专利名称：：一种用于治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物型杀菌制剂，具体地说，涉及一种用于治疗哺乳动物子宫内膜炎的生物制剂。
背景技术：
：子宫内膜炎是哺乳动物如奶牛、猪等常见的生殖器官疾病，是造成母畜不孕的主要原因之一。严重地影响母畜的繁殖和经济效益。其主要病因是人工授精、分娩或助产时消毒不严，产后护理不当等侵入细菌引起感染，此外阴道炎、子宫脱出、胎衣不下等，都可继发子宫内膜炎。其主要症状有急性一般发生于流产后或产生胎衣不下时，体温升高，食欲减退，精神沉郁。严重时，拱背，努责，常作排尿状，慢性由急性继发而来，发情周期不正常。目前国内外对母畜子宫内膜炎的治疗仍以抗生素为主，但是抗生素治疗存在许多不利因素。如(1)容易使细菌产生耐药性；(2)单一药物抗菌谱不广；(3)容易造成抗生素残留；(4)其它副作用。例如，患子宫内膜炎的奶牛经过抗生素治疗以后，会导致牛奶中的抗生素残留，将这些使用过抗生素的奶牛所挤出的牛奶混入食用牛奶中造成的后果是极其严重的。联合国粮农组织(FA0)和世界卫生组织(WHO)建议，在奶牛接受抗生素治疗停药后至少3天(最好停药5-7天)内挤出的奶汁不直接作为食用的奶原料。存在于奶中或肉内的残留物，可引起人们的过敏反应，也可使人发生皮疹等。抗生素在奶中的残留，作为重大的社会公害，在欧美国家早已禁止上市，且实施残留期挤出的牛奶全部丢弃的管理办法。如美国的食品和药品局(F.D.A)规定，每毫升牛奶中的抗生素的含量不得超过0.006国际单位，使用抗生素的牛奶在96小时内应废弃。目前各国颁布的《食品卫生法》均规定，使用抗生素治疗乳房炎的牛奶，5天内不得作为食品销售。发达国家还对各场产鲜奶每月抽查一次，如发现残留抗生素者罚，同时规定兽医使用抗生素时必须告之畜主不得将鲜奶出售食用的期限，否则一旦查出兽医应负责任。中医、中兽医学应用天然药物(中草药)来治疗人类和动物的疾病，现被誉为天然医学。如中国专利CN1302634A(治疗子宫炎症的药)，但是由于中药的药效作用慢，以致病情迁延不愈，或反复发作，因而临床使用效果并不好。美国专利US4692452(Methodfortreatmentofendometritisinmammalianfemales)，报道了用化学制剂治疗哺乳动物的子宫内膜炎，但是化学制剂往往对子宫内膜具有剌激性，会造成子宫内膜纤维化，以致于形成疤痕，不利于奶牛进一步的配种受孕。溶葡萄球菌酶是Schindler禾口Schuhard1964年首次从St即hylococcussimul雄培养基中发现，含246个氨基酸。其作用机制是裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽键桥，从而破坏细胞壁的完整性并使菌体溶解，是一种肽链内切酶，具有直接的杀菌作用。药效学试验研究证明，溶葡萄球菌酶对MSSA、MRSA、产酶金黄色葡萄球菌、不产酶金黄色葡萄球菌均有强杀菌作用，且杀菌活性相近，MIC50和MIC90分别为0.25和1g/ml。其杀菌活性强于环丙沙星、磺胺嘧啶银、头孢噻肟等抗菌剂。3溶菌酶为细菌胞壁溶解酶、酵母菌胞壁溶解酶、霉菌胞壁溶解酶中的一种或一种以上；所用的溶菌酶是从蛋清中提取的活性成分，是符合中国药典标准的原料药，溶菌酶是通过作用于胞壁中的P-l，4糖苷键或P-l，3葡聚糖而杀死细菌。溶葡萄球菌酶和溶菌酶具有独特的杀菌机理，使其不同于一般的抗生素。抗生素的作用一般是抑制细菌生长，促使细菌产生新的耐药质粒或新酶来阻止抗菌素的作用。而这些酶则是裂解并杀死细菌，作用时间短，细菌不容易产生耐药性，同时杀菌效果好，能专一性的作用于目的微生物的细胞壁，对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等都有抗菌作用，而对没有细胞壁的动物体细胞不会产生不利影响，因而安全性很高。由于近年来在动物饲养过程中因抗生素的滥用导致的食品安全问题越来越突出，如何既保障动物食品的安全又使动物的生产性能能够正常发挥，作为一种对人和动物都安全的抗菌制剂，溶葡萄球菌酶和溶菌酶逐渐受到人们的重视，并被应用于动物生产。杨为荣(溶菌酶治疗奶牛产后子宫内膜炎试验，乳业科学与技术，2001(4):44-46)采用溶菌酶注射治疗奶牛子宫内膜炎，结果表明溶菌酶对子宫内膜炎的总治愈率、治疗后子宫恢复程度均较抗生素治疗的效果好。对子宫内膜炎的总治愈率达82.35%88.24%，明显高于金霉素的治愈率(56.25%)。因给药方式是将溶菌酶直接溶解于生理盐水，子宫内灌注给药，总治愈率还不太高，溶菌酶的使用量偏大，而且使用较为不便。中国专利ZL03142299.3(—种用于预防和治疗奶牛子宫内膜炎的制剂及其制备方法)，公开了用溶葡萄球菌酶、溶菌酶、抑菌肽和医学上可接受的载体制成的制剂，可以预防和治疗奶牛子宫内膜炎。
发明内容发明人已经在前期的研究工作中，从患乳房炎和子宫内膜炎奶牛的奶或子宫黏液中分离菌株，在体外用重组溶葡萄球菌酶、苯唑西林、氨苄西林、庆大霉素进行了杀菌试验，结果表明重组溶葡萄球菌酶对奶牛乳房炎和子宫内膜炎分离的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有良好抑杀效果，对链球菌(包括无乳链球菌和停乳链球菌)和牛源多杀巴氏杆菌具有一定的抑杀效果，对苯唑西林、氨苄西林、庆大霉素耐药菌株同样具有良好抑杀效果(黄青山等，重组溶葡萄球菌酶对奶牛乳房炎和子宫内膜炎常见病原菌的体外杀菌试验.中国兽药杂志，2007，41(8):41-47)。本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种用于治疗哺乳动物子宫内膜炎的生物杀菌栓剂，以克服现有技术存在的杀菌效果不理想、在子宫内存留时间短、与粘膜滑液的相互作用弱，不利于渗入到阴道黏膜的缺点。本发明需要解决的技术问题之二是提供该种栓剂的制备方法。本发明的发明构思是这样的本发明的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂，其组成及重量百分含量为溶葡萄球菌酶O.001%-0.1%，溶菌酶0.1_10%，海藻酸钠0.1_10%，聚氧乙烯硬脂酸酯80.0-99.6%。所述及的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂还可包含重量百分比为0_1%的洗必泰o所述及的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂，其优选配方的组成及重量百分比为4溶葡萄球菌酶O.001%-0.1%，溶菌酶0.1_10%，海藻酸钠0.1_5%，洗必泰0.1-0.5%，聚氧乙烯硬脂酸酯85.0-99.6%。所述及的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂的制备方法包括如下步骤(1)含有溶葡萄球菌酶和溶菌酶微球的制备将溶葡萄球菌酶、溶菌酶加入到海藻酸钠溶液中混合，加入到5%氯化钙溶液中，形成微粒，过滤得到含有溶葡萄球菌酶和溶菌酶的微球，冷冻干燥；(2)栓剂的制备按上述比例称取聚氧乙烯硬脂酸酯加热溶解，将步骤(1)制备好的微球按上述比例加入到溶化的聚氧乙烯硬脂酸酯中，倒入栓剂模具中成型。溶葡萄球菌酶和溶菌酶(下述简称溶葡萄球菌酶复合酶)为抑杀菌成分，可以有效杀灭引起子宫内膜炎的各种病原菌；海藻酸钠为赋形剂，并且还具有缓释功能，使得溶菌酶能够在子宫内缓慢释放达到更好的治疗效果。聚氧乙烯硬脂酸酯为赋形剂。这种栓剂在子宫内首先液化，然后海藻酸钠颗粒在子宫内缓慢液化并逐步释放溶葡萄球菌酶和溶菌酶，具有在子宫内缓慢释放的优点，同时在加工的过程中由于先将复合酶经海藻酸钠包裹，使得在制备栓剂的过程中复合酶的活性可以有效地保持。本发明公开的溶葡萄球菌酶复合酶栓剂具有如下特点1、本制剂在动物子宫内存在的时间长，在给药后48小时，子宫粘液中还保留了很高的杀菌活性，基本上给药1-2次就可以有效预防和治疗动物子宫内膜炎。2、杀菌效果强。该制剂对哺乳动物子宫致病菌具有很强的杀菌作用。体外实验可以有效杀灭革兰氏阳性菌和阴性菌。2、稳定性强。本品在25t:常温保存2年，生物活性基本没有改变。在制剂的储存和运输方面优于冻干粉。3、本发明为生物制剂，克服了传统化学类制剂对子宫粘膜具有剌激性，细菌容易产生耐药性的缺点。易被机体所接受，且没有任何毒副作用。4、本制剂采用局部用药的方式，给药方便。与冻干粉相比不需要另外溶解，给药更方便。具体实施例方式实施例1溶葡萄球菌酶栓剂制备方法1(配方1)1、组成和配比溶葡萄球菌酶0.001%、溶菌酶0.1%、海藻酸钠0.1%、洗必泰0.5%、聚氧乙烯硬脂酸酯99.299%。2、配制(1)首先将2克溶菌酶和20mg溶葡萄球菌酶、2克海藻酸钠和1克洗必泰加入到100mL水溶液中混合均匀，滴加到5%氯化钙溶液中，形成微粒，过滤后经冷冻干燥制得微粒。(2)将微球置于生理盐水中，37t:放置6-8小时检测溶液中的溶菌酶的量(检测方法参照文献刘源岗等，溶菌酶的活性测定，食品科技，2005，10)，计算出微球中含有的溶葡萄球菌酶和溶菌酶的包封率。根据包封率计算需要加入的微粒的量，然后取适量微粒加入到溶化的聚氧乙烯硬脂酸酯中。5(3)称取聚氧乙烯硬脂酸酯99.299g加热到6(TC溶解，然后将制备好的微粒0.701克加入到溶解好的聚氧乙烯硬脂酸酯中，迅速倒入栓剂模具中成型即可。实施例2溶葡萄球菌酶栓剂制备方法2(配方2)1、组成和配比溶葡萄球菌酶0.05%、溶菌酶2%、海藻酸钠1%、洗必泰0.3%、聚氧乙烯硬脂酸酯96.65%。2、配制(1)首先将2克溶菌酶和50mg溶葡萄球菌酶、1克海藻酸钠和0.6克洗必泰加入到100mL水溶液中混合均匀，滴加到5%氯化|丐溶液中，形成微粒，过滤后经冷冻干燥制得微粒。(2)同实施例1测定制备好微粒的包封率，根据包封率计算需要加入的微粒的量，然后取适量微粒加入到溶化的聚氧乙烯硬脂酸酯中。(3)称取聚氧乙烯硬脂酸酯96.65g加热到6(TC溶解，然后将制备好的微粒3.35克加入到溶解好的聚氧乙烯硬脂酸酯中，迅速倒入栓剂模具中成型即可。实施例3溶葡萄球菌酶栓剂制备方法3(配方3)1、组成和配比溶葡萄球菌酶O.1%;溶菌酶10%;海藻酸钠1%，聚氧乙烯硬脂酸酯88.9%。2、配制(1)首先将20克溶菌酶和200mg溶葡萄球菌酶、10克海藻酸钠加入到200mL水溶液中混合均匀，滴加到5%氯化钙溶液中，形成微粒，过滤后经冷冻干燥制得微粒。(2)同实施例1测定制备好微粒的包封率，根据包封率计算需要加入的微粒的量，然后取适量微粒加入到溶化的聚氧乙烯硬脂酸酯中。(3)称取聚氧乙烯硬脂酸酯88.9克加热到6(TC溶解，然后将制备好的微粒11.1克加入到溶解好的聚氧乙烯硬脂酸酯中，迅速倒入栓剂模具中成型即可。实施例4栓剂的溶出释放试验1、实验材料按上述配方1、配方2、配方3配制的栓剂，以常规的复合酶聚氧乙烯硬脂酸酯栓剂作为对照(配方4:含聚氧乙烯硬脂酸酯88.9%，溶菌酶10%，溶葡萄球菌酶0.1%)。配方4所含成分同配方3，但不制成海藻酸钠微粒。2、试验方法溶出度测定方法取配制好的栓剂1枚(约5.0克)，以lOmLO.9%生理盐水溶液为溶齐U，温度为37。C，转速为75r/min，分别于0、30min、60min、3h、6h、12h、24h、48h时取样，测定溶菌酶活力单位。并根据测得的栓剂中的溶菌酶的活力单位计算出各样品的溶出度。3、实验结果从表1可以看出配方1、2和3制备得到的溶葡萄球菌酶复合酶栓剂的体外缓释效果远远好于配方4，在48小时，三种栓剂才基本全部释放，而常规的栓剂基质在3小时就全部释放。表l3种复合酶栓剂与聚氧乙烯硬脂酸酯栓剂的体外释放效果的比较6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5栓剂的体外药效学试验1、试验器材试验菌株金黄色葡萄球菌(ATCC6538);大肠杆菌(ATCC11229)磷酸盐缓冲溶液(PBSO.03mol/lpH7.2)2、试验方法将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液。取上述菌悬液，用凉至4045t:的营养琼脂培养基(细菌)或沙氏琼脂培养基(酵母菌)15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后，将待测的栓剂切片(厚度约3-5mm)后贴到固体培养基得的表面，然后将平板置于35°C士2。C培养。栓剂的有效性通过有无抑菌圈和抑菌圈的大小来评价。抑菌圈的有无通过"+"，"_"来表示，另外"++"或"+++"分别表示抑菌圈大于10mm或大于15mm。3、试验结果从表2可以看出配方1、2和3制备得到的溶葡萄球菌酶复合酶栓剂都可以有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。证明上述3种栓剂的体外抑杀菌效果好。表23种溶葡萄球菌酶复合酶栓剂的体外抑菌效果比较配方金黄色葡萄球菌(ATCC6538)大肠杆菌(ATCC11229)1+++++2+++++3+++++不含有溶葡萄球菌酶复合酶的空白配方--实施例6溶葡萄球菌酶复合酶栓剂的稳定性试验1、试验器材试验菌株金黄色葡萄球菌(ATCC6538);磷酸盐缓冲溶液(PBSO.03mol/lpH7.2)2、试验方法将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液。取被试样品(含有复合酶的栓剂)和对照样片(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4片，分成4组置于4个灭菌三角烧瓶。取上述菌悬液，经过103稀释后计数，然后接种到三角烧瓶，每瓶接种20mL，分别将样片加入到烧瓶中，置于35°C士2t:培养18-20小时，后检测0D600，计算抑菌率。X=(0D600空白组-0D600实验组)/0D600空白组X100%3、试验结果从表3可以看出复合酶栓剂在25t:存放24个月后对金黄色葡萄球菌杀灭活性没有发生变化。表325t:存放24个月后对金黄色葡萄球菌杀灭效果保存温度及时间(。c、月)对照组平均菌落数及范围(cfu/片)不同配方的杀灭率123空白2515.20X10510010010002515,80X10510010010002526.20X10510010010002533.50X10510010010002567.10X105100100100025124.50X105100100100025182.60X105100100100025246.60X105100100100025365.30X1051001001000注阴性对照组无细菌生长。实施例7溶葡萄球菌酶复合酶栓剂在奶牛子宫内的代谢1、试验材料溶葡萄球菌酶复合酶栓剂试验菌株金黄色葡萄球菌(ATCC6538);磷酸盐缓冲溶液(PBSO.03mol/lpH7.2)2、试验方法将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液，经过103稀释后备用。患病奶牛子宫内给溶葡萄球菌酶复合酶栓剂后，分别于1、3、6、12，24、48小时检测粘液的抑菌活性。取给药后不同时间分离到子宫内分泌的粘液各0.5克，加入到4.5mL含有试验菌的培养基中，置于35°C士2t:培养18-20小时，后检测0D600，计算抑菌率。X=(0D600空白组-0D600实验组)/0D600空白组X100%3、试验结果实验结果表明，溶葡萄球菌酶复合酶栓剂经奶牛子宫给药后，可以在奶牛子宫内保留较长的时间，给药后48小时粘液中还保持了一定的杀菌活性。表4溶葡萄球菌酶复合酶栓剂给药后不同时间子宫粘液的杀菌活性的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例8溶葡萄球菌酶复合酶栓剂对奶牛子宫内膜炎的作用效果1、慢性子宫内膜炎病牛症状以阴道排出脓性分泌物为主要临床症状，病牛从阴门排有灰白色或黄褐色稀薄脓液，故在尾根、阴门及飞结处粘有阴道排出物或干痂。阴道检查可见阴道黏膜和子宫腹部充血，子宫颈肿胀、松弛张开，宫颈口附有脓性分泌物；直肠检查发现子宫角增大，收縮反应微弱，缺乏弹性，宫壁增厚变硬，子宫蓄积炎性分泌物时，则有轻微波动感。2、试验药物溶葡萄球菌酶复合酶栓剂；利土剂组。3、试验方法在奶牛繁殖年度，选择分娩后2040天确诊患有慢性子宫内膜炎的奶牛供试验用，根据治疗顺序，将其随机分为"溶葡萄球菌酶复合酶"组和"利土剂"组。溶葡萄球菌酶复合酶组每次使用1枚溶葡萄球菌酶复合酶栓剂直接放入奶牛子宫，隔一天给药一次。利土剂组利土剂药液100mL(利凡诺0.5g、土霉素碱2g溶于100mL生理盐水中)直接注入子宫内，隔日l次，连续34次为l个疗程。4、治疗效果判定标准治愈阴道排出的黏液透明无异味，其他临床症状消失，恢复正常发情周期，且配种后23个月直检确定妊娠。有效子宫明显软化，收縮性强，其他症状减轻，但发情配种后未妊娠。无效与治疗前比较无明显变化。5、试验结果表5溶葡萄球菌酶复合酶组与利土剂组治疗效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表5可以看出，用溶葡萄球菌酶复合酶治疗奶牛子宫内膜炎(以慢性脓性和卡他性脓性为主)效果比传统的利土剂治疗法有明显提高，治愈率前者比后者提高30个百分点以上。权利要求一种用于治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂，其特征在于，以制剂的总重量计，组分包括溶葡萄球菌酶0.001％-0.1％，溶菌酶0.1-10％，海藻酸钠0.1-10％，聚氧乙烯硬脂酸酯80.0-99.6％。2.根据权利要求1所述的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂，其特征在于，制剂组分中还包括0-1%重量百分比的洗必泰。3.根据权利要求2所述的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂，其特征在于，以制剂的总重量计，溶葡萄球菌酶O.001%-0.1%，溶菌酶0.1_10%，海藻酸钠0.1_5%，洗必泰0.1-0.5%，聚氧乙烯硬脂酸酯85.0-99.6%。4.根据权利要求l-3任一所述的治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)含有溶葡萄球菌酶和溶菌酶微球的制备将溶葡萄球菌酶、溶菌酶加入到海藻酸钠溶液中混合，加入到5%氯化钙溶液中，形成微粒，过滤得到含有溶葡萄球菌酶和溶菌酶的微球，冷冻干燥；(2)栓剂的制备按上述比例称取聚氧乙烯硬脂酸酯加热溶解，将步骤(1)制备好的微球按上述比例加入到溶化的聚氧乙烯硬脂酸酯中，倒入模具中成型。全文摘要本发明公开了一种用于治疗哺乳动物子宫内膜炎的栓剂及其制备方法。以制剂的总重量计，组分包括溶葡萄球菌酶0.001％-0.1％；溶菌酶0.1-10％；海藻酸钠0.1-10％，聚氧乙烯硬脂酸酯80.0-99.6％。该制剂采用局部给药方式，能有效治疗哺乳动物子宫内膜炎，杀菌效果强，稳定性好，并且在加工的过程中由于先将溶菌酶和溶葡萄球菌酶经海藻酸钠包裹，使得在制备栓剂的过程中两种酶的活性可以有效地保持，能够在子宫内缓慢释放，达到更好的治疗效果。文档编号A61K9/02GK101766813SQ20081020823公开日2010年7月7日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者李国栋,黄晋江,黄青山申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司