专利名称：Aml的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗患有白血病，特别是急性髓性白血病(AML)，尤其是对常规的化学疗法具有耐受性的急性髓性白血病的温血动物，特别是人类的方法，包括向所述动物联合施用或一起施用治疗有效量的如本文所定义的式(I)化合物，以及可用于AML治疗的常规化合物或化合物混合物，特别是拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物或抗肿瘤抗生素，和任选地至少一种药用可接受的载体，用于同时、分开或相继使用；还涉及一种药物组合物和包括所述联合的商业包。
附图简述
图1Huvec，U937，TF-1和HL-60细胞系以及患者白血病细胞样品1、2、3、5和6的RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)结果，表明了存在或不存在VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2和β2-微球蛋白。
图2在加入外源VEGF情况下，通过台盼蓝染色排除法计数，测定24小时后TF-1细胞和HL-60细胞的存活率。
图3在有或者没有PTK787的情况下加入外源VEGF，通过台盼蓝染色排除法计数，测定24小时后TF-1细胞的存活率。
图4在加入不同浓度的PTK787后，通过总细胞杀死试验(total cell killassay)测定三种AML细胞系(HL-60，TF-1和K562)的白血病细胞存活率。
图5A通过台盼蓝染色排除法计数，在加入外源VEGF的情况下，患者白血病细胞存活率的提高。
B通过台盼蓝染色排除法计数，在加入PTK787的情况下，患者白血病细胞存活率的降低。
图6在加入PTK787的情况下用总细胞杀死试验测定72小时后患者白血病细胞的存活率。
图7在加入PTK787的情况下，用总细胞杀死试验测定72小时后阿糖胞苷(cytarabine)和米托蒽醌(mitoxantrone)对患者白血病细胞的LC 50值。
背景技术：
本文中所使用的术语“急性髓性白血病”涉及一种不受控制的、快速进行性的骨髓细胞生长，例如粒细胞以及红细胞系和巨核细胞系(megakaryotic)细胞和祖先细胞的生长。在患有AML的患者中，不成熟的骨髓细胞、红细胞系或巨核细胞系细胞在数量上严重地超过红细胞(红血球)，导致疲劳和出血，并且增加了对感染的易感性。即使使用进攻性化学治疗方案，在儿童以及成人中AML仍具有不良的预后。总存活率为40-60％。在重度骨髓抑制化学疗法之后的自体骨髓移植不能改变存活率，但在进攻性化学疗法之后的同种异体骨髓移植可以将存活率提高多达70％。令人遗憾的是，可获得的匹配的同胞供体是有限的。因此，需要有新的治疗AML的治疗对策。
据怀疑AML细胞表达VEGF，且AML的VEGF产生与AML的临床结果有关(ESJM de Bont等人，Br.J.Haematol.113296，2001)。本发明基于以下的假设，即白血病细胞除表达VEGF(血管内皮细胞生长因子)外，还可以表达功能性的VEGFR(血管内皮细胞生长因子受体)，而且VEGFR表达不仅参与提高白血病细胞存活率，而且涉及白血病细胞对于化疗剂的敏感性。响应来自白血病细胞的VEGF，骨髓中的内皮细胞可以释放出生长因子，这些生长因子通过旁分泌途径支持白血病细胞生长。如果某些白血病细胞获得了表达功能性VEGFR的能力，则可能产生自分泌循环。
VEGF，现在被称为VEGF-A，是被最好地研究和表征的血管发生诱导物中的一种。VEGF看来是一种内皮细胞迁移和增生的有效刺激物。VEGF可以与flt-1/VEGFR-1和flk-1/KDR/VEGFR-2结合，而不与flt-4/VEGFR-3结合，这些受体都属于酪氨酸激酶类受体。然而VEGFR-1和-2都以高亲合性与VEGF-A结合，VEGFR-2是激活促有丝分裂反应的主要受体，而VEGFR-1可能参与细胞迁移。
本文中所定义的式I化合物，尤其是PTK787(又名ZK222584)，是酪氨酸激酶抑制剂，其被设计成通过与VEGFR的ATP结合部位直接结合来抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)信号转导。该药物对于KDR最特异，但也可以抑制flt-1和flt-4，且对于其它酪氨酸激酶受体，包括c-kit也具有活性。PTK787抑制一些同位移植到小鼠中的人类恶性肿瘤的生长，包括A431表皮样癌、Ls174T结肠癌、HT-29结肠癌和PC-3前列腺癌，如J.Wood等人，Cancer Res.602178，2000中所述。PTK787对这些肿瘤细胞没有直接的作用，但确实降低了肿瘤组织中的血管密度，这提示在这些细胞中其主要的作用方式是抑制血管发生。
发明内容
令人意外地，现已发现本文中所定义的式I化合物，尤其是PTK787，当与AML治疗中所用的常规化合物联合时，可有效地抑制表达VEGF和/或VEGFR的AML细胞系和患者AML细胞的增殖，即使这些AML细胞对单独使用的常规化合物具有抗性也是如此。
因此，在本发明的第一个方面涉及一种治疗急性髓性白血病(AML)，尤其是对于常规的化学疗法有抗性的急性髓性白血病的方法，包括对需要治疗的温血动物，优选人类，联合施用或一起施用治疗有效量的用于治疗AML的常规化合物和式I化合物
其中r为0-2，n为0-2，m为0-4，R1和R2(i)是低级烷基或(ii)一起形成子式I*中的桥 该结合是通过两个末端碳原子实现的，或(iii)一起形成子式I**中的桥 其中环成员T1、T2、T3和T4中一个或两个是氮，而其余的在每个情况中是CH，且结合是通过T1和T4实现的；A、B、D和E各自独立的是N或CH，条件是这些基团中不超过2个基团是N；G是低级亚烷基、被酰氧基或羟基取代的低级亚烷基、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、氧杂(-O-)、硫杂(-S-)或亚氨基(-NH-)；Q是低级烷基；
R是H或低级烷基；X是亚氨基、氧杂或硫杂；Y是未取代或取代的芳基、吡啶基，或未取代或取代的环烷基；和Z是氨基、单-或双取代的氨基、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、醚化或酯化的羟基、硝基、氰基、羧基、酯化的羧基、烷酰基、氨基甲酰基、N-单取代-或N，N-双取代的氨基甲酰基、脒基、胍基、巯基、磺基、苯硫基、苯基-低级烷基硫基、烷基苯基硫基、苯磺酰基、苯基-低级烷基亚磺酰基或烷基苯基亚磺酰基，如果存在多于1个的基团Z，取代基Z是彼此相同的或不同的；且其中由波形线表征的键，如果存在的话，是单键或者双键；或其中1或多个N原子带有氧原子的所定义化合物的N-氧化物，或具有至少一个成盐基团的这种化合物的盐。
式I的化合物的定义中所使用的基团和符号具有WO 98/35958中所公开的含义，该公开文件在此引入本申请作为参考。特别地，在WO 98/35958中指定为优选的化合物在本发明中也是优选的。
本文中使用的术语“PTK787”是指式I的化合物，其中r，n和m各自是0，R1和R2一起形成子式I*的桥，A，B，D和E各自是CH，G是亚甲基，X是亚氨基，Y是4-氯苯基，且以波形表征的键是双键。
在AML治疗中与AML治疗所用的常规化合物一起或联用施用的优选的化合物是在上文中所定义的化合物PTK787。更优选，PTK787是以其琥珀酸盐的形式应用的。
根据本发明用于治疗AML的化合物还优选那些在EP 1 259 487、WO01/55114、EP 1 129 075、WO00/27820、EP 1 107 964、WO 00/09495、EP1 165 085、WO 00/59509、WO 02/090343、WO 01/85715、WO 01/85691、WO 02/092603、WO 03/040101和WO 03/040102中一般地或具体地公开的、提及的或一般地和具体地要求的化合物，它们的全部内容在此引入作为参考。
特别地，靶向、减少或抑制VEGF活性或生产的化合物是在下面文献中一般地和具体地公开的那些化合物、蛋白质、aptamer或单克隆抗体WO 98/45331、WO98/11223、WO 00/27819和EP0 769 947；M.Prewett等人，Cancer Research59(1999)5209-5218，F.Yuan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.93，pp.14765-14770，Dec.1996，Z.Zhu等人，CancerRes.58，1998，3209-3214，和J.Mordenti等人，Toxicologic Pathology，Vol.27，no.1，pp 14-21，1999；WO00/37502和WO 94/10202；AngiostatinTM(制管张素)，描述于M.S.O′Reilly等人，Cell 79，1994，315-328；EndostatinTM(内皮抑素)，描述于M.S.O′Reilly等人，Cell 88，1997，277-285；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体，例如RhuMab；或描述于US 6,168,778、US 6,147,204、US 6,051,698、US 6,011,020、US 5,958,691、US 5,817,785、US 5,811,533、US 5,696,249、US 5,683,867、US 5,670,637和US 5,475,096中的那些，例如，pegaptanib钠，也优选用于根据本发明的AML治疗。
应当理解在上述方法的讨论中，提及活性组分时还包括药学可接受的盐。如果这些活性组分具有，例如，至少一个碱性中心，它们可以形成酸加成盐。具有酸基(例如COOH)的活性组分还可以与碱形成盐。活性组分或其药用可接受的盐还可以以水合物的形式应用或包括用于结晶的其它溶剂。
本文中使用的术语“治疗”包括对患有AML或处于所述疾病的前期(pre-stage)或缓解后时期(post-remission stage)的患者的治疗。治疗可在所述患者中延迟疾病的进展，或局部或完全消除疾病。
特别优选的是根据本发明对于幼年生物的治疗。因此，在本发明的优选的方面涉及一种治疗急性髓性白血病(AML)，尤其是对于常规的化学疗法有抗性的急性髓性白血病的方法，包括对需要治疗的幼年人类施用治疗有效量的与上文中所定义的式I化合物，特别是化合物PTK787一起或联合给药的用于治疗AML的常规化合物。
用于治疗急性髓性白血病(AML)的常规化合物包括，但不局限于，拓扑异构酶II抑制剂，比如胺苯丫啶、鬼臼亚乙苷或表鬼臼毒噻吩糖苷，抗代谢物，比如阿糖胞苷、氨甲喋呤或巯基嘌呤，或抗肿瘤抗生素，比如米托蒽醌、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表柔霉素、高三尖杉酯碱或去甲氧柔红霉素。在本发明中考虑用于治疗AML的其它常规化合物是在治疗ALL(急性淋巴细胞白血病)当中通常使用的化合物，比如天冬酰胺酶、环磷酰胺、gemtuzumab(或任何其它CD 33单克隆抗体)、异环磷酰胺、巯乙磺酸钠、强的松、拓扑替康(topotecan)和长春新碱。在术语“常规化合物”下也包含所提及化合物的混合物，例如阿糖胞苷与米托蒽醌、胺苯丫啶、柔红霉素、鬼臼亚乙苷或去甲氧柔红霉素的联用，或阿糖胞苷与鬼臼亚乙苷和柔红霉素或米托蒽醌的联用。这样，本发明方法的特征在于三重或四重治疗，包括将式I的化合物与两种或三种用于治疗AML的常规化合物一起施用或联合施用。
优选用于本发明的常规化合物是胺苯丫啶、鬼臼亚乙苷、阿糖胞苷、柔红霉素和米托蒽醌及它们的混合物，特别是胺苯丫啶、阿糖胞苷和米托蒽醌。特别优选儿科使用的常规化合物。
将式I化合物与一种常规化合物或数种常规化合物一起施用或联合施用的方法可以进一步地包括一种或多种药用可接受的载体，并涉及同时、分开或相继使用这些化合物。
在本发明的另一方面涉及一种组合药物制剂，特别是如下意义上的“成套药盒”，即，如以上所定义的活性组分可以独立地给药，或通过使用具有不同量的组分的不同固定组合来给药，即，同时或在不同的时间点给药。这样，药盒的各部分可以，例如，同时或按时间顺序错开给药，即成套药盒的任一部分在不同的时间点以相等的或不等的时间间隔给药。非常优选时间间隔是如此选择的，即各部分的联用对所要治疗的疾病的作用要大于仅仅使用任一活性组分可得到的结果。在联合制剂中式I的活性组分的总量与活性组分——用于治疗AML的常规化合物——的比例是可以改变的，例如，以应付所要治疗的患者子群的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可归因于患者的年龄、性别、体重等等。特别优选考虑到儿科使用时的特殊要求的给药方案。优选，存在至少一种有益效果，例如，式I的化合物和常规化合物的效果的相互增强，特别是协同作用，例如超过加性效应，额外的有利效果，更少副作用，以一种或每一种活性组分的无效剂量施用的联合治疗效果，以及特别是式I的化合物和用于治疗AML的常规化合物的强协同作用。
相关技术领域的技术人员完全能够选择相关的试验模型以证明与用于AML治疗的常规化合物一起或联合施用的式I的化合物在上文中和在下文中提及的治疗AML的有益效果。单一化合物的活性或本发明的联合的活性，可在例如，合适的临床研究中或通过如下所述的实施例的方式加以证明。合适的临床研究是，例如，在晚期AML患者中(优选在幼年患者中)的开放非随机化剂量增加研究。这种研究尤其证明了使用本发明的联合所观察到的协同作用。在治疗AML上的有益效果可以通过这种研究的结果直接确定，或随对于本领域技术人员本身已知的研究设计改变来确定。例如，可以将一种联用组分以固定剂量给药，而将第二种联用组分的剂量逐步升高直到达到最大耐受剂量(MTD)。或者，可以进行安慰剂-对照双盲研究以证明本文中提及的本发明的联合的益处。
在本发明的再一方面还涉及药物组合物。根据本发明用于联用组分的分开给药和以固定组合给药(即，包含至少两种联用组分的单一盖仑制剂组合物)的药物组合物，可以以本身已知的方式制备，并且可以是适于对温血动物，包括人类，进行肠内施用(比如口服或直肠)和肠胃外给药的组合物，其包含仅治疗有效量的至少一种药理学活性联用组分或还包含一种或多种药用可接受的载体，特别是适合于肠内或肠胃外应用的载体。
新的药物组合物含有，例如，约10％到约100％，优选约20％到约60％的活性组分。用于肠内或肠胃外给药的联合治疗的药物制剂是，例如，单位剂型，比如糖衣片、片剂、胶囊或栓剂和安瓿。如果没有另外指出，这些制剂是以本身已知的方法制备的，例如用常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冷冻干燥工艺制备的。应理解包含在每种剂型的单一剂量中的联用组分的单位含量本身不一定构成有效量，因为必要的有效量可以通过给予多个剂量单元来实现。
特别地，本发明联合中每种联用组分的治疗有效量可以同时或相继地以任何顺序给药，且各组分可以分开给药或以固定的联合形式给药。例如，按照本发明治疗AML的方法可以包括以联合治疗有效的量、优选地以协同有效量、例如以相当于本文所述量的日剂量，同时地或相继地以任一顺序(i)施用游离形式或药学可接受盐形式的第一联用组分，(ii)施用游离形式或药学可接受盐形式的第二联用组分，和任选地，(iii)施用游离形式或药学可接受盐形式的第三，第四，等等的联用组分。本发明的联合中各单个联用组分可以在治疗期间的不同时间分开给药，或以分开形式或单一联合形式同时给药。更进一步，术语给药也包括使用可以在体内转化为联用组分本身的联用组分的前体药物。因此应理解本发明包括所有这样的同时或交替治疗的方案，而术语“给药”将作相应地解释。
用于本发明联合中的式I化合物和联用组分的有效剂量可以根据所使用的具体化合物或药物组合物，给药方式，所要治疗的AML的进展阶段，所要治疗的AML的严重程度，和所要治疗的患者的响应性加以改变。由此，本发明的联合的给药方案是根据包括给药途径和患者的肾和肝功能在内的各种因素加以选择的。具有普通技术的医生、临床医生或兽医可以容易确定和开出用于预防、对抗或阻止病情发展所需要的式I化合物的有效量或本发明联合中其他各单个活性组分的有效量。为了最佳精确性地获得能产生效力而没有毒性的活性组分浓度，需要以靶位置对活性组分的利用度的动力学为基础的方案。
如果温血动物是成年人，式I的化合物(特别是PTK787)的剂量优选在约100到1500，更优选约250到1250，和最优选500到1000毫克/天的范围内。在本发明的联合中，与单独应用相比，式I化合物的剂量可以降低。例如，在与用于AML治疗的常规化合物联用或一起使用时，PTK787的剂量优选在50到1000，更优选在约100到800，和最优选在200到500毫克/天的范围内。另一联用组分，即用于治疗AML的常规化合物的优选剂量也相应地降低，优选降低到标准剂量的约50％。
供儿童使用的剂量相应地降低，且使其适应于儿童的体重和/或体表面积。例如在与用于治疗AML的常规化合物联用或一起给药中PTK787的剂量优选在1到15，更优选约1.5到10，和最优选2.5到6毫克/天且每千克患者体重的范围内。
此外，本发明涉及如上文所描述的药物组合物在治疗AML中的用途。
另外，本发明提供一种商业包，其包括作为活性组分的本发明联合，及其在治疗AML中同时、分开或相继使用的说明书。
本发明也提供了本文中所定义的式I化合物和本发明的联合在AML治疗药物制备中的用途。
实施例一般方法和材料细胞系和患者样品细胞系HL-60、TF-1、K562和U937获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA))，并在RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute)中培养，且对于U937、K562和HL-60细胞，该培养基补充青霉素/链霉素和10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah，USA)，而对于TF-1细胞，补充GM-CSF 1ng/毫升。
在知情同意后，在诊断时获得6名0-18岁的儿科AML患者的骨髓和外周血细胞。依据细胞形态学使用FAB分级和免疫表型分型(Bennett JM等人，Br.J.Haematol.33451-458，1976)对诊断进行评价。通过Lymphoprep(Nycomed，Oslo，挪威)密度梯度分离单个核细胞(MNC)，并在液氮中冷藏直到使用。将冷藏的AML细胞迅速地在37℃融化，在5倍体积的正常小牛血清(NCS)中稀释，如Dokter WH等人，Leukemia 9425-432，1995所述。剩余的沉淀是被绵羊红细胞耗竭并用lymphoprep密度梯度分离的T细胞。剩余的胚细胞群含有超过95％AML细胞，下文称为AML细胞，其在补充以青霉素/链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640中培养。
原代白血病细胞和白血病细胞系的培养在与重组(rec)VEGF165(Sigma，St.Louis，MI)和/或PTK787孵育之前，将AML细胞和/或细胞系在无血清培养基(X-vivo 10，Biowhitaker，布鲁塞尔，比利时)中使其血清饥饿4小时。为了进行增殖实验，将细胞在六孔平板(Corning-Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts，美国)中，以1×105细胞每孔的细胞密度在无血清培养基(X-vivo-10)中培养24小时。细胞是处理的(rec VEGF1655-100ng/mL)或未经处理的(只有培养基)，并且是在存在或缺乏PTK787(5-100nM)的情况下培养的。24小时后用血细胞计数器对活细胞进行一式三份计数(通过台盼蓝染色排除法测定)。每个实验以一式三份试样进行，且用白血病细胞系进行的实验被重复三次。
细胞周期分析将细胞用PBS洗涤，再悬浮在PBS中的75％乙醇中，并在4℃下保持至少30分钟。在分析之前，将细胞用PBS洗涤，再悬浮于PBS中的1毫克/毫升RNase A中并保温30分钟，而后在含有0.05毫克/毫升碘化丙锭(Sigma)、1mM EDTA和0.1％Triton-X-100的染色液中温育。然后使悬浮液通过尼龙筛网过滤器过滤，并在Becton Dickinson FACScan上分析。
RNA提取和RT-PCR通过Trizol方法按照厂家的说明书提取总RNA(Life Technologies，Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)。通过在37℃下在含有2μg总RNA、随机六聚体(Pharmacia)、5X第一链缓冲液、RNasin和1μL逆转录酶(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)的20μL反应混合物中逆转录至少一小时来制备cDNA。在引物、10x缓冲液、1.5mM MgCl2、dNTP和Taq(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)的存在下将cDNA扩增。使混合物在专用于此PCR试验的PCR循环条件下于Perkin Elmer装置中扩增。在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳对PCR产物进行分析。将凝胶用溴化乙锭染色并拍照。对β2-微球蛋白特异的引物是有义(CCA GCA GAGAAT GGA AAG TC)和反义(GAT GCT GCT TAC ATG TCT CG)，PCR产物260bp，22个循环，退火温度为55℃。对于VEGF有义引物(GAGTGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC)和反义引物(CTC CTG CCCGGC TCA CCG CCT CGG CTT)，PCR产物177，312，384bp，30个循环，退火温度60℃。用于VEGF的引物跨越剪接点，使每个剪接变体的扩增产物可电泳分离。用于VEGFR-1的特异引物有义(GAG TCC TTTATC CTG GAT GC)和反义(ACA GAG CCC TTC TGG TTG GT)，PCR产物750bp，35个循环，退火温度57℃。
对于VEGFR-2的嵌套的RT-PCR第一PCR有义引物(CGC TGGGAG AAA GAA CCG)和反义引物(GCT CAC TGC CAC TCT GAT TATTG)，PCR产物329bp，25个循环，1mM MgCl2，5％DMSO，退火温度60℃。嵌套的PCR有义引物(TCC GCG CCT CCT CCT TCT CTA GACAG)和反义引物(GGC CAT CGC TGC ACT CAG TGA)，PCR产物270bp，25个循环，1.25mM MgCl2，退火温度53℃，使用4μL第一PCR产物。为控制在第一PCR反应中cDNA的加入量，用与第二VEGFR-2PCR(嵌套的)中所使用的相同的第一PCR产物进行β2-微球蛋白PCR。将第一产物分开；将4μL用于β2-微球蛋白PCR以控制在第一PCR中的cDNA的加入量。
蛋白质提取和蛋白质印迹法在冰上于样品缓冲液(含2％-十二烷基-硫酸钠、10％甘油、2％β-巯基-乙醇和60nM Tris-C1 pH值6.8的软化水)中制备细胞裂解产物。使蛋白质在12.5-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上分离，并印到PVDF膜(Millipore，Bedford)上。随后将印迹用含5％脱脂奶粉和0.05％吐温-20的Tris-缓冲盐水(TBST)封闭，然后与一抗和二抗保温。使用多克隆的山羊-抗人VEGFR-2(Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA)抗体，并使用二级兔-抗山羊HRPO(DAKO，Denmark)。通过ECL化学发光检测系统和ECL薄膜(Amersham Pharmacia Biotech)使蛋白质显现。
使用总细胞杀死试验测定细胞的耐药性使用2-天细胞培养试验对白血病HL-60和TF-1细胞(10,000细胞/孔)进行体外细胞耐药性评价，该试验基于以下原理即只有活细胞能够将3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-四唑溴化物(MTT)(5毫克/毫升，于PBS中，加入每个孔，4小时)还原成有颜色的甲产物，在520纳米处使用分光光度法测定。对于患者的白血病样品(10,000细胞/孔)，使用3-天的细胞培养物。以9个不同浓度一式四份地在96孔小型培养平板中进行阿糖胞苷(0.001-10毫克/毫升)和米托蒽醌(0.0001-1μg/毫升)或阿霉素(0.0001-1μg/毫升)的试验。光密度(OD)与活细胞的数目是线性相关的。对照孔仅仅含有白血病细胞以及培养基而没有药物，而空白孔中仅仅含有培养基。以空白孔中的背景进行校正后，用公式(平均OD处理孔/平均OD对照孔)×100％计算每种药物浓度下的细胞存活率百分数。当对照孔在3-天培养期后仍含有70％以上的白血病细胞时(用MGG染色测定)，认为结果是可评价的。在3天时背景校正后对照孔的平均OD总是超过有效结果的0.1个任意单位。用LC50值(杀死50％白血病细胞所需要的药物浓度)来比较在患者之间和/或各种药物组合之间的差异。LC50值公式([％白血病细胞存活率＞50％]-50)/([％白血病细胞存活率＞50％]-[％白血病细胞存活率＜50％])×(当白血病细胞存活率＜50％时的药物浓度-当白血病细胞存活率＞50％时的药物浓度)+(当白血病细胞存活率＞50％时的药物浓度)。
统计分析使用Spearman等级相关系数(rho)计算相关性。用成对样品非参数检验(Wilcoxon Signed Ranks test)来分析成对的活细胞(有或者没有VEGF，以及有或者没有PTK787的情况)。将显著差异定义为P值＜0.05。
实施例1VEGF和VEGFR对白血病细胞系HL-60和TF-1细胞生长的影响在TF-1、U937和HL-60细胞中通过RT-PCR(图1)和通过功能性试验(图2)来检验VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达。所有三个细胞系都显示VEGF表达。HL-60和U937细胞在VEGFR-1的RT-PCR中显示阳性PCR条带。所试验的细胞系没有一个显示有VEGFR-2的PCR条带。
为证明功能性的VEGFR，在没有外源生长因子(无血清状态)的情况下向HL-60和TF-1细胞中加入重组体(rec)VEGF165，并在24小时刺激作用后通过台盼蓝染色排除法对活细胞计数。用recVEGF165在TF-1细胞中发现了剂量-依赖性增强的白血病细胞存活率，高达对照细胞(100％)的450％。在HL-60细胞中recVEGF165诱导细胞存活率增加，高达对照细胞的980％(图2)。
可以由PTK787中断VEGFR信号会降低细胞存活率来突现出VEGF/VEGFR信号的重要性。当加入25nM PTK787时TF-1细胞存活率减少到21.9％(图3)。通过向细胞培养物中加入rec VEGF可以将25和50nMPTK787的作用阻断。在TF-1细胞中对VEGFR信号的抑制作用以剂量依赖的方式诱导细胞程序死亡(通过PI DNA标记显示)，在过夜培养后高达12％，而相比较在对照孔中为5％。通过用recVEGF165处理，程序死亡的细胞的百分率再次落在对照孔的范围内(4％)。
用PTK787阻断VEGFR信号可以降低HL-60细胞的白血病细胞存活率，最高为1％，而对于TF-1细胞为10％(图4)。不出所料，K562细胞的白血病细胞存活率显示出根本没有降低。
尽管利用RT-PCR没有发现VEGFR-2表达，且VEGFR1的表达只能在U937和HL-60细胞中得到证实，但这些数据表明阻断VEGFR信号可以诱发细胞凋亡，该细胞凋亡可以通过添加VEGF165抑制。
实施例2VEGF和PTK787对患者白血病细胞存活率的影响。
在6个原代AML样品中，通过RT-PCR分析VEGFR-1和-2以及VEGF165的表达(图1)。在这6个患者的5个中，可以分离mRNA并进行RT-PCR。所有5个患者表达各种量的VEGF。在5个患者的4中发现了VEGFR-1的弱PCR条带。患者2，3和6表达大量的VEGFR-2转录物，而患者1和5则根本不表达VEGFR-2(图1)。
尽管不能在所有患者样品中评价VEGFR表达，但对所有的样品进行了功能性VEGFR的测定。在无血清条件下白血病细胞的存活率显示，在不同的患者样品中24小时后活细胞的绝对数量有很大的差异(中值23.5×103活细胞；范围6.6-78.1×103活细胞)。
用5ng/毫升recVEGF165，白血病细胞的存活率提高了100％到多达143.3％(范围114.2％-188.9％；p-值0.043)，然而加入PTK787则引起细胞死亡增加(中值降低55.1％；范围降低28.2％-75.4％；p-值0.043)(图5)。向含PTK787(25nM)的白血病细胞培养物中加入外源VEGF165，可以将PTK787的效果抵消，中值细胞存活率降低为15％(范围0％-35.5％)，相比之下单独用PTK787的存活率降低为55.1％。因此外源VEGF165可解除PTK787的作用，为PTK787所诱导的细胞死亡总作用的73％。
实施例3PTK787和常规AML药物在患者白血病细胞存活率上的影响将患者的白血病细胞与不同剂量的PTK787一起保温，并用总细胞杀死测定法评价白血病细胞的耐药性。对于PTK787的体外抗药性结果概括于表1中，并在图6说明。给出个体患者的剂量反应曲线(图6)和LC50值(表1)。
发现在个体患者之间存在显著的差异。在全部患者中VEGFR-1的表达都是弱的，而VEGFR-2的表达则是不同的，从无表达到高表达水平。具有高VEGFR-2表达和低VEGF表达的患者样品(No.2和3)对于PTK787抑制作用是敏感的，引起高白血病细胞的细胞毒性；而对于具有高VEGFR-2和VEGF表达的患者6，在白血病细胞培养物中加入PTK787则显示中间结果。最耐受的样品(No.1)通过RT-PCR显示出高VEGF表达和没有VEGFR-2表达。尽管数目少，但这些数据表明，PTK787孵育的个体白血病细胞毒性结果是VEGF及VEGFR-2表达水平的结果。
PTK787与常规化学治疗药物比如米托蒽醌和阿糖胞苷一起同时使用，在白血病细胞的细胞毒性上引起加性效应。在图7和在表1中，证实了PTK787可导致阿糖胞苷和米托蒽醌的剂量反应曲线显著的降低，引起加入PTK787时阿糖胞苷和米托蒽醌的LC50值的下降。
表1各种药物在不同患者的AML样品中的LC50值。
给出在存在PTK787情况下和/或在存在阿糖胞苷或米托蒽醌与PTK787的联合的情况下以数字表示的LC50值。
权利要求
1.一种治疗患有急性髓性白血病(AML)的温血动物的方法，包括将治疗有效量的式I化合物 其中r为0-2，n为0-2，m为0-4，R1和R2(i)是低级烷基或(ii)一起形成子式I*中的桥 该结合是通过两个末端碳原子实现的，或(iii)一起形成子式I**中的桥 其中环成员T1、T2、T3和T4中的一个或两个是氮，而其余的在每个情况下都是CH，且结合是通过T1和T4实现的；A、B、D和E各自独立地是N或CH，条件是这些基团中不超过2个基团是N；G是低级亚烷基、被酰氧基或羟基取代的低级亚烷基、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、氧杂(-O-)、硫杂(-S-)或亚氨基(-NH-)；Q是低级烷基；R是H或低级烷基；X是亚氨基、氧杂或硫杂；Y是未取代或取代的芳基、吡啶基或未取代或取代的环烷基；且Z是氨基、单-或二取代的氨基、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、醚化或酯化的羟基、硝基、氰基、羧基、酯化的羧基、烷酰基、氨基甲酰基、N-单取代-或N，N-二取代的氨基甲酰基、脒基、胍基、巯基、磺基、苯硫基、苯基-低级烷硫基、烷基苯基硫基、苯磺酰基、苯基-低级烷基亚磺酰基或烷基苯基亚磺酰基，如果存在多于1个基团Z，取代基Z是彼此相同的或不同的；且其中由波形线表征的键，如果存在的话，是单键或者双键；或其中1或多个N原子带有氧原子的所定义化合物的N-氧化物，或具有至少一个成盐基团的这种化合物的盐；与用于AML治疗的常规化合物或化合物混合物，和任选地至少一种药学可接受的载体一起或联合施用给所述动物。
2.权利要求1的方法，其中式I的化合物是PTK787。
3.权利要求1的方法，其中用于AML治疗的常规化合物是拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素或这些化合物的混合物。
4.权利要求1的方法，其中用于AML治疗的常规化合物选自胺苯丫啶、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、阿糖胞苷，methotexate、巯基嘌呤、米托蒽醌、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素，表柔霉素、高三尖杉酯碱、去甲氧柔红霉素、天冬酰胺酶、环磷酰胺、gemtuzumab、其它CD 33单克隆抗体、异环磷酰胺、巯乙磺酸钠、强的松、拓扑替康、长春新碱和其混合物。
5.根据权利要求1到4任一项的方法，其中AML对常规的化学疗法有抗性。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其中温血动物是人。
7.根据权利要求6的方法，其中人是幼年的人。
8.一种联合药物制剂，其包含如权利要求1所定义的式I化合物和可用于AML治疗的常规化合物以及任选地至少一种药学可接受的载体，用于同时、分开或相继使用，其中活性组分在联合药物制剂的各个部分中是以游离形式存在的或是以药学可接受盐的形式存在的。
9.根据权利要求8的联合药物制剂，其中如权利要求1所定义的式I化合物是PTK787。
10.一种药物组合物，其包含如权利要求1所定义的式I化合物和可用于AML治疗的常规化合物，以及任选地药用载体。
11.根据权利要求10的药物组合物，其包含对AML进行联合治疗时有效的量的式I化合物和可用于AML治疗的常规化合物。
12.根据权利要求10或11的药物组合物，其中如权利要求1所定义的式I化合物是PTK787。
13.根据权利要求10的药物组合物用于治疗AML的用途。
14.一种商业包，其包括如权利要求1所定义的式I化合物和可用于AML治疗的常规化合物，以及其在AML治疗中同时、分开或相继使用的说明书。
15.如权利要求1所定义的式I化合物和可用于AML治疗的常规化合物在制备AML治疗药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种治疗患有对常规的化学疗法具有抗性的急性髓性白血病(AML)的温血动物的方法，包括对所述动物施用治疗有效量的式(I)化合物，其中基团与符号具有说明书中所定义的含义，其中，所述式(I)化合物与可用于AML治疗的常规化合物或化合物混合物，特别是拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物或抗肿瘤抗生素，一起或联合给药，以同时、分开或相继使用；还涉及一种药物组合物和包括所述联合的商业包。
文档编号A61K31/502GK101076338SQ200380101079
公开日2007年11月21日 申请日期2003年10月7日 优先权日2002年10月8日
发明者E·S·J·M·德本特, W·A·坎普斯 申请人:齐肯胡伊斯－格罗宁根学院(Umcg)