专利名称：miR-145在制备治疗炎症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种小分子RNA在制备药物中的应用，尤其涉及 miR-145在糖尿病等炎症代谢性疾病治疗中的作用。
背景技术：
随着饮食和生活方式的改变，肥胖、糖尿病、高血脂、高血压等代谢性疾病已成为 目前威胁人类健康的重要疾病。糖尿病及其慢性并发症是常见的代谢性疾病之一，而糖尿 病大血管并发症是糖尿病患者致死、致残的主要原因。以往大量研究发现糖尿病大血管病 变主要是动脉粥样硬化病变，而高糖高脂是导致动脉粥样硬化病变的主要因素。研究显示， 高血糖、高血脂可致内皮细胞损伤，单核细胞粘附、迁移、移行进入血管壁分化为巨噬细胞， 巨噬细胞一方面吞噬脂质转变成巨噬泡沫细胞，同时表达、分泌多种细胞因子，这些细胞因 子一方面加剧了血管壁的慢性炎症反应，同时也进一步加重内皮细胞损伤，并促进血管平 滑肌细胞增殖及分泌细胞因子，血管平滑肌细胞亦可吞噬脂质而转变成泡沫细胞，后者是 糖尿病动脉粥样硬化的病理基础。近年来，研究提示天然免疫的激活在动脉粥样硬化的血管炎症反应过程中起主导 作用。天然免疫是机体针对各种理化损伤因素或周围环境改变而启动的快速防御性的体 系。经典的天然免疫系统包括巨噬细胞、抗原递呈B细胞和树状突细胞。巨噬细胞激活后 可以分泌多种细胞因子，化学因子和生长因子，参与了动脉粥样硬化和糖尿病血管慢性炎 症反应的全过程。因此研究高糖高脂对巨噬细胞细胞因子表达的影响，对阐明糖尿病血管 损伤的机制具有非常重要的意义。细胞因子的表达调控机制十分复杂。研究证实，微小RNAOiiicroRNAs，miRNAs)参 与了生命过程中的许多重要进程，包括细胞增殖、凋亡、脂肪代谢、胰岛素代谢、免疫功能 等，并且还参与了诸如肿瘤、糖尿病的发生发展。miRNA是一种在进化过程中高度保守的、内 源性非编码的约22个核苷酸左右的单链RNA小分子，它能以不完全互补的方式结合到其靶 RNA的;T末端非翻译区的某些特定区域，实现转录后调控的作用，抑制蛋白质的合成。以往 的研究发现大约有哺乳动物基因编码miRNA，调控10%甚至更多的人类基因，然而绝大 部分miRNA的靶基因至今尚未明确，miRNA的发现及其对基因转录后的调控作用对有关研 究基因表达的调控提供了重要的线索，能促使本领域更好的认识生命现象的本质。
发明内容
本发明目的在于提供一种小分子RNA在制备药物中的应用，尤其涉及miR-145在 制备治疗炎症药物中的应用。更进一步，本发明提供miR-145在制备治疗糖尿病等炎症代谢性疾病药物中的应用。更进一步，本发明提供miR-145在制备检测糖尿病制剂中的应用。更进一步，本发明提供miR-145在制备治疗糖尿病大血管病变的靶点药物中的应用。
本发明所述的miR-145还可作为炎症性疾病的检测监督指标，所述的miR-145的 抑制剂能用于促增殖药物。本发明的技术方案包括采用芯片技术研究观察在高糖、高脂情况下，人巨噬细胞内miRNA和细胞因子表 达的变化情况；并将miRNA芯片结果中下调的人miRNA和人细胞因子抗体芯片结果中上调 的人细胞因子基因通过生物信息学技术进行比较以预测miRNA可能的靶细胞因子基因；采 用相关的miRNA研究技术，了解miRNA在糖尿病大血管炎症病变过程中的作用及其作用靶 点，并探索建立通过干预miRNA以防治糖尿病慢性并发症的方法。具体而言，本发明首先应用芯片研究高糖高脂对人巨噬细胞miRNA基因表达的影 响，观测miRNA在炎症代谢性疾病中的作用。结果显示高糖高脂下调83个miRNA基因的 表达，其中葡萄糖、AcLDL、葡萄糖+AcLDL及油酸共同下调的miRNA有7个，而高糖高脂上调 的miRNA仅1个。本发明将miRNA芯片结果中下调的人miRNA和人细胞因子抗体芯片结果中上调的 人细胞因子基因通过生物信息学技术进行比较，预测miRNA可能的靶细胞因子基因，结果 显示，42个细胞因子的上调可能是因为高糖高脂下调了相应的miRNA所致。故，推测该些 miRNA有可能介导了高糖高脂影响巨噬细胞细胞因子的表达。OPG为肿瘤坏死因子受体超家族中的一个分泌蛋白，能与TNF相关的凋亡诱导配 体(TRAIL)相互作用而广泛调控细胞凋亡，研究表明OPG在糖尿病大血管病变中发挥重要 作用，其中，糖尿病患者的循环血中OPG水平上升，在粥样斑块中OPG也明显上调。OPG还与 核因子-κ B受体活化因子(RANK)相互作用导致血管壁钙化，而血管钙化被认为是糖尿病 心血管死亡率的独立预测指标及基础的病理学变化之一。此外，OPG能通过其假受体(Decoy Receptor)中和促凋亡因子TRAIL的活性，因而能防止细胞凋亡。因此OPG在糖尿病AS的 发病过程中扮演着重要的角色。本发明利用数据库通过生物信息学技术预测到miR-145能 负调控0PG，在糖尿病大血管病变中发挥作用。本发明通过实验观测miR-145在糖尿病大血管病变中的作用如下1.评估高糖、高脂对OPG表达的影响用人细胞因子抗体芯片观测高糖、高脂对人巨噬细胞细胞因子表达的影响，结果 显示，高糖、高脂可以上调OPG的基因表达，western bolt技术证实OPG蛋白表达也明显增 加；同时，结果显示，OPG在人动脉粥样硬化样本平滑肌细胞中表达增加，表明OPG在糖尿病 大血管病变过程中发挥重要作用。2.评估高糖、高脂对人巨噬细胞miR-145表达的影响观察糖耐量受损病人(IGT)、2型糖尿病人(2-DM)与正常对照组人群相比， miR-145的基因表达的差别采用miRCURYTM表达谱芯片观察高糖、高脂对人巨噬细胞 miRNA表达的影响，结果显示，高糖、高脂可下调83个miRNA基因的表达，通过生物信息学技 术预测显示miR-145可负调控OPG ；同时本发明分组采集了 IGT、2_DM病人和正常对照组人群的外周静脉血，分离出 外周血单个核细胞，抽提RNA，用realtime PCR方法检测miR-145的表达，并进行比较，结果 显示，IGT和2-DM病人外周血单个核细胞中miR-145的基因表达水平较对照组人群低，说明miR-145在IGT和2-DM中表达有下调，进一步评估miR-145在糖尿病大血管中的作用。
3.证实miR-145负调控OPG实验分别将miR-145的抑制剂和前体转染HEK293细胞及巨噬细胞，通过Westernblot 检测，结果显示，转染了 miR-145抑制剂的细胞中OPG表达上调，而转染了 miR-145前 体的细胞中OPG表达下调，强烈提示OPG的表达受到miR-145的负调控；为进一步证明 miRNA-145可以与OPG基因序列3’末端非翻译区(3’ -UTR)直接作用调控OPG表达，本发 明将OPG mRNA 3’ -UTR片段克隆到荧光素酶载体中，分别与miR-145的前体或抑制剂共转 染HEK 293细胞，检测荧光素酶活性，结果显示，共转染了 miRNA-145抑制剂使得荧光素酶 活性明显增加，而共转染了 miR NA-145前体后荧光素酶活性减低，结果表明，miRNA-145可 以通过与OPG基因序列3’末端非翻译区(3’ -UTR)直接作用调控OPG蛋白表达，在糖尿病 大血管炎症病变中发挥重要作用。4.过表达的OPG对细胞增殖和凋亡的影响在THP-I细胞培液中加入重组人OPG蛋白，用XTT实验的方法，观测OPG对细胞增 殖的影响，结果显示，与未加入OPG蛋白的对照组相比，培液中加入OPG蛋白的细胞增殖明 显增加；同时用Armexin V/propidium iodide标记进行流式细胞仪的方法发现加入OPG蛋 白抑制了 THP-I细胞的凋亡，而向培液中同时加入OPG蛋白及其生理配体核因子_ κ B受体 活化因子配体(RANKL)，可以逆转OPG蛋白对THP-I细胞凋亡的抑制作用，结果表明，OPG能 促进巨噬细胞的增殖、抑制凋亡，从而在糖尿病大血管动脉粥样硬化病变中发挥重要作用。5. miR-145对细胞增殖与凋亡的影响(l)miR-145对细胞增殖的影响基于上述实验已证实miR-145是OPG的调节因 子，而OPG对细胞的增殖和凋亡有影响，采用XTT实验与细胞生长曲线等方法，检测miR-145 也具有类似的生物学活性，结果证实，THP-I细胞转染miR-145抑制剂后，与过表达OPG蛋 白的结果一致，细胞增殖增加，而加入了 RANKL后，miR-145抑制剂对细胞增殖的促进作用 减弱；另一方面，转染了 miR-145前体的细胞增殖减缓，结果表明miR-145的抑制剂可通过 上调OPG部分促进THP-I细胞的增殖。(2)miR_145对细胞凋亡的影响采用免疫印迹与免疫荧光等方法探讨miR-145对 内源性与外源性凋亡通路的影响，结果显示miR-145可通过影响Bax，Bcl-2, Caspase-9, Caspase-3、poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)等多个凋亡因子，促进细胞的凋亡；与现 有技术公开的，在外源性凋亡途径激活后，Bax可由弥散分布的形式转变成胞内的点杆状分 布比较，本发明结果显示，转染了 miR-145前体的细胞中Bax呈点杆状分布，同时用TUNEL 的方法证实了过表达miR-145增加原位细胞的凋亡；另外，转染了 miR-145前体后，293细 胞和P53阴性的H1299细胞有凋亡增加，表明miR-145可以不通过p53诱导细胞的凋亡，而 miR-145抑制剂可以作为一种抑制细胞凋亡的因子。6.过表达miR-145可以导致染色体分离本发明进一步研究miR-145对染色体分离的影响，分别用miR-145的前体和抑制 剂转染HEK293及HeLa肿瘤细胞株，采用免疫荧光技术研究发现，与对照组相比，转染了 miR-145前体的细胞出现明显的染色体桥和落后染色体的异常染色体分离现象，结果表明 miR-145能引起染色体的异常排列，从而促进细胞凋亡。7.小鼠体内试验证实miR-145抑制剂促进巨噬细胞增殖
选用了 C57BL6/J小鼠，分为对照组、miR-145组和miR-145抑制剂组，分别向小鼠 体内注射PBS、miR-145寡核苷酸和miR-145抑制剂寡核苷酸，注射三次后用免疫组化等方 法观察小鼠体内巨噬细胞的变化，结果显示，注射miR-145抑制剂的小鼠体内骨髓单个核 细胞增殖能力较对照组和miR-145组明显增加；小鼠组织石蜡切片结果显示，注射miR-145 抑制剂组的小鼠肝脏组织巨噬细胞表面特异标记分子⑶68染色明显增加，增殖指标PCNA 染色也明显增加，说明抑制了体内miR-145后，导致巨噬细胞增多，引起炎症免疫反应，提 示miR-145在代谢性疾病的炎症过程中的作用。本发明用microRNA芯片和细胞因子抗体芯片研究了在高糖、高乙酰化LDL等情 况下人巨噬细胞的microRNA和细胞因子的表达谱。结果表明，miR-145表达下调，而骨保 护素0PG表达上调；在未服用口服降糖药物的口服糖耐量受损(IGT)和2型糖尿病的患者 中，miR-145表达较正常对照组人群下调；在糖尿病动脉粥样斑块中，0PG表达上调，并且 0PG的水平与冠心病的严重程度与血糖的控制情况相关；另外，结果还显示，miR-145能负 调控0PG，转染miR-145抑制剂后，0PG的表达上调，而过表达miR-145后，0PG的表达下调； 进一步采用荧光素酶实验证实miR-145可以与0PG的3’端非翻译区结合负调控0PG的蛋 白表达；结果还显示，转染了 miR-145抑制剂可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，而过表达 miR-145可以诱导细胞凋亡、引起异常的染色体分离现象；小鼠体内试验结果显示，体内注 射miR-145抑制剂可以引起小鼠肝脏组织巨噬细胞明显增加，小鼠骨髓单个核细胞增殖能 力增加，说明在体内抑制了 miR-145的表达可以导致体内单核巨噬细胞的增殖浸润，导致 体内炎症反应，换言之，miR-145在抗炎反应中发挥作用。本发明经试验证实，在高糖、高脂情况下，microRNA参与糖尿病血管病变等代谢疾 病的炎症病变发生发展，可用于制备治疗炎症药物，尤其是制备治疗糖尿病等炎症代谢性 疾病药物及制备检测糖尿病制剂。所述的miR-145可成为糖尿病病人检测指标之一，并作 为糖尿病大血管病变等炎症性疾病的治疗靶点。
图1是细胞因子抗体芯片结果表明，其中，高糖、高脂上调骨保护素0PG的表达，并 通过western的方法验证了芯片的结果。图2是MicroRNA芯片结果发现，其中，高糖、高脂下调miR-145表达，并通过 real-time PCR的方法进一步证实了芯片结果。图3是体外实验结果，在细胞内过表达miR-145，0PG表达下调，抑制细胞内 miR-145, 0PG表达上调。图4是荧光素酶实验证实miR-145直接与0PG 3’末端非翻译区相互作用，其中， 负调控0PG表达，0PG是miR-145的靶蛋白。图5是体外试验结果，其中细胞水平转染了 miR-145抑制剂可以促进细胞增殖，而 过表达miR-145可以抑制细胞增殖。图6体外试验结果，其中过表达miR-145可以促进细胞凋亡、引起异常的染色体分 离现象。图7小鼠体内试验结果，其中显示，体内注射miR-145抑制剂可以引起小鼠肝脏组 织巨噬细胞明显增加，小鼠骨髓单个核细胞增殖能力增加。
具体实施例方式
本发明所涉及的实验用生物材料和试剂均可市购。实施例1.细胞培养THP-1人巨噬细胞细胞株，培养在含10% FBS的RPMI 1640 (Gibco)培养液中，至 于37°C温箱，5% C02,当细胞处于对数生长期时，在培养液中加入200nM 12-0-tetradecan oylphorbol-13-acetate (TPA, Cell Signaling Technology)，48 小时后分化成巨噬细胞。 HeLa和HEK 293肿瘤细胞株，培养在含10% FBS的高糖DMEM(Gibco)培养液中，至于37°C 温箱，5% C02。2.分离外周血单个核细胞，提取总RNA，real-time PCR检测miR-145在签署知情同意书情况下，分别取5个正常对照组、新发现口服糖耐量受损人群、 新诊断2型糖尿病患者各2ml外周静脉血，用聚蔗糖/泛影钠密度梯度离心的方法分离外 周血，获取单个核细胞。使用mirVana mi RNA Isolation Kit (Ambion) RNA提取试剂盒按说 明书步骤抽提纯化外周血单个核细胞总RNA，分光光度计进行定量并检测RNA纯度。各个 样品各取30ng总RNA为模板，使用Amibion提供的针对miR-145的逆转录引物及mirVana qRT-PCR mi RNA detection kit (Ambion)试剂盒逆转录成cDNA。以cDNA为模板，使用针对 miR-145 的 PCR 引物及 mirVana qRT-PCR mi RNA detection kit (Ambion)提供的荧光定量 PCR体系，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增，测各个样品的Ct值，用U6基因作为内 参校正各组样品上样量的差别后，使用2_ACT方法比较各组之间miR-145表达的差异。3.细胞转染采用电穿孔的方法转染THP-1细胞miR-145的前体和抑制剂。为了获取最大的转 染效率，本发明优化了电压，电容和有效的RNA浓度。具体电穿孔步骤如下首先用无血清 的RPMI 1640重新悬浮细胞，使细胞浓度为5 X 106/250 iil，然后向0. 4-cm电穿孔杯内加 入THP-1细胞悬浮液和6. 75 ill miRNA(50nM)的前体或抑制剂，冰上放置lOmin。使用BTX ECM 630电穿孔仪，电压和电容分别为170V和2000 u F。电穿孔后冰上放置15min，放入6 孔板中，加入含10% FBS的培液到2. 5ml，48小时后收集蛋白用western blot技术检测。使用siPORT neoFX (Ambion)转染HEK 293 cells和Hela细胞，分为对照组、转染 miR-145的抑制剂组、转染miR-145的前体组、转染miR-145的前体和加入0PG组这四组，具 体转染方法参照说明书要求进行，miRNA工作浓度为50nmol/L，48小时收集蛋白用western blot技术检测。4.荧光素酶实验首先构建0PG 3’ UTR的克隆位点，该位点包含miR-145的结合位点。然后将带荧 光素酶的质粒和mina的抑制剂或者前体用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)共转染HEK 293细胞，以半乳糖苷酶质粒作为校正。转染48小时后检测荧光素酶的强度。5.蛋白印迹分析用RIPA裂解细胞，提取总蛋白，对蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入上样缓 冲液，100°C煮沸5分钟后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压100V。电泳完后，将蛋白转 移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，后用所要检测的蛋白一抗4°C孵育过夜，二抗 室温孵育2小时，发光液显色。用actin做对照校正上样量差别后，对信号强度进行分析。
6.免疫细胞化学先在24孔板内放入已预先泡酸、灭菌的盖玻片，然后将细胞种植到24孔板内，分 别转染miR-145前体或抑制剂。待板上铺满一层细胞后，用PBS洗细胞两次后加入含0. 1% Triton X-100的PHEM缓冲液透化lmin，然后在4%低聚甲醛和0. 05%戊二醛PHEM中固定。 用的牛血清白蛋白(Sigma)封闭细胞，一抗室温孵育1-2小时，FITC标记的二抗室温孵 育1小时。用DAPKChemicon)复染细胞核，然后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察， 记录图像分析。7.细胞增殖实验用XTT比色法(Sigma-Aldrich Chemicals)检测细胞的增殖。电穿孔转染THP-1 细胞miR-145前体或抑制剂后，将细胞加入96孔板中，放入37°C温箱，72小时后检测细胞 的增殖情况进行比较。用siPORT neoFX(Ambion)转染293细胞miR-145前体或抑制剂后，连续四天计数 细胞数变化，做细胞生长曲线。8.凋亡实验在THP-1细胞培液中加入重组人0PG蛋白，24小时后用Annexin V/ propidiumiodide (BioVision)标记进行流式细胞仪的方法评估凋亡的情况。用免 疫印迹的方法检测过表达miR-145后凋亡因子Bax，Bcl-2, Caspase-9，Caspase_3、 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)的变化。用TUNEL的方法检测过表达miR-145对原位 细胞的凋亡的影响。9.小鼠体内试验选用12周的雄性C57BL/6小鼠实施体内实验，先对小鼠行颈静脉插管，待插管小 鼠情况稳定后，将小鼠随机分为对照组、miR-145组和miR-145抑制剂组，分别向小鼠体内 注射PBS、miR-145寡核苷酸和miR-145抑制剂寡核苷酸，连续三日，三日后将小鼠麻醉后处 死进行实验。实验结果表明，miR-145表达下调，而骨保护素0PG表达上调；在未服用口服降糖 药物的口服糖耐量受损(IGT)和2型糖尿病的患者中，miR-145表达较正常对照组人群下 调；在糖尿病动脉粥样斑块中，0PG表达上调，并且0PG的水平与冠心病的严重程度与血糖 的控制情况相关；另外，结果还显示，miR-145能负调控0PG，转染miR-145抑制剂后，0PG的 表达上调，而过表达miR-145后，0PG的表达下调；进一步采用荧光素酶实验证实miR-145 可以与0PG的3’端非翻译区结合负调控0PG的蛋白表达；结果还显示，转染了 miR-145抑 制剂可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，而过表达miR-145可以诱导细胞凋亡、引起异常的 染色体分离现象；小鼠体内试验结果显示，体内注射miR-145抑制剂可以引起小鼠肝脏组 织巨噬细胞明显增加，小鼠骨髓单个核细胞增殖能力增加，说明在体内抑制了 miR-145的 表达可以导致体内单核巨噬细胞的增殖浸润，导致体内炎症反应，换言之，miR-145在抗炎 反应中发挥作用。SEQUENCE LISTING<110>复旦大学附属华山医院<120>miR_145在抗炎症治疗中的应用<130>42
8
<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>88<212>RNA<213>Homo sapiens<400>1caccuugucc ucacggucca guuuucccag gaaucccuua gaugcuaagauggggauucc60uggaaauacu guucuugagg ucaugguu 88<210>2<211>23<212>RNA<213>Homo sapiens<400>2guccaguuuu cccaggaauc ccu2权利要求
miR-145在制备治疗炎症药物中的应用。
2.miR-145在制备治疗炎症代谢性疾病药物中的应用。
3.按权利要求1或2所述的应用，其中所述的药物是糖尿病大血管病变的靶点药物。
4.按权利要求2所述的应用，其中所述的代谢性疾病是糖尿病。
5.miR-145在制备检测糖尿病制剂中的应用。
6.miR-145在制备炎症性疾病的检测监督指标中的应用。
7.一种含有miR-145的抑制剂。
8.按权利要求1的抑制剂在制备促增殖药物的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，涉及一种小分子RNA在制备药物中的应用，尤其涉及miR-145在糖尿病等炎症代谢性疾病治疗中的作用。本发明经试验证实，在高糖、高脂情况下，microRNA参与糖尿病血管病变等代谢疾病的炎症病变发生发展，可用于制备治疗炎症药物，尤其是制备治疗糖尿病等炎症代谢性疾病药物及制备检测糖尿病制剂。所述的miR-145可成为糖尿病病人检测指标之一，并作为糖尿病大血管病变等炎症性疾病的治疗靶点。
文档编号A61P29/00GK101843632SQ20091004810
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者张伟伟, 杨志红, 梁文昌, 胡仁明 申请人:复旦大学附属华山医院