含有转化生长因子α的疫苗组合物的制作方法

专利名称：含有转化生长因子α的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和人类医学领域，特别是一种能够引起对抗自 身TGFa的免疫去势反应的疫苗制剂。该疫苗可以用于某些癌症和其 它TGFa相关疾病的治疗。
现有技术
转化生长因子(TGFa)是一种50个氨基酸的多肽，最初分离自 逆转录病毒转化细胞的条件培养基。开始它被认为是一种能够与表皮 生长因子(EGF)竟争结合EGF-R的分子。然而，抗EGF抗体不能 识别TGFa ( Todaro等(1976)， Nature 264， 26-31 )。所以，这两种生 长因子是两种免疫学不同的实体。
TGFa属于EGF家族。结构和功能相关的蛋白组成了这个家族。 该家族的其他成员有EGF、双调蛋白(AR)、 criptol ( CR1 )、肝素结 合EGF、 P动物纤维素、表皮调节素。另一方面痘病毒科包括了 EGF 相关蛋白。其中最具代表性的是牛痘病毒生长因子(VGF)。
所有这些分子结合并活化EGF-R，那就是为什么它们被视为这一 受体的配体。这个系统在正常和肿瘤细胞的生长中发挥作用。EGF-R 是一种170kD的糖蛋白，其基因已经被克隆并测序。该受体的胞内域 伴有酪氨酸激酶蛋白活性。这些蛋白与v-erb-B癌基因产物具有结构 同源性，这成为其与肺瘤转化过程关联的证据(Heldin C.H. (1984), Cell 37, 9-20.)
TGFa合成为160个氨基酸的跨膜前体形式(前TGFa)。成熟 TGFa， 50个氨基酸的可溶形式，是通过蛋白水解断裂释放的。人TGFa (hTGFa)显示出与人EGF( hEGF)具有43%的氨基酸序列同 一性， 与小鼠或大鼠TGFa有93%同一性。此外，它们的生物学效应不具有 种特异性。许多实验室的工作已证实了 TGFa调节培养细胞增殖、迁移和分 化的能力(Carpenter和Wahl. (1990)， Springer-Verlag ,柏林，69-171页)。
TGFa是最广泛存在的EGF-R配体。它在胚胎发生时的正常组织 和成年人的正常及肿瘤组织中表达。然而，在敲除TGFa的小鼠中并 未观察到大的病理缺陷，并且这些小鼠可以生存并繁衍(Bruce Mann 和同事(1993)， Cell, 73， 249-261 )。
在胂瘤发生过程中，EGF-R活化的旁分泌和自分泌过程的失调节 是由生长因子表达的上调或其受体高合成或突变造成的。
在上皮性肿瘤中测到了高水平的EGF-R。在许多情况下，该受体 的过度表达预示着不良预后。
TGFa的诱导常见于肿瘤转化。事实上，许许多多的研究表明不 同部位的上皮性胂瘤中该分子有过度表达，包括乳腺、肺、脑、肝、 前列腺、膀胱、胃肠道、结肠、生殖(卵巢)和内分泌组织等。
尽管TGFa诱导肿瘤发生的机制尚未明确，已有一些报道将该生 长因子的过度表达与肺瘤的分级、患者的生存和其它胂瘤标记物联系 起来。此外， 一些研究人员已经证实了它们与其它癌基因的关系，如 肝癌中的c-myc。 TGFa也是von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因(VHL ) 的标耙(总结在Lee等，(1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease,巻IB, 277-318)。
尽管TGFa和EGF以相似的亲和力与同 一受体结合，TGFa通 常比EGF效力更强，并且在一些情况下，据述它的效应更强和/或更 持久(Barrandon和Green ( 1987)， Cell, 50, 1131誦1137)'据报道 对于内化的TGFa/EGF-R复合物，TGFa和EGF-R优先重新循环回 到细胞表面，而当EGF/EGF-R复合物内化至同一类型细胞中时，两 种成分都被有效降解(Ebner和Derynck ( 1991 ), Cell Regul. 2， 599-612)。这些结果表明每种生长因子生物活性的差异可能是由于细 胞内运输机制不同造成的。
另一方面，TGFa是一种比EGF更强的血管生成因子(Schreiber等，(1986), Science 232， 1250-1253 )。
至于在胂瘤中的表达，有证据表明某些上皮性肿瘤的细胞膜中存 在EGF前体，但TGFa在上皮性肿瘤中有着最多的表达，并且与EGF 相反，它是通过与EGF-R的自分泌环起作用的。另一方面，我们中心 的结果显示在某些上皮性肺瘤的活检组织中有TGFa表达而没有EGF (乳腺异管癌、喉癌)，但其它肿瘤呈现的EGF多于TGFa (非小细 胞肺癌(NSCLC))。这些结果表明生长因子在不同肿瘤细胞的肿瘤生
物学中具有不同的影响。
这些年所累积的关于EGF-R/EGF-R配体系统和癌症之间关系的 所有证据，使该系统成为癌症免疫治疗中极富吸引力的目标。
我们小组先前的结果证实了可发展一种基于EGF的疫苗用于癌 症主动免疫治疗。事实上，已经获得了有关用偶联至载体蛋白的hEGF 进行疫苗接种所产生的免疫原性和低毒性的临床前期和临床证据 (Gonzdlez等 (1996 )， Vaccine Research 5 ( 4), 233-243 )。
临床前期研究显示用在佐剂中的hEGF免疫小鼠可以增加移植了 Ehrlich腹水瘤(EAT)的小鼠的存活(Gonzalez等(1996)， Vaccine Research 5(4)， 233-243 )-
制备了 hEGF与P64K的融合蛋白。该蛋白含有在P64K的45/46 氨基酸间插入的hEGF序列。该融合蛋白被用于免疫小鼠，引起抗 hEGF的特异性体液免疫应答。所激发的免疫应答使负荷EAT的小鼠 寿命延长(Gonzalez和同事(1997 )， Vaccine Research 6(2)， 91-100 )。
在两项针对NSCLC患者的临床试验中观察到，与历史对照组相 比较，接种疫苗的患者的生存有增加趋势。具有抗hEGF高水平抗体 反应的患者存活显著增加(Gonz^ez等 (1998)， Annals of oncology 9, l画5)'
通常接种EGF不会产生抗TGFa的特异性抗体应答。然而已经 获得的证据是小鼠模型接种含TGFa的免疫原性制剂后，仅一些小鼠 产生了低水平的抗EGF抗体。该抗体应答在一些情况下能够阻断EGF 在体外与其受体的结合。然而所获得的抗EGF抗体的水平并不足以产生有效的EGF免疫去势反应并在抗肿瘤作用中发挥影响。
由于这些生长因子中的每一种在各肺瘤和/或原发瘤及其转移灶
之间作用不同， 一种联合EGF-R的两种主要配体TGFa和EGF的疫
苗通常对上皮性肿瘤具有更好的抗肿瘤效应。
在本发明之前，尚未有任何治疗将含有hTGFa或任何衍生物，
或其与EGF-R的其它配体EGF的组合的疫苗制剂用于癌症主动免疫治疗。

发明内容
本发明提供了一种疫苗组合物，它含有TGFa或其任何来源的任 何衍生物，与载体蛋白遗传连接(融合蛋白)或通过化学方法偶联， 它能够抑制上皮性肿瘤的生长而无不良副作用。这一作用是通过生长 因子免疫去势机制实现的。本发明还要求保护一种含有hTGFa与 hEGF或任何衍生物的组合以及载体蛋白的疫苗组合物。
该疫苗组合物可用于治疗依赖TGFa或TGFa/EGF的上皮性肿 瘤，或与TGFa相关的任何其它疾病，如银屑病(Kapp等(1993) J Dermatol Sci， Jun; 5 ( 3): 133-42)'
在TGFa的详细说明中，具有与原分子相同的免疫学特性和/或相 似作用的任何TGFa衍生片段都包括在内。那些衍生物，包括但并不 排除其它氨基酸的原始置换、改变特定氨基酸以增加稳定性和/或活 性、化学修饰等。
更为具体地说，本发明提供了一种能够引起自身TGFa免疫去势 反应的疫苗组合物，它可以用于某些癌症和其它与TGFa相关的疾病 的治疗。
另一方面本发明包括了由TGFa和EGF的组合构成的疫苗制剂肿瘤。
1- 免疫原性制剂
本发明使用的疫苗制剂所包含的hTGFa或者通过基因工程的方 法与载体蛋白偶联(融合蛋白)，或者通过化学方法与之结合。这些免疫原性制剂的任何一种中所使用的hTGFa可以是重组的、合成的或 来自天然来源。不同的蛋白可以用作栽体。可用作栽体蛋白的例子有 破伤风类毒素、KLH、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白及其它。 疫苗制剂中hTGFa的最佳量波动在每剂5jxg至1000jag之间。
另一方面使用了含有hTGFa与hEGF的组合的疫苗制剂(国家 药品注册办7^室，Office of National Registration of Medication, HEBERMIN Not 1266 )。
在TGFa或EGF的详细说明中，具有与原分子相同的免疫学特 性和/或相似作用的任何TGFa或EGF衍生片段都包括在内。那些衍 生物包括但并不排除其它氨基酸的原始置换、改变特定氨基酸以增 加稳定性和/或活性、化学^^饰，及其它。
A) 通过基因工程方法获得融合蛋白TGFa-栽体蛋白 使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码hTGFa的
基因(500bp)。将获得的DNA片段进行消化并在特定的位点克隆至 含有编码载体蛋白的基因的表达载体中。获得的蛋白含有两种分子的 一个或多个拷贝。可以使用哺乳动物细胞、细菌或酵母菌作为表达载 体。该载体还可以在载体蛋白的N末端包括6个组氨酸，通过在琼脂 糖凝胶上进行限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)进 行DNA测序，以及最后使用抗hTGFa的特异性单克隆抗体(R&D System)通过蛋白质印迹技术对任意大肠杆菌表达抹表达融合蛋白进 行分析来证实所获得的质粒。为获得蛋白，使用强破坏法破坏细菌细 胞壁，然后使用琉酸铵差异沉淀法和色谱法相结合纯化蛋白。最后，
在无菌条件下过滤蛋白并保存于-20x:或冻干并保存于4X:直至随后使用。
B) 获得含hTGFa的化学结合物
获得含有与不同载体蛋白(如P64K)结合的hTGFa的不同制剂。 可以使用任何化学结合法。优先使用的化学法是北美专利U.S.Pat， Not. 4,302,386; Lee等，1981中所述的使用EMCS物质的方法。
或者，可以使用戊二醛结合方法。简而言之，将这两或三种在最终溶液中浓度为lmg/ml的分子与0.05%戊二醛(在总溶液中)混合。 混合物于室温下温育1小时，然后用PBS1 x/10mMMgCl2溶液透析。 最后，在4'C用PBS1 x透析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂 并保存于4。C直至使用。
C ) 获得将hTGFa和hEGF相结合的疫苗。
获得将EGF-R的两种主要配体相结合的疫苗可以通过不同方式 进行
1- 在注射时按1:1关系混合两种分别含有与栽体蛋白相连的 hTGFa或hEGF的疫苗。为此目的可以使用每种生长因子与栽体蛋白 的融合蛋白或化学结合物。疫苗制剂中hTGFa和hEGF的最佳量波 动在每剂5|ug至1000ng之间。
2- 根据A部分所述获得一种相似的基因构建体，它含有两种生 长因子hTGFa和hEGF，或它们任何书f生物的组合。
3- 应用B部分所述的方法通过化学方法获得含hTGFa和hEGF 或它们任何衍生物的组合与载体蛋白的化学结合物。
D) 获得免疫原性制剂
为获得该疫苗组合物理想的免疫原效应，可便利地使用合适的佐 剂并选择给药途径以使疫苗制剂表现出高免疫原性。
本发明所述疫苗组合物是通过两种特定方式制备的
1) 使用Al(OH)3作为佐剂以获得水溶液，疫苗制剂吸附在该化 合物上。为此目的在不同制剂中用相当于5jxg到1000pg的TGFa结 合到2到5mg的Al(OH)3上.振荡该制制l小时，最终的溶液置于4 匸保存直至随后使用。
2) 使用不完全弗氏佐剂，形成水/油或油/水乳状液。融合蛋白或 化学结合物与佐剂在最终制剂中的量在40/60到60/40 (体积/体积)的 范围内。所用体积取决于期望获得的最终乳状液。在免疫接种前加入 佐剂并将制剂于室温下振荡10到30分钟。
每种免疫原性制剂的最终体积覆盖了相应给药途径的适宜范围。 对于如C部分所述在注射时即刻制备联合疫苗的情况，如前所述将与适宜佐剂混合的两种疫苗通过振荡混合并注射或者分别注射。
可以通过多种途径施用疫苗组合物肌肉内、皮下、鼻内和皮内。 实施例
实施例1:通过聚合酶链式反应(PCR)获得编码成熟TGFoc的 DNA片段。
使用PSK/TGFot载体(CIGB，古巴)作为模板通过PCR扩增编码 hTGFa的基因。该质粒含有克隆至商品载体pBluescript KS-(Stragene) 的EcoRV位点的hTGFa互补DNA(cDNA)。使用所述特异性引物 扩增编码成熟TGFa (50个氨基酸长(图l))的序列
N末端5-GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3，
(下划线，Xbal限制酶切位点)
C末端5画CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC画3， (下划线，EcoRI限制酶切位点)
简而言之，在75pL的混合物中使用200ng的PSKTGFa，混合 物含有每种特异性引物各500ng，各200mM浓度的脱氧三磷酸核苷 酸的混合物，25mMMgCh和100单位溶于Promega提供的緩冲溶液 中的Taq-聚合酶(Promega),。执行30个循环的变性(94°C 1分钟)、 退火(60t: 1分钟)和延伸(72" 30秒)。在第一个循环之前，将 DNA变性4分钟；最后一个循环之后，再最后延伸2分钟。
PCR产物在低熔点(LGT)琼脂糖凝胶上电泳分离，并按照常规 步骤用笨酚提取来纯化扩增的基因并用Xbal和EcoRI酶(NEB， USES)消化。按该方案制备的是编码成熟TGFa的基因片段。
实施例2:获得融合蛋白TGFot-P64K的表达载体。
使用表达载体pM 92(CIGB，古巴)。该质粒含有编码脑膜炎奈瑟 氏球菌(B385抹)的P64K蛋白的lpdA基因，其受大肠杆菌色氨酸 搡纵子启动子(ptrp)和噬菌体T4转录终止子(tT4)的控制。pM92编码 氨苄西林和卡那霉素抗生素耐药性。用pM 92转化Dam-大肠杆菌菌 抹(GC-366)并使用商品试剂盒(Quiagen)根据生产商的方案纯化该质 粒。消化PM92栽体并从LGT琼脂糖凝胶纯化。而后用T4连接酶(Gibeo BRL)将PM92栽体与之前制备的成熟hTGFa的cDNA相连接。 所获质粒pMTGFa编码含有在P64K的45/46氨基酸间插入的 hTGFa的融合蛋白。通过琼脂糖凝胶限制酶切分析、使用 Sequenase2.0(Amersham-USB)进行DNA测序，以及最后使用hTGFa 的特异性单克隆抗体(R&D System)通过蛋白质印迹技术分析大肠杆 菌MM299株中融合蛋白表达，来证实该重组质粒。图2显示了表达 栽体pMTGFa获得过程的图解。该载体编码融合蛋白TGFa-P64K。
实施例3:获得N末端有6个组氨酸的融合蛋白TGFa-P64K的 表达载体(pMHisTGFa)。
依照之前实施例所述的相同方案获得表达载体pMHisTGFa，起 始栽体为pM224,它包括了一个编码P64KN末端6个组氨酸的片段。 由于与带有Cu^或其它金属的螯合S印harose结合增加，该6个组氨 酸的标记在蛋白纯化过程中显现了优势。
实施例4:融合蛋白(TGFa-P64K)纯化。
表达融合蛋白TGFa-P64K的大肠杆菌(MM299抹)在LBA培 养基(IO g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨千 西林)中于37。C生长10小时。收集细胞后，所有的步骤在0-4'C下进行。 在弗氏压碎器中于1500 kg/cm2破裂细菌，并于11,000 xg下高速离心 30分钟以除去不溶部分。第一步纯化使用4(T/o的辟f酸铵沉淀以去除部 分大肠杆菌蛋白。在4"C11，000 xg下进一步离心30分钟以去除得到的 沉淀。上清通过疏水作用层析法(TSK-butil， Pharmacia,瑞典)分部分 离，使用在pH=7.2、含0.15M NaCl的Tris-Cl緩冲液中从40%到0% 递减的硫酸铵梯度。然后将所得样品通过经PBS 1 x平衡的G200柱 (Pharmacia)凝胶过滤而分离，使最终纯度大于95%,按照Lowry等 (1951 )丄Biol. Chem. 191,495-498描述的比色法测定蛋白浓度。使用 抗P64K和TGFa的特异性抗体，通过蛋白质印迹技术对融合蛋白进 行表征。
实施例5:融合蛋白(HisTGFa-P64K)纯化。
表达融合蛋白TGFa-P64K的大肠杆菌(MM299株)在LBA培养基(IO g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨苄西 林)中于37。C生长10小时。收集细胞后，所有的步骤在0-4。C下进行。 在弗氏压碎器中于1500 kg/cin2下破裂细菌，并于11,000 xg下高速离 心30分钟以除去不溶部分。第一步纯化^f吏用40y。的辟u酸铵沉淀以去 除部分大肠杆菌蛋白。在4°C 11,000 xg进一步离心30分钟以去除得到 的沉淀。由于蛋白中存在6个组氨酸，上清通过螯合亲和层析法 (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia,瑞典)分部分离，使用在 pH=5.5、含0. 5M NaCl的Tris-Cl緩冲液中从25mM到500mM递增 的咪唑梯度。然后所得样品通过经PBS 1 x平衡的凝胶过滤G25柱 (Pharmacia)去除盐分，达到95%纯度水平。按照Lowry等(1951) J. Biol. Chem. 191,495-498描述的比色法测定蛋白浓度。使用抗P64K 和TGFa的特异性抗体，通过蛋白质印迹技术对融合蛋白进行表征。
实施例6:用hTGFa特异性单克隆抗体(Mab)识别重组蛋白 TGFa-P64K。
4吏用蛋白质印迹技术确定在融合蛋白中的TGFa是否可以被抗 hTGFa Mab (Calbiochem)所识别。按传统步骤将25jug的EGF-P64K、 TGFa-P64K或P64K在两个聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移到 0.45pm硝酸纤维素膜上。转移后，将膜与含5%脱脂奶的TBS 1 x封 闭液一起于4。C温育过夜。使用TBS 1 、Tween 20(0.05%)简单冲洗后， 将一张膜与抗P64K抗体(1/500)(图3A),另一张膜与抗TGFa Mab(1/100)(图3B)—起在室温下温育2小时。然后用同样的溶液洗3 次，并将膜在同样条件下与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白 (1/1000 ) —起温育1小时。最后加入0.004g Fast Net酶底物(Sigma), 该底物在含O.IM Tris-Cl(pH=8.2)、 0.004g萘酚ACE-MX磷酸(Sigma) 及400pLNN，二甲基甲酰胺的20mL缓冲液中。用相似的冲洗终止反 应。观察到了抗hTGFa Mab对TGFa -P64K的特异性识別(图3 )。 这一结果证明融合蛋白中的TGFa保持了能够被特异性抗体识别的结 构。
实施例7:获得化学结合物hTGFa-P64K。将1毫升在PBS/10 mM MgCl2中浓度为2mg/mL的TGFa与1 毫升在同样溶剂中浓度为2mg/mL的P64K相混合。然后加入0.2mL 0.5%的戊二醛溶液使最终百分比为0.05%。混合物于室温温育1小时， 然后用PBS 1 x/10 mM MgCh溶液透析。最后，于4'C用PBS 1 x透 析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂并在4X:保存直至使用。 实施例8:获得hTGFa、 hEGF与P64K的融合蛋白。 使用质粒pBEF 10作为模板PCR扩增编码hEGF ( 150bp )的基 因。该质粒含有克隆至商品载体pBiuescript SKII(Stragene)的EcoR V 位点的完整hEGF。用实施例2所述方法将获得的DNA连接到 pMHisTGFa质粒位于P64K C末端的Bam HI位点。这样就获得了编 码融合蛋白TE-P64K的pMTGFa-EGF载体。
实施例9:获得化学结合物hTGFa-hEGF-P64K。 将1亳升在PBS/10 mM MgCl2中浓度为3mg/mL的TGFa与1 亳升在同样溶剂中浓度为3mg/mL的hEGF和3mg/mL的P64K相 混合。然后加入0.6mL 0.5%的戊二醛溶液使最终百分比为0.05%。混 合物于室温温育1小时，然后用PBS1 x/10 mMMgCl2溶液透析。最 后，于4'C用PBS1 x透析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂并 在4'C保存直至使用。
实施例10:制备含hTGFa的制剂。
如本发明中详述的那样将实施例2、 3、 7、 8和9中所述的不同免 疫原性制剂与Al(OH)3或Montanide ISA 51相混合。所有制剂中 hTGFa的用量等于50jLig ,在实施例8和9所述的联合疫苗中，hTGFa 和hEGF的用量为50pg 。每种融合蛋白或化学结合物制剂使用2毫 克Al(OH)3,制剂分别含有50pghTGFa或hEGF的相当物。
实施例11:制备含TGFa-P64K蛋白和EGF-P64K蛋白的联合疫苗。
在注射之前，将总体积为0.5mL在0.6mg重组体中的50pg每种 生长因子与相同体积的Montanide ISA 51混合并在室温下振荡10分钟。当使用Al(OH)3作为佐剂时，注射之前将在2 mg Al(OH)3中含
0.6mg每种蛋白的两种制剂相混合。
实施例12:制备含化学结合物TGFa/P64K和EGF/P64K的联合疫苗。
于室温下使用注射器将0.25mL含50pg如实施例7所述连接到 P64K的hTGFa的免疫原性制剂与0.25mL含hEGF的相应免疫原性 制剂相混合，并如实施例10所述与0.5mL的Montanide ISA 51混合 10分钟。
当使用Al(OH)3作为佐剂时，将吸附于2 mg Al(OH)3、分别含有 50pg hTGFa或hEGF的前述化学结合物各0.5mL相混合。
实施例13:小鼠模型中TGFa-P64K/不完全弗氏佐剂(Montanide ISA 51)的免疫原性。
为了证实疫苗的免疫原性，对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠皮下注 射与Montanide ISA 51按1:1混合的58mg(相当于5pgTGFa)、 116mg(10ng)或0，6mg(50iag) TGFa-P64K。如本发明的详细描述制备 免疫原并在免疫前振荡IO分钟。每只动物接种4剂。在免疫前、 一周 后及此后每两周进行抽血。从所抽取的动物血中分离血清并采用间接 ELISA技术测定抗hTGFa的特异性抗体滴度。
简而言之，用含2.5)ag/mL hTGFa的pH=7.2碳酸盐-碳酸氬盐緩 冲液按50pL/孔包被微滴ELISA板(COSTAR)，并在4。C温育过夜。 用PBS 1 x_Tween 20(0.05%)冲洗三次后，用PBS 1 x-Tween 20(0.050/。)-SFT(5o/。)溶液在37r封闭1小时。立刻加入被免疫小鼠的 血清并于37 。C温育2小时。冲洗后，将于PBS 1 x-Tween 20(0.05。/。)-SFT(5。/。)中1/1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠免 疫球蛋白(Sigma)加入板中在相同温度下温育板1小时(50nL/pozo)。最 后，在冲洗后，加入在pH=9.8 二乙醇胺緩冲液中终浓度为lmg/mL 的酶底物(对硝基苯磷酸(Sigma)) (50pL/孔)。在ELISA读板机中测 量所形成的酶-底物复合物在405nm的吸光度。
图4显示了在用TGFa-P64K免疫的小鼠中获得的多价抗hTGFa抗体应答的动力学。
由于hTGFoc与大鼠或小鼠相应因子之间的高度同源性(93% )， 可以将此抗hTGFa的免疫应答视为抗自身TGFa (小鼠)的应答。 实施例14:小鼠模型中TGFa-P64K/Al(OH)3的免疫原性。 使用2 mg Al(OH)3作为佐剂，按之前实施例所述实施免疫方案。 按本发明的详细描述制备免疫原性制剂。对于TGFa获得的抗体滴度 达1/10000。用于测定抗体滴度的技术是实施例13中所述的间接 ELISA。
实施例15:小鼠模型中用TGFa-P64K蛋白/不完全弗氏佐剂 (Montanide ISA 51)免疫的小鼠中的IgG亚群分布。
通过实施例13中所述的间接ELISA技术，使用1/1000稀释的与 生物素(Jackson)偶联的抗不同IgG亚群的特异性抗血清，然后用链 霉抗生物素蛋白-磷酸酶复合物(1/1000)，来测定IgG亚群分布。
测定每种IgG亚群相对于被免疫动物血清中的总IgG的比例。按 照实施例13中所述的免疫程序通过皮下(组1)或肌内(组2)途径 用含50吗TGFa的融合蛋白免疫动物。图5是所获得的亚群分布。研 究所用的两组小鼠均获得更大比例的IgGl。
实施例16:通过放射受体测定技术(RRA)测定用TGFa-P64K 蛋白/不完全弗氏佐剂(Montanide ISA 51)免疫的动物血清抑制 I125-TGFa结合的能力。
为测定之前所述的免疫程序中所产生的抗体是否能够抑制TGFa 与其受体结合，使用了一种称为RRA的体外技术。在合成中，如实施 例13中所述获得的被免疫小鼠的血清与包含100mL人胎盘膜和20mL I125-TGFa(100000 cpm)以及330mL緩沖液(pBN7.4， 10mM Tris曙Cl， 10mM MgCl2和1°/。 BSA)的混合物一起温育。使用氯胺T方法(Hunter 和Greenwood (1962)， Nature, 358:495-498)将TGFa偶联至放射性同 位素I125。混合物于室温下温育1小时并用lmL之前提到的緩冲液终 止反应。最后将试管于1000rpm离心30分钟。洗涤沉淀并晾干。用 Y发射计数器(Wallac，芬兰)检测放射性。放射性测量值的减少表明由于被测血清的作用，TGFa与其受体的结合被抑制。在所有被测血 清中抑制百分比为50%-80%。
实施例17:测定通过用TGFa-P64K蛋白免疫而产生的抗人EGF (hEGF)体液应答。
使用所述的间接ELISA技术在显示高抗TGFa抗体滴度的小鼠 血清中检测抗EGF抗体的存在。向包被有hEGF(CIGB)的板内加入 1/100 、 1/1000和1/10000稀释的血清。图6显示了用TGFa-P64K蛋 白免疫的小鼠血清中获得的抗EGF抗体滴度。仅在一组被免疫小鼠 中获得了阳性抗EGF抗体应答。
然而用 一种化学结合物EGF-P64K免疫的小鼠未显示任何水平的 抗TGFa抗体。
实施例18:通过用TGFa-P64K蛋白/不完全弗氏佐剂(Montanide ISA 51)免疫而获得的多克隆抗血清抗hTGFa在体外对人类胂瘤的 识别。
将使用TGFa-P64K蛋白与Montanide ISA 51免疫小鼠获得的多 克隆抗血清抗hTGFa用于检测包埋在石蜡中的肿瘤活检组织中的 TGFa表达。这些活检组织获自接种了基于EGF的疫苗的患者。在一 名有高抗hEGF抗体反应的患者身上，观察到了 NSCLC胂瘤的消退。 然而，后来检测到了喉部的第二胂瘤。分析这两个胂瘤的活检组织并 观察到每一个肿瘤中EGF和TGFa的差异性表达。图7中显示的是 不同抗体的反应性值。这些结果证实了用含TGFa-P64K的疫苗制剂 进行免疫会产生能识别人体肺瘤中hTGFa的抗hTGFa特异性抗体这 一事实。
实施例19:乳腺癌活检组织中EGF、 TGFa和EGF-R的mRNA表达。
使用TRIZOL试剂(Life technologies)从乳腺癌肺瘤活检组织中分 离信使核糖核酸(mRNA)并通过逆转录酶转换为cDNA。使用对于这 些分子中每一种的特异性引物对总cDNA进行30个PCR循环。用一 个管家基因(GAPDH)作为内对照。获得的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离并用溴化乙锭来观察。
图8显示了在22个乳腺癌中使用对EGF、 TGFa、 EGF-R和 GAPDH (内对照)的特异性引物获得的结果。只在1/22的活检组织 中观察到了 EGF mRNA,而在大多数样品中观察到TGFot和EGF-R mRNA的高表达。这两个分子表达之间的高度相关性提示 TGFa/EGF-R自分泌环在这类胂瘤生长中的重要性(图9)。
附图简要说明


图1:成熟hTGFa的基因和氨基酸序列(黑体下划线字母)。 图2:表达载体pMTGFa获得过程图解。
图3:通过蛋白质印迹技术，抗P64KMab( A)和抗hTGFaMab (B )对TGFa-P64K融合蛋白的识别。对P64K( 1 )、 EGF-P64K ( 2 ) 和TGFoc-P64K ( 3 )进行10%SDS-PAGE。然后将蛋白转移至硝酸纤 维素膜并与抗P64K ( A)或TGFa (B)的特异性抗体一起温育，以 表征TGFa与P64K的融合蛋白。
图4:抗hTGFa抗体反应动力学通过间接ELISA技术测定抗 hTGFa特异性抗体滴度。用与Montanide ISA 51混合的相当于 5pg(A)、 10pg(B)和50pg(C) hTGFa的TGFa-P64K蛋白免疫小鼠。x 轴代表从每只小鼠收集样本的天数，y轴代表所达到的抗体滴度的倒 数。免疫的天数在图A中用箭头指出(0、 14、 28和42天)。
图5:用相当于50iigTGFa的融合蛋白进行免疫诱导产生的IgG 亚群分布。使用TGFa-P64K蛋白经皮下(1)或肌内(2)免疫所诱 导的抗体反应中IgG亚群比例的比较。对每组5只免疫动物，图中显 示标准偏差值。
图6:用TGFa-P64K融合蛋白免疫的小鼠中的抗EGF特异性抗 体反应。图表中显示的是在用TGFa-P64K免疫的小鼠中达到的抗 hTGFa和抗EGF抗体的滴度。
图7:通过对EGF疫苗II期临床试验中接受疫苗接种的患者胂瘤 活检组织的免疫组化分析来测定EGF-R、 EGF和TGFa的表达。这三种分子在肺原发肿瘤和后出现的喉部第二原发瘤中的差别活性，在 图中用加号显示。
图8: EGF、 hTGFa和EGF-RmRNA在22个乳腺癌中的表达。 该图显示了用对每种分子特异性的引物获得并在1.5%的琼脂糖凝胶 上分离后用溴化乙锭观察到的30个PCR循环的产物。GAPDH mRNA 表达作为内对照，也可以看到。
图9:乳腺癌活检组织中hTGFa和EGF-R mRNA水平之间的关 系通过一个计算程序(ImagQuant, Amersham)分析用溴化乙锭获 得的条带强度。x轴显示对于每个样品用对EGF-R特异性的引物获得 的PCR产物的强度值与用GAPDH获得的强度值之间的关系(相对强 度)，y轴是对hTGFa相同的相对强度值。在这两种分子的表达之间 观察到了确实的相关性(R2=0.657， P-0.00121 )。
权利要求
1.引发抗自身TGFα的特异性免疫应答的疫苗组合物，其中所述组合物包含自身TGFα或其任何衍生物作为活性成分以及合适的佐剂。
2. 根据权利要求1的疫苗组合物，其包含人重组TGFa。
3. 根据权利要求1和2的疫苗组合物，其包含单独的或与其它 EGF-R配体相组合的自身TGFa作为活性成分。
4. 根据权利要求1-3的疫苗组合物，其中作为活性成分的自身 TGFa和EGF-R配体可任选通过化学结合或通过遗传方式偶联至载体 蛋白。
5. 根据权利要求4的疫苗组合物，其包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌 的P64K蛋白作为载体蛋白。
6. 根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFa和来自脑膜炎奈 瑟菌的P64K蛋白之间的化学结合物作为活性成分。
7. 根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFa和来自脑膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之间的化学结合物作为活性成分，还包含EGF。
8. 根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFa和来自脑膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之间的重组融合蛋白作为活性成分。
9. 根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFa和来自脑膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之间的重组融合蛋白作为活性成分，其中所述 P64K蛋白的N末端有一个六个组氨酸的尾。
10. 根据权利要求9的疫苗组合物，其包含TGFa、来自脑膜炎 奈瑟氏球菌的P64K蛋白和EGF之间的重组融合蛋白作为活性成分。
11. 根据权利要求1-10的疫苗组合物，其包含不完全弗氏佐剂 作为佐剂。
12. 根据权利要求1-10的疫苗组合物，其包含Al(OH)3作为佐剂。
13. 治疗表达TGFa或任何EGF-R配体的上皮性来源肿瘤恶性疾病的方法，其中使用权利要求1- 12中任何一项所述的疫苗组合物。
14.根据权利要求13的方法，用于治疗胂瘤，如肺、乳腺、前列 腺、胃和卵巢的表皮样癌，其中使用权利要求1-12中任何一项所述 的疫苗组合物。
全文摘要
本发明涉及一种含有转化生长因子α的疫苗组合物。本发明涉及能够产生针对自身TGFα的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含TGFα及其任何衍生物作为活性成分，以及适宜的佐剂。所述疫苗制剂还可包括TGFα和其它生长因子如表皮生长因子(EGF)的组合，从而抑制其进展依赖于所述因子的肿瘤的增殖。使用所述组合物可控制表皮样癌的生长和增殖。
文档编号A61K39/385GK101406692SQ20081008766
公开日2009年4月15日 申请日期2001年12月6日 优先权日2000年12月6日
发明者A·奥瓦雷斯阿科斯塔, A·穆莱谢拉, B·桑切斯拉米雷斯, G·E·吉伦涅托, G·M·冈萨雷斯马里内罗, R·佩雷斯罗德里格斯, T·梅南德斯麦迪纳 申请人:分子免疫中心