗神经元型烟碱样乙 酰胆碱受体(nAChR)的活性。该受体与痛觉的传导相关，适当的抑制该受体可以起到镇痛 作用。其中，突变体ltl4a-7与原ltl4a都有相对高的药效，这样就为芋螺毒素ltl4a和同源的 其他毒素的性质优化提供了较好的理论依据和实验依据。
发明内容
本发明的目的是针对上述镇痛药物的现有的技术基础及其局限性，公开一种较天然的芋 螺毒素ltl4a具有镇痛活性的突变体多肽ltl4a-7，同时公开了其制备方法及在制备镇痛药 物中的应用。
本发明的一种信号芋螺突变体多肽化合物，其特征在于，氨基酸序列方向N端到C端为
Lt 14a-7 MCPPLCAPSCTNO
其中，ltl4a-7具有酰胺化的C端，*表示酰胺化。 此外还有包含该多肽序列的蛋白以及在它们基础上通过单独或组合采取氨基酸缺失，取代， 添加以及共价和非共价修饰手段所获得的化合物。 制备该突变体的方法
1. 精确称量Rink树脂O.lmmol (合计0.2g)后，至于手工合成反应器中，用DMF冲洗六次， 然后加入约树脂体积2 3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使树脂能在溶液中上下翻 动。
2. 加入树脂体积2倍量的20%哌啶于手工合成反应器中，通入氮气反应10分钟。然后用 DMF冲洗两次。
3. 再次加入树脂体积2倍量的20%哌啶于手工合成反应器中，通入氮气反应20分钟。然
后用DMF冲洗六次。
4. 称量0.45mmol的Fmoc-AA、 HOBt禾卩HBTU，先用lml DMF溶解HOBT及HBTU，后 将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟。
5. 将活化好的Fmoc-AA溶液以及ImL DIPEA同时加入树脂中。
6. 调节氮气的流量，使树脂能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时。
7. 反应结束后用DMF、 DCM、 DMF依次各洗Resin两次。
8. 重复步骤3至8，直到多肽序列偶连完为止。
9. 加入树脂体积2倍量的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分 钟。
10. 用DCM、 DMF、 DCM依次各洗树脂两次，最后一次洗完后，将树脂尽量抽干，即得 Peptide-Resin (肽树脂)。
11. 配置裂解液lg肽树脂对应10ml裂解液。
12. 将裂解液加入到手工合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防 蒸干。另将无水乙醚置于4'C冰箱中冷冻备用。
13. 反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中。再用TFA清洗合成反应器2-3 次，洗液同样收集到50ml离心管中。
14. 将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中。按无水乙醚裂解液=10 : 1 (体积比)的比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入， 同时不断搅拌至不再产生沉淀为止。
15. 将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三 次。
16. 将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥。
17. 碘氧化法按0.1mg粗肽lml水配粗肽溶解液。加入碘液不停搅拌，直至黄色不褪去， 离心除去杂质。
18. 取10-20^1上样于HPLC进行检测，找出可能的目的峰进行质谱鉴定。
19. 之后纯化分子量相应的目的峰，冻干保存。
有益效果天然ltl4a与ltl4a-7的作用对象是神经元型nAChr，两者化学结构和性质 上的区别在于(l)前者第七位为Lys，后者为Ala; (2)前者分子量为1391.7，后者为1338.4 (均为复性前)；(3)前者的等电点为8.29，后者为5.27。天然ltl4a及其突变体ltl4a-7 序列如下所示(*表示酰胺化)这些化学结构和基本性质上的差异决定了后者在镇痛效果上
具有比较好的优越性。
Ltl4a MCPPLCKPSCTNO Lt 14a-7 MCPPLCAPSCTNO
1. Ltl4a-7同样具有镇痛活性 可能由于疏水丙氨酸的引入导致疏水性增强使蛋白质分子内部结合更加紧密，稳定性^
高与nAChR某些受体亚基结合能力增强，从而适当的增加了拮抗活性，适当的增加了对疼痛 传导的阻断作用，使得该突变体具有了相对比较好的镇痛活性。
动物实验表明，脑室注射同等剂量的ltl4a, ltl4a-7后，在1. 5h、 3h、 6h的时刻，ltl4a-7 的药性均较优于前者，而在6h左右二者药效均不明显。
2. Ltl4a突变体在镇痛中的应用
根据文献报道，海螺毒素MVIIA的镇痛活性比吗啡高1000倍以上。持续时间长久。其 机制是通过抑制中枢神经中的N型钙离子通道而发挥其镇痛效力。Ltl4a的镇痛机理是拮抗 神经元型烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)的活性。适当地抑制该受体可阻止痛觉信号的传导， 从而起到镇痛作用。经小鼠醋酸扭体模型实验表明，ltl4a及其突变体ltl4a-7的镇痛活'^ 在3h时均优于MVIIA，而ltl4a的突变体在1. 5h时的药性弱于MVIIA， 1. 5h ltl4a-7的药 性却强于MVIIA。因此本专利所述的ltl4a的突变体可以作为另一种的高活性镇痛药物。
3. 副作用小
Ltl4a-7由于药靶确切，作用位点专一，与药靶结合强度恰到好处，用量低，用药剂量无 需不断增加，因此具有很小的副作用。
4. 用途广泛
由于药靶不同于阿片类药物，ltl4a-7适用于所有阿片类镇痛药敏感型和不敏感型的疼 痛。本发明中针对ltl4a-7的应用是指它们作为缓解疼痛的候选药物或先导药物的应用。具 体而言是指在治疗癌痛，神经痛，以及风湿引起的疼痛等疼痛中的应用。
图1为液质联用质谱仪检测到的分子量，经确认为ltl4a-7。 图2为3h时刻ltl4a-7， ltl4a， MVIIA，生理盐水的镇痛效果比较。 图3为1.5h、 3h、 6h时刻ltl4a-7， ltl4a和MVIIA的镇痛效果对比。 图中，在1.5小时时刻，ltl4a-7和ltl4a组差异并不显著，ltl4a和MVIIA组差异不显著。 在3小时时刻，ltl4a和ltl4a-7差异不显著，而二者与MVIIA差异极显著(p<0.01)。在6 小时时刻，三者差异不显著。
具体实施例方式
一种信号芋螺毒素突变体多肽化合物，其氨基酸序列方向N端到C端 Ltl4a-7 MCPPLCAPSCTNC* 其中，ltl4a-7具有酰胺化的C端，*表示酰胺化。 实施例1:信号芋螺毒素ltl4a突变体ltl4a-7的固相合成及分离纯化
1. 精确称量Rink树脂0.1mmol(合计0.2g)后，至于手工合成反应器中，用DMF冲洗六次， 然后加入约树脂体积2 3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使树脂能在溶液中上下翻 动。
2. 加入树脂体积2倍量的20%哌啶于手工合成反应器中，通入氮气反应10分钟。然后用 DMF冲洗两次。
3. 再次加入树脂体积2倍量的20%哌啶于手工合成反应器中，通入氮气反应20分钟。然 后用DMF冲洗六次。
4. 称量0.45mmo1的Fmoc-AA、 HOBt禾B HBTU，先用lml DMF溶解HOBT及HBTU，后 将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟。
5. 将活化好的Fmoc-AA溶液以及lmL DIPEA同时加入树脂中。
6. 调节氮气的流量，使树脂能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一 般 为2小时。
7. 反应结束后用DMF、 DCM、 DMF依次各洗Resin两次。
8. 重复步骤3至7，直到多肽序列偶连完为止。
9. 加入树脂体积2倍量的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟。
10. 用DCM、 DMF、 DCM依次各洗树脂两次，最后一次洗完后，将树脂尽量抽干，即得Peptide-Resin (肽 树脂)。
11. 配置裂解液lg肽树脂对应10ml裂解液。
12. 将裂解液加入到手工合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防 蒸干。另将无水乙醚置于4t:冰箱中冷冻备用。
13. 反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中。再用TFA清洗合成反应器2-3 次，洗液同样收集到50ml离心管中。
14. 将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中。按无水乙醚裂解液=10 : 1 (体积比)的比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入， 同时不断搅拌至不再产生沉淀为止。
15. 将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三 次。
16. 将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻千机冷冻真空干燥。
17. 碘氧化法按0.1mg粗肽lml水配粗肽溶解液。加入碘液不停搅拌，直至黄色不褪去， 离心除去杂质。
18. 取10-20pl上样于HPLC进行检测，结果如图l所示，找出可能的目的峰进行质谱鉴定。 之后纯化分子量相应的目的峰，纯化中，采用HypersilBDSC18反相柱(300A, 5pm,4.6 mmx300 mm)。将氧化后的多肽样平经终止反应，离心后，加载到已用Buffer A(0.1 %TFA) 平衡好的反相柱上。用Buffer B (含0.1% TFA的乙腈)梯度洗脱。流速为1 ml/min， 215 nm及254nm双通道检测，收集洗脱峰。得到MCPPLCAPSCTNC*。
19. 冻干保存。
实施例2: ltl4a-7经脑室注射后镇痛活性较优于ltl4a和MVIIA。
用醋酸扭体法测定ltl4a-7的镇痛活性。KM小鼠重在18g左右，雌雄各半，随机分组， 每组8只。脑室注射浓度为5Hg/^，每只注射10W。按1.5h， 3h， 6h时间间隔腹腔注射浓度 为0.7%的醋酸，20pl每只。记录15min内小鼠的扭体次数。每组取平均值。并和生理盐水对 照组比较扭体次数差异的显著性。结果如图2， 3所示。实验表明，ltl4a及其突变体ltl4a-7 的镇痛活性在3h时均优于MVIIA，而ltl4a的突变体在1. 5h时的药性弱于MVIIA， 1. 5h ltl4a-7的药性却强于MVIIA。因此本专利所述的ltl4a的突变体可以作为另一种的高活性 镇痛药物。
序列表
<110>中山大学
〈l加〉一种信号芋螺毒素突变体多肽化合物ltl4a_7及其制备方法和应用
<160> 1
〈210〉 1 〈211〉 13 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<221〉 protein <400>
Met Cys Pro Pro Leu Cys Ala Pro Ser Cys Thr Asn Cys 1 5 10
权利要求
1.芋螺毒素突变体多肽，其氨基酸序列为MCPPLCAPSCTNC。
2、 权利要求1所述的芋螺毒素突变体多肽化合物，其特征在于，氨基酸序列方 向N端到C端为MCPPLCAPSCTNC"表示酰胺化。
3、 编码权利要求l所述芋螺毒素突变体多肽的基因。
4、 权利要求l、 2、或3所述多肽或多肽化合物用于离子通道类型的检测、或者 神经生物学工具药物或者治疗神经系统疾病引起的疼痛药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种中国南海信号芋螺毒素lt14a的突变体多肽化合物lt14a-7和该多肽的制备技术和应用。该肽由成熟的芋螺毒素lt14a经第七位赖氨酸替换成丙氨酸而获得，由此命名为lt14a-7(用A替换第七位K)氨基酸序列方向从N端到C端为MCPPLCAPSCTNC。通过化学合成的方法制备lt14a-7，该多肽具有拮抗神经元型乙酰胆碱受体的活性，在镇痛药物开发中具有重要价值，在治疗某些疾病引起的慢性疼痛和受体研究中也具有很好的效果。
文档编号A61P25/00GK101372507SQ20081002906
公开日2009年2月25日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者任政华, 赟 吴, 亮 周, 周茂军, 孙丹丹, 官景慈, 尤驭文, 徐安龙, 曾夏芸, 潘武广, 磊 王 申请人:中山大学