专利名称：抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抗体活性的卵黄抗体产品——抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体的制备和提纯方法及应用。
背景技术：
副溶血弧菌是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性细菌，是夏季食物中毒最常见的病原菌之一，近几年副溶血性弧菌导致的食源性疾病一直是我国微生物食源性疾病的首要病因，严重威胁人们的身体健康。同时弧菌病也是海水养殖业中的常见疾病之一，副溶血弧菌可以感染多种鱼类和虾类并造成大量死亡，造成巨大经济损失。近年来，海水鱼虾类的集约化养殖，特别是网箱养殖成为主要海水养殖品种的 养殖模式，弧菌病的危害日益严重，所以鱼虾养殖业中对弧菌病的防治尤为重要。
副溶血弧菌于1950年在日本发生的一次爆发性食物中毒事件中，由藤野恒三郎首次发现并分离得到。它的致病性源于侵袭性溶血素和脲酶。副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素(TDH)和相对耐热直接溶血毒素(TRH)是主要致病因子，溶血素已被证明是一种细胞毒， 而TDH和TRH的编码基因已被克隆测序。大多数病人腹泻样本中分离 的副溶血弧菌在血平板上产生溶血空斑，这一特殊的溶血现象被命名为神奈川现象(Kanagawa phenomenon, KP)。通常TDH由KP+副溶血弧菌产生，但少数病人分离出的KP—副溶血弧菌中有明显的TDH 致病作用，进一步的研究发现，部分KP—副溶血弧菌含TDH基因，但 在体外条件下未充分表达，而有一部分KP+副溶血弧菌可自发丧失TDH 基因变为KP副溶血弧菌。还有一类KP—副溶血弧菌，它不含TDH基因， 能产生TRH。 TDH基因与TRH基因都不是单一基因，其中TDH基因族 的同源性达到80%以上，而TRH基因与TDH基因的同源性为68%，因 此一对引物无法检测所有的TDH和TRH基因。有学者在研究病例时发 现，部分致病性副溶血弧菌脲酶均为阳性而KP—，并认为脲酶是主要 致病病因，但相关研究结果表明脲酶阳性菌株多数同时携带TDH和 TRH，因此不能排除TDH和TRH在脲酶阳性副溶血弧菌致病中的协同 作用。研究表明，非临床样本中的副溶血弧菌仅有1% 2%的KP-副溶 血弧菌，但由于副溶血弧菌的产毒条件会受到诸如消化道环境或食品 基质的影响，因此现行的卫生标准并不是仅以KP作为判断依据，而 是要求不得检出副溶血弧菌。
鸡卵黄抗体(lgY)是从鸡血清中转移而来，具有典型的免疫球 蛋白结构。母鸡经免疫10 d左右，即在卵黄中产生抗体，加强免疫 更可产生较长时间的免疫应答，可从其不断产出的鸡卵黄中得到大 量、均一和高效的IgY，因此IgY生产成本低，适合大规模生产。而 且研究表明，IgY具有较高的稳定性，对热、酸、碱、酶具有良好的 耐受性。近年来，利用IgY的被动免疫保护作用用于疾病的预防和治 疗受到了国内外的广泛关注，并取得了良好的效果。IgY在免疫学检 测中也已得到广泛应用，如通过酶联免疫吸附、免疫扩散、组织化学和细胞化学等试验用于检测免疫循环复合物、类风湿因子、病毒、细 菌及其毒素等。
因此，采用副溶血弧菌为抗原，免疫健康产蛋母鸡，制备特异性
的IgY抗体，在副溶血弧菌的免疫学检测、抗原的纯化，以及副溶血
弧菌感染的预防和治疗上具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗副溶血弧菌的 特异性鸡卵黄抗体(IgY)。
本发明的另一个目的是提供所述抗副溶血弧菌鸡卵黄抗体的制 备和纯化方法。
本发明还有一个目的是提供所述抗副溶血弧菌特异性IgY在用 于制备因副溶血弧菌感染引起的相关疾病的预防或治疗的药物制剂、 保健品或词料添加剂的应用，以及在制备用于相关的免疫学检测试剂 中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现
提供一种抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体，采用副溶血弧菌为抗原免 疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄
抗体粗提物；纯化后得到所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体纯品。用还 原型SDS-PAGE检测时，图谱呈现两条区带，分别是IgY的重链和轻 链。
本发明同时提供所述抗副溶血弧菌鸡卵黄抗体的制备和提纯方 法，包括以下步骤
(1) 制备副溶血弧菌抗原并灭活；
(2) 取副溶血弧菌抗原免疫母鸡，收集免疫鸡蛋；
(3) 从免疫鸡蛋分离得到的蛋黄液中提取抗副溶血弧菌的鸡卵黄 抗体粗提物；
(4) 将(3)制备得到的粗提物进行纯化制得纯品，并进行纯度鉴 定和活性检测。
步骤(1)所述制备副溶血弧菌抗原的方法是把副溶血弧菌株 接种到2%NaCl蛋白胨液体培养基中，3(TC条件下150r/min摇床中 培养18 h 24h，取培养液离心得到菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体 得到菌悬液；步骤(1)所述灭活的方法是在菌悬液中加入体积终浓 度为0.02% 0.4%的甲醛，20。C 4(TC下静置12 h 48h，然后离心 除去甲醛，用生理盐水洗涤3 5次，调整菌悬液浓度。制备的副溶 血弧菌抗原4。C下保存备用。
步骤(2)所述取副溶血弧菌抗原免疫母鸡的方法是选取适龄健 康蛋鸡隔离词养，取上述备用副溶血弧菌抗原液加入等量的弗氏完全 佐剂并充分乳化，然后采用皮下或皮内多点注射进行免疫。间隔2 4周后进行第一次加强免疫，再间隔2 4周进行第二次加强免疫， 加强免疫时改用弗氏不完全佐剂。
用间接HJSA跟踪检测免疫鸡蛋中抗副溶血弧菌特异性IgY的 效价，收集高效价鸡蛋，4"C下保存。
步骤(3)所述提取粗提物的方法是
将免疫鸡蛋外壳用75%的酒精消毒后取出蛋黄，用蒸馏水反复
冲洗蛋黄表面，尽量去除蛋黄膜表面的蛋白，刺破卵黄膜并收集蛋黄
液;采用水稀释法提取，用蒸馏水按体积比1: 7 9稀释，调节pH5. 0 5.4, 4。C放置过夜后，10000r/min离心30min，收集上清液得到IgY 粗提液；
可再采用膜过滤法提取，以截留分子量为100KD的膜进行超滤， 得到粗提物。
步骤(4)所述纯化的方法是
方法一用超滤膜将IgY粗提液浓縮至20 50mg/mL后，在IgY 粗提液中滴加饱和硫酸铵溶液使其终浓度达到50%， 4℃静置lh后 以3000r/min离心，得到的沉淀物用适量蒸馏水(水量按照普通实验 常规，没有特殊要求)溶解，再滴加饱和硫酸铵溶液使其终浓度达到 33%， 3()00r/min离心得到沉淀物，用PB缓冲液(0. 01mol/L， pH7. 4) 溶解，并用透析袋透析除盐。
将除盐后的IgY溶液过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱， 用含有0. 12mol/L、 0.15mol/L和0.6mol/L NaCl的PB缓冲液 (0.01mol/L， pH7.4)分段洗脱，收集效价峰，用透析袋浓縮后进行 Sephadex凝胶层析，收集效价峰。
方法二将IgY粗提液超滤浓縮至20 50mg/mL，将95%乙醇 置于-2℃预冷2h后，按粗提液与乙醇体积比l: l的比例把乙醇缓 慢加入到粗提液中，放置4T:下缓慢搅拌lh，离心后弃上清，将沉淀 物溶于25ranol/L NaCl溶液中，在4'C下用滤纸过滤除去其中的脂蛋 白沉淀，调整蛋白含量。
按粗提液与乙醇体积比为10: 2 6的比例缓慢加入冷乙醇，离 心后弃上清，沉淀溶于PB缓冲液(0.01mol/L， pH7.4)中；
将IgY溶液过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，收集效价 峰后用透析袋浓縮，进行S印hadex凝胶层析，收集效价峰。
采用方法一或方法二纯化后的IgY通过SDS-PAGE电泳检测纯 化效果，然后冷冻干燥，4℃保存。
本发明同时提供了所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体(IgY)的应用。
其中一种应用是以其粗提物或纯品按一定的比例与辅料配比， 制成不同的制剂，包括液态制剂、干粉制剂、颗粒制剂、片剂或胶囊 剂等，可应用于制备预防和治疗副溶血弧菌食物中毒和感染的药物、 保健品，以及水产养殖中防治副溶血弧菌病的药物或饲料添加剂。所 述辅料及比例参照本领域常规技术。
本发明具体提供了一种制备预防和治疗海水养殖对虾的副溶血 弧菌引起的红腿病药物或制剂，包括以下按照所述的重量百分比组成 的各组分
IgY粗提冻干粉 30 35%;
鱼粉 10 15%;
鱼油 5%;
明胶 35%;
环化糊精 10%;
防腐剂 1%。
另一种应用是在制备免疫检测试剂中的应用，具体包括ELISA， 免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析 和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术，用以检测相应的副溶血弧菌抗 原。
本发明提供的抗副溶血弧菌IgY还有一种应用是可作为亲和配 基，用于相应的副溶血弧菌抗原的亲和纯化。
本发明的有益效果是
(1) 本发明所述抗副溶血弧菌IgY由副溶血弧菌免疫产蛋母鸡而得，具有特异性好、效价高的优点，用于防治副溶血弧菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果；
(2) 本发明所述抗副溶血弧菌IgY采用健康母鸡所产鸡蛋为载 体，安全无毒，成本低，产量高，易于产业化。
图1抗副溶血弧菌卵黄抗体10%还原型SDS-PAGE图谱
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1:副溶血弧菌菌体抗原的制备
把副溶血弧菌株接种到2%NaCl蛋白胨液体培养基中，30 ℃条件 下150r/min摇床中扩大培养18h，取培养液4500r/min离心15min 得到菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体3次得到副溶血弧菌菌悬液。
实施例2:副溶血弧菌菌体抗原的灭活在菌悬液中加入体积终浓度为0. 4%的甲醛，40 ℃条件下静置12h，
然后4500r/min离心15min，除去甲醛，用生理盐水洗涤菌体3 5 次。调整菌悬液浓度，4℃下保存备用。
实施例3:母鸡的免疫
选取23周龄健康罗曼褐蛋鸡隔离饲养。取备用灭活菌悬液加入 等体积的弗氏完全佐剂，使抗原浓度为5X107Cfu/mL并充分乳化， 然后进行注射免疫，免疫剂量为lmL/只。间隔3周后进行第一次加 强免疫，再间隔3周进行第二次加强免疫，加强免疫时改用弗氏不完 全佐剂。收集免疫鸡蛋，4℃下保存。
实施例4:从蛋黄中粗提IgY
将免疫鸡蛋外壳用75%的酒精消毒后取出蛋黄，用蒸馏水反复 冲洗蛋黄表面，尽量去除蛋黄膜表面的蛋白，刺破卵黄膜并收集蛋黄 液，可采用水稀释法提取，用蒸馏水按体积比l: 7 9稀释蛋黄液， 调节pH5.0 5.4， 4℃放置过夜后，10000r/min离心30min，收集 上清液得到IgY粗提液;再采用膜过滤法提取，以截留分子量为100KD 的膜对蛋黄液进行超滤，得到粗提物。
实施例5:将粗提IgY抗体纯化
用超滤膜将IgY粗提液浓縮至30mg/mL，然后滴加饱和硫酸铵溶 液使其体积终浓度达到50%， 4℃静置过夜后3000r/min离心，得到
的沉淀物用蒸馏水溶解，再次滴加饱和硫酸铵溶液使其体积终浓度达 到33%， 4℃静置lh后3000r/min离心得到沉淀物，用PB缓冲液 (0.01mol/L， pH7.4)将沉淀物溶解，并用透析袋透析除盐。将除盐 后的IgY溶液过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，用含有0. 12mol/L、 0. 15mol/L和0. 6mol/LNaCl的PB缓冲液(0. 01mol/L， PH7.4)分段洗脱，收集效价峰。用透析袋将得到的IgY溶液浓縮， 进行Sephadex凝胶层析，收集效价峰，冷冻干燥后4℃ 保存。
或者将IgY粗提液超滤浓縮至20 50mg/mL，将95%乙醇置于 -20。C预冷2h后，按粗提液与乙醇体积比l: 1的比例把乙醇缓慢加 入到粗提液中，放置4℃ 下缓慢搅拌lh，离心后弃上清，将沉淀物溶 于25mmol/L NaCl溶液中，在4℃ 下用滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉 淀，调整蛋白含量，按粗提液与乙醇体积比为10: 5的比例缓慢加入 冷乙醇，离心后弃上清，沉淀溶于PB缓冲液(0.01mol/L， pH7.4); 将IgY溶液过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，收集效价峰后 用透析袋浓縮，进行S印hadex凝胶层析，收集效价峰，冷冻干燥后 4℃ 保存。
实施例6:抗体纯度鉴定
取实施例4、 5中的产品进行IgY纯度鉴定，用非还原型 SDS-PAGE检测，图谱呈现单一条带，即为提纯的抗副溶血弧菌IgY。 用10%还原型SDS-PAGE检测，结果见附图l，其中M为Marker, 1 为水稀释法粗提IgY， 2为用硫酸铵提纯的IgY， 3为IgY纯品。
实施例7:抗体效价测定
取实例4、 5中的产品进行IgY效价测定，用间接ELISA方法检测，包被副溶血弧菌抗原浓度为108cfu/mL， 二抗为辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgY抗体，工作浓度为1: 10000，其它试验条件按常规设 定，以未免疫的鸡蛋的卵黄液为阴性对照。IgY效价为l: 3200 1:
51200或更高。
实施例8:体外抑菌试验
取4支装有8mL液体培养基的试管，各加入1mL指示菌悬液，使 细菌浓度为106cfu/mL。向其中3支试管各加入lmL不同浓度的IgY， 使抗体的终浓度分别为lmg/mL、 5mg/mL和10mg/mL，剩下的一支作 对照，加入lmL无菌的PBS (0.01mol/L， pH7.4)。将4支试管置于 37i:的恒温培养箱中培养，分别在第lh、 3h和5h取培养液，用稀释 平板法计算活菌数。结果证明，制备的抗副溶血弧菌IgY的浓度达到 5mg/mL时，对副溶血弧菌的生长繁殖有明显的抑制作用。
实施例9:抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体在制备治疗海水养殖对虾的副 溶血弧菌引起的红腿病的药物或制剂中的应用
南美白对虾患红腿病，经检测确定为感染副溶血弧菌。按下列配 方将抗副溶血弧菌IgY抗体粗提冻干粉制成微胶囊饵料IgY冻干粉 30 35%，鱼粉10 15%，鱼油5%，明胶35%，环化糊精10%,防腐剂 1%，所述鱼粉、鱼油等采用本领域常用产品即可。用抗副溶血弧菌IgY 微胶囊饵料词喂患病对虾，4天后症状明显减轻，l周后完全康复。
实施例10:制备检测副溶血弧菌的双抗夹心ELISA试剂盒
IgY具有比IgG更高的特异性和敏感性，是优良的免疫学检测工 具。下面是一种利用IgY作为捕获抗体，用双抗夹心ELISA检测副 溶血弧菌的方法
将纯化的抗副溶血弧菌特异性IgY溶于包被液(0.05mol/L， pH9.6碳酸盐缓冲溶液)，使浓度达到20ug/mL，然后以每孔100uL包被高结合力酶标条，37'C孵育2h;洗涤3次后每孔加入100 u L待 测样品，37℃孵育2h;洗涤3次，每孔加入100 u L 5 u g/mL抗副溶 血弧菌特异性兔IgG， 37。C孵育lh;洗涤3次，每孔加入100uL辣 根过氧化物酶标羊抗兔IgG (1: 10000), 37。C孵育lh;洗涤5次， 然后每孔加入100 u L TMB显色液显色10min，立即加入50 u L 2mol/L H2S0J冬止反应。用酶标仪测定酶标孔450nm吸光值，以待测样品和阴 性对照的OD45o值之比大于2. 1判断为阳性。
同理，也可建立以抗副溶血弧菌特异性IgY为检测抗体，抗副溶 血弧菌特异性兔IgG为捕获抗体的双抗夹心ELISA。
在其他一系列免疫诊断技术中用以检测相应的副溶血弧菌抗原 的应用，例如免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨 荧光免疫分析和免疫细胞学等，不一一在实施例中赘述。
权利要求
1、一种抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体，其特征在于采用副溶血弧菌为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体粗提物；纯化后得到所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体纯品。
2、 一种权利要求1所述的抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体制备方法， 其特征在于包括以下步骤(1) 制备副溶血弧菌抗原并灭活；(2) 取副溶血弧菌抗原免疫母鸡，收集免疫鸡蛋；(3) 从免疫鸡蛋分离得到的蛋黄液中提取抗副溶血弧菌的鸡卵 黄抗体粗提物；(4) 将(3)制备得到的粗提物进行纯化制得纯品，并进行纯度 鉴定和活性检测。
3、 根据权利要求2所述的抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体制备方法， 其特征在于步骤(1)所述灭活是采用甲醛法进行灭活，在制备得到 的副溶血弧菌抗原菌菌悬液中加入甲醛，使甲醛体积终浓度达到 0.02% 0.4%， 20。C 40。C下静置12 h 48h后离心除去甲醛，用生理盐水洗涤菌体并调整浓度；步骤(2)所述免疫包括基础免疫和加强免疫；所述基础免疫是 在副溶血弧菌抗原中加入等量弗氏完全佐剂，充分乳化后进行注射免 疫；所述加强免疫为2 3次，是在副溶血弧菌抗原中加入等量弗氏 不完全佐剂，充分乳化后进行注射免疫。
4、 根据权利要求2所述的抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体制备方法， 其特征在于步骤(3)中所述提取方法是采用水稀释法提取得到粗提 液和膜过滤法提取得到粗提物；所述水稀释法是将分离得到的蛋黄液 用蒸馏水适当稀释，调节pH5.0 5.4， 4t:静置12h后离心，收集上 清液得到IgY粗提液；所述膜过滤法是以截留分子量为100KD的膜进 行超滤，得到IgY粗提物。
5、 根据权利要求2所述的抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体制备方法， 其特征在于步骤(4)中所述纯化方法是将IgY粗提液超滤浓縮至20 50mg/mL，滴加等体积饱和硫酸铵 溶液使其饱和度达到50%， 4'C静置过夜后离心得到沉淀物，用蒸馏 水溶解后滴加饱和硫酸铵溶液使其饱和度达到33%, 4。C静置lh后 离心得到沉淀物，用PB缓冲液溶解，并用透析袋透析除盐；将除盐 后的IgY溶液过DEAE-S印harose Fast Flow离子交换柱，收集效价 峰后用透析袋浓縮，进行S印hadex凝胶层析，收集效价峰即得纯品；或者将IgY粗提液超滤浓縮至20 50mg/mL，将95%乙醇置于 -2(TC预冷2h后，按粗提液与乙醇体积比l: l的比例把乙醇缓慢加 入到粗提液中，沉淀完全后离心，弃上清，将沉淀物溶于25nimol/L NaCl溶液中，调整蛋白浓度，按粗提液与乙醇体积比为10: 2 6的 比例缓慢加入冷乙醇，离心后弃上清，沉淀溶于PB缓冲液，透析； 将IgY溶液过DEAE-S印harose Fast Flow离子交换柱，收集效价峰 后用透析袋浓縮，进行S印hadex凝胶层析，收集效价峰即得纯品。
6、 根据权利要求2所述的抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤(4)中所述纯度鉴定和活性检测包括采用酶联免 疫吸附试验检测抗体效价；采用SDS-PAGE电泳鉴定纯度。
7、 一种权利要求l所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体的应用，其 特征在于应用于制备预防和治疗因副溶血弧菌感染引起的相关疾病 的药物、保健品或饲料添加剂；或者应用于检测副溶血弧菌的免疫学 检测中；或者应用于副溶血弧菌抗原的亲和纯化。
8、 根据权利要求7所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体的应用，其 特征在于所述药物、保健品或饲料添加剂的剂型为液态制剂、干粉制 剂、颗粒制剂、片剂或胶囊剂；所述免疫学检测包括酶联免疫吸附测 定、时间分辨荧光免疫分析、免疫细胞学或抗体芯片方法。
9、 根据权利要求7所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体的应用，其 特征在于所述药物包括以下按照所述的重量百分比组成的各组分IgY粗提冻干粉 30 35%; 鱼粉 10 15%;鱼油 5%; 明胶 35%; 环化糊精 10%;防腐剂 1%。
10、 根据权利要求7所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体的应用，其特征在于作为亲和配基用于相应的副溶血弧菌抗原的亲和纯化。
全文摘要
本发明公开了一种抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体，同时公开了其制备方法，通过制备副溶血弧菌抗原并灭活、免疫母鸡，收集免疫鸡蛋、从免疫鸡蛋蛋黄液中粗提抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体、纯化等步骤制备得到。本发明同时提供了所述抗副溶血弧菌的鸡卵黄抗体在制备副溶血弧菌相关的食品安全检测试剂、疾病免疫诊断试剂和防治副溶血弧菌相关的疾病的药物、保健品或饲料添加剂中的应用。本发明制备的抗副溶血弧菌鸡卵黄抗体(IgY)特异性高，纯度高，用于制备免疫学检测试剂，以及制备治疗副溶血弧菌相关疾病的药物和添加剂均有很好的效果；而且成本低，产量高，易于产业化。
文档编号A61K9/20GK101343320SQ20081002915
公开日2009年1月14日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者何彬斌, 廖振林, 祥 方, 斌 王, 俊 蒲, 钟青萍 申请人:华南农业大学