专利名称：：麦芽糖结合蛋白作为免疫增强剂的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及麦芽糖结合蛋白新的医用用途，尤其是公开了麦芽糖结合蛋白作为免疫增强剂的用途，属于免疫学
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背景技术：
：本发明涉及的麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein,简称MBP)是大肠杆菌ma正基因编码的周质蛋白，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一，分子量42kD。malE基因产物能与多种蛋白融合，因此是进行表达研究的有效媒介。在现代分子克隆中含有malE基因的pMAL是在大肠杆菌中克隆的表达载体，其编码麦芽糖结合蛋白(MBP),在malE和LacZa之间含有多克隆位点，克隆的基因插入malE下游，通过强启动子tac和ma正翻译的起始信号产生克隆基因的高效表达。ma正基因含有正常的信号先导序列，融合蛋白能穿过细胞膜，使其在周质腔中得以纯化，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的进一步亲和纯化。在malE和多酶切位点之间含有Xa因子酶切位点，在Xa因子酶切位点后插入目的基因片段，可以使MBP与外源蛋白得以分离。目前大家普遍认为MBP标签是没有活性的，或在标签蛋白中具有较低的生物学活性，所以它是目前较常用的克隆表达载体。
发明内容本发明公开一种麦芽糖结合蛋白作为免疫增强剂的用途，具有增强细胞免疫应答的能力，可作为免疫增强剂应用于临床免疫治疗领域。本发明的麦芽糖结合蛋白能刺激淋巴细胞转化，促进IL-2和IFN-y的产生，活化Thl细胞，增强细胞免疫应答作用，可作为免疫佐剂应用于治疗性疫苗，作为增强剂应用于恶行肿瘤、免疫缺陷等治疗。下述的实验证实了MBP具有免疫增强作用实验例l1.材料UPercoll及ConA购自Sigma.Amyloseresin、pMAL漏p2、Xa因子购自NEB公司，G-25购自Amersham.MTT1.2Balb/c小鼠购自吉林大学实验动物中心2.方法通过MTT法检测MBP诱导小鼠淋巴细胞增殖反应。处死小鼠，无菌取脾，制成脾细胞悬液，70°/。Percoll分离单个核细胞。设阴性对照组、ConA阳性对照组和MBP实验组，阴性对照组不加任何刺激物，阳性对照组由5吗/mlConA刺激，实验组分别由2.5吗/ml、5吗/ml、10吗/ml、20昭/ml、40i!g/ml的MBP刺激。96孔板培养，每孔脾细胞5x105，总体系20(^1，培养至44小时，收取上清备用，然后掺入MTT，4小时后酶标仪测定570nmA值。3i吉果如表1所示，MBP以剂量依赖关系刺激淋巴细胞增殖。_表1.MBP诱导淋巴细胞增殖反应_ConA(ng/ml)MBP((ig/ml)A5704500.47±0.12000.26±0.10150.28±0.0600.35±0.10100.36±0.110200.37±0.090400.39±0.084.结论MBP可诱导淋巴细胞增殖。实验例21.材料细胞因子IL-2、IFN-y及IL-4ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司2.方法通过ELISA检测小鼠脾脏单个核细胞培养上清中的细胞因子IL-2、IFN-y、IL-4的水平。分别用包被抗体(anti-IL-2、anti-IFN-y、anti-IL-4及anti-TNF-a单克隆抗体)包被96孔ELISA板，每孔100iiL，包板，4°C过夜。弃包被液，用PBS-0.05。/。Tween-20洗板。每孔加入200uL封闭液，室温lh,弃封闭液，洗板。加入待测上清及己知浓度的标准品，100"L/孔，室温下孵育2h。弃去液体，洗板。加入生物素标记的特异性检测抗体IOOiiL/孔，室温放置lh。弃去液体，洗板。加入酶标亲和素，100uL/孔，室温放置30min。弃去液体，洗板。加底物100pL/孔，室温下孵育15min。每孔加入2NH2S0450uL终止反应。通过酶标仪450腿测定A值。3.结果进一步通过ELISA检测MBP刺激脾细胞培养上清中IL-2、IFN-Y、IL-4细胞因子分泌情况，从而检测活化的淋巴细胞亚群。与对相比MBP促进脾细胞分泌IL-2、IFN-y，IL-4未见改变(表2)。由此可见MBP可活化Thl细胞。表2.MBP对脾脏淋巴细胞分泌细胞芮于的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.结论MBP非特异性诱导Thl细胞的活化实验例31.材料IFN-YELISPOT试剂盒购自达克为生物有限公司，BALB/C小鼠购自吉林大学实验动物中心。2.方法2.1MBP免疫BALB/C小鼠取BALB/C小鼠10只，分设阴性对照组和实验组，阴性对照组注射生理盐水，实验组注射MBP蛋白与等体积弗氏完全佐剂(第一次免疫)或弗氏不完全佐剂(后续免疫)充分乳化，每只鼠注射MBP蛋白50昭，颈背部及腹股沟多点注射，每只鼠共注射400^1。第一次免疫后两周，同等剂量加强免疫3次，每周一次。2.2ELISPOT检测IFN-y处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞。按照达科为小鼠IFN-yELISPOT预包被试剂盒使用说明书检测MBP刺激小鼠淋巴细胞分泌IFN-Y的淋巴细胞的频率。设阴性对照组，阳性组ConA5吗/ml，实验组MBP3.0昭/ml。每孔中加入按上述方法制备的淋巴细胞3xl05，各孔中加入相应刺激10|il，总体系llOpl，设三复孔，5%C02，37。C中培养24小时。BiosysBioreader4000自动读板仪分析结果。3.结果为检测MBP融合蛋白中的MBP是否具有生物学活性，首先将MBP融合蛋白免疫小鼠，然后用ELISPOT试剂盒检测MBP直接刺激脾淋巴细胞IFN-y的分泌情况。结果显示当事先未用MBP时，MBP刺激脾细胞分泌IFN-Y的细胞频数为13.50±3，进一步提示MBP可直接刺激Thl少量活化；当MBP融合蛋白免疫后，MBP刺激脾细胞分泌IFN-y的细胞频数为178.17±51.08，明显较为免疫治增高，提示MBP可特异性刺激Thl大量活化。表3.MBP诱导的小鼠淋巴细胞FN-y释放的ELISPOT结果非免疫组细胞频数MBP免疫组细胞频数阴性对照ConA(+)MBP(+)阴性对照ConA(+)MBP(+)0192.6±73,713.5±3.60201±42.1178.2±5.14.结论MBP不仅非特异性刺激Thl活化，而且能特异性刺激Thl活化。实验例41.材料MTT、淋巴细胞分层液Percoll购于Ameresco，MBP多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购于NewEnglandBiolads公司。BALB/C小鼠购自吉林大学实验动物中心。2.方法为确定MBP是否直接作用于T细胞，将MBP直接与脾脏淋巴细胞反应，然后通过免疫组化分析方法，采用抗MBP抗体检测T细胞表面合的MBP。实验设三组阴性对照组、实验组、吸附试验组。实验操作如下分离小鼠脾脏淋巴细胞，每组淋巴细胞用生理盐水调至lxl06/ml，反应总体系为200ul，阴性对照组不加MBP，实验组加MBP，吸附试验组用抗MBP抗体与MBP37"C预反应半小时后再加淋巴细胞，各组均4。C过夜。PBS洗三次，涂片，室温下10%甲醛固定10min，3%过氧化氢氧化内源性过氧化物酶30min，2。/。BSA封闭30min，弃去封闭液加入抗MBP特异性抗体，湿盒中4"C过夜。PBS洗三次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下湿盒中孵育30min。PBS洗三次，加入新鲜配置的DAB显色15min，PBS冲洗终止反应，苏木精复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，显微镜观察(x1000)。计数500个淋巴细胞，观察阳性细胞所占百分比。3.结果为了明确MBP刺激Thl活化，是否由于直接作用于T细胞而产生，将MBP与淋巴细胞在体外直接反应，然后采用抗MBP抗体通过免疫组化进行了检测。结果可见，阴性对照组(未加入MBP的淋巴细胞)未见阳性细胞，实验组(加入MBP的淋巴细胞)可见阳性细胞，且阳性细胞均为淋巴细胞，阳性淋巴细胞占总淋巴细胞的37.7%，通过阴性对照组和实验组的比较可见MBP直接作用于淋巴细胞；采用1:2000抗MBP抗体吸附结合MBP后，阳性细胞的比例为0，可见抗MBP抗体可以中和MBP，从而阻止MBP结合于淋巴细胞上，进一步证实MBP可直接作用于T淋巴细胞。4.结论MBP可与T细胞结合发挥作用。实验例51.材料Lewis肺癌细胞购于ATCC。C57小鼠20只购自吉林大学动物实验中心。2.方法通过肿瘤模型实验检测MBP辅助MUC1抗肿瘤作用。C57小鼠分成两组，MUC1组及MUC1-MBP组。每只鼠注射剂量100-500^1，其中含MUC1和MUC1-MBP，BCG作为佐剂。颈背部皮下多点及两侧腹股沟皮下注射，隔周一次，共免疫两次，在第二周免疫后4天背部皮下注射Lewis肺癌细胞，注射细胞数为5xl0V只。在清洁的环境下饲养，三周后测定肿瘤的大小。3.结果使用小鼠Lewis肺癌细胞做动物模型。在用疫苗免疫后的第4天给C57小鼠注射Lewis肺癌细胞，三周后，对照组在背部注射局部均长出大小不等的肿瘤，其中体积最大的是2250tnm3，有的肿瘤中心破溃；鼠状态消痩，毛色灰暗无光泽，28天后该鼠死亡。对照组肿瘤平均体积537mm3;而经融合蛋白MUC1-MBP免疫鼠，仅有6只在背部长出18-31mr^大小的肿瘤，疫苗免疫组肿瘤平均体积14mm3;单纯MUC1免疫鼠平均肿瘤体积345mm3。提示MUC1诱导的免疫具有抗肿瘤作用，而且MBP辅助MUC1疫苗产生了更加强烈的细胞免疫应答，具有更明显的杀伤肿瘤作用。表4.肿瘤模型证实MBP辅助肿瘤疫苗产生的细胞免疫应答作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.结论MBP辅助MUC1疫苗产生了强烈的细胞免疫应答，抗肿瘤效果明显。本发明的积极效果在于MBP不仅非特异性刺激Thl细胞活化，而且特异性诱导Th活化增强细胞免疫应答，为免疫治疗提供新的免疫增强剂，可作为免疫增强剂应用于临床免疫治疗领域。具体实施方式本发明MBP适用于下述医疗用途1、治疗性疫苗的佐剂2、预防性疫苗的佐剂3、用于免疫治疗包括治疗恶行肿瘤、免疫缺陷等免疫低下等疾病。实施例1将MBP与肿瘤抗原MUC1结合制备成MBP-MUC1融合蛋白疫苗应用将编码MUC1的20个氨基酸(APDTRPAPGSTAPPAHGVTS)的6个串连重复序列的cDNA(360bp)片段在BamHI和Hindlll双酶切位点处连入pMAL-p2载体，然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5oc。经氨节青霉素筛选转化菌落，通过酶切及基因测序分析插入片段。将重组质粒转化大肠杆菌DH5a,通过0.3mMIPTG诱导表达，通过筛选获得稳定的表达菌株pMAL-MUC1/DH5a。煮沸裂解少量细菌，经10%SDS-PAGE分析MUCl-MBP融合蛋白的表达，通过Westernblotting鉴定特异的表达条带。大量培养的工程菌，超声破碎后留取上清通过Amylose亲和层纯化人MUCl-MBP融合蛋白。实施例2MBP作为佐剂与肿瘤疫苗MUCl混合应用将pMAL原核表达载体转染大肠杆菌DH5a，采用IPTG小量诱导表达，通过SDS-PAGE鉴定后，大量培养细菌，诱导表达，超生破碎留取上清，通过Amyloseresin纯化、G-25除盐、Xa因子裂解获得MBP蛋白。然后MBP与MUCl按照l:l混合制备成400ul溶液，给小鼠皮下多点注射。实施例3MBP作为佐剂与预防性疫苗混合应用按照上述方法制备MBP，配制成6mg/ml，按照1:1比例与预防性疫苗混合应用。MBP单独用于抗肿瘤将pMAL原核表达载体转染大肠杆菌DH5a,采用IPTG小量诱导表达，通过SDS-PAGE鉴定后，大量培养细菌，诱导表达，超生破碎留取上清，通过Amyloseresin纯化、G-25除盐、Xa因子裂解获得MBP蛋白，制备成蛋白溶液6mg/ml，给小鼠皮下注射。权利要求1、麦芽糖结合蛋白作为制备免疫增强剂中的用途。2、麦芽糖结合蛋白作为制备治疗性疫苗的佐剂中用途。3、麦芽糖结合蛋白作为制备预防性疫苗的佐剂中的用途。4、麦芽糖结合蛋白作为制备抗肿瘤药物中的用途。全文摘要本发明公开一种麦芽糖结合蛋白(简称MBP)作为免疫增强剂的用途，MBP不仅非特异性刺激Th1细胞活化，而且特异性诱导Th活化增强细胞免疫应答，为免疫治疗提供新的免疫增强剂，可作为免疫增强剂应用于临床免疫治疗领域。文档编号A61K38/16GK101327315SQ200810051018公开日2008年12月24日申请日期2008年7月23日优先权日2008年7月23日发明者台桂香,柳忠辉申请人:台桂香