专利名称：：卷柏降血脂有效部位及其提取方法和应用以及穗花衫双黄酮的提取方法
技术领域：
：本发明涉及了一种从巻柏脂溶性部位提取降血脂有效部位——乙酸乙酯部位，同时，还涉及该有效部位的提取方法和应用；另外，还涉及一种该乙酸乙酯有效部位经进一步提取制得穗花衫双黄酮的提取方法。
背景技术：
：高脂血症(Hyperlipaemia，HLP)主要是指血清总胆固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平过高和/或血清高密度脂蛋白——胆固醇(HDL-C)水平过低。高脂血症是中老年的常见病和多发病，随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，该病的发病率明显增加，发病的年龄也有所提前。高脂血症所引起的动脉粥样硬化是造成冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因，严重危害到了人类的生命健康。目前，西药调节血脂虽有肯定的疗效，但有不同程度的副作用，且作用靶点单一。西药他汀类是目前公认为调脂最有效并广泛应用的药物，但具有肝脏和肌肉毒性等副作用。近年来，中药调血脂以其疗效好、副作用小的优势而成为研究的热点。巻柏为蕨类植物门巻柏科(Selaginellaceae)巻柏属(&/ag/"e〃")植物，约有700种，广泛分布于全世界。我国约有50种，盛产于全国各地。2005年版《中华人民共和国药典》收载了两个品种巻柏5Wflgz力e〃atoman'sc/wa(Beauv.)Spring;垫装巻柏S.;w/v/wata(Hook.etGrev.)Maxim.。巻柏是我国传统中药材，早在《本经》中就有记载，列为上品，功能为活血通经，破血散结。巻柏全草入药，巻柏作为民间传统中药材，药用历史悠久。由于传统药物的服用方法多为水煎煮法，现代药理研究也多用水煎煮液整体研究，发现水煎液在抗肿瘤、免疫、止血等方面均有很好的药理活性。但对其脂溶性部位研究较少，特别是在降血脂方面的研究尚未见报道。穗花杉双黄酮(Amentoflavone)又名阿曼托双黄酮，是一种从天然植物中分离纯化得到的双黄酮类化合物，分子式为C3oH1801()，分子量538，植物来源广泛，药理活性明显。在很多种中草药如银杏叶、贯叶连翘中均存在，而巻柏(包括巻柏、垫装巻柏、中华巻柏和江南巻柏等)中穗花杉双黄酮的含量又远远高于其他中草药。文献报道穗花杉双黄酮具有抗病毒、抗炎、抗癫痫、神经细胞保护、促(^2+释放活性等活性。目前，穗花杉双黄酮的提取方法工艺过程较为繁锁，成本也相对较高。
发明内容本发明的目的在于提供一种从巻柏脂溶性部位提取得到巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。同时，本发明的目的还在于提供一种该巻柏降血脂有效部位的提取方法。另外，本发明的目的还在于提供一种该巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的应用。本发明的目的还在于提供了一种可以利用该巻柏降血脂有效部位经进一步提取制备穗花衫双黄酮的方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种巻柏降血脂有效部位，该有效部位为巻柏经丙酮水提取后经浓縮并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。本发明的技术方案还在于采用了一种巻柏降血脂有效部位的提取方法，包括以下步骤将巻柏全草用丙酮与水的混合液在室温下浸提2—4次，每次6—9天，后经过滤，合并滤液减压，压强为0.1—0.15Mpa，回收溶剂得浓縮的提取物，将浓縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。所述的丙酮与水的体积比为丙酮水=(6—8):(2—4)。进一步讲，本发明的技术方案还采用了一种穗花衫双黄酮的提取方法，其由巻柏降血脂有效部位经进一歩提取而制得，具体包括以下步骤将巻柏全草用丙酮与水的混合液在室温下浸提2—4次，每次6—9天，后经过滤，合并滤液减压，压强为0.1—0.15Mpa，回收溶剂得浓縮的提取物，将浓縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位；将制得的乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱层析，用石油醚一丙酮按体积比为10:1—7:3梯度洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到穗花衫双黄酮。所述的硅胶为200—300目。另外，本发明的技术方案还采用了巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的应用。本发明的巻柏降血脂有效部位是从巻柏脂溶性部位提取得到，巻柏在自然界中分布很广泛，这就使得本发明的原料易得，成本很低。另外，本发明的提取方法工艺过程简单，易操作。实验表明利用本发明的巻柏降血脂有效部位经过进一步提取得到的穗花衫双黄酮具有很好的降血脂作用。体内实验表明能降低高脂血症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，来降低血脂水平。本发明穗花衫双黄酮具有较高的提取率，一次提取率可高达30%—40%。采用本发明的巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位进一步制备而得的单体化合物经鉴定为穗花衫双黄酮，其结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>穗花衫双黄翻Amentoflavone图1为穗花衫双黄酮标准品质量与峰面积的标准曲线图；图2为样品含量测定色谱图。具体实施方式实施例1本实施例为巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位的制备方法，具体步骤如下取干燥巻柏全草，用丙酮与水按体积比为7:3冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液减压(压强为0.1Mpa)回收溶剂得浓縮提取物，将得到的浓縮提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。实施例2本实施例为穗花衫双黄酮的提取方法，具体步骤如下取实施例l制得的乙酸乙酯部位，进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-丙酮按体积比为10:1、8:2和7:3进行梯度洗脱(每个梯度洗脱5个柱体积，速度为5ml/秒)，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到穗花衫双黄酮纯品。结构鉴定化合物穗花衫双黄酮，EIMSm/z:538(]VT),270,121;'H-NMR(DMSO-^)5:13.10(1H，s,5-OH)，13.00(1H,s,5"-OH)，6.83(1H，s,H-3),6.21(1H,d，/=2.0Hz，H-6)，6.48(1H,d,声2.0Hz,H画8),8.03(1H，s，H-2'),7.17(1H,d，《/=9.3Hz,H画5')，8.01(1H，d，^9.3Hz，H-6'),6.80(1H，s,H-3"),6.42(1H,s,H-6"),7.59(2H，d,>/=8.8Hz,H-2"'，6"'),6.74(2H,d,/=8.8Hz,H-3"'，5'").13C-NMR(DMSOOS:163.8(C-2),102.9(C-3),181.7(C画4),161.5(C画5),98.9(C-6),164.1(C國7),94.0(C画8),157.4(C-9)，103.7(C-IO)，121.0(C-1132.3(C画1'),127.8(C隱2'),120.0(C-4'),116.2(C-5'),131.4(C-6'),163.7(C-2"),102.6(C國3"),182.1(C-4"),160.5(C-5"),98.6(C-6"),161.9(C-7"),104.0(C画8"),154.5(C隱9")，103.7(C画10"),121.4(C-l'"),128.2(C-2"'),115.8(C-3"')，161.0(C-4'"),115.8(C画5'"),128.2(C画6"')。实施例3本实施例为巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位及穗花衫双黄酮在降血脂方面的应用例。体内降血脂抗氧化试验动物昆明小鼠，空腹体重为23士2g，全部雄性。由河南省医学动物实验中心提供。材料与试剂巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位、穗花衫双黄酮由河南大学天然药物研究所制备提供。决明子降脂片，吉林吉春制药有限公司批号070501。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒，北京中生生物工程高技术公司提供。试验方法高脂乳剂的配制猪油40g、胆固醇20g、丙硫氧嘧啶lg、2g胆盐(配成10%溶液)、丙二醇2ml和吐温801ml，加水至100ml，超生30min。动物分组与处理取50只小鼠，平均体重23士2g，按实验要求分为正常对照组，高脂模型组，给药组(包括穗花衫双黄酮给药组和巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位给药组)，阳性对照组(决明子降脂片)。正常对照组动物上午ig(灌胃)给于蒸馏水，下午ig0.5%CMC-Na，高脂模型组均于每天上午ig给于高脂乳剂(0.2ml/10g*d)，下午ig0.5%CMC-Na，给药组分别于每天上午ig给于高脂乳剂(0.2ml/10g*d)，下午ig给药，给药量见表2。20天后，各组小鼠均禁食12h，眼底静脉丛取血，离心分离血清用于血脂及SOD、MDA的测定。表1动物分组与处理<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>指标测定方法TC，TG，LDL-C，HDL-C，MDA，SOD的测定按试剂盒说明方法进行。数据处理实验数据x土s表示，实验统计采用spsslO.O统计软件进行单因素方差分析。结果巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位和化合物穗花衫双黄酮对高脂血症小鼠血脂的影响，结果见表2。与高脂模型对照组相比巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位、化合物穗花衫黄酮血浆中TC、LDL-C均有所降低，数据差异有显著意义，HDL-C有显著提高，TG无显著影响；阳性对照组血浆中TC、LDL-C均有显著性降低。与阳性药组相比巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位给药组、化合物穗花衫黄酮组能更加显著的提高血浆中HDL-C的水平。表2巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位与穗花衫双黄酮对营养性高脂血症小鼠血脂的作用(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与模型组比较'p<0.001，P<0.01,P<0.05与空白组比较AMP<0.001，MP<0.01，;、P<0.05以上结果可知在穗花衫双黄酮的用量为乙酸乙酯部位二分之一时，二者对高脂血症小鼠血脂的作用基本相当，对乙酸乙酯部位中穗花衫双黄酮的含量测定，发现穗花衫双黄酮在乙酸乙酯部位的含量为31.64%，由此可知乙酸乙酯部位的主要有效成分是穗花衫双黄酮。以下是对乙酸乙酯部位中穗花衫双黄酮的含量测定。HPLC法测定仪器与试剂仪器岛津LC-2010高效液相色谱仪，UV-2010A检测器，自动进样器，四元低压梯度泵，CLASS-vp色谱工作站，AL-104型电子天平(梅特勒一托利多)，KQ3200型超声波清洗器。试剂甲醇(色谱纯，厂家)，高纯水，磷酸为分析纯，穗花山双黄酮标准品为天然产物研究所自制，纯度98%。色谱条件RP-18色谱柱(4.6mmx250mm,5pm)，Merck公司生产；流动相甲醇0.1%磷酸水溶液(65:35)，流速0.8ml/min;检测波长337nm;柱温25°C，定量方法为外标峰面积法。标准曲线的制定精密称取标准品1.2mg于10ml容量瓶中，摇匀备用。取一定量用过滤器(0.45pm)过滤得0.12mg/ml标准品溶液，分别进样1pl、3^1、5pl、7^1、10^1，将所得峰面积对双黄酮质量进行线性回归，得标准曲线Y=5E+06X-10436,r=1.000，线性范围为0.12吗~1.2吗。结果见表4，据表4做标准曲线，见图l。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>样品测定精密称取3mg乙酸乙酯有效部位至于10ml容量瓶中，加入甲醇8ml，超声使溶解，定容至10ml，过滤(0.45|im)的样品溶液。平行6份，含量测定色谱图见图2，其中A为标准品色谱图，B为样品色谱图。结果平均含量为31.64%，i^D=0.75%。本发明还分别测定了巻柏、垫装巻柏、江南巻柏、中华巻柏等巻柏属巻柏中穗花衫双黄酮的含量，结果如表5所示。表5不同种巻柏属植物中穗花衫双黄酮的含量植物_穗花衫双黄酮百分含:湖南产巻柏0.51%西藏产垫装巻柏0.36%江南巻柏0.31%中华巻柏0.42%最后所应说明的是以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。权利要求1、一种卷柏降血脂有效部位，其特征在于该有效部位为卷柏经丙酮水提取后经浓缩并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。2、一种如权利要求l所述的巻柏降血脂有效部位的提取方法，其特征在于包括以下步骤将巻柏全草用丙酮与水的混合液在室温下浸提2—4次，每次6—9天，后经过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮的提取物，将浓縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。3、根据权利要求2所述的巻柏降血脂有效部位的提取方法，其特征在于所述的丙酮与水的体积比为丙酮水=(6—8):(2—4)。4、穗花衫双黄酮的提取方法，其特征在于包括以下步骤将巻柏全草用丙酮与水的混合液在室温下浸提2—4次，每次6—9天，后经过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮的提取物，将浓縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位；将制得的乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱层析，用石油醚一丙酮按体积比为10:1—7:3梯度洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到穗花衫双黄酮。5、根据权利要求4所述的穗花衫双黄酮的提取方法，其特征在于所述的硅胶为200_300目。6、一种如权利要求1所述的巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的应用。全文摘要本发明公开了一种卷柏降血脂有效部位及其制备方法和应用，该有效部位为卷柏经丙酮水提取后经浓缩并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。本发明的卷柏降血脂有效部位是从卷柏脂溶性部位提取得到，卷柏在自然界中分布很广泛，这就使得本发明的原料易得，成本很低。另外，本发明的提取方法工艺过程简单，易操作。实验表明利用本发明的卷柏降血脂有效部位经过进一步提取得到的穗花衫双黄酮具有很好的降血脂作用。体内实验表明能降低高脂血症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，来降低血脂水平。本发明穗花衫双黄酮具有较高的提取率，一次提取率可高达30％-40％。文档编号A61K31/352GK101606955SQ20081005005公开日2009年12月23日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者姬志强,康文艺,贺光东,郭曙光申请人:河南大学