专利名称：：黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种黑豆皮花青素的用途，特别是涉及一种黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用。技术背景随着人民生活水平的不断提高，各种各样的所谓"富贵病"也在不断威胁人类健康。糖尿病便是其中的一种具有代表性的终身疾病。最近的流行病调査证实，我国的糖尿病患病率高达10%,已成为继心脑血管疾病和癌症之后的第三号杀手。而糖尿病的危害主要来自糖尿病血管并发症，因此对糖尿病血管并发症的防治研究极为迫切。糖尿病个体体内蛋白质发生非酶糖基化致使非酶糖基化代谢产物增多，是导致糖尿病血管并发症的重要原因之一。非酶糖基化代谢产物增多，可以直接促进微血管基底膜增厚，诱导肿瘤生长因子-p(TGF-P)等多种细胞因子表达，刺激细胞外基质增生，还可以通过与非酶糖基化代谢产物受体(RAGE)结合产生一系列反应，最终导致糖尿病血管并发症的产生["2]。自身氧化在非酶糖基化代谢产物形成的一系列级连反应中具有重要作用，氧化应激增强可以导致非酶糖基化代谢产物生成增加。自由基清除基可以显著抑制非酶糖基化代谢产物的形成[3]，糖尿病时增强的氧化应激可以加速非酶糖基化代谢产物的形成，进而促进糖尿病血管并发症的发展。因此抑制非酶糖基化反应，抑制非酶糖基化代谢产物生成是防治糖尿病血管并发症的新策略。参考文献1.BrownnleeMvlassaraH,Aminoguanidinepreventsdiabetesinducedarterialwallproteincrosslinking.Science,1986，232:1629-1728.2.SajithlalGB,ChrtthaP，ChandrnkasanG.Theroleofmetal-cat-analyzedoxidationintheformationofadvancedglycationproducts:invitrostudyoncollagen.FreeRadicBiolMed.1998,25:265-269.3.VarvarovskaJ,RacekJ，StozickykyF,etal.ParanletersofoxidativestressinchildrenwithTypeIdiabetesmellitusandtheirrelatives.JDiabetesComplications,2003,17:7-10.
发明内容本发明的目的是提供黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用。本发明的技术方案概述如下黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用。通过实验获知我们观察到黑豆皮花青素能够降低大鼠的血糖浓度，同时更重要的是能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，揭示其控制糖尿病血管并发症的益处主要来自强大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代谢产物的形成，同时其还具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，对控制糖尿病血管并发症的进展也有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症。黑豆皮花青素所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并发症方面的优势明显。黑豆皮花青素高效无毒，安全性极高，因此在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1含有50%黑豆皮花青素的有效部位的最大耐受量试验1.试验材料动物ICR小鼠，18~22g，雌雄兼用；SD大鼠，体重180~200g，雄性，北京试验动物研究中心提供。2.试剂含有50%黑豆皮花青素的有效部位(黑豆皮花青素含量大于50%，自制)。3.最大耐受量试验将40只ICR小鼠分为两组，第l组，常水对照组；第2组，含有50%黑豆皮花青素的有效部位组。每组20只，雌雄各半，禁食12h后，1天内给小鼠灌胃给药的含有50%黑豆皮花青素的有效部位最大浓度0.4g/mL溶液，间隔4h给药1次。1天共给药3次，每次0.30ml/10g，连续观察7天。给药后正常颗粒料饲养，自由饮水，自然光照12h/12h，室温2024。C，湿度60%。观察动物反应。4.试验结果灌胃给药7天内小鼠无一死亡，给药第3、8天分别称重，体重变化两组没有差异，动物均增重。8天称重后逐只处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各器官均无异常。50%黑豆皮花青素有效部位的最大给药量为38g/kg，说明该提取物安全无毒。实施例2一种含有黑豆皮花青素的有效部位的降血糖及抑制非酶糖基化的活性测试1.试验材料动物雄性Wistar大鼠，北京动物中心提供。试剂50%黑豆皮花青素有效部位(自.制，花青素含量大于50%);链尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均为美国Sigma公司产品；羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为美国Sigma公司产品，北京京科公司分装；仪器DV650全自动生化仪，SHIMAZU1601紫外可见分光光度计，微量移液器，电子分析天平，旋涡混匀器。2.试验方法(1)糖尿病动物模型制备180-220g雄性Wistar大鼠90只，适应性喂养三天，随机选12只大鼠作为正常对照组。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg，注射后均给予正常饮食，12h后测大鼠空腹尾静脉血糖，血糖〉16.7mmoI/L为糖尿病造模成功。取造模成功者60只纳入试验，余弃去。(2)动物分组及喂养将糖尿病大鼠随机分为5组，空白对照组、AG治疗组、50%黑豆皮花青素有效部位低、中和高剂量组，每组12只。空白对照组用自来水灌胃，AG治疗组用150mg/kg.d的AG灌胃，50%黑豆皮花青素有效部位低、中和高剂量组分别用50、100、150mg/(kg.d)的50%黑豆皮花青素有效部位进行灌胃，10%黑豆皮花青素和20%黑豆皮花青素剂量组分别采用300mg/(kg.d)10%黑豆皮花青素有效部位和200mg/(kg.d)20%黑豆皮花青素有效部位进行灌胃，每日下午4时灌胃1次，各组均给予标准饲料常规喂养，自由进食及饮水，不使用胰岛素。在喂养过程中，各组大鼠均有正常死亡，试验开始时各组具有12只大鼠，试验结束时，各组均有IO只大鼠。G)标本取材喂养12周后，大鼠空腹6h，称体重，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，挖眼球取血5ml备用。另剖腹取出大鼠双肾，双肾去除包膜称重。取部分肾脏置入液氮中冷冻。(4)肾皮质中体内非酶糖基化终产物(AGEs)的检测用荧光法测AGEs。取肾皮质0.5g，剪成小块，加生理盐水lml磨成匀浆，2500r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加入氯仿-甲醇(2:1)5ml去脂，4。C振摇过夜。4000r/min离心15min，弃上清，留沉淀，用2ml甲醇及0.5ml蒸馏水冲洗沉淀。3000r/min离心7min，重复冲洗3次。新鲜配置O.lmol/LHEPES缓冲液用总量为225ml的蒸馏水溶解NaCl9.36g，KC10.433g，Na2HP04.2H200.158g，葡萄糖1.17g，HEPES5.85g，用Imol/LNaOH调节pH值至7.05，再用蒸馏水定容至250ml。将沉淀颗粒悬浮在含有2ml的HEPES缓冲液的试管中，每试管加入280uIV型胶原酶，并作空白胶原酶对照管，37。C恒温震荡24h后，3500r/min离心15min，上清液即为被胶原酶消化的肾皮质胶原。用荧光光度计在激发波长370nm、发射波长440nrn处测定荧光强度，其数值用空白胶原酶校正。然后用氯胺T法测定消化液中的羟脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羟脯氨酸(Hyp)所含荧光强度为一个单位(AU/mgHyp)表示。(5)血糖的检测取上述大鼠自凝血2ml，利用全自动生化仪测定血糖。3.试验结果(1)各组实验大鼠形态、肾重、体重及肾重/体重的比较所有成模糖尿病大鼠均出现多饮、多食、多尿的表现，由于消瘦及多食逐渐呈小头大腹的形态，与正常对照组相比，毛色暗淡无光泽，尾静脉采血后伤口不易愈合。糖尿病大鼠12周时体重较正常对照组显著降低，肾重/体重比值明显升高；AG治疗组和各给药剂量组的肾重/体重比值比对照组低(PO.Ol)，结果见表l。表l各组大鼠体重、肾重、1肾重/体重比较(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注.-方差分析与t检验，与正常对照组比较，*P<0.05,**P<0.01，与空白对照组比较，均为P<0.01。(2)血清血糖及肾皮质AGEs:试验结束时，各试验组血糖值仅B2高剂量组与空白对照组存在显著性差异。同时AG治疗组、黑豆皮花青素有效部位各剂量组与正常对照组、空白对照组相比，大鼠肾皮质AGEs均有非常显著性差异(**P<0.01)，AG治疗组AGEs低于给药剂量组，黑豆皮花青素有效部位各剂量组之间以及与AG治疗组相比较无显著性。(见表2)表2各组大鼠的血糖及肾皮质AGEs测定结果组别鼠数(只)血糖(mmol/L)AGEs(AU/mgHyp)正常对照组空白对照组AG治疗组50%黑豆皮花青素有效部位低剂量组50%黑豆皮花青素有效部位中剂量组50%黑豆皮花青素有效部位高剂20%黑豆皮花青素有效部位剂:组10%黑豆皮花青素有效部位剂」组10101010101010105.59±0.6833.92±5.8124.3±5.4825.78±3.1619.53±3.4711.47±2.74**17.25土3.48"26.92士3.57"4.91±1.6919.76土4.45承^11.87±3.98**17.39±3.77**厶14.53±2.84**10.21±2.71**#13.21±3.06**#18.03±2.71**#结果显示黑豆皮花青素各浓度组和各剂量组均具有一定程度的降血糖功效，其中50%黑豆皮花青素高剂量组作用明显，同时各浓度组和各剂量组均能抑制肾皮质AGEs的形成，从而抑制非酶糖基化，防治糖尿病血液综合症的发生。实施例3含有50%黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)提取500g黑豆皮中加入5000g的体积百分浓度为50%乙醇的盐酸水溶液，盐酸的体积百分比浓度为1%，常压5(TC温浸提取4次，提取时间分别为6、5、4、3小时，过滤，滤网的目数为120，得上清液，上清液在温度560'C，真空度为0.06~0.08MPa,减压浓縮回收乙醇，得糖度为40的浓縮物；(2)大孔树脂吸附分离将(1)中浓縮物用水分散恢复至原体积经HP20型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，洗脱液通过薄层分析及UV含量检测，收集富含花青素的组分，将其合并，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为40的浓縮物，减压干燥，得50%黑豆皮花青素的有效部位。利用UV进行花青素的含量测定试剂2%盐酸甲醇溶液；仪器紫外-可见分光光度计、100ml棕色容量瓶、10ml棕色容量瓶；实验歩骤精密称定供试样品10mg(M)，置100ml棕色容量瓶中，加入2%盐酸甲醇溶液70ml，超声溶解，冷却至室温，用2%盐酸甲醇溶液定容。精密吸取lml上述溶液，置10ml棕色容量瓶中，用2%盐酸甲醇溶液定容至10ml，以同批2%盐酸甲醇溶液做空白，置540nm处测定其吸收度(Asp)。精密称定飞燕草素标准品10mg(Mst)，置100ml棕色容量瓶中，加入2%盐酸甲醇溶液70ml，超声溶解，冷却至室温，用2%盐酸甲醇溶液定容。精密吸取lml上述溶液，置10ml棕色容量瓶中，用2%盐酸甲醇溶液定容至10ml，以同批2%盐酸甲醇溶液做空白，置540nm处测定其吸收度(Ast)。花青素含量=^x^xlOO%AstM如果没有标准品则以下式计算花青素含量％=，x,微x腦1020100xM式中Asp:样品溶液吸收度1020:飞燕草素吸收系数M:样品称重量(g)注测得的吸收度应落在0.10.9之间，如未落入此区间，可改变称重量或作进一步稀释。实施例4含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入原料质量4倍的体积百分浓度为5%的乙醇酸水溶液为提取溶齐IJ，该溶液的酸为盐酸，盐酸的体积百分比浓度为3%，在3(TC提取3次，每次6小时，过80目筛，得提取液，上清液在温度^6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮回收乙醇，得糖度为10的浓縮物；，(2)将(1)中浓縮物用水分散恢复至原体积，经AB-8型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含花青素的组分，将其合并，在温度^6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为10的浓縮物，减压干燥，得黑豆皮花青素的有效部位。实施例5含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入原料质量8倍的10%乙醇硫酸水溶液为提取溶剂，硫酸水溶液的体积百分浓度为2%，在40。C提取1次，4小时，过100目筛，得提取液，上清液在温度S6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮回收乙醇，得糖度为10的浓縮物；(2)将浓縮物用水分散恢复至原体积，经HPD100型大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含花青素的组分，将其合并，在温度560'C，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为40的浓縮物；减压干燥，得黑豆皮花青素的有效部位。实施例6含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入原料质量6倍的20%乙醇乙酸水溶液为提取溶剂，乙酸水溶液的体积百分比为5%，在2(TC提取4次，每次4小时，过120目筛，得提取液；(2)将提取液经HPD100A型大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为30的浓縮物，减压干燥得黑豆皮花青素的有效部位。实施例7含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入原料质量7倍的30%乙醇磷酸水溶液为提取溶剂，磷酸水溶液的体积百分比为2%，水溶液为提取溶剂，在3(TC提取3次，每次6小时，过100目筛，得提取液，上清液在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮回收乙醇，得糖度为40的浓縮物；(2)将浓縮物用水分散至原体积经HPD300型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含50%黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度^60'C，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为20的浓縮物，减压干燥得黑豆皮花青素的有效部位。实施例8含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入原料质量5倍的体积百分比浓度为40%的乙醇柠檬酸水溶液为提取溶剂，柠檬酸水溶液的体积百分比为4%，在2(TC提取4次，每次2小时，过80目筛，在温度560'C，真空度为0.060.08MPa减压浓縮至糖度20，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:1的比例分散至水中；(2)将所述步骤(1)获得的产物经X-5型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含50%黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度S60'C，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为40的浓縮物，干燥，得50%黑豆皮花青素的有效部位。实施例9含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入所述原料质量9倍的体积百分比浓度为40%的乙醇乙酸水溶液为提取溶剂，乙酸水溶液的体积百分比为3%，3(TC提取3次，每次4小时，过120目筛，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮至糖度40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:4的比例分散至水中；(2)将所述步骤(1)获得的产物经NKA-II型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含50%黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为40的浓縮物，干燥，得黑豆皮花青素的有效部位。实施例10含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入所述原料质量8倍的体积百分比浓度为10%的乙醇酸水溶液提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为盐酸，盐酸水溶液的体积百分比浓度为1%，在5(TC提取1次，每次8小时，过100目筛，在温度S6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮至糖度10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:10的比例分散至水中；(2)将所述步骤(1)获得的产物经D101型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含50%黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为40的浓縮物，干燥，得黑豆皮花青素的有效部位。实施例11含有黑豆皮花青素的有效部位，用下述方法制成(1)以黑豆皮为原料，加入所述原料质量5倍的体积百分比浓度为40%的乙醇酸水溶液为提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为柠檬酸，柠檬酸水溶液的体积百分比浓度为5%;在4(TC提取5次，每次6小时，过100目筛，在温度S60'C，真空度为0.060.08MPa减压浓縮至糖度IO，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:5的比例分散至水中；(2)将所述步骤(1)获得的产物经DA201型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含50%黑豆皮花青素的组分，将其合并，在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，得糖度为30的浓縮物，干燥，得黑豆皮花青素的有效部位。权利要求1.黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用。全文摘要本发明公开了黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用，通过实验获知黑豆皮花青素能够降低大鼠的血糖浓度，同时更重要的是能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，揭示其控制糖尿病血管并发症的益处主要来自强大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代谢产物的形成，同时其还具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，对控制糖尿病血管并发症的进展也有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症。黑豆皮花青素所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并发症方面的优势明显。黑豆皮花青素高效无毒，安全性极高，因此在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。文档编号A61P3/10GK101327210SQ20081005395公开日2008年12月24日申请日期2008年7月25日优先权日2008年7月25日发明者刘岱琳,张静泽,珊朱,谢文利,虹陈申请人:中国人民武装警察部队医学院