专利名称：：一种治疗水痘的药物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种治疗水痘的药物及其制备方法，属于血液制品领域。
背景技术：
：水痘-带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)感染引起的疾病。VZV感染是儿童期常见的疾病，可通过呼吸道分泌物传播，传染性强。健康儿童感染多症状轻微，但在某些特殊人群如免疫功能不全者会导致皮损异常大的播散性感染、继发性A群链球菌和金黄色葡萄球菌等条件致病菌的感染及肺、脑、肝、肾、心、眼等脏器损伤等并发症，甚至死亡。随着器官移植与社会人口老年化的进程，VZV感染会很常见，也是亟待解决的问题。虽然水痘疫苗可以有效预防水痘的发生，但全世界仍有很多人未接种水痘疫苗，因此，可以治疗水痘的药物仍然为本领域研究重点之一。欧洲药典公开了规格为25IU/ml的水痘人免疫球蛋白静脉注射剂，采用筛选自然感染人群恢复期血浆为原料制备而得，用于水痘的预防。目前，未见有能够有效治疗水痘的药物的相关报道。
发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能够有效治疗水痘的药物。本发明治疗水痘的药物是以水痘人免疫球蛋白为主要活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂；其中，所述的水痘人免疫球蛋白采用人体进行水痘疫苗免疫后所得血浆为原料制备而得。其中，上述人体进行水痘疫苗免疫后所得血浆中水痘病毒抗体效价》8IU/ml。所述的血浆的来源如下1、使用冻干水痘减毒活疫苗对献血员进行免疫注射。3个月后再次对献血员进行加强免疫注射。2、收集献血员加强免疫注射3个月后的血浆，并测定血浆中水痘病毒抗体效价，水痘病毒抗体效价》8U/ml的血浆为合格血浆。进一步的，本发明治疗水痘的药物，其水痘人免疫球蛋白的制备方法包括如下步骤a、融化血浆将水痘病毒抗体效价》8IU/ml的原料血浆于04。C融化；b、组分分离用质量百分含量为0.9%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4555g/L，调节pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应过程温度控制在-2.5±0.5°C，离心分离上清液，即得FI反应液；c、过滤将FI反应液调节pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇终浓度为20%，将反应液温度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附杂质，搅拌、静置、过滤，所得沉淀即为FII+III沉淀；d、沉淀溶解将FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化钠溶液溶解，调节溶液pH值至5.10±0.05，调节溶液离子强度为O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为17%，控制溶液温度为-4.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，所得滤液即为FII滤液；e、滤液沉淀FII滤液中加入氯化钠溶液，调节溶液离子强度为0.05，调节溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为25%，每升乙醇补加lmol/L氯化钠溶液0.05L，控制最终反应液温度为一7.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，即得FII沉淀；f、层析FII沉淀用注射用水溶解后过滤，滤液用注射用水透析脱醇，然后用阴离子交换凝胶层析纯化，得到IgG溶液；g、超滤将IgG溶液超滤，所得超滤液4倍浓縮，然后用注射用水调节超滤液中蛋白浓度为15士5g/L，用0.5mol/L的盐酸调节超滤液pH值至4.8士0.1、电导率不超过350uS/cm;h、巴氏灭活病毒将g步骤所得溶液于60士0.5i:水浴中连续加温10小时；i:低PH孵放灭活病毒将h步骤灭活病毒后的蛋白溶液过滤、澄清、再次超滤，浓縮或冻干即得。其中，上述制剂的剂型优选为静脉注射剂。进一步的，所述静脉注射剂的规格为50IU/ml，40ml。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述静脉注射剂的制备方法，该方法包括如下步骤a、融化血浆将水痘病毒抗体效价》8IU/ml的原料血浆于04。C融化；b、组分分离用质量百分含量为0.9%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4555g/L，调节pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应过程温度控制在-2.5±0.5°C，离心分离上清液，即得FI反应液；c、过滤将FI反应液调节pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇终浓度为20%，将反应液温度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附杂质，搅拌、静置、过滤，所得沉淀即为FII+III沉淀；d、沉淀溶解将FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化钠溶液溶解，调节溶液pH值至5.10±0.05，调节溶液离子强度为O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为17%，控制溶液温度为-4.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，所得滤液即为FII滤液；e、滤液沉淀FII滤液中加入氯化钠溶液，调节溶液离子强度为0.05，调节溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为25%，每升乙醇补加lmol/L氯化钠溶液0.05L，控制最终反应液温度为一7.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，即得FII沉淀；f、层析FII沉淀用注射用水溶解后过滤，滤液用注射用水透析脱醇，然后用阴离子交换凝胶层析纯化，得到IgG溶液；g、超滤将IgG溶液超滤，所得超滤液4倍浓縮，然后用注射用水调节超滤液中蛋白浓度为15士5g/L，用0.5mol/L的盐酸调节超滤液pH值至4.8士0.1、电导率不超过350uS/cm;h、巴氏灭活病毒将g步骤所得溶液于60士0.5i:水浴中连续加温10小时；i:低PH孵放灭活病毒将h步骤灭活病毒后的蛋白溶液过滤、澄清、再次超滤，然后用0.5mol/L的盐酸调整蛋白溶液pH值为3.84.4、水痘病毒抗体效价》50IU/ml，补加麦芽糖至麦芽糖质量浓度为10%，过滤除菌，然后于2325。C放置21天；j:成品分装按所需规格分装、即得。其中，a步骤中所用的原料血浆应采用国家批准的诊断试剂进行传染性病原微生物标志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗体、HIV(1+2)抗体、梅毒、ALT等复核检査，结果应为阴性。剔除不符合要求的血浆，严格防止在融浆操作过程中不符合要求的血浆袋与正常血浆交叉污染。装血浆的血浆袋表面应消毒，然后破袋、融化血浆。其中，b步骤用质量百分含量为O.9%的氯化钠溶液稀释血浆蛋白的目的是增加c步骤沉淀中IgG的含量。其中，b、c、d步骤中调节pH值所用的pH值调节剂可以为常规的静脉注射液pH值调节剂，优选为pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。其中，为了c步骤中硅藻土的吸附效果最好且不浪费硅藻土以节约成本，硅藻土加入量优选为每升溶液18g。其中，d步骤为了使沉淀中的组分IgG充分溶解，沉淀溶解选用用6-12倍W/V的0.01mol/L氯化钠溶液溶解。其中，e步骤加入lmol/L氯化钠溶液，并调整pH值至6.90士0.05，力阳5%的乙醇至终浓度为25%，其目的是提高高纯度IgG的收率。e步骤中调节pH值所用的pH值调节剂为lmol/L的NaHC03溶液其中，f步骤透析脱醇所用透析袋的截留分子量为30KD，f步骤层析时，采用PS370型阴离子交换凝胶柱，以PH值为6.7士0.3的磷酸盐缓冲液平衡层析柱，调整蛋白质浓度为1545g/L、pH值为6.7±0.3，上样，流速控制为40120cm/h，收集IgG，上样结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤层析柱上的残余IgG，与收集的IgG液合并。凝胶层析去除了溶液中绝大部分的杂蛋白与IgA，使流出液IgG的纯度》99。/。，IgG单体与二聚体的含量》97呢。其中，h步骤处理中间品时未加保护IgG的稳定剂，目的是强化灭活病毒效果；巴氏加热方法可灭活脂包膜与非脂包膜病毒，常规巴氏加热方法灭活产品的pH值为7.0，本发明中采用巴氏加热方法灭火病毒时溶液的pH值为4.8士0.1，可以提高灭活速率，其灭活病毒种类谱显著较单纯的低pH孵放法广泛(对非脂包膜病毒有效)。h步骤灭活病毒结果灭活HIV、VSV、Sindbis与Polio-l均2;4Log数量病毒。其中，i步骤中所述的再次超滤所用的超滤膜截留分子量为10KD。为了确保病毒灭活完全，i步骤进行低pH孵放灭活病毒，低pH孵放灭活病毒对HAV(甲型肝炎病毒，H印atitisAVirus)与人细小病毒B19(humanparvovirusB19)等非脂包膜病毒灭活效果较好。其中，j步骤所述的规格为50IU/ml，40ml。本发明所要解决的第三个技术问题是提供了上述药物在制备治疗或预防巨细胞病毒疾病的药物中的用途。本发明药物可以有效治疗水痘，还能用于治疗或预防巨细胞病毒疾病，为巨细胞病毒疾病的预防和治疗提供了一种新的途径，本发明方法制备的静注水痘人免疫球蛋白，其质量好、收率与纯度高(IgG的纯度》99。/。，IgG单体与二聚体的含量》97。/。)、病毒安全性高，具有广阔的应用前景。具体实施例方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例l水痘人免疫球蛋白的制备1、使用中国生物制品总公司长春生物制品研究所生产的O.5ml/支的冻干水痘减毒活疫苗对献血员进行免疫注射。3个月后再次对献血员进行加强免疫注射。2、收集献血员加强免疫注射3个月后的血浆，并测定血浆中水痘病毒抗体效价，水痘病毒抗体效价》8U/ml的血浆为合格血浆。3、生产前每袋血浆采用国家批准的诊断试剂进行传染性病原微生物标志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗体、HIV(1+2)抗体、梅毒、ALT等复核检査，结果应为阴性。剔除不符合要求的血浆，严格防止在融浆操作过程中不符合要求的血浆袋与正常血浆交叉污染4、血浆袋表面消毒、破袋、融化血浆温度至04。C，按低温乙醇蛋白分离法进行组分分离以9g/L氯化钠溶液稀释血浆蛋白质含量至4555g/L，调节pH值7.0±0.4，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%。将反应液温度控制在-2.5±0.5°C。5、将FI反应液调节pH值6.80士0.10，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为20%。将反应液温度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土，搅拌后过滤，收集的沉淀立即于-3(TC以下存放。6、FI+n+III沉淀物溶解后，调节pH值5.10±0.05，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为17%，控制反应液温度在-4.5±0.5°C。搅拌、静置后过滤。7、每升滤过液加入lmol/L氯化钠溶液O.04L，调节反应液pH值6.90±0.05，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为25%，每升乙醇补加lmol/L氯化钠溶液O.05L最终反应液温度控制在一7.5士0.5。C，搅拌静置后过滤，收集沉淀。8、FII沉淀物以注射用水溶解后过滤，滤过液以注射用水透析脱醇。采用阴离子交换凝胶层析，以P朋.7士0.3磷酸盐缓冲液平衡层析柱，调整蛋白质浓度1545g/L、p朋.7士0.3，上样，流速40120cm/h，使FII溶液流穿过层析柱，收集IgG。上样结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤层析柱上的残余IgG，与流穿液合并转入下工序。用l2mol/L氯化钠溶液洗脱吸附在层析柱上的杂蛋白，用0.2lmol/L氢氧化钠溶液再生。填充料满载时，再生使用不超过400个循环。9、层析后超滤，调整蛋白质浓度15士5g/L、pH4.8士0.1、电导率不超过350uS/cm后输入巴氏灭活罐。10、制品在60士0.5"C水浴中连续加温10小时，以灭活可能残留的污染病毒。11、灭活后再次超滤，调整PH3.84.4、水痘抗体效价不低于50IU/ml，除菌过滤，将制品于2325'C，放置21天，进行低pH孵放灭活病毒。灭活结束将制品转入28'C冷库存放原液经纯化、超滤、除菌过滤后即为水痘人免疫球蛋白原液。实施例2静脉注射用水痘人免疫球蛋白的制备用实施例1制备的水痘人免疫球蛋白原液配制静脉注射剂，使静脉注射剂中IgG含量不低于50g/L、水痘抗体效价不低于50IU/ml，并补加入麦芽糖至10%。在万级局部一百级洁净间进行分装，每瓶分装2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，含人血来源水痘抗体2000IU，效价不低于50IU/ml，装量40ml。试验例l静脉注射用水痘人免疫球蛋白的质量检测及结果静注水痘人免疫球蛋白，规格2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，代表数量2000瓶，抽检数量20瓶。检验依据参考静注乙型肝炎人免疫球蛋白国家注册标准YBS00102008。静注水痘人免疫球蛋白的质量检测及结果见表l。表l静脉注射用水痘人免疫球蛋白的质量检测及结杲<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例2水痘人免疫球蛋白以巨细胞病毒为靶抗原的特异性抗体效价测定1、试验目的由于特异性抗体效价的量与人免疫球蛋白中和相关病毒后的细胞蚀斑计数呈负相关关系，因此，如果本发明水痘人免疫球蛋白中所含的巨细胞病毒抗体效价能基本达到静注巨细胞病毒人免疫球蛋白特异性抗体效价水平，即可确定本发明水痘人免疫球蛋白能预防和治疗巨细胞病毒疾病。测定本发明水痘人免疫球蛋白含巨细胞病毒抗体效价，以静注巨细胞病毒人免疫球蛋白为阳性对照。2、材料与方法2.1免疫球蛋白2.1.1本发明7K痘人免疫球蛋白(Humanvaricellaimmunoglobulin,HVIG)，试制品，批号200605101，IgG含量:125.9g/L，规格2ml/瓶，检测效价13.28IU/ml。2.1.2静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(HumanCytomegalovirusImmunoglobulinforIntravenousAdministration,HCIG)，Lot:MIVCMV-198，IgG含量52g/L，规格10g/瓶失效期6-19-2006，检测效价76.82IU/ml。MassachusettsPublicHealthBiologicLaboratoriesUSA生产。2.2IgG酶联免疫试剂盒2.2.1水痘-带状疱疹病毒IgG酶联免疫试剂盒(VaricellaZosterVirusIgGELISA)，德国IBL-HamburgGmbH公司产品，批号VG-173。2.2.2巨细胞病毒IgG酶联免疫试剂盒(CytomegalovirusIgGELISA)，意大利DIESSE公司产品，批号142。2.3方法2.3.l检验条件与操作程序分别按IgG酶联免疫试剂盒的说明书进行。2.3.2受试品的稀释度使用IgG酶联免疫试剂盒配置的稀释液稀释受试品。通过效价初筛试验，分别取得每个IgG受试品适宜的一个稀释度。2.3.3受试品的0D均值每个相同的样品分别加入到8个定量酶标孔，统计得到的除去最高、最低2个值后6个0D值的均值。2.3.4标准曲线对数回归系数分别使用5个质控品的标示量与0D检测均值通过对数回归求得质控品的检测值，再使用该方程代入5个质控品的标示量分别计算出相应的校正0D值，使标准曲线对数回归系数》99.9%。2.3.5校正系数与校正值质控品抗体效价标示值/检测值=校正系数(F系数)，如果受试品的抗体效价检测值位于两个F系数相差较大的区间时，采用两个相邻的效价检测值校正系数之和/两个相邻的标示效价值之和X该受试品的检测效价值4亥受试品的F系数。每个受试品的效价检测值X校正系数二校正值(F值)。3、试验结果试验结果见表2。表2水疸、巨细胞病羞免疫球蛋白与相应靶抗原的待异性抗体效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从表2可以看出，本发明水痘人免疫球蛋白与巨细胞病毒人免疫球蛋白所含的巨细胞病毒抗体效价相近(分别为877、1477mlU/mg);此外，水痘人免疫球蛋白与巨细胞病毒人免疫球蛋白所含的水痘病毒抗体效价相当(分别为105.5、100mlU/mg)，所以确定水痘疫苗能诱发人体产生巨细胞病毒抗体。据此推测，本发明水痘人免疫球蛋白能够预防和治疗巨细胞病毒感染性疾病。权利要求1.一种治疗水痘的药物，其特征在于它是以水痘人免疫球蛋白为主要活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂；其中，所述的水痘人免疫球蛋白是采用人体进行水痘疫苗免疫后所得血浆为原料制备而得。2、根据权利要求l所述的治疗水痘的药物，其特征在于所述的人体进行水痘疫苗免疫后所得血浆中水痘病毒抗体效价》8IU/ml。3、根据权利要求2所述的治疗水痘的药物，其特征在于所述的水痘人免疫球蛋白的制备方法包括如下步骤a、融化血浆将水痘病毒抗体效价》8IU/ml的原料血浆于04。C融化；b、组分分离用质量百分含量为0.9%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4555g/L，调节pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应过程温度控制在-2.5±0.5°C，离心分离上清液，即得FI反应液；c、过滤将FI反应液调节pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇终浓度为20%，将反应液温度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附杂质，搅拌、静置、过滤，所得沉淀即为FII+III沉淀；d、沉淀溶解将FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化钠溶液溶解，调节溶液pH值至5.10±0.05，调节溶液离子强度为O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为17%，控制溶液温度为-4.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，所得滤液即为FII滤液；e、滤液沉淀FII滤液中加入氯化钠溶液，调节溶液离子强度为0.05，调节溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为25%，每升乙醇补加lmol/L氯化钠溶液0.05L，控制最终反应液温度为一7.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，即得FII沉淀；f、层析FII沉淀用注射用水溶解后过滤，滤液用注射用水透析脱醇，然后用阴离子交换凝胶层析纯化，得到IgG溶液；g、超滤将IgG溶液超滤，所得超滤液4倍浓縮，然后用注射用水调节超滤液中蛋白浓度为15士5g/L，用0.5mol/L的盐酸调节超滤液pH值至4.8士0.1、电导率不超过350uS/cm;h、巴氏灭活病毒将g步骤所得溶液于60士0.5i:水浴中连续加温10小时；i:低PH孵放灭活病毒将h步骤灭活病毒后的蛋白溶液过滤、澄清、再次超滤，浓縮或冻干即得。4、根据权利要求l所述的治疗水痘的药物，其特征在于所述制剂的剂型为静脉注射剂。5、根据权利要求4所述的治疗水痘的药物，其特征在于所述静脉注射剂的规格为50IU/ml，40ml。6、权利要求4所述的静脉注射剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤a、融化血浆将水痘病毒抗体效价》8IU/ml的原料血浆于04。C融化；b、组分分离用质量百分含量为0.9%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4555g/L，调节pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，反应过程温度控制在-2.5±0.5°C，离心分离上清液，即得FI反应液；c、过滤将FI反应液调节pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇终浓度为20%，将反应液温度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附杂质，搅拌、静置、过滤，所得沉淀即为FII+III沉淀；d、沉淀溶解将FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化钠溶液溶解，调节溶液pH值至5.10±0.05，调节溶液离子强度为O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为17%，控制溶液温度为-4.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，所得滤液即为FII滤液；e、滤液沉淀FII滤液中加入氯化钠溶液，调节溶液离子强度为0.05，调节溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇浓度为25%，每升乙醇补加lmol/L氯化钠溶液0.05L，控制最终反应液温度为一7.5士0.5。C，搅拌、静置、过滤，即得FII沉淀；f、层析FII沉淀用注射用水溶解后过滤，滤液用注射用水透析脱醇，然后用阴离子交换凝胶层析纯化，得到IgG溶液；g、超滤将IgG溶液超滤，所得超滤液4倍浓縮，然后用注射用水调节超滤液中蛋白浓度为15士5g/L，用0.5mol/L的盐酸调节超滤液pH值至4.8士0.1、电导率不超过350uS/cm;h、巴氏灭活病毒将g步骤所得溶液于60士0.5i:水浴中连续加温10小时；i:低PH孵放灭活病毒将h步骤灭活病毒后的蛋白溶液过滤、澄清、再次超滤，然后用O.5mol/L的盐酸调整蛋白溶液pH值为3.84.4、水痘病毒抗体效价》50IU/ml，补加麦芽糖至麦芽糖质量浓度为10%，过滤除菌，然后于2325。C放置21天；j:成品分装按所需规格分装、即得。7、根据权利要求6所述的静脉注射剂的制备方法，其特征在于b、c、d步骤中调节pH值所用的pH值调节剂为pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；e步骤中调节pH值所用的pH值调节剂为lmol/L的^Ht^溶液。8、根据权利要求6所述的静脉注射剂的制备方法，其特征在于c步骤中硅藻土的加入量为每升溶液18g。9、根据权利要求6所述的静脉注射剂的制备方法，其特征在于f步骤透析脱醇所用透析袋的截留分子量为30KD;i步骤中所述的再次超滤所用的超滤膜截留分子量为10KD。10、权利要求15任一项所述的药物在制备治疗或预防巨细胞病毒疾病的药物中的用途。全文摘要本发明涉及一种治疗水痘的药物及其制备方法，属于血液制品领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种能够有效治疗水痘的药物。本发明治疗水痘的药物是以水痘人免疫球蛋白为主要活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂；其中，所述的水痘人免疫球蛋白采用人体进行水痘疫苗免疫后所得血浆为原料制备而得。本发明药物还可用于治疗或预防巨细胞病毒疾病，具有广阔的应用前景。文档编号A61P31/22GK101361973SQ20081030464公开日2009年2月11日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者魏宪义申请人:四川远大蜀阳药业股份有限公司;魏宪义