专利名称：：粘膜疾病引起的组织退化、损伤或损害的治疗或预防方法
技术领域：
：本发明涉及粘膜疾病的治疗领域。
背景技术：
：口腔溃疡粘膜炎(Oralulcerativemucositis)是癌症药物治疗和放疗中常见的疼痛性、剂量限制性毒性。这种疾病被表征为导致形成溃疡性损害的口腔粘膜损坏。在粒细胞减少的患者中，伴有粘膜炎的溃疡是常导致败血症或菌血症的天然口腔细菌的常见入口。在接受抗肿瘤药物治疗的患者中，有三分之一以上发生一定程度的粘膜炎。在接受白血病诱导疗法或者多种骨髓移植预处理方案治疗的患者中，所述粘膜炎发生的频率和严重程度明显增加。在这些个体中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕见。中度至重度粘膜炎发生于几乎所有接受头部和颈部肿瘤放疗的患者，并且通常始于15Gy的累积辐射量，而后在总剂量达到60Gy或以上时加重。粘膜炎的发展在临床上经历三个阶段1.伴随有疼痛性粘膜红斑的炎症，其可以对局部麻醉剂做出应答。2.伴有假膜形成的疼痛性溃疡，以及在骨髓抑制治疗的情况下，为需要抗菌治疗的潜在威胁生命的败血症。疼痛的强度通常需要肠胃外给予麻醉剂镇痛。3.自愈，发生在停止抗肿瘤治疗后的约2-3周。粘膜炎的标准治疗主要是姑息疗法，包括使用局部镇痛剂(例如利多卡因，lidocaine)和/或全身施用麻醉剂和抗生素。目前，唯一一种批准用于口腔粘膜炎的治疗剂是Kepivance(Palifermin)，其仅被批准用于在进行治疗恶性血液病的造血干细胞移植前接受预处理方案的患者中治疗口腔粘膜炎。作为生物过程的粘膜炎的复杂性仅在最近才被关注。己经提出所述病症代表口腔粘膜细胞和组织、活性氧、促炎细胞因子、凋亡介体和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)间的连续相互作用。尽管上皮细胞退化和损坏最终导致粘膜溃疡，但与辐射诱导的粘膜毒性相关的早期变化似乎发生在内皮和粘膜下层的结缔组织内。对辐射1周内粘膜的电子显微镜评估显示出对内皮和结缔组织二者的损害，但没有对上皮的损害。这种损伤可能是由自由基的形成介导的。辐射和化疗两者引发粘膜炎发展的整体机制似乎是类似的。本领域仍然需要改善粘膜疾病的治疗或预防方法。发明概述一方面，本发明提供了治疗、预防、抑制或减轻由粘膜疾病引起的受试者组织退化、损伤或损害，或者恢复受所述疾病不利影响的受试者组织的治疗方法，其包括向所述目标受试者施用有效量的式A的免疫调节化合物R-NH-CH-(CH2)——C-XCOOHO(A)在式A中，n为l或2，R为氢、酰基、垸基或肽片段，X为芳族氨基酸或杂环氨基酸或其衍生物，其中，向所述目标受试者施用所述免疫调节化合物，而不向所述目标受试者施用至少一种所述干扰素。X优选为L-色氨酸或D-色氨酸。本发明还涉及式A化合物在制备用于治疗粘膜疾病的药物中的应用。优选实施方案本发明可应用于粘膜疾病或其疾病症状(manifestations)。在优选实施方案中，粘膜疾病由受试者(优选人类患者)的辐射和/或化疗而引起。所述辐射可以是急性辐射或者分次辐射(fractionatedradiation)。粘膜疾病可能是辐射和化疗的组合引起的。在某些实施方案中，所述疾病是口腔粘膜疾病和/或食道粘膜疾病，例如粘膜炎(mocositis)和/或溃疡性损害(ulcerativelesions)。根据一个实施方案，本发明涉及通过向哺乳动物受试者(优选人类患者)施用免疫调节化合物来治疗粘膜炎。在某些实施方案中，在向患者施用辐射和/或化疗剂之前、期间和/或之后，施用本发明的免疫调节化合物。辐射通常以多种剂量施用，但粘膜疾病发生于几乎所有接受头部和颈部肿瘤放疗的患者，并通常始于15Gy的累积辐射量，而后在60Gy或以上的总累积剂量时加重。在优选实施方案中，在向患者施用7-8Gy(例如7.5Gy)、15Gy、40Gy、60Gy或更多辐射之前、期间或之后施用本发明的免疫调节化合物。还可以施用本发明的免疫调节化合物治疗或预防由施用化疗剂(例如顺铂)而引起的粘膜疾病，例如以约0.1-50mg/kg'范围内的剂量(例如约5mg/kg)施用化疗剂而引起的粘膜疾病。本发明中使用的免疫调节化合物包括式A的免疫调节剂r-nh-ch-(ch2)——c——Xcooh0(A)式A中，n为l或2，R为氢、酰基、烷基或肽片段，X为芳族氨基酸或杂环氨基酸或者其衍生物。优选X为L-色氨酸或D-色氨酸。作为"X"的芳族氨基酸或杂环氨基酸的适合衍生物为酰胺、一个(CrC6)烷基或两个(CpC6)烷基取代的酰胺、芳基酰胺和(d-C6)烷基酯或芳基酯。作为"R"的合适的酰基或烷基为1至约6个碳的支链或直链烷基基团、2至约10个碳原子的酰基基团以及封端基团(如苄氧羰基和叔丁氧羰基)。优选地，式A中显示的CH基团的碳具有立体构型，当n为2时，其立体构型不同于X的立体构型。优选实施方案使用了化合物，如，D-谷氨酰基-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰基-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰基-Nin-甲酰-L-色氨酸、N-甲基-Y-L-谷氨酰基-L-色氨酸、N-乙酰个L-谷氨酰基-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰基-D-色氨酸、P-L-天冬氨酰-L-色氨酸和J3-D-天冬氨酰-L-色氨酸。特别优选的实施方案使用了Y-D-谷氨酰基-L-色氨酸，有时候称为SCV-07。这些化合物、制备这些化合物的方法、这些化合物的药学上可接受的盐和其药物制剂公开在美国专利第5,916,878号中，其通过引用方式并入本文。SCV-07,即Y-D-谷氨酰基-L-色氨酸，是具有Y-谷氨酰基或者P-天冬氨酰基的这类免疫调节药物中的一员，其由俄罗斯科学家发现，并在美国经SciClonePharmaceuticals公司验证在几个适应症上均具有疗效。SCV-07在体内和体外具有多种免疫调节活性。SCV-07提高了Con-A诱导的胸腺细胞和淋巴细胞的增殖，增加了Con-A诱导的白介素2(IL-2)的生成和脾脏淋巴细胞的IL-2受体的表达，并剌激Thy-1.2在骨髓细胞上的表达。在体内，SCV-07对受5-FU免疫抑制的动物和使用绵羊红血细胞的免疫模型具有强免疫促进作用。式A化合物可以以在约0.001-2000mg的范围内的剂量施用，优选剂量约为0.01-100mg。可以每周施用一次或多次，优选以天为基础，每天施用一次或多次。可以通过任何合适的方法施用，包括通过注射、定期输注和连续输注等方式经口、鼻、透皮、舌下施用。可通过肌内注射施用，当然也可以使用其它形式的注射和输注，并且也可以采用其它施用形式，如经口或鼻吸入或口服。剂量还可以以毫克/千克计算，所述剂量在约0.1-10,000ug/kg的范围内，更优选在约1.0-1000ug/kg的范围内。还包括具有取代、删除、延长、替换或其它修饰部分的生物活性类似物，其具有与SCV-07基本相似的生物活性，如与SCV-07具有足够同源性，从而通过与SCV-07基本相同的活性以基本相同的方式发挥作用的SCV-07衍生肽。在一些实施方案中，所述式A化合物存在于药学可接受的液体载体(例如注射用水、生理浓度的盐水或其类似物)中，或者与合适的一种或多种干载体和一种或多种赋形剂一起以片剂的形式存在。可以通过常规的剂量滴定(dose-titration)试验确定式A化合物的有效量。实施例1:SCV-07在治疗仓鼠由急性辐射诱导的口腔粘膜炎中的首次研究1.目的该研究的目的是利用急性辐射诱导的仓鼠口腔粘膜炎疾病模型，对SCV-07治疗该疾病的功效进行初步评估。通过皮下注射以每天一次lug/kg、10ug/kg或100ug/kg的剂量施用SCV-07，在辐射前一天开始并持续至辐射后第16天，共给药18天。在任何治疗组都没有观察到死亡，并且生长速率在统计学上没有显著差异，这表明这些剂量的SCV-07得到很好的耐受。在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治疗的动物其第22天的粘膜炎评分显示出统计学上的显著降低(P=0.024)。在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治疗的动物其第14天的粘膜炎评分显示出统计学上的显著降低(P=0.025)，另外评分为3或更高的天数在统计学上显著降低(P=0.029)。这些数据表明，SCV-07对辐射诱导的粘膜炎的严重程度和病程具有剂量依赖性疗效。急性辐射模型已经证明仓鼠的急性辐射模型是提供抗粘膜炎化合物初步评估的一项准确、有效且经济的技术。在这种模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定义，并且在辐射后约14-16天达到评分峰值。所述急性模型几乎没有全身毒性，几乎不会引起仓鼠死亡，因此可以使用小组(N=7-8)进行初始功效研究。它还用于研究粘膜炎发病机理中的特定机理性要素。对于在所述急性辐射模型中显示有效的分子，还可以在更复杂的分次辐射、化疗或同步治疗模型中对其进行进一步评估。在这个研究中，在第0天施用40Gy的急性辐射剂量。在第12天至第28天，观察到临床上显著的粘膜炎。2J开究目的和概述研究目的本研究的目的是评估通过在辐射前一天和辐射至第16天之间按不同的皮下注射方案施用的SCV-07对由急性辐射诱导的口腔粘膜炎的发病频率、严重程度和持续时间的影响。研究概述在第0天，向32只叙利亚金色仓鼠(SyrianGoldenHamsters)的左侧颊囊施用40Gy急性辐射剂量。通过每天一次皮下注射施用测试物。在辐射前一天(第-l天)开始给药，并持续至第16天。从第6天开始对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天评估持续直至第28天。3.评估粘膜炎评估从第6天开始对粘膜炎的等级进行评分，随后每隔一天进行评分，直至第28天(包括第28天)。根据以下参数，评估与安慰剂相比每种药物治疗对粘膜炎的效果-各组中的仓鼠患有溃疡粘膜炎(评分23)的天数上的差异。在进行评估的每一天，将各药物治疗组中粘膜炎盲测评分S的动物数量与对照组进行比较。在累积的基础上比较差异，并通过卡方分析(chi-squareanalysis)确定统计学上的显著性。在这个分析中，将功效定义为与对照组相比，动物组患有溃疡(评分S)的天数显著减少。每日粘膜炎评分的秩和差异(Ranksumdifferences)对于每个评估日，利用非参数秩和分析将对照组的评分与治疗组的评分进行比较。如果治疗组从第6天至第28天中的两天或更多天的评分在统计学上显著降低，则认为是治疗成功。体重和存活状态每天都对所有动物进行称重并记录其存活状态，以评估治疗组之间可能存在的动物体重差异，将其作为由治疗引起的粘膜炎严重程度和/或潜在毒性的指标。4.研究的设计将32只叙利亚金色仓鼠分为4组，每组8只。在第0天使所有动物在其左侧颊囊接受40Gy的单剂量急性辐射。这可以通过麻醉动物并将其左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物其它部位而实现。如表l中的详述，通过每天一次皮下注射施用测试物。从第6天开始在临床上评估粘膜炎，并每隔一天评估，持续直至第28天。表1.硏究的设计<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*第0天在辐射前30分钟给药。5.材料和方法进行研究的场所在马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA)，经BiomodelsAAALAC认证的实验室进行研究。该研究得到了BiomodelsIACUC的正式批准。动物使用在研究开始时为5-6周龄、平均体重为85.3g的雄性LVG叙利亚金色仓鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳号(earpunch)对每只动物进行编号，并以每笼8只动物的小组进行圈养。在研究开始前，使动物适应环境。在这个为期5天的过程中，每天观察动物以淘汰不健康的动物。圈养在提供有过滤空气、温度为70°F+/-5°F、相对湿度为50%+/-20%的动物房中进行研究。设定动物房以保持最小为12-15的每小时换气量。所述动物房受自动定时器调控，保持12小时接通和12小时关闭的光/暗循环，没有微光。使用3^/-0-0^@垫料。垫料最少每周更换一次。利用市售去污剂清洗笼、盖和瓶子等，并风干。使用市售消毒剂对表面和引入橱内的材料进行消毒。每天清扫地板并每周最少利用市售去污剂拖洗两次。每个月，利用稀释的漂白溶液将墙和笼架擦拭至少一次。对于所有笼舍，均使用具有确定研究、剂量、动物编号和治疗组所必须的适当信息的笼舍卡片或标签进行标记。记录研究过程中的温度和相对湿度，并保留记录。饮食使用PurinaLabdiet⑧5061鼠粮饲喂动物，并提供水，供其任意取食。动物的随机选择和分配在辐射前，按照预期将动物随意分成4个治疗组。通过与个体编号对应的耳号确定每只动物。为了得到更为一致的身份识别，使用耳号编号而非标签，这是因为标签在研究过程中可能会被移动。使用笼舍卡片或标有研究编号(SCI-01)、治疗组编号和动物编号的标签确定每个笼舍。皮下给药和药物应用提供粉末状的测试化合物SCV-07，并在施用前溶于无菌的PBS中。制备三种稀释液100lag/mL，10|ig/mL和1pg/mL。通过带有27G针的结核菌素注射器，使用对各组适当的SCV-07稀释液，以0.1ml/100g体重的体积施用药物。在背部或腹部进行皮下注射。粘膜炎的诱导利用标准的急性辐射方法诱导粘膜炎。在第0天向所有动物施用单剂量辐射(40Gy/剂)。利用160千伏电压(15-ma)源在30cm的焦距产生辐射，使用0.35mmCu过滤体系硬化(hardened)。以3.2Gy/分钟的速率靶向辐射左侧颊囊粘膜。在辐射前，用腹膜内注射氯胺酮(Ketamine，160mg/kg)和甲苯噻嗪(Xylazine，8mg/kg)麻醉动物。利用铅屏保护仓鼠身体的其它部位，将左侧颊囊外翻、固定并分离。粘膜炎评分在上述研究的过程中，计算粘膜炎评分、体重变化和存活状态。在对粘膜炎进行评估中，采用吸入麻醉剂麻醉动物，将左侧颊囊外翻。通过与经验证的图片判断标准进行比较，对粘膜炎进行目测评分，范围为0(正常)至5(严重溃疡)(临床评分)。利用描述的方式，此判断标准的定义如下表2:粘膜炎评分<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>认为1-2的评分表示疾病的轻度阶段，而3-5的评分表示中度至重度粘膜炎。目测评分后，利用标准技术对每只动物的粘膜进行拍照。在实验总结时，使所有底片显影并随机对照片进行编号。利用上述判断标准，由至少两位经过训练的独立观察员对照片进行盲测分级(盲测评分)。6.结果和讨论6.1存活状态在该研究过程中没有观察到死亡。6.2体重变化对每日平均百分体重变化数据进行评估。在研究过程中，盐水(PBS)处理的对照仓鼠组的平均体重增加值是其初始体重的70.4%。在研究过程中，在从第-1天至第16天接受1ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的68.4%。在研究过程中，在从第-l天至第16天接受10ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的70.3%。在研究过程中，在从第-1天至第16天接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的82.0%。通过计算每只动物体重增加的曲线下面积(AUC)评估这些差异的显著性，然后利用单向ANOVA检验比较不同的治疗组。此分析的结果表明不同治疗组之间没有显著差异(p=0.191)。6.3粘膜炎(表3和4)计算各组的每日平均粘膜炎评分。在盐水处理的对照组，在第20天观察到粘膜炎峰值水平，此时的平均评分达到3.8。从第-l天至第16天接受1ug/kgSCV-07的组在第16天粘膜炎平均评分峰值为3.8。从第-1天至第16天接受10ug/kgSCV-07的组在第16天粘膜炎平均评分峰值为3.7。从第-1天至第16天接受100ug/kgSCV-07的组在第18天粘膜炎平均评分峰值为3.4。通过计算各组评分为3或更高的天数并利用卡方检验比较这些数字来评估在不同治疗组间观察到的差异的显著性。该分析的结果示于表2中。盐水处理的对照组仓鼠在所评估的46.9%的动物日中评分都为3或更高。对于在第-1天至第16天接受1ug/kgSCV-07的组，也在所评估的46.9%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分。在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治疗的组中的仓鼠在37.5%的动物日具有3或更高的评分，但其与对照之间并没有统计学上的显著差异(P=0.079)。在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治疗的组中，仓鼠在35.4%的动物日具有3或更高的评分，其与对照之间存在统计学上的显著差异(P=0.029)。利用Mann-Whitney秩和分析对粘膜炎评分进行进一步分析，以比较各组的每日评分。这个分析的结果示于表4中。在此分析中，通常需要粘膜炎评分显著下降2天才能视为粘膜炎明显缓解。相对于盐水对照组，在第-l天至第16天用lug/kgSCV-07治疗的组在研究中任一天都没有显示出统计学上显著的任何症状改善。相对于对照，在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治疗的组在第22天显示出显著的改善(P-0.024)。相对于对照，在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治疗的组在第14天显示出显著的改善(P-0.025)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3.各组动物评分为3或更高的总天数的卡方分析。这个统计量是溃疡严重程度的计算值，是在临床上具有重要意义的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4.利用Mann-Whtiney秩和检验，测定所观察的每日粘膜炎评分的组间差异显著性。这个非参数统计量适合于粘膜炎目测评分判断标准。显示了各个计算的P值。下划线表示显著改善。结论1.根据死亡率和体重增加的观察结果，在该研究中没有来自SCV-07的任何毒性的证据。2.在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治疗的动物在第22天的粘膜炎评分显示出与剂量相关的统计学上的显著降低(P二0.024)。3.在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治疗的动物在第14天的粘膜炎评分显示出统计学上的显著降低(P-0.025)，另外评分为3或更高的动物天数显示出统计学上的显著降低(PK).029)。4.观察到SCV-07对粘膜炎的严重程度和病程具有有利的剂量依赖性作用。提高给药频率或使每日单剂量加倍可能增强所观察到的效果。SI<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>附表2-粘膜炎评分<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例2:SCV-07在治疗仓鼠由急性辐射诱导的口腔粘膜炎的二次研究本研究的目的是利用急性辐射诱导的仓鼠口腔粘膜炎疾病模型，对SCV-07在治疗该疾病的功效进行初步评估。通过皮下注射以每天一次或两次lmg/kg或100ug/kg的剂量施用SCV-07，从辐射前一天开始并持续至辐射后第20天，共22天。在任何治疗组都没有观察到死亡，并且生长速率在统计学上具有显著增加，这表明这些剂量的SCV-07可以得到很好的耐受，并且实际上可以降低与粘膜炎相关的体重减少。在该研究中，对照组仓鼠在所评估的28.1%的动物日的粘膜炎评分为3或更高。在第-l天至第20天每天一次用100pg/kgSCV-07治疗的动物，其评分为3或更高的动物天数在统计学上显著降低至6.3%(P〈0細)，并且在第14天(P-O.Oll)、16天(P=0,002)和18天(P=0.001)的单日评分在统计学上显著降低。在第-1天至第20天每天两次用100pg/kgSCV-07治疗的动物，其评分为3或更高的动物天数在统计学上显著降低至8.9%(P<0.001)，并且在第18天(P<0.001)禾U20天(P=0.003)的单日评分在统计学上显著降低。在第-1天至第20天每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的动物，其评分为3或更高的动物天数在统计学上显著降低至12.5%(P〈0細)，并且在第16天(P=0.043)、18天(P=0.009)和20天(P=0.007)的单日评分在统计学上显著降低。从第-1天至第20天每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的动物的粘膜炎评分没有显示出任何显著降低。每天一次用100pg/kgSCV-07治疗的组与每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的组之间，评分为3或更高的动物天数没有统计学上的显著差异(P=0.054)。当比较这两组之间的单日评分时，仅在第14天观察到显著的差异(P=0.005)。这些观察结果表明，每天一次用100pg/kgSCV-07治疗与每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的显著改善非常接近。这个观察结果表明，每天一次100pg/kg是最接近于本研究和之前SCI-01研究所测剂量中最佳给药剂量的剂量。介绍1.1背景口腔溃疡粘膜炎是癌症药物治疗和放疗中常见的疼痛性、剂量限制性毒性。这种疾病被表征为导致形成溃疡性病变的口腔粘膜损坏。在粒细胞减少的患者中，伴有粘膜炎的溃疡是常导致败血症或菌血症的天然口腔细菌的常见入口。在接受抗肿瘤药物治疗的患者中，有三分之一以上发生一定程度的粘膜炎。在使用白血病诱导疗法或者多种骨髓移植预处理方案治疗的患者中，所述粘膜炎发生的频率和严重程度明显增加。在这些个体中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎，这并不罕见。中度至重度粘膜炎发生于几乎所有接受头部和颈部肿瘤放疗的患者，并且通常始于15Gy的累积辐射量，而后在总剂量达到60Gy以上的总剂量时加重。粘膜炎的发展在临床上经历三个阶段1.伴随有疼痛性粘膜红斑的炎症，其可以对局部麻醉剂做出应答。2.伴有假膜形成的疼痛性溃疡，以及在骨髓抑制治疗的情况下，为需要抗菌治疗的潜在威胁生命的败血症。疼痛的强度通常需要肠胃外麻醉药镇痛。3.自愈，发生在停止抗肿瘤治疗后的约2-3周。粘膜炎的标准治疗主要是姑息疗法，包括使用局部镇痛剂(例如利多卡因)和/或全身施用麻醉药和抗生素。目前，唯一一种批准用于口腔粘膜炎的治疗剂是Kepivance(Palifermin)，其仅被批准用于在进行治疗恶性血液病的造血干细胞移植前接收预处理方案的患者中治疗口腔粘膜炎。粘膜炎作为生物过程的复杂性仅在最近才被关注。已经提出所述病症代表口腔粘膜细胞和组织、活性氧、促炎性细胞因子、凋亡介体和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)间的连续相互作用。尽管上皮细胞退化和损坏最终导致粘膜溃疡，但与辐射诱导的粘膜毒性相关的早期变化似乎发生在内皮和粘膜下层的结缔组织内。对辐射1周内粘膜的电子显微镜评估显示出对内皮和结缔组织二者的损害，但没有对上皮的损害。这种损伤可能是由自由基的形成介导的。辐射和化疗两者引发粘膜炎发展的整体机制似乎是类似的。1.2急性辐射模型已经证明由本课题的主要研究者开发的急性辐射仓鼠模型是提供抗粘膜炎化合物初步评估的一项准确、有效且经济的技术。在这个模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定义，并且在辐射后约14-16天达到评分峰值。所述急性模型几乎没有全身毒性，几乎不会引起仓鼠死亡，因此可以使用小组(N=7-8)进行初始功效研究。它还用于研究粘膜炎发病机理中的特定机制性要素。对于在所述急性辐射模型中显示有效的分子，还可以在更复杂的分次辐射、化疗或同步治疗模型中对其进行进一步评估。在这个研究中，在第0天施用40Gy的急性辐射剂量。在第12天至第28天，观察到在临床上显著的粘膜炎。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是评估通过在辐射前一天和辐射后第20天之间按不同的皮下注射方案施用的SCV-07对由急性辐射诱导的口腔粘膜炎的发病频率、严重程度和持续时间的影响。之前利用SCV-07的研究(研究SCI-Ol，实施例l)已经表明，从第-l天至第16天每天一次施用100^ig/kg剂量具有一定的抗粘膜炎活性。在这个研究中，从第-1天至第20天每天一次或两次施用100ng/kg和lmg/kg的SCV-07，以观察在之前研究中所见的部分效果是否能够持续。2.2研究概述第0天，向40只叙利亚金色仓鼠的左侧颊囊施用40Gy急性辐射剂量。通过每天一次或两次皮下注射100pg/kg或lmg/kg施用测试物SCV-07。在辐射前一天(第-l天)开始给药，并持续至第20天。从第6天开始对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天评估，持续直至第28天。3.评估3.1粘膜炎评估从第6天开始对粘膜炎的级别进行评分，随后每隔一天进行评分，直至第28天(包括第28天)。根据以下参数，评估与安慰剂相比，每种药物治疗对粘膜炎的效果3丄1各组中的仓鼠在患有溃疡粘膜炎(评分>3)的天数上的差异。在进行评估的每一天，将各药物治疗组中粘膜炎盲测评分^3的动物数量与对照组进行比较。在累积的基础上比较差异，并通过卡方分析确定统计学上的显著性。在这个分析中，将功效定义为与对照组相比，动物组患有溃疡(评分S)的天数显著降低。与此相同的实验还用于评估不同药物治疗组之间的差异。3丄2每日粘膜炎评分的秩和差异对于每个评估日，利用非参数秩和分析将对照组的评分与治疗组的评分进行比较。如果治疗组从第6天至第28天中的两天或更多天的评分在统计学上显著降低，则认为是治疗成功。3.2体重和存活状态每天都对所有动物进行称重并记录其存活状态，以评估治疗组之间可能存在的动物体重差异，将其作为由治疗引起的粘膜炎严重程度和/或潜在毒性的指标。4.研究设计将40只叙利亚金色仓鼠分为5组，每组8只。在第0天使所有动物在其左侧颊囊接受40Gy的单剂量急性辐射。这可以通过麻醉动物并将其左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物其它部位而实现。根据表5的详述，通过每天一次皮下注射施用测试物。在第6天开始在临床上评估粘膜炎，并每隔一天评估，持续直至第28天。表5.SCI-02研究设计<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*第0天在辐射前30分钟给药。5.材料和方法5.1进行研究的场所在马萨诸塞州沃特敦(Watertown，MA)，经BiomodelAAALAC认证的实验室进行研究。该研究得到了BiomoddIACUC的证实批准。5.2动物使用在研究开始时为5-6周龄、平均体重为85.3g的雄性LVG叙利亚金色仓鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳号对每只动物进行编号，并以每笼8只动物的小组进行圈养。在研究开始前，使动物适应环境。在这个为期5天的过程中，每天观察动物以淘汰不健康的动物。5.3圈养在提供有过滤空气、温度为70°F+/-5°F、相对湿度为50%+/-20%的动物房中进行研究。设定动物房以保持最小为12-15的每小时换气量。所述动物房受自动定时器调控，保持12小时接通和12小时关闭的光/暗循环，没有微光。使用5^Z-(9-Cbfe⑧垫料。垫料最少每周更换一次。利用市售去污剂清洗笼、盖和瓶子等，并风干。使用市售消毒剂对表面和引入橱内的材料进行消毒。每天清扫地板并且每周最少利用市售去污剂拖洗两次。每个月利用稀释的漂白溶液将墙和笼架擦拭至少一次。对于所有笼舍，均使用具有确定研究、剂量、动物编号和治疗组所必须的适当信息的笼舍卡片或标签进行标记。记录研究过程中的温度和相对湿度，并保留记录。5.4饮食使用PurinaLabdiet5061鼠粮饲喂动物，并提供水，供其任意取食。5.5动物随机选择和分配在辐射前，按照预期将动物随意分成5个治疗组。通过与个体编号对应的耳号识别每只动物。为了得到更为一致的身份识别，使用耳号编号而非标签，这是因为标签在研究过程中可能会被移动。使用笼舍卡片或标有研究编号(SCI-02)、治疗组编号和动物编号的标签确定每个笼舍。5.6皮下给药和药物应用提供粉末状的测试化合物SCV-07，并在施用前溶于无菌的PBS中。制备三种稀释液100ng/mL，10pg/mL和1pg/m。通过带有27G针的结核菌素注射器，使用对各组适当的SCV-07稀释液，以0.1ml/100g体重的体积施用药物。在背部或腹部进行皮下注射。5.7粘膜炎的诱导利用标准的急性辐射方法诱导粘膜炎。在第0天向所有动物施用单剂量辐射(40Gy/剂)。利用160千伏电压(15-ma)源在30cm的焦距产生辐射，使用0.35mmCu过滤体系硬化。以3.2Gy/分钟的速率耙向辐射左侧颊囊粘膜。在辐射前，用腹膜内注射氯胺酮(160mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉动物。利用铅屏保护仓鼠身体的其它部位，将左侧颊囊外翻，固定并分离。5.8粘膜炎评分在上述研究的过程中，计算粘膜炎评分、体重变化和生存状态。为了对粘膜炎进行评估，利用吸入麻醉剂麻醉动物，并将左侧颊囊外翻。通过与经验证的图片判断标准进行比较，对粘膜炎进行目测评分，范围为0(正常)至5(严重溃疡，临床评分)。利用描述的方式，此判断标准的定义如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表6SCI-02:粘膜炎评分认为1-2的评分表示疾病的轻度阶段，而3-5的评分表示中度至重度粘膜炎。目测评分后，利用标准技术对每只动物的粘膜进行拍照。在实验总结时，将所有底片显影并随机对照片进行编号。利用上述判断标准，由至少两位经过训练的独立观察员对照片进行以盲测分级(盲测评分)。6.结果和讨论6.1生存状态在该研究过程中没有观察到死亡。6.2体重变化对每日平均百分体重变化数据进行评估。在研究过程中，盐水处理的对照仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的44.1%。在研究过程中，在从第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的49.9%。在研究过程中，在从第-1天至第20天每天两次接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的61.3%。在研究过程中，在从第-1天至第20天每天一次接受lmg/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的63.4%。在研究过程中，在从第-l天至第20天每天两次接受lmg/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值是其初始体重的69.1%。通过计算每只动物体重增加的曲线下面积(AUC)评估这些差异的显著性，然后利用单向ANOVA检验比较不同治疗组。该分析的结果表明，SCV-07治疗组和对照组之间具有显著差异(P=0.012)。每天两次用100pg/kg治疗的组和每天一次用1mg/kgSCV-07治疗的组、每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的组的体重增加都显著大于盐水对照组(分别为P=0.014、P=0.009、P=0.004)。6.3粘膜炎(表7和8)计算每组的每日平均粘膜炎评分。在盐水处理的对照组，在第18天观察到粘膜炎峰值水平，此时的平均评分达到3.0。从第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的组在第16天的粘膜炎平均评分峰值为2.2。从第-1天至第20天每天两次接受100ug/kgSCV-07的组在第14天和第16天的粘膜炎平均评分峰值为2.5。从第-1天至第20天每天一次接受1mg/kgSCV-07的组在第14天的粘膜炎平均评分峰值为2.9。从第-1天至第20天每天两次接受1mg/kgSCV-07的组在第14天的粘膜炎平均评分峰值为2.6。通过计算各组评分为3或更高的天数并利用卡方(x2)检验比较这些数字来评估在不同治疗组间观察到的差异的显著性。该分析的结果示于表7中。盐水处理的对照组仓鼠在所评估的28.1%的动物日中评分都为3或更高。对于在第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的组，在所评估的6.3%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，这与对照组之间存在统计学上的显著差异(P<0.001)。对于在第-1天至第20天每天两次接受100ug/kgSCV-07的组，在所评估的8.9%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，这与对照组之间存在统计学上的显著差异(P〈0.001)。对于第-1天至第20天每天一次用lmg/kgSCV-07治疗的组，在28.1%的动物日具有3或更高的评分，其与对照组在统计学上没有显著差异(P4.000)。第-1天至第20天每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的组，在12.5%的动物日都具有3或更高的评分，其与对照组之间存在统计学上的显著差异(PO.OOl)。每天一次用100pg/kgSCV-07治疗的组与每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的组之间，评分为3或更高的动物天数在统计学上没有显著差异(P:0.054)。利用Mann-Whitney秩和分析对粘膜炎评分进行进一步分析，以比较各组的每日评分。这个分析的结果示于表8中。在此分析中，通常需要粘膜炎评分显著下降2天才能视为粘膜炎明显缓解。相对于盐水对照组，在第-l天至第20天每天一次用100ug/kgSCV-07治疗的组在研究的第14天(？=0.011)、第16天(P=0.002)和第18天(P=0.001)显示统计学上的显著改善。相对于对照，在第-1天至第20天每天两次用100ug/kgSCV-07治疗的组在第18天(PO.001)和第20天(P=0.003)显示出显著改善。相对于对照，在第-l天至第20天每天一次用1mg/kgSCV-07治疗的组的粘膜炎在研究中任一天都没有显示任何显著改善。相对于对照，在第-l天至第20天每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的组在第16天(P二0.043)、第18天(P^.009)和第20天(P-0.007)显示出显著改善。通过对每天一次用100pg/kgSCV-07治疗的组和每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的组进行比较，仅在第14天显示出单日的统计学显著差异(P-0.005)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表7.SCI-02.各组动物评分为3或更高的总天数的卡方分析。这个统计量是溃疡严重程度的计算值，是具有临床重要性的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表8.SCI-02.利用Mann-Whitney秩和检验，测定所观察的每日粘膜炎评分的组间差异显著性。这个非参数统计量适合于粘膜炎目测评分判断标准。显示了各个计算的P值。下划线表示显著改善。7.结论1.根据死亡率和体重增加的观察结果，在该研究中没有来自SCV-07的任何毒性的证据。2.与盐水对照组相比，每天两次用100吗/mlSCV-07治疗的组、每天一次用1mg/mlSCV-07治疗的组或每天两次用1mg/mlSCV-07治疗的组的体重增加显著增加(分别为P^.014、P二0.009和PK).004)。3.在第-1天至第20天每天一次用100pg/mlSCV-07治疗的动物评分为3或更高的动物天数显示出统计学上的显著降低(P<0.001)，并且在第14天(P=0.011)、第16天(P-0.002)和第18天(P=0.001)的单日评分也显示出统计学的显著降低。4.在第-1天至第20天每天两次用100ug/kgSCV-07治疗的动物评分为3或更高的动物天数显示出统计学上的显著降低(P<0.001)，并且在第18天(PO.OOl)和第20天(P=0.003)的单日评分也显示出统计学上的显著提高。5.在第-1天至第20天每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的动物评分为3或更高的动物天数显示出统计学的显著降低(P<0.001)，并且在第16天(P=0.043)、第18天(P^.009)和第20天(P-0.007)的单日评分也显示出统计学的显著提高。6.从第-1天至第20天每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的动物，其粘膜炎评分没有显示出任何显著降低。7.每天一次用100吗/kgSCV-07治疗的组与每天两次用1mg/kgSCV-07治疗的组之间，评分为3或更高的动物日数没有统计学上的显著差异(P=0.054)。当比较这两组的单日评分时，仅在第14天观察到显著的差异(P=0.005)。这些观察结果表明，每天一次用100pg/kgSCV-07治疗与每天两次用lmg/kgSCV-07治疗的显著改善非常接近。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>9.2附表4-粘膜炎评分天<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>实施例3:SCV-07在治疗仓鼠由分次辐射诱导的口腔粘膜炎中的作用功效的研究1.介绍1.1背景已经发现KGF-1和其他FGF家族成员在BDF-1中诱导口腔和食道粘膜表面的上皮增厚。人们认为SCV-07和衍生的SCV-07肽具有可能与KGF-1重叠的机制，并且发现了它们在其他粘膜损伤模型中的保护作用。口腔溃疡粘膜炎是癌症药物治疗和放疗中常见的疼痛性、剂量限制性毒性。这种疾病被表征为导致形成溃疡性病变的口腔粘膜损坏。在粒细胞减少的患者中，伴有粘膜炎的溃疡是常导致败血症或菌血症的天然口腔细菌的常见入口。在接受抗肿瘤药物治疗的患者中，有三分之一以上发生一定程度的粘膜炎。在使用白血病诱导疗法或者多种骨髓移植预处理方案治疗的患者中，所述粘膜炎的发生频率和严重程度明显增加。在这些个体中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕见。中度至重度粘膜炎发生于几乎所有接受头部和颈部肿瘤放疗的患者中，并且通常始于15Gy的累积辐射量，而后在总剂量达到60Gy或以上时加重。粘膜炎的发展在临床上经历三个阶段1.疼痛性红斑，其通常可以由局部麻醉剂或非镇静性镇痛剂控制。2.常伴有假膜形成的疼痛性溃疡。在并发性骨髓抑制(concomitantmyelosuppression)的情况下，由口腔起源的菌血症或败血症并不罕见。疼痛的强度通常需要麻醉药镇痛，常为肠胃外施用。3.自愈，发生在停止抗肿瘤治疗后的约2-3周。目前，唯一批准用于预防和/或治疗粘膜炎的生物物质或药物是Kepivance(palifermin)。Kepivance的应用限于为治疗恶性血液病而接受干细胞移植的患者的粘膜炎。因此，粘膜炎的标准疗法由舒缓性洗剂(palliativerinses)组成，例如盐水、碳酸氢盐溶液、漱口液、局部镇痛剂(例如利多卡因)和/或全身施用的麻醉药。粘膜炎作为生物过程的复杂性仅在最近才被关注。已经提出所述病症代表口腔粘膜细胞和组织、活性氧、促炎性细胞因子、凋亡介体、多个信号通路和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)间的连续相互作用。尽管上皮细胞退化和损坏最终导致粘膜溃疡，但与辐射诱导的粘膜毒性相关的早期变化似乎发生在内皮和粘膜下层的结缔组织内。辐射和化疗两者引发粘膜炎发展的整体机制似乎是类似的。1.2分次辐射模型已经证明由本课题的主要研究者开发的分次辐射仓鼠模型是提供对抗粘膜炎化合物初步评估的一项准确、有效且经济的技术。在这个模型中，在第0、1、2、3、7、8、9和10天使仓鼠左侧颊囊接受8个7.5Gy的剂量，而在急性辐射研究中在第0天使用40Gy的单剂量。使用这个辐射方案的基本原理是它更加接近于癌症患者接受放疗的临床过程。在这个模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定义，并在辐射后约14-16天达到粘膜炎评分峰值。分次辐射模型的死亡率(通常来自麻醉剂的副作用)稍高于急性辐射模型中观察到的死亡率，因此组的大小提高(至每组10只)以进行实验。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是评估皮下注射施用的SCV-07对由分次辐射方法诱导的口腔粘膜炎的发病频率、严重程度和持续时间的影响。2.2研究概述在第O、1、2、3、6、7、8和9天对40只雄性叙利亚金色仓鼠的左侧颊囊施用8剂7.5Gy的辐射。这通过麻醉动物并将其左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物身体的其他部位而完成。如表9中的详述，通过每天一次皮下注射施用测试物。从第7天开始，对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天评估，持续到第35天。施用表9所列的测试物，第1组和第2组从第-1天至第29天给药，第3组仅在辐射日给药，第4组在第-15天至第29天之间的非辐射日(第-l天、第4天、第5天和第10-29天)给药。3.评估3.1粘膜炎评估从第6天开始对粘膜炎的级别进行评分，随后每隔一天进行评分，直至第34天(包括第34天)。根据以下参数，评估与安慰剂相比，每种药物治疗对粘膜炎的效果3丄1各组仓鼠具有溃疡粘膜炎(评分23)的不同天数的差异。在进行评估的每一天，将各药物治疗组中粘膜炎盲测评分^3的动物数量与对照组进行比较。在累积的基础上比较差异，并通过卡方分析确定统计学上的显著性。在这个分析中，将功效定义为与对照组相比，动物组患有溃疡(评分23)的天数显著降低。3丄2每日粘膜炎评分的秩和差异对于每个评估日，利用非参数秩和分析将对照组的评分与治疗组的评分进行比较。如果治疗组从第6天至第28天中的两天或更多天的评分在统计学上显著降低，则认为是治疗成功。3.2体重和生存状态每天都对所有动物进行称重并记录其生存状态，以评估治疗组间可能存在的动物体重差异，其作为由治疗引起的粘膜炎严重程度和/或潜在毒性的指标。4.研究设计在第0、1、2、3、6、7、8和9天对40只雄性叙利亚金色仓鼠的左侧颊囊施用8个7.5Gy的剂量辐射。这通过麻醉动物并将其左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物身体的其他部位而完成。如表9中的详述，上午8点通过皮下注射施用测试物，每天一次。从第6天开始对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天进行一次直至第34天。施用表9所列的测试物，第1组和第2组从第-1天至第29天给药，第3组仅在辐射日(第0-3天和第6-10天)给药，第4组在第-1天至第29天之间的非辐射日(第-l天、第4天至第5天和第10-29天)给药。表9.SCI-03.研究设计<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>第O、1、2、3、6、7、8和9天在辐射前约30分钟注射SCV-07。5.材料和方法5.1进行研究的场所在马萨诸塞州沃特敦，经BiomodelsAAALAC认可的实验室进行研究。5.2动物使用在研究开始时为5-6周龄、平均体重为85.3g的雄性LVG叙利亚金色仓鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳号对每只动物进行编号，并以每笼约IO只动物的小组进行圈养。在研究开始前，使动物适应环境5天，并在此期间，每天观察动物以淘汰不健康的动物。5.3圈养在提供有过滤空气、温度为70。F+A5。F、相对湿度为50%+/-20%的动物房中进行研究。设定动物房以保持最小为12-15的每小时换气量。所述动物房受自动定时器调控，保持12小时接通和12小时关闭的光/暗循环，没有微光。使用SW-(9-Cofo⑧垫料，垫料最少每周更换一次。利用市售去污剂清洗笼、盖和瓶子等，并风干。使用市售消毒剂对表面和引入橱内的材料进行消毒。每天清扫地板并且每周最少利用市售去污剂拖洗两次。每个月利用稀释的漂白溶液将墙和笼架擦拭最少一次。对于所有笼舍，均使用具有确定研究、剂量、动物编号和治疗组所必须的适当信息的笼舍卡片或标签进行标记。记录研究过程中的温度和相对湿度，并保留记录。5.4饮食使用PurinaLabdie^S)5061鼠粮饲喂动物，并提供水，供其任意取食。5.5动物随机选择和分配在辐射前，按照预期将动物随意分成4个治疗组。通过与个体编号对应的耳号识别每只动物。为了得到更为一致的身份识别，使用耳号编号而非标签，这是因为标签在研究过程中可能会被移动。使用笼舍卡片或标有研究编号(SCI-03)、治疗组编号和动物编号的标签确定每个笼舍。5.6皮下给药和药物应用提供粉末状的测试化合物人SCV-07肽，并在施用前溶于无菌的PBS中。通过具有27G针的结核毒素注射器施用0.1体积的药物。在背部或腹部进行皮下注射。5.7粘膜炎诱导利用Philips160kVp(千伏电压)(18.75-ma)X射线源在30cm的焦距产生辐射，并使用3.0mm的硬化A1过滤体系。以3.32Gy/分钟的速率靶向辐射左侧颊囊粘膜。带有Victoreen530型剂量计的所述源标度表明施用速率为28.57nC/分钟。利用这个标度，每只动物每个时间点在每个辐射剂量接受的能量约为64.5nC(纳库仑)。在辐射前，用腹膜内注射氯胺酮(160mg/kg)禾口甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉动物。利用铅屏，将左侧颊囊外翻、固定并分离。5.8粘膜炎评分在上述研究的过程中，计算粘膜炎评分、体重变化和生存状态。为了对粘膜炎进行评估，利用吸入麻醉剂麻醉动物，并将左侧颊囊外翻。通过与经验证的图片判断标准进行比较，对粘膜炎进行目测评分，范围为0(正常)至5(严重溃疡，临床评分)。利用描述的方式，此判断标准的定义如下表10SCI-03:粘膜炎评分<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>认为1-2的评分表示疾病的轻度阶段，而3-5的评分表示中度至重度粘膜炎。目测评分后，利用标准技术对每只动物的粘膜进行拍照。在实验总结时，将所有底片显影并随机对照片进行编号。利用上述判断标准，由至少有两位经过训练的独立观察员对照片进行以盲测分级(盲测评分)。6.结果6.1存活状态在该研究中，对照组在第8天由于辐射所需的麻醉而发生一例死亡。6.2体重变化研究组之间的体重变化没有显著性差异。对每日平均百分体重变化数据进行评估。在研究过程中，盐水处理的对照仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的76.3%。在研究过程中，在从第-1天至第29天接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的80.7%。在研究过程中，在辐射日接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值仅为其初始体重的66.3%。在研究过程中，在第-l天、第4天、第5天和第10-29天接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的69.7%。通过计算每只动物体重增加的曲线下面积(AUC)评估这些差异的显著性，然后利用单向ANOVA检验比较不同治疗组。这个分析的结果表明不同治疗组之间没有显著差异(P=0.490)。6.3粘膜炎(表ll和12)对照动物之间粘膜炎发展的动力学和严重程度与预期的一致。计算每组的每日平均粘膜炎评分。在盐水处理的对照组，在第19天出现为3.2的粘膜炎平均评分峰值。从第-1天至第29天接受SCV-07的组在第19天出现为3.3的粘膜炎平均评分峰值。在辐射日(第0-3天和第6-9天)接受SCV-07的组在第17天出现为3.0的粘膜炎平均评分峰值。在第1、4、5天和第10-29天接受SCV-07的组在第17、19和23天出现为2.9的粘膜炎平均评分峰值。通过计算各组评分为3或更高的天数并利用卡方(x2)检验比较这些数字来评估在不同治疗组间观察到的差异的显著性。该分析的结果示于表11中。盐水处理的对照组仓鼠在所评估的36%的动物日评分都为3或更高。从第-l天至第29天接受SCV-07的组中，在所评估的32.7%的动物日观察到3以上的粘膜炎评分，其与对照组之间并没有统计学上的显著差异(P=0.448)。对于在第0-3天和第6-9天接受SCV-07的组，在所评估的24%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，这与对照组之间存在统计学上的显著差异(P:0.002)。对于在第-1、4、5和第10-29天接受SCV-07的组，在所评估的30.7%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，其与对照组之间并没有统计学上的显著差异(P二0.204)。利用Mann-Whitney秩和分析对粘膜炎评分进行进一步分析，以比较各组的每日评分。这个分析的结果示于表12中。在此分析中，通常需要粘膜炎评分显著下降2天才能视为粘膜炎明显缓解。在第-1天至第29天用SCV-07治疗的组在第29天(P=0.004)、第31天(P=0.017)和第33天(P=0.002)明显好于盐水对照。在第0-3天和第6-9天用SCV-07治疗的组在第21天(P=0.047)、第23天(PO.OOl)、第25天(P=0.009)、第29天(PO.OOl)、第31天(P=0.015)和第33天(PO扁)明显好于盐水对照。在第-1、4、5天和第10-29天用SCV-07治疗的组在第29天(P〈0.001)、第31天(P^.004)和第33天(PO.001)明显好于盐水对照。36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表ll.SCI-03.各组动物评分为3或更高的总天数的卡方分析。这个统计量是溃疡严重程度的计算值，是具有临床重要性的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表12.SCI-03.利用Mann-Whitney秩和检验，测定所观察的每日粘膜炎评分的组间差异显著性。这个非参数统计量适合于粘膜炎目测评分判断标准。显示了各个计算的P值。下划线表示粘膜炎评分相对于对照的显著降低。7.结论1.根据死亡率和体重增加的观察结果，在该研究中没有来自SCV-07的任何毒性的证据。2.在辐射日(第0-3天和第6-9天)用100pg/kg人SCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上显著降低(P-0.002)，在第21天(P《047)、第23天(P〈0.001)、第25天(P-0.009)、第29天(P〈0.001)、第31天(P^.015)和第33天(P〈0.001)的粘膜炎评分显著降低。这个结果表明，SCV-07可有效降低粘膜炎的整体严重程度，从而可以促进粘膜炎损伤的消退。3.在第-1天至第29天或者在非辐射日(第-l、4、5和第10-29天)用SCV-07治疗的仓鼠并未显示出评分为3或更高的动物天数的显著降低，但却在第29、31和33天显示出粘膜炎评分的显著降低。4.以施用辐射的方案为基础比较SCV-07的功效可以了解其某些作用机制，但仍需要进一步评估。实际上，在非辐射日施用药物的SCV-07方案并不像预期的一样有效，尤其对于在连续多日治疗的动物更是如此。另外，所有用SCV-07治疗的动物在研究晚期的应答都相同，这一观察结果表明SCV-07在辐射诱导的粘膜炎的整体发病机理和消退中发挥多重作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例4:SCV-07在治疗仓鼠由顺铂和急性辐射组合诱导的口腔粘膜炎中的研究之前利用SCV-07的研究表明，在由急性辐射和分次辐射诱导的口腔粘膜炎疾病仓鼠模型中SCV-07均可有效治疗所述疾病。在这个研究中，在由化疗和辐射组合诱导的口腔粘膜炎仓鼠模型中，具体在采用顺铂和辐射组合诱导的口腔粘膜炎仓鼠模型中，评估SCV-07的功效。方法将40只金色叙利亚仓鼠按照预期随机分成大小相等的四个组。通过在第-1天施用5mg/kg的单个剂量顺铂并在第0天施用35Gy的单个剂量辐射，在金色叙利亚仓鼠的左侧颊囊诱导粘膜炎。从第-1天开始并每天一次持续至第20天，通过皮下注射以10吗/kg、100吗/kg或lmg/kg的剂量施用100pL体积的SCV-07。每天对动物活动和体重进行评估。从第6天开始并持续在研究过程中每隔一天进行评估，利用标准评分6点判断标准对口腔粘膜炎进行评估。在整个研究过程中，利用卡方检验对评分为3的溃疡粘膜炎的天数进行评估，并利用秩和检验对每日单组评分进行评估。结果在所有试验组中，用SCV-07治疗的动物的粘膜炎均受到有利的作用。重度粘膜炎从溶剂对照组中所评估的50%动物日降低至SCV-07治疗动物中的约30%。在疾病过程的后期阶段，粘膜炎达到峰值之后，可以观察到最显著的影响。没有观察到各组之间在体重变化上的显著差异。在试验过程中没有动物死亡。结论1.根据死亡率和体重增加的观察结果，在该研究中没有来自SCV-07的任何毒性的证据。.在第-1天至第20天利用10pg/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上的显著降低(P<0.001)，并且在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(P<0.001)的粘膜炎评分显著降低。3.在第-1天至第20天利用100pg/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上的显著降低(P<0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第22天(P=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(P<0.001)和第28天(P<0.001)的粘膜炎评分显著降低。4.在第-1天至第20天利用lmg/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上的显著降低(P<0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P=0.012)、第24天(P=0,001)、第26天(P=0.003)和第28天(P<0.001)的粘膜炎评分显著降低。1.1背景已经发现KGF-1和其他FGF家族成员在BDF-1中诱导口腔和食管粘膜表面的上皮增厚。认为SCV-07和衍生的SCV-07肽具有可能与KGF-1重叠的机制，并且发现了它们在其他粘膜损伤模型中的保护作用。口腔溃疡粘膜炎是癌症药物治疗和放疗中常见的疼痛性、剂量限制性毒性。这种疾病被表征为导致形成溃疡性病变的口腔粘膜损坏。在粒细胞减少的患者中，伴有粘膜炎的溃疡是常导致败血症或菌血症的天然口腔细菌的常见入口。在接受抗肿瘤药物治疗的患者中，有三分之一以上发生一定程度的粘膜炎。在使用白血病诱导疗法或者多种骨髓移植预处理方案治疗的患者中，所述粘膜炎的发生频率和严重程度明显增加。在这些个体中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕见。中度至重度粘膜炎发生于几乎所有接受头部和颈部肿瘤放疗的患者中，并且通常始于15Gy的累积辐射量，而后在总剂量达到60Gy或以上时加重。粘膜炎的发展在临床上经历三个阶段1.疼痛性红斑，其通常可以由局部麻醉剂或非麻醉镇痛剂控制。2.常伴有假膜形成的疼痛性溃疡。在并发性骨髓抑制的情况下，由口腔起源的菌血症或败血症并不罕见。疼痛的强度通常需要麻醉药镇痛，常为肠胃外施用。3.自愈，发生在停止抗肿瘤治疗后的约2-3周。目前，唯一批准用于预防和/或治疗粘膜炎的生物物质或药物是Kepivance(palifermin)。Kepivance的应用限于为治疗恶性血液病而接受干细胞移植的患者的粘膜炎。因此，粘膜炎的标准疗法由舒缓性洗剂组成，例如盐水、碳酸氢盐溶液、漱口液、局部镇痛剂(例如利多卡因)和/或全身施用的麻醉药。粘膜炎作为生物过程的复杂性仅在最近才被关注。已经提出所述病症代表口腔粘膜细胞和组织、活性氧、促炎性细胞因子、凋亡介体、多个信号通路和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)间的连续相互作用。尽管上皮细胞退化和损坏最终导致粘膜溃疡，但与辐射诱导的粘膜毒性相关的早期变化似乎发生在内皮和粘膜下层的结缔组织内。辐射和化疗两者引发粘膜炎发展的整体机制似乎是类似的。1.2利用顺铂的口腔粘膜炎化学-辐射模型。已经证明由本课题的主要研究者开发的化学-辐射仓鼠口腔粘膜炎模型是提供对抗粘膜炎化合物初步评估的一项准确、有效且经济的技术。在这个模型中，仓鼠在第-1天接受5mg/kg的单剂量顺铂，接着在第0天在左侧颊囊接受35Gy的单剂量辐射，而在急性辐射研究中在第0天使用40Gy的单剂量。该模型中的粘膜炎病程与急性辐射模型非常类似，并在辐射后约16-18天达到粘膜炎评分峰值。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是评估皮下注射施用的SCV-07对由分次辐射方法诱导的口腔粘膜炎的发病频率、严重程度和持续时间的影响。2.2研究概述仓鼠在第-1天通过腹膜内注射接收5mg/kg的单剂量顺铂，然后在第0天在左侧颊囊接收35Gy的单剂量辐射。这通过麻醉动物并将其左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物其它部位而实现。如表13的详述，通过每天一次皮下注射施用测试物。在第6天开始，对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天评44估，持续至第28天。从第-l天至第20天施用测试物。3.评估3.1粘膜炎评估从第6天开始对粘膜炎的级别进行评分，随后每隔一天进行评分，直至第28天(包括第28天)。根据以下参数，评估与安慰剂相比，每种药物治疗对粘膜炎的效果3丄1各组仓鼠具有溃疡粘膜炎(评分23)的不同天数的差异。在进行评估的每一天，将各药物治疗组中粘膜炎盲测评分》3的动物数量与对照组进行比较。在累积的基础上比较差异，并通过卡方分析确定统计学上的显著性。在这个分析中，将功效定义为与对照组相比，动物组患有溃疡(评分23)的天数显著降低。3丄2每日粘膜炎评分的秩和差异对于每个评估日，利用非参数秩和分析将对照组的评分与治疗组的评分进行比较。如果治疗组从第6天至第28天中的两天或更多天的评分在统计学上显著降低，则认为是治疗成功。3.2重量和生存状态每天都对所有动物进行称重并记录其生存状态，以评估治疗组间可能存在的动物体重差异，将其作为由治疗引起的粘膜炎严重程度和/或潜在毒性的指标。4.研究设计4540只雄性叙利亚金色仓鼠在第-1天通过腹膜内注射接受5mg/kg顺铂。在第0天，向所有动物的左侧颊囊施用35Gy的急性辐射剂量。这通过麻醉动物并将左侧颊囊外翻，同时用铅屏保护动物其它部位而实现。如表13中的详述，通过皮下注射施用测试物，每天一次。在第6天开始，对粘膜炎进行临床评估，并每隔一天进行评估直至第28天。表13.SCI-04.研究设计<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*第0天在辐射前30分钟进行给药。5.材料和方法5.1进行研究的场所在马萨诸塞州沃特敦，经BiomodelsAAALAC认可的实验室进行研究。该研究得到了BiomodelsIACUC的的正式批准，IACUC批准号07-0620-01。5.2动物使用在研究开始时为5-6周龄、平均体重为90g的雄性LVG叙利亚金色仓鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳号对每只动物进行编号，并以每笼约10只动物的小组进行圈养。在研究开始前，使动物适应环境5天，并在此期间，每天观察动物以淘汰不健康的动物。5.3圈养在提供有过滤空气、温度为70°F+/-5°F、相对湿度为50%+/-20%的动物房中进行研究。设定动物房以保持最小为12-15的每小时换气量。所述动物房受自动定时器调控，保持12小时接通和12小时关闭的光/暗循环，没有微光。使用B^Z-(9-Co^⑧垫料。垫料最少每周更换一次。利用市售去污剂清洗笼、盖和瓶子等，并风干。使用市售消毒剂对表面和引入橱内的材料进行消毒。每天清扫地板并且每周最少利用市售去污剂拖洗两次。每个月利用稀释的漂白溶液将墙和笼架擦拭最少一次。对于所有笼舍，均使用具有确定研究、剂量、动物编号和治疗组所必须的适当信息的笼舍卡片或标签进行标记。记录研究过程中的温度和相对湿度，并保留记录。5.4饮食使用PurinaLabdiet5061鼠粮饲喂动物，并提供水，供其任意取食。5.5动物随机选择和分配在辐射前，按照预期将动物随意分成4个治疗组。通过与个体编号对应的耳号识别每只动物。为了得到更为一致的身份识别，使用耳号编号而非标签，这是因为标签在研究过程中可能会被移动。使用笼舍卡片或标有研究编号(SCI-04)、治疗组编号和动物编号标的标签确定每个笼舍。5.6皮下给药和药物应用提供粉末状的测试化合物人SCV-07肽，并在施用前溶于无菌的PBS中。利用具有27G针的结核毒素注射器施用0.1体积的药物。在背部或腹部进行皮下注射。5.7粘膜炎诱导在这个研究中，用顺铂和辐射的组合诱导粘膜炎。在第-l天单次注射(IP)施用5mg/kg顺铂。在第0天施用35Gy的单焦点辐射剂量。利用Philips160kVp(千伏电压)(18.75-ma)X-射线源在30cm的焦距产生辐射，并使用3.0mm硬化Al过滤体系。以3.32Gy/分钟的速率靶向辐射左侧颊囊。带有Victoreen模型530剂量计的所述源标度表明施用速率为28.57nC/分钟。利用这个标度，每只动物在每个辐射剂量接受的剂量约为688.6nC(纳库仑)。在辐射前，利用腹膜注射氯胺酮(160mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉动物。利用铅屏，将左侧颊囊外翻、固定并进行分离。5.8粘膜炎评分在上述研究的过程中，计算粘膜炎评分、体重变化和生存状态。为了对粘膜炎进行评估，利用吸入麻醉剂麻醉动物，并将左侧颊囊外翻。通过与经验证的图片判断标准进行比较，对粘膜炎进行目测评分，范围为0(正常)至5(严重溃疡，临床评分)。利用描述的方式，此判断标准的定义如下表14SCI-04:粘膜炎评分<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>认为1-2的评分代表疾病的轻度阶段，而3-5的评分表示中度至重度粘膜炎。目测评分后，利用标准技术对每只动物的粘膜进行拍照。在实验总结时，将所有底片显影并随机对照片进行编号。利用上述判断标准，由至少有两位经过训练的独立观察员对照片进行以盲测分级(盲测评分)。6.结果和讨论6.1生存状态在这个研究中没有观察到死亡。6.2体重变化研究组之间的体重变化没有显著性差异。对每日平均百分体重变化数据进行评估。在研究过程中，盐水处理的对照仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的46.5%。在研究过程中，在从第-1天至第20天接受10ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的51.3%。在研究过程中，在从第-1天至第20天接受100ug/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的46.7%。在研究过程中，在从第-1天至第20天接受lmg/kgSCV-07的组中，仓鼠的平均体重增加值为其初始体重的48.8%。通过计算每只动物体重增加的曲线下面积(AUC)评估这些差异的显著性，然后利用单向ANOVA检验比较不同的治疗组。这个分析的结果表明不同治疗组之间没有显著差异(P=0.663)。6.3粘膜炎(表15和16)对照动物之间粘膜炎发展的动力学和严重程度与预期的一致。计算每组的每日平均粘膜炎评分。在盐水处理的对照组，在第18天出现为3.1的粘膜炎平均评分峰值。从第-1天至第20天接受10ug/kgSCV-07的组在第16天出现为2.9的粘膜炎平均评分峰值。从第-1天至第20天接受100ug/kgSCV-07的组在第14天和第16天出现为2.8的粘膜炎平均评分峰值。在第-1天至第20天接受1mg/kgSCV-07的组在第16天出现为3.2的粘膜炎平均评分峰值。通过计算各组评分为3或更高的天数并利用卡方(x2)检验比较这些数字来评估在不同治疗组间观察到的差异的显著性。该分析的结果示于表15中。盐水处理的对照组仓鼠在所评估的50%的动物日评分都为3或更高。从第-l天至第20天接受10ng/kgSCV-07的组中，在所评估的34.2%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，其与对照组之间并没有统计学上的显著差异(P<0.001)。从第-1天至第20天接受100pg/kgSCV-07的组中，在所评估的29.2%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，其与对照组之间存在统计学上的显著差异(P<0.001)。从第-1天至第20天接受100^g/kgSCV-07的组中，在所评估的30.8%的动物日观察到3或更高的粘膜炎评分，其与对照组之间并没有统计学上的显著差异(P<0.001)。利用Mann-Whitney秩和分析对粘膜炎评分进行进一步分析，以比较各组的每日评分。这个分析的结果示于表16中。在此分析中，通常需要粘膜炎评分显著下降2天才能视为粘膜炎明显缓解。与盐水对照相比，在第-1天至第20天用10pg/kgSCV-07治疗的组在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(P<0.001)的粘膜炎明显较少。与盐水对照相比，在第-l天至第20天用100ng/kgSCV-07治疗的组在第6天(P:0.015)、第22天(？=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(P<0.001)和第28天(P<0.001)的粘膜炎明显较少。与盐水对照相比，在第-1天至第20天用lmg/kgSCV-07治疗的组在第6天(P=0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P=0.012)、第24天(P=0.001)、第26天(P=0.003)和第28天(P〈0扁)的粘膜炎明显较少。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表15.SCI-04各组动物评分为3或更高的总天数的卡方分析。这个统计量是溃疡严重程度的计算值，是具有临床重要性的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表16.SCI-04.利用Mann-Whitney秩和检验，测定所观察的每日粘膜炎评分的组间差异显著性。这个非参数统计量适合于粘膜炎目测评分判断标准。显示了各个计算的P值。下划线表示粘膜炎评分相对于对照的显著降低。7.结论1.根据死亡率和体重增加的观察结果，在该研究中没有来自SCV-07的任何毒性的证据。2.从第-1天至第20天利用10|ag/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上的显著降低(PO.OOl)，并且在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(PO.OOl)的粘膜炎评分显著降低。3.从第-1天至第20天利用100pg/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上显著降低(P〈0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第22天(P=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(PO.001)和第28天(PO.001)的粘膜炎评分显著降低。4.从第-1天至第20天利用lmg/kgSCV-07治疗的动物显示出粘膜炎评分为3或更高的天数在统计学上显著降低(PO.001)，并且在第6天(P:0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P二0.012)、第24天(P-O.OOl)、第26天(？=0.003)和第28天(PO.001)的粘膜炎评分显著降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>9.2附表8-粘膜炎评分<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>权利要求1.用于治疗、预防、抑制或减轻由粘膜疾病引起的受试者组织退化、损伤或损害，或者恢复受所述疾病不利影响的受试者组织的治疗方法，其包括向所述受试者施用有效量的式A的免疫调节化合物其中，n为1或2，R为氢、酰基、烷基或肽片段，X为芳族氨基酸或杂环氨基酸或者其衍生物。2.如权利要求1的方法，其中X为L-色氨酸或D-色氨酸。3.如权利要求1的方法，其中所述化合物为SCV-07。4.如权利要求1的方法，其中所述化合物的施用剂量在约0.001-2000mg的范围内。5.如权利要求l的方法，其中所述化合物的施用剂量在约0.01-100mg的范围内。6.如权利要求1的方法，其中所述化合物的施用剂量在约0.1-10,000ug/kg受试者体重的范围内。7.如权利要求1的方法，其中所述化合物的施用剂量在约1-1,000ug/kg受试者体重的范围内。8.如权利要求l所述的方法，其中所述疾病是由受试者接受的辐射或化疗中的至少一种引起的。9.如权利要求l所述的方法，其中所述粘膜包括口腔粘膜或食道粘膜中的至少一种。10.如权利要求l所述的方法，其中所述疾病包括粘膜炎或溃疡性损害中的至少一种。11.如权利要求8的方法，其中所述辐射施用的累积剂量至少为约15Gy。12.如权利要求8的方法，其中所述辐射施用的累积剂量至少为约40Gy。13.如权利要求8的方法，其中所述辐射施用的累积剂量至少为约60Gy。14.如权利要求8所述的方法，其中化疗包括顺铂。15.如权利要求14的方法，其中所述顺铂的施用剂量在0.1-50mg/kg的范围内。16.如权利要求14的方法，其中所述顺铂的施用剂量为约5mg/kg。全文摘要利用免疫调节化合物治疗粘膜疾病。文档编号A61K38/00GK101657210SQ200880011935公开日2010年2月24日申请日期2008年2月11日优先权日2007年2月13日发明者伊斯雷尔·里奥斯,辛西娅·塔特希尔申请人:希克龙制药公司