专利名称：调节补体系统的激活以用于治疗出血相关炎症的制作方法
调节补体系统的激活以用于治疗出血相关炎症 与相关专利申请的参考本专利申请要求分别于2007年3月6日和2007年3月7日提交的美国 临时专利申请号60/905， 178和60/905， 356的优先权权益，所述专利文 献整体通过提及而合并入本文。发明背景血友病A的发生比率据估计为在IO， OOO个男性中出现1个，而血友 病B的发生比率为在25， OOO个男性出现l个。血友病的主要并发症是在 关节中的关节内出血。超过90。/。的具有严重血友病的患者将会具有关节 出血，除非在年轻时提供凝血因子替代作为预防。平均来说，严重血 友病患者每年将会经历17次关节出血。反复的关节出血导致血友病性 滑膜炎。目前的疗法包括用凝血因子vni进行预防，然而，替代疗法必须 在年轻时开始，以便阻止滑膜炎的发展。当替代失败，或者受试者变得对此类替代具有抵性时，采用按需疗法(on-demand therapies)。 此类疗法包括施用镇痛药例如C0X-2抑制剂和水袋，随后为滑膜切除术 和最终为全关节置换术。上述疗法中没有一种减轻与出血相关的炎症 性损害，并且此外，关于由C0X-2抑制剂介导的心血管风险的关注导致 C0X-2抑制剂撤出了市场。用于治疗与出血相关的关节炎症的备选和/ 或改良的治疗方法可能对于这些和其他患者将会具有显著的益处。发明概述本文所描述的发明提供了几种用于治疗出血相关炎症例如滑膜炎 的新方法，在此类治疗中有用的組合物，以及相关的方法和组合物。 在第一个示例性的方面，本发明提供了用于在有此需要的哺乳动物受 试者中治疗滑膜炎、减少滑膜炎的发生率、减少滑膜炎的严重度、或 者延迟滑膜炎的发作的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的取 消或减少所述受试者中补体途径的激活的试剂(即，"补体途径激活调节剂(complement pathway activation modulating agent)"， 其也可以称为"CPAMA"或CPAM试剂；如果在本文中使用术语"试剂"， 那么它一般指的是CPAMA，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛 盾)。在相关意义中，本发明提供了此类试剂在治疗滑膜炎或其他出 血相关炎症中的用途，并且还提供了此类试剂在制备用于治疗此类病 状的药物中的用途。在另一个意义中，本发明提供了包含CPAMA的产品 (例如药学上可接受的组合物)，所述产品用于治疗滑膜炎(例如血 友病性滑膜炎)或其他出血相关炎症(其可以包括或不包括滑膜炎)。 在一个实施方案中，待通过上述用途/方法进行治疗的受试者患有 血友病(其可以是血友病A或血友病B或两者)。在另一个方面，受试 者还或者备选地患有另一种出血病症。在另一个方面，患者可以患有 出血相关炎症，其可以包括或不包括血友病性滑膜炎或滑膜炎(一般 地)。在一个具体的实施方案中，所述CPAM试剂是生物学试剂(或生物 分子一 —例如蛋白质、糖蛋白、聚糖、核酸、脂质等，其在生物体中 天然产生，或者是此类分子的变体或衍生物)，该试剂在一个实施方 案中是抗体。在一个更具体的实施方案中，所述CPAM试剂是特异性地 与C5a受体(C5aR)的胞外环相互作用的抗体。在一个实施方案中，所 述CPAM抗体还或者备选地特异性地抑制或取消C5a与其关联(cognate ) 受体的结合。在一个具体的示例性实施方案中，所述CPAM抗体由具有 ECACC登录号00110609、 02090226或02090227,或ATCC登录号HB 11382、 HB 11384或HB-11625的杂交瘤产生。因此，本发明还提供了此类试剂 在治疗此类病状中和在制备用于治疗此类病状的药物中的用途。本发4明还提供了包含任何这些试剂的产品，所述产品用于治疗滑膜炎或出 血相关炎症(其可以包括或不包括滑膜炎)。在另一个实施方案中，所述试剂是寡肽，其一般限于非抗体肽、 多肽或蛋白质(或其衍生物)。在一个实施方案中，所迷试剂是小分子化合物。通常，在本发明 的情况下的小分子化合物(或在用于鉴定在实践本文所描述的本发明方法中有用的化合物的方法情况下的候选试剂)是具有大于约100道尔 顿且小于约2， 500道尔顿的分子量的非肽小有机化合物。此类小分子化 合物/小分子候选试剂通常包含关于与蛋白质(例如C5a和/或C5aR )的 结构相互作用(例如通过氢键键合)而言所需的官能团，并且通常至 少包括胺基团、羰基、羟基和/或羧基，和一般包括这些官能团中的至 少两种。此类小分子化合物通常还包含环状碳或杂环结构和/或芳香族 或多芳香族结构，其常常被一个或多个上述官能团取代。小分子还或 备选地可以特别选自糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶以及任何前述 物质的衍生物、结构类似物或组合。合适的小分子化合物通常是有机 分子，优选具有大于100道尔顿且小于约2， 500道尔顿的分子量的小有 机化合物，其包含至少一个胺基团、羰基、羟基和/或羧基，并且包含 环状碳或杂环结构。在一个具体的示例性实施方案中，所述CPAM小分 子试剂选自N- ((4-二甲基氨基苯基)甲基)-N- (4-异丙基苯基)-7-甲氧 基-1， 2, 3， 4-四氢萘-1-曱酰胺盐酸化物、R (-) -2- [4'-异丁基苯基)-丙酰基氨基]-l，l-二甲基哌啶错碘化物、([R]-2-(4-异丁基-苯 基)-N-(3-哌咬-l-基-丙基)-丙酰胺和3-芳基-5， 6-二取代的哒溱，或 者任何前述物质的组合(这个短语自始至终也应当理解为包括所有前 迷物质的组合)。在另一个方面，所述CPAM小分子化合物是在例如WO 2006128670中所描述的C5aR的苯基氨基化合物拮抗剂。在一个实施方案中，所述方法进一步包括给受试者施用止血剂，例如凝血因子，其在某些实施方案中是凝血因子xin、凝血因子IX、 凝血因子vn、凝血因子vni、纤维蛋白原，或者任何前述物质的生物 学活性片段、任何前述物质的功能性变体或任何前述物质的衍生物，5或者任何前述物质的組合。在一个示例性实施方案中，所述方法进一试剂，所述试剂在一个实施方案中是编码所述凝血因子的核酸，所述试剂在另一个实施方案中编码凝血因子XIII、凝血因子IX、凝血因子vn、凝血因子vin、纤维蛋白原、凝血酶或蛋白质抗纤维蛋白溶解剂 (例如抑酶肽)，或者前述物质的衍生物或变体、或任何前述物质的 的组合。CPAM试剂可以以任何合适的方式取消或减少任何合适的补体途径 的激活。在一个实施方案中，所述CPAM试剂取消或减少C5a表达、C5a 与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或任何前述内容的组合。在一个实施方案中，所述CPAM试剂作为药物组合物的一部分进行 施用，所述药物组合物在一个实施方案中被配制成用于口服、关节中 (局域性的)、静脉内、皮下或局部施用。因此，在一个示例性实施 方案中，本发明提供了此类药物组合物，其中所述组合物被配制为可 注射制剂。本发明的方法一般可以用于治疗任何类型的滑膜炎。在一个实施 方案中，滑膜炎是急性的，或者在另一个实施方案中，滑膜炎是慢性 的。在另外一个实施方案中，滑膜炎是急性前期的(pre-acute)。包 含此类试剂的组合物可以被指明在这些适应症中的一种或多种之中使 用，并且所述方法通过在使用此类组合物用于此类目的方面对患者、 保健提供者等进行教导而促进包含此类试剂的组合物的销售和使用。在另一个方面，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗出 血相关炎症(其可以包括或不包括滑膜炎，并且更特别地可以排除普 遍地与血友病或者与一种类型的血友病(例如血友病A)相关的滑膜 炎)、减少出血相关炎症的发生率、减少出血相关炎症的严重度、或 延迟出血相关炎症的发作(或进展)的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的取消或减少所述受试者中补体途径的激活的试剂(即 CPAMA)。在另一个方面，本发明提供了新的药物组合物，其可以例如用于6治疗任何上述病症/病状。在一个示例性实施方案中，本发明提供了药 物组合物，其包含有效量的取消或减少补体途径的激活的试剂，例如
上述抗体之一 (例如本文其他地方所描述的抗C5a抗体之一)，以及凝 血因子或其他止血剂(例如，去氨加压素(DDAVP)或抗纤维蛋白溶解 剂例如氨甲环酸和氨基己酸)。
在另一个方面，本发明提供了抑制或减少C5a受体(C5aR)的激活 的试剂用于治疗滑膜炎的用途。滑膜炎可以是急性的、'隄性的或亚急 性的(并且可以与一种或多种类型的血友病相关)。在一个不同的方 面，本发明提供了此类试剂在制备用于治疗滑膜炎的药物中的用途。 在另一个具体的方面，所述试剂是对于C5aR特异的抗体。在另一个方 面，所述试剂还或者备选地用作用于在具有血友病的患者中治疗滑膜 炎的药物。在一个具体方面，所述试剂是抗体，所述抗体由下述杂交 瘤表达，或者包含由下述杂交瘤表达的抗体的功能性部分具有ECACC 登录号00110609、 02090226或02090227,或ATCC登录号HB 11382或HB 11384或HB-11625的杂交瘤。本发明还提供了包含此类试剂的产品(例 如，药学上可接受的组合物)，所述产品用于治疗此类病状(在具有 此类病状或处于形成此类病状的危险中的患者之中)。
在另一个方面，本发明提供了 (a)取消或减少C5aR的激活的试剂 和(b)凝血因子或止血因子的组合用于治疗滑膜炎的用途。本发明还 提供了包含此类要素組合的组合物。在一个具体方面，所述凝血因子 或止血因子选自凝血因子XIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、 凝血因子VII、凝血因子VIII、纤维蛋白原、凝血酶、任何前述物质的 变体、任何前述物质的衍生物、以及任何前述物质的组合。
本发明还提供了抑制或减少C5aR的激活的试剂用于治疗滑膜炎， 用于治疗出血相关炎症的用途。在一个方面，所述试剂是对于C5aR特 异的抗体。在另一个方面，所述试剂还或者备选地特异性地结合C5aR 的胞外环。在一个示例性方面，所述试剂是抗体，所述抗体由下述杂 交瘤表达(或等价于由下述杂交瘤表达的抗体)，或者包含由下述杂 交瘤表达的抗体的功能性部分(例如CDRs)，或者基本上由下述杂交瘤表达的抗体组成具有ECACC登录号00110609 、 02090226或 02090227，或ATCC登录号HB 11382或HB 11384或HB-11625的杂交瘤。 本发明还提供了此类抗体在治疗出血相关炎症和更特别地(或备选地) 滑膜炎例如血友病性滑膜炎中的用途(以及此类试剂在制备用于此类 病状的药物中的用途)。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的 取消或减少补体途径的激活的CPAM试剂，和编码凝血因子或其他止血 剂的核酸。
在一个实施方案中，在所述药物组合物中的CPAM试剂是生物学试 剂(或"生物分子")，其在一个实施方案中是抗体，或在另一个实 施方案中是寡肽。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血因子 VIII、凝血因子IX、凝血因子VII、凝血因子X、凝血因子XI、任何前 述物质的活性片段、任何前述物质的变体、或任何前述物质的衍生物。
在另一个实施方案中，在所述药物组合物中的CPAM试剂取消或减 少C5a表达、C5a与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或者任何或所 有前述内容的组合。
在另外一个实施方案中，所述药物组合物被配制成用于口服、静 脉内、皮下或局部施用，或者在另一个实施方案中，所述药物组合物
:陂配制为可注射制剂。
这些方面和实施方案在该文件中所提供的本发明描述之中进一步 进行描述，并且本发明的另外方面、实施方案、特征和优点(例如， 通过使用具有本文所描述的试剂的特征的测试候选物，来鉴定在上述 治疗方案中有用的试剂或试剂组合的方法)将会由于在该文件中所提 供的本发明描述而显而易见。
本发明的示例性方面和特征
为了更好地举例说明本文所描述的发明，此处提供了本发明的示
例性方面和特征的非限制性列表
1.在有此需要的受试者中治疗滑膜炎、减少滑膜炎的发生率、减
8少滑膜炎的严重度、或者延迟滑膜炎的发作或延迟滑膜炎的进展的方 法，所述方法包括给受试者施用有效量的取消或减少所述受试者中补 体途径的激活的试剂。
2. 根据方面l的方法，其中所述受试者患有血友病。
3. 根据方面1或方面2的方法，其中所述试剂是抗体。
4. 根据方面3的方法，其中所述抗体特异性地与C5a受体(C5aR) 的胞外环相互作用。
5. 根据方面3或方面4的方法，其中所述抗体特异性地抑制或取消 C5a与其关联受体的结合。
6. 根据方面4的方法，其中所述抗体由具有ECACC登录号 00110609、 02090226或02090227，或ATCC登录号HB 11382或HB 11384 或HB-11625的杂交瘤产生。
7. 根据方面l-6中任一项的方法，其进一步包括给所述受试者施 用有效量的凝血因子或其他止血因子。
8. 根据方面7的方法，其中所述因子是凝血因子XIII、凝血因子 IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子VII、凝血因子vin、纤维蛋 白原、凝血酶、任何前述物质的变体、或任何前述物质的衍生物、或 任何前述物质的组合。
9. 根据方面l-8中任一项的方法，其中所述试剂取消或减少C5a 表达、C5a与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。
10. 根据方面l-9中任一项的方法，其中所述试剂作为药物组合物 的一部分进行施用。
11. 根据方面10的方法，其中所述药物组合物被配制成用于静脉 内、皮下或关节中(局域性的)施用。
12. 根据方面10的方法，其中所述药物组合物被配制为可注射制剂。
13. 根据方面1-12中任一项的方法，其中所述滑膜炎是急性的或 亚急性的。
14. 在有此需要的受试者中治疗出血相关炎症、减少出血相关炎
9症的发生率、减少出血相关炎症的严重度、或者延迟出血相关炎症的 发作或进展的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的取消或减少 所述受试者中补体途径的激活的试剂。
15. 根据方面14的方法，其中所述试剂是抗体。
16. 根据方面15的方法，其中所述抗体特异性地与C5a受体(C5aR) 的胞外环相互作用。
17. 根据方面15或方面16的方法，其中所述抗体特异性地抑制或 取消C5a与其关联受体的结合。
18. 根据方面16的方法，其中所述抗体由具有ECACC登录号 00110609、 02090226或02090227，或ATCC登录号HB 11382或HB 11384 或HB-11625的杂交瘤产生。
19. 根据方面14-18中任一项的方法，其进一步包括给所述受试者
施用有效量的凝血因子或其他止血因子。
20. 根据方面19的方法，其中所述凝血因子是凝血因子XIII、凝 血因子IX、凝血因子VII、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子VIII、 纤维蛋白原、凝血酶、或任何前述物质的变体、或任何前述物质的衍 生物、或4壬4可前述物质的组合。
21. 根据方面14-19中任一项的方法，其中所述试剂取消或减少 C5a表达、C5a与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。
22. 根据方面14-21中任一项的方法，其中所述试剂作为药物组合 物的一部分进行施用。
23. 用于治疗出血相关炎症的药物组合物，其包含有效量的(a)
组合:、''''，'、' -,、
24. 根据方面23的药物组合物，其中所述试剂是单克隆抗体或活 性抗体片段。
25. 根据方面24的药物组合物，其中所述抗体特异性地与C5a受体 (C5aR)的胞外环相互作用。
26. 根据方面24或方面25的药物组合物，其中所述抗体特异性地
10抑制或取消C5a与其关联受体的结合。
27. 根据方面25的药物組合物，其中所述抗体由具有ECACC登录号 00110609、 02090226或02090227'或ATCC登录号HB 11382或HB 11384 或HB-11625的杂交瘤产生。
28. 根据方面23-27中任一项的药物组合物，其中所述凝血因子是
凝血因子xni、凝血因子ix、凝血因子vn、凝血因子vni、纤维蛋白 原、或任何前述物质的变体、或任何前述物质的衍生物、或4壬何前述 物质的组合。
29. ;f艮据方面23-28中任一项的药物组合物，其中所述试剂取消或 减少C5a表达、C5a与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。
30. 根据方面23-29中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物 被配制成用于皮下、静脉内或关节中(局域性的)施用。
31. 根据方面23-30中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物 被配制为可注射制剂。
这些方面在本文所提供的本发明描述中更充分地进行描述，并且 本发明的另外方面、特征和优点将会由于本文所提供的本发明描述而 显而易见。
附图简述
在说明书的结论部分中特别指出被视为本发明的主题，并且在那 里明确要求进行保护。然而，当与附图一起阅读时，通过参考下面的 详细描述可以最好地理解本发明，其中涉及组织构成和操作方法以及 其目标、特征和优点，在所述附图中
图l呈现了人正常滑膜组织中C5aR表达的显微照片。显示了用 W17/1 (B)以及用IgG对照(A)探测的人滑膜的免疫组织化学。
图2呈现了显微照片，其显示了在免疫测定法中通过抗人C5aRl抗 体对人骨关节炎滑膜进行染色。
图3呈现了显微照片，其显示了在免疫测定法中通过抗人C5aRl抗体对人血友病性滑膜炎组织进行染色。
发明详述
在下面的详细描述中，阐述了众多具体细节，以便提供对于本发 明的彻底理解。然而，本领域技术人员将会理解，本发明可以无需这 些具体细节而进行实践。在其他情况下，未详细描述众所周知的方法、 操作程序和组分，以便不使本发明含糊不清。
在某些实施方案中，本发明旨在用于在有此需要的受试者中治疗 和/或预防对于动关节(滑膜关节)的损害，或出血相关炎症，或两者 的组合物和/或方法(以及还有此类组合物在治疗此类病状或者在制备 用于治疗此类病状的药物中的用途)。
在某些实施方案中，滑膜炎应当理解为包括任何病因学的关节的 滑膜或关节软骨的任何炎症。在某些实施方案中，滑膜炎或关节病可 以具有自身免疫病因学、炎症、创伤或其他，它们中的任何都代表了 本发明的实施方案。在某些实施方案中，滑膜炎是外伤性滑膜炎、滑 膜的炎症、或对于关节的关节软骨的损害。在某些实施方案中，滑膜 炎是血友病性滑膜炎。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗的组合物，其可以包 括被特别配制用于关节内和/或肠胃外使用，用于在例如治疗和/或预 防滑膜炎和/或对于关节软骨的损害中使用，例如用于手术后关节灌洗
或者治疗和/或预防炎性关节炎、骨关节炎(OA)和/或退行性关节病 (DJD)的组合物。使用此类组合物的此类具体方法是本发明的另外方 面。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治 疗滑膜炎、减少滑膜炎的发生率、减少滑膜炎的严重度、或者延迟滑 膜炎的发作或进展的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的取消 或减少所述受试者中补体途径的激活的试剂。
在一个方面，本发明涉及治疗一种或多种与出血相关炎症有关的
12疾病、病症或病状的方法。在一个实施方案中，术语"治疗"包括预 防性的以及病症緩解性的治疗。在某些实施方案中，术语"治疗"包 括"减少"、"阻抑，，和"抑制"疾病、病症和/或病状，或与之相关 的症状。在某些实施方案中，术语"减少"、"阻抑，，和"抑制"具 有其通常理解的含义，即在另一个实施方案中变少或降低疾病、病症 或病状的发生率、严重度或发病机制，或者在另一个实施方案中延迟 疾病、病症或病状的发生率、严重度或发病机制，或者在另一个实施 方案中减少疾病、病症或病状的发生率、严重度或发病机制。在实施 方案中，术语治疗是指延迟的与疾病、病症或病状相关的症状的进展， 延长的与疾病、病症或病状相关的症状的緩解，减少的与疾病、病症 或病状相关的症状的发生率，和/或与疾病、病症或病状相关的症状的 改善。在一个实施方案中，术语"治疗"、"减少"、"阻抑"或"抑 制"是指与所示疾病、病症或病状相关的发病率、死亡率或其组合的 减少。关于本发明的治疗方法的这些术语和类似概念可以从个体方面 进行评估，或者更通常地就具有相关病状的个体群体，例如具有通过 临床试验所确定的病状的大多数患者来说进行评估。在一个实施方案 中，关于疾病或病状而言，术语"进展"是指范围或严重度的增加、 前进、增长或变得更糟。在一个方面，本发明的方法提供了用于减少 或终止病状的进展(或降低病状进展的可能性)的手段，所述病状例 如为滑膜炎(例如血友病患者中的滑膜炎)。在另一个实施方案中， 术语"复发"意指在緩解或潜伏状态后疾病的回复。在一个方面，根
滑膜炎的复发可能性。在一个实施方案中，本发明的治疗方法减少疾 病的严重度。在另一个实施方案中，应用本文所描述的本发明方法还 或者备选地可以减少与疾病相关的症状。在另外一个实施方案中，根 据本发明的治疗方法还或者备选地可以在个体中减少在疾病过程中正 常表达的生物标志物的数目。
一般地，本发明的任何方法可以任选地
包括下述步骤通过本领域已知用于评估此类内容(例如病状严重度、 生活质量等)的相关测试来检测患者或其他受试者的状态(例如健康)
13是否已被改变(通常为改善)。
在一个实施方案中，术语"治疗，，及其所包括的方面是指施用给具有所示疾病、病症或病状的受试者，或者在某些实施方案中，施用给易患所示疾病、病症或病状的受试者(或已被鉴定为处于形成所述疾病、病症或病状的危险(通常为紧急危险)中的受试者)。术语"易患"被认为尤其是指与在所示疾病的发生率、严重度等方面的倾向或统计学增加相关的遗传特性镨或家族关系。在某些实施方案中，术语
"易患"被认为尤其是指与所示疾病的增加的危险相关的生活方式。在某些实施方案中，术语"易患"被认为尤其是指与所示疾病相关的
生物标志物的存在。还可能由于与素质(predisposition )不相关(或已知相关)的病状，例如与损伤相关的出血病状，或者与或可能与炎症相关的病状而存在危险。
在另一个实施方案中，本发明方法的实践可以减少靶疾病、病状或病症的发病机制。在某些实施方案中，术语"减少发病机制"应当理解为包括减少与特定疾病、病症或病状相关的组织损害或器官损害。在另一个实施方案中，术语"减少发病机制"应当理解为包括减少所考虑的那种相关疾病、病症或病状的发生率或严重度。在另一个实施方案中，术语"减少发病机制"应当理解为包括减少所示的相关疾病、病症或病状或者与之相关的症状的数目。
术语"施用"或其语法形式是指使受试者与本发明的化合物接触。施用可以在体外即在试管中完成，或者在体内即在活的生物体例如人的细胞或组织中完成(或者离体)。在一个实施方案中，本发明包括给哺乳动物受试者例如人患者施用本发明的化合物。
在某些实施方案中，术语"试剂的有效量"是指这样的量，其可检测地取消或减少受试者例如人患者中补体途径的激活(此类量通常可以称为"生理学有效量")。在一个方面，本发明涉及这样的方法，即给受试者施用生理学有效量的CPAM试剂，以便诱导、促进和/或增强其中的生理学效应，例如出血相关炎症的减少、 一种或多种补体途径的抑制(例如，C5a/C5aR相互作用的抑制)等等。在某些实施方案中，术语"有效量"是这样的量，其导致所示疾病、病症或病状的治疗，包括如本文所述的"治疗"的任何实施方案。在某些实施方案中，术语"试剂的有效量"是指这样的量，其还或者备选地导致该化合物的治疗效果或治标效果的量。试剂的此类量(在任一或两种情况下)可以称为"治疗有效量"。对于预防或减少发作、减少发作可能性等而言有效的试剂的量可以称为"预防有效量，，。在
一个实施方案中，给受试者提供治疗有效量的CPAM试剂，以便促进、诱导或增强治疗效果(例如，血友病性滑膜炎的治疗)。在另一个实施方案中，给受试者提供预防有效量的CPAM试剂，以在受试者中减少形成病状的危险、延长达到病状发作时的时间、减少紧急病状的可能严重度，等等。
术语"试剂，，和"化合物，，是同义的，并且在本文中可互换使用，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛盾。
术语"化合物"是指CPAM试剂，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛盾。
在某些实施方案中，术语"试剂"表示化学化合物，化学化合物的混合物，生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白质或其部分例如肽)，或由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制得的提取物。此类试剂的活性可以使得它适合于作为"治疗剂"，所述治疗剂是生物学、生理学或药理学活性物质，所述物质在受试者中局域性地或全身性地发挥作用，从而产生治疗上有益的生理学效应。
本发明的方法可以应用于任何合适的哺乳动物。在某些实施方案中，"受试者"或"宿主"是指人或非人哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是灵长类动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是啮齿类动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是农场动物和/或家庭宠物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人患者。
在一个方面，如本文所描述的，本发明提供了用于在有此需要的受试者例如被诊断为具有此类病状的人患者中治疗滑膜炎、关节病和/
15或出血相关炎症的方法和/或组合物。
在一个实施方案中，受试者患有血友病。在一个实施方案中，受
试者患有血友病A。在另一个实施方案中，受试者患有血友病B。在另一个方面，受试者患有非血友病性滑膜炎(其可以例如与职业或运动损伤相关)。
在一个实施方案中，所述CPAM试剂取消或减少补体途径的激活，所述补体途径在一个实施方案中是经典途径，或在另一个实施方案中是旁路途径，或者在另一个实施方案中，所述试剂取消或减少这两种途径的激活。
在一个实施方案中，所述试剂取消或减少(a) Cl激活；(b)组分C4和C2这两者的部分的切割；(c)激活的复合物C4b2a的形成；(d)C3的切割；(e)C3b的产生；(f) C4b2a3b的形成；(g)C5的切割；(h)膜攻击单元的形成；或(i)任何前述内容的组合。
在一个实施方案中，所述试剂取消或减少C3b产生，例如通过取消或减少(a ) C3被切割成C3a和C3b; ( b ) C3bBb的形成，C5被切割成C5a和C5b和/或膜攻击单元的起始；(c) C5b与C6和C7相组合而形成C5bC6C7; (d) C5bC6C7与C8相组合；(e)多个C9相组合而形成进一步的末端膜攻击复合物，其在细胞表面上引起细胞溶解；或(f)任何前述内容的组合。在一个方面，所述试剂取消或减少C3 (通过调节C3和/或C3受体的功能)、C1和/或C5。
CPAM试剂一般地可以是任何合适的试剂，所述试剂以减少出血相关炎症的方式减少补体激活。适合性可以由普通技术人员/从业者就毒性、在促进所需生理学或治疗效果方面的有效性等来进行测定。此类试剂可以包括本领域已知的抗体，肽，抑制剂，拮抗剂，或其他，例如描述于Makrides， S. C. Pharmacological Reviews 50: 59-78(1998);美国专利号5，135，916; 3， 3'-亚脲基双[6-(2-氨基-8-羟基-6-硫-l-萘基偶氮)苯磺酸，四钠盐，舒拉明钠，氨曱环酸，肝素，氧肟酸衍生物(例如，水杨基氧將酸(SHA)或乙酰氧肟酸(AHA));经取代的酰胺；经取代的羟胺；醛將(例如水杨基醛將)；羟苯基化
16合物(例如儿茶素或氢化咖啡酸)；薛；齐墩果酸；和麻黄。目前可从例如Parke-Davis， Arm Arbor, Mich. ， USA和Behringer AG,Morburg， Germany商购获得补体抑制剂；美国专利申请公开号20060105980中所描述的适体(aptamer)，以及本领域技术人员已知
的其他。
在另一个实施方案中，所述CPAM试剂是生物学试剂，其在一个实施方案中是这样的试剂，所述试剂特异性地取消或减少C5a表达、C5a与关联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。在某些实施方案中，此类试剂是抗体，所述抗体在某些实施方案中，特异性地与C5a受体(C5aR)的胞外环相互作用，或在某些实施方案中，特异性地抑制或取消C5a与其关联受体的结合。在一个具体实施方案中，所述CPAM试剂是特异性地与不位于C5aR的N-末端处或附近的C5aR的胞外环结合的抗体(其可以是抗体片段、抗体衍生物等)或其他分子(例如抗体模拟物)。在一个更加具体的实施方案中，所述CPAM试剂是与C5aR的第二个环结合的抗体或其他分子。此类抗体的实例描述于例如WO03/062278和US 200524406中。可以为有用的CPAM试剂的其他分子以及相关或者有关的原理、方法等例如描述于下列文献中Valentino等人，下文,Lee等人，下文，Schnathaum等人，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters 16 (2006) 5088-5092, Scola等人，JBC Papersin Press (手稿M609178200 ，其于2006年12月11日在线开于http: 〃丽.jbc. org/cgi/doi/10. 1074/jbc. M609178200);和Rinder等人，Ann. Thorac. Surg. 2007; 83:146-52。关于实践本发明方法的相关原理也例如描述于下列文献中Dunn等人，Curr. Opin.Hematol. 12:390-394 (2005); Roosendaal等人，Seminars inThrombosis and Hemostasis, 29 (1): 37-42; Arumugam等人，ClinicaChmimica Acta 374 (2006) 33-45 ; 和Tsoukas等人，Blood,107 (5): 1786-1790 (2006)。
在一个具体的示例性实施方案中，所述抗体由具有ECACC登录号00110609、 02090226或02090227，或ATCC登录号HB 11382或HB 11384或HB-11625的杂交瘤产生。
在某些实施方案中，所述抗体如美国专利申请公开号20030175267
中所述，或者在另一个实施方案中，所述抗体如美国专利申请公开号20050244406中所述，或者在另一个实施方案中，所述抗体如美国专利号5，480， 974中所述，或者在另一个实施方案中，所述抗体如美国专利号5， 177， 190中所述，或如日本专利号JP 08109200 A中所述，或如世界知识产权组织z^开号WO 9516033中所述，或如Thomas， TC等人，MolImmunol 1996; 33: 1389-1401中所述。在某些实施方案中，本发明的方法/组合物利用此类抗体的组合，或者此类抗体和本文所述的其他试剂的组合，被视为本发明的一部分的任何组合。
因此，使用本领域众所周知的标准方法可以产生并鉴定出针对补体受体或配体的抗体，所述方法中仅一些在本文中例示。在某些实施方案中，抗体可以通过本领域已知的用于制备和表征抗体的常规手段
来制备(参见例如，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, 1988)。
在某些实施方案中，用于产生单克隆抗体(MAbs)的方法通过下列方式而开始依照本发明用免疫原性组合物对动物进行免疫接种，其中取决于所采用的抗原组成和方案，有或没有先前的免疫耐受(例如对于正常细胞群体耐受，然后用肺瘤细胞群体进行免疫接种)；并且从那个经免疫接种的动物中收集抗血清。在某些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
广泛范围的动物物种可以用于产生抗血清。通常，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。因为兔具有相对较大的血量，所以常常使用兔(尽管不是唯一地使用)来产生多克隆抗体。
如本领域众所周知的，给定的组合物可以在其免疫原性方面不同。因此，常常必需加强宿主免疫系统，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体相偶联而达到的。示例性的且优选的栽体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白
18或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于将多肽与载体蛋白质相缀合的 手段是本领域众所周知的，并且包括戊二醛、间-马来酰亚氨基苯曱酰
基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮化联苯胺。
还如本领域众所周知的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过 使用免疫应答的非特异性刺激剂(称为佐剂)而得到增强。示例性的 且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌 (#7co6ac^e77i//B f"6ercw/o57s)的免疫应答的非特异性刺激剂)、 不完全弗氏佐剂、和氢氧化铝佐剂。
在多克隆抗体的产生中所使用的免疫原组合物的量依免疫原的性 质以及用于免疫接种的动物而变。各种途径可以用于施用免疫原(皮 下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可以通过在免疫接种后的各个 点时取经免疫接种的动物的血样来监控多克隆抗体的产生。还可以给 予第二次加强注射。重复加强和滴定的过程，直至达到合适的滴度。 当获得所需的滴度水平时，可以对经免疫接种的动物进行采血，并且 分离和贮存血清，和/或所述动物可以用于产生MAbs。
MAbs可以容易地通过使用众所周知的技术来制备，例如在美国专 利号4，196， 265 (其通过提及而合并入本文)中所例示的那些。通常，
所述免疫原组合物例如为纯化或部分纯化的肿瘤细胞或血管内皮细胞 蛋白质、多肽、肽或完整细胞组合物。以对于刺激抗体生成细胞而言 有效的方式施用免疫接种组合物。啮齿类动物例如小鼠和大鼠是优选 的动物，然而，使用兔、绵羊、蛙细胞也是可以的。使用大鼠可以提 供某些优点，但小鼠是优选的，其中BALB/c小鼠是最优选的，因为这 是最常规使用的并且一般产生更高百分比的稳定融合。
在免疫接种后，选择具有用于产生抗体的潜力的体细胞，特别是B 淋巴细胞(B细胞)，以用于在产生MAb的方案中使用。这些细胞可以 获自活组织检查的脾、扁桃体或淋巴结，或者获自外周血样品。脾细 胞和外周血细胞是优选的，前者是因为它们是处于分裂性成浆细胞阶 段中的抗体生成细胞的丰富来源，和后者是因为外周血可容易获得。通常，对动物实验对象组进行免疫接种，并且取出具有最高抗体滴度 的动物的脾，并通过用注射器对脾进行匀浆而获得脾淋巴细胞。通常，
来自经免疫接种的小鼠的脾包含约5 x 107 - 2 x 1 08个淋巴细胞。
然后，将来自经免疫接种的动物的抗体生成B淋巴细胞与永生的骨 髓瘤细胞的细胞相融合，所述骨髓瘤细胞一般是与进行免疫接种的动 物相同的物种的细胞。适合于在产生杂交瘤的融合操作程序中使用的 骨髓瘤细胞系优选地是非抗体生成性的，具有高的融合效率以及酶缺 陷，所述酶缺陷使得它们不能在仅支持所需的融合细胞(杂交瘤)生 长的某些选择培养基中生长。
可以使用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，如本领域技术人员已知 的。例如，当经免疫接种的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、 X63-Ag8.653、 NSl/l.Ag 4 1、 Sp210-Ag14、 F0、 NS0/U、 MPC-ll、 MPC11-X45-GTG 1. 7和S194/5XX0 Bul;对于大鼠，可以使用R210. RCY3、 Y3-Ag 1.2.3、 IR983F、 4B210或上文列出的小鼠细胞系之一; 以及U-266 、 GM1500-GRG2、 LICR-L0N-HMy2和UC729-6在人细胞融合 方面都是有用的。
用于产生抗体生成性脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种的方法 通常包括在促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)存在下，将体细 胞与骨髓瘤细胞以4: l的比例相混合，尽管比例可以分别从约20: l至约 1:1变4匕。4吏用4山台病毒的融合方法已由Kohler和Milstein (Nature, 256: 495-497， 1975; Eur. J. Immunol., 6:511-519， 1976 )进行了 描述，以及使用聚乙二醇(PEG)例如37% (v/v) PEG的融合方法已由 Gefter等人(Somatic Cell Genet. ， 3: 231-236， 1977 )进行了描述。 使用电诱导的融合方法也是合适的(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第2版，Academic Press, Orlando, Fla., 第71-74页,1986 )。
融合操作程序可以以低频率(约l x l(T6 - 1 x 10_8)产生活的杂种。
但是，可以通过在选择培养基中进行培养来将活的融合杂种与亲本的、 未融合的细胞区分开。选择培养基可以包含在组织培养基中阻断核苷
20酸的从头合成的试剂。在某些实施方案中，此类试剂包括氨基蝶呤、 氨甲蝶呤、重氮丝氨酸或其他。
在某些实施方案中，选择培养基是HAT。
在某些实施方案中，所述培养提供了从中选择出特定杂交瘤的杂 交瘤群体。在某些实施方案中，通过下列方式来进行杂交瘤的选择 在孩吏量滴定板中通过单克隆稀释(single-clone dilution)来培养细 胞，随后就所需的反应性来测试各个克隆上清液(在约2-3周后)。 在某些实施方案中，测定法可以包括放射免疫测定法、酶免疫测定法、 细胞毒性测定法、噬斑测定法、斑点免疫结合测定法等。
在某些实施方案中，对所选择的杂交瘤进行系列稀释，并且克隆 到各抗体生成细胞系中，所述克隆随后可以无限地繁殖以提供MAbs。 在某些实施方案中，可以如下将细胞系用于MAb产生可以将杂交瘤的 样品注射入(常常注射入腹膜腔中)组织相容性动物类型中，所述动 物用于提供体细胞和骨髓瘤细胞以用于最初融合。经注射的动物形成 肿瘤，所述肿瘤分泌由融合的细胞杂种产生的特异性单克隆抗体。然 后，可以抽取动物的体液例如血清或腹水，以提供高浓度的MAbs。在 某些实施方案中，各细胞系在体外进行培养，其中MAbs天然地被分泌 到培养基中，从所述培养基中可以容易地以高浓度获得它们。在某些 实施方案中，如果需要，使用过滤、离心和各种色镨方法例如HPLC或 亲和层析，进一步纯化通过任一方式产生的MAbs。
在某些实施方案中，可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。 为此，由从经免疫接种的动物的脾中分离的RM制备组合免疫球蛋白噬 菌粒文库，并且通过使用表达抗原的细胞和对照细胞(例如正常对肿 瘤细胞)进行淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。
在某些实施方案中，在本发明中所采用的MAbs具有人、鼠类、猴、 大鼠、仓鼠、鸡或者兔起源。本发明考虑了使用人抗体，具有人恒定 区和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其他物种的"人源化"或嵌 合抗体，以及其他重组抗体及其片段。
在某些实施方案中，用于在本发明的组合物和/或方法中使用的MAbs涉及单克隆抗体的功能性片段的使用。 一般而言，可以在实践本 文所描述的本发明方法之中使用任何合适类型的抗体片段。在某些实 施方案中，使用Fab片段。在某些实施方案中，通过用非特异性巯基蛋 白酶(木瓜蛋白酶)使完整的免疫球蛋白进行蛋白水解来获得Fab片段。 在某些实施方案中，通过用半胱氨酸、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇使活 性位点中的硫氩基还原来激活木瓜蛋白酶。可以通过用EDTA(2 mM) 进行螯合来去除储备酶(stock enzyme)中的重金属，以确保最大的 酶活性。可以以l: IOO的重量比将酶和底物混合在一起。在温育后，通 过用碘乙酰胺使疏醇基发生不可逆的烷基化或者简单地通过透析来终 止反应。可以通过SDS-PAGE来监控消化的完全性，并且通过A蛋白 -Sepharose或离子交换层析来分开各个级分。
在某些实施方案中，功能性片段是F(ab')2片段。在某些实施方案 中，经由用胃蛋白酶进行有限的蛋白水解，而从兔和人起源的IgG制备 F(ab')2片段。条件可以根据免疫球蛋白亚类而变化。
在某些实施方案中，功能性片段是Fc片段，或单链Fv片段，其的 制备是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，所述抑制补体途径的试剂是任何长度的肽、 或蛋白质。肽或多肽通常是指基于单条氨基酸聚合物链的化合物，而 蛋白质可以包含多条相联合的多肽链和/或多个蛋白质单元(例如，蛋 白质可以是二聚体或更高级别的多聚体)。在某些实施方案中，所述 试剂是寡肽。在某些实施方案中，术语"寡肽"是指任何长度的肽， 其包含功能材料，例如蛋白质，或其功能性片段。
在另一个实施方案中，肽可以包含来自任何动物物种(包括人) 的天然多肽的片段，天然(人和非人)多肽及其片段的衍生物，和天 然多肽的变体。在一个实施方案中，"片段"包含有在成熟天然多肽 的序列内的区域，并且在另一个实施方案中，"衍生物"包含天然多 肽的氨基酸序列和糖基化变体以及共价修饰物。在另一个实施方案中， "变体"是指天然多肽的氨基酸序列和糖基化变体。
在某些实施方案中，所述CPAM试剂是环肽C5aR拮抗剂，例如
22AcF-
、 H67KDMQLGR74 、 YSFKPMPLaR 、 NMeFKP 、 NMePHe-Lys-Pro-D-Cha-X-D-Arg、 NMe-FKP、 NMeFKPdChaWr 、氢化肉 桂酸盐-[OP(D-Cha)WR]、 (F-
) 、 CHIPS肽或其类似物、 jim〃os-A8 (jun〃os-C5a-(l-68)-Arg69Ser70Leu71Leu72Arg73 、 A8Delta71-73 (C5a-(1-68)-Arg69Ser70)、或任何前述物质的组合。 在某些实施方案中，所述试剂是corpstatin或其他C3抑制剂。这些试 剂是本领域已知的，并且具体描述于例如WO 03033528A1 、 US 20060160726A1、 US 20060217530A1和WO 04040000中。
在某些实施方案中，所述CPAM试剂是N-((4-二甲基氨基苯基)甲 基)-N- (4-异丙基苯基)-7-曱氧基-1， 2， 3， 4-四氢萘-l-曱酰胺盐酸化 物、R (-) -2- [4'-异丁基苯基)-丙酰基氨基]-1， 1-二甲基哌啶镇碘化 物、([R]-2-(4-异丁基-苯基)-N-(3-哌啶-l-基-丙基)-丙酰胺、3-芳 基-5，6-二取代的哒溱、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸盐、或其任何组 合，或者在某些实施方案中，此类试剂与本文描述的任何其他试剂的 组合。
在某些实施方案中，所述CPAM试剂如美国专利号6355245中所述， 或者在另一个实施方案中，所述试剂如美国专利号5853722中所述，或 者在另一个实施方案中，所述试剂如美国专利号6074642中所述，或者 在另一个实施方案中，所述试剂如美国专利号6723743中所述，或者在 另一个实施方案中，所述试剂如美国专利申请公开号2005/0004031中 所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如美国专利申请公开号 2003/0175267中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如美国专 利申请公开号2005/0226870中所述，或者在另一个实施方案中，所述 试剂如世界知识产权组织公开号WO 2005/092366中所述，或者在另一 个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号WO 2006/004589 中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织公 开号WO 2003/082826中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如 世界知识产权组织公开号WO 2004/043925中所述，或者在另一个实施 方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号WO 2003/061765中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号wo
2003/009803中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识 产权组织公开号2005/074607中所述，或者在另一个实施方案中，所述 试剂如世界知识产权组织公开号WO 2004/022096中所述，或者在另一 个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号冊2003/084524 中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织z厶 开号WO 2003/082829中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如 世界知识产权组织公开号WO 2003/082828中所述，或者在另一个实施 方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号WO 2002/49993中所述， 或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识产权组织公开号WO 2004/018460中所述，或者在另一个实施方案中，所述试剂如世界知识 产权组织^^开号WO 2005/007087中所述，或如Makrides SC， Pharmacol Rev 1998; 50:59-87中所述，或如Morikis， D.等人，Protein Sci 1998; 7: 619-627中所述；或如Pellas TC等人，J. Immunol 1998; 160: 5616-5621中所述；或如Riley RD等人，J Thorac Cardiopvasc Surg 2000; 120: 350-358中所述，所述参考文献中的每一篇通过提及 而全部合并入本文。在另一个实施方案中，所述试剂是其组合，或者 这些与本文描述的任何其他试剂的組合。
在某些实施方案中，所述CPAM试剂抑制与补体途径相关的基因的 表达。在某些实施方案中，所述试剂是核酸。
在一个实施方案中，术语"核酸，，分子是指DNA或RNA，其可以为 单链或双链。核酸可以包括在本质上为原核或真核mRNA的序列。DNA 可以包括来自真核或原核mRNA的cDNA，来自真核或原核DNA的基因组 DNA序列，或者在另一个实施方案中，合成的DM序列。该术语还指包 含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列。在本发明的組合物中的核 酸序列可以是棵核酸，或者在另一个实施方案中，可以被包含在载体 内。
根据本发明的这个方面，并且在一个实施方案中，可以将编码目 的序列的多核苷酸区段连接到商购可得的表达载体系统中，所述表达
24载体系统适合于转导/转化哺乳动物细胞，和适合于指导重组产物在经 转导的细胞内的表达。应当意识到，此类商购可得的载体系统可以容 易地经由常用的重组技术进行修饰，以便替换、加倍或突变现有的启 动子或增强子序列和/或引入任何另外的多核苷酸序列，例如编码另外 的选择标记的序列或编码报道多核苷酸的序列(关于进一步的细节，
参见例如，"Methods in Enzymology"第1-317巻，Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.等人(编 辑)Greene Publishing Associates, (1989),和Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)，或其他标准实验室手册)。
在一个实施方案中，本发明的核酸和/或载体尤其包括核酶、反义 寡核苷酸或对于编码序列特异的miRNA试剂。
在一个实施方案中，术语"miRNA试剂"是指通过RNA干扰机制来
调节耙基因表达的试剂。
在本发明的方法中所使用的miRNA试剂一般可以具有任何合适的 结构。在一个实施方案中，miRNA试剂包括可以形成发夹结构的双链 RNA。在另一个实施方案中，所采用的miRNA试剂是小核糖核酸分子， 或寡核糖核苷酸，其以双链体结构存在，例如在一个实施方案中，彼 此杂交的两个不同的寡核糖核苷酸，或在另一个实施方案中，采取发 夹结构从而产生双链体结构的单个核糖寡核苷酸。
在一个实施方案中，可以根据由制造商提供的说明书，在Applied Bio Systems寡核苷酸合成仪上合成核酸和/或寡核苷酸。在另一个实 施方案中，可以通过本领域普遍已知的许多方法来合成核酸/寡核苷酸 或经修饰的寡核苷酸。
在一个实施方案中，术语"编码序列"是指"编码"特定多肽或 肽的核酸序列。在一个实施方案中，编码序列是当置于合适的调节序 列的控制之下时，在体外或在体内被转录(在DNA的情况下)和被翻译 (在mMA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由在5'(氨 基)末端处的起始密码子和在3'(羧基)末端处的翻译终止密码子来
25确定。编码序列可以包括但不限于，来自原核或真核mRNA的cDNA、来 自原核或真核DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DM序列。转录终止序 列常常位于编码序列的3'。
在一个实施方案中，术语"编码序列"包括编码多肽的DNA序列， 以及转录成抑制性反义分子的DNA序列。
在一个实施方案中，当它涉及载体、核酸及它们在根据本发明的 组合物和/或方法中的用途时，术语"减少表达"是指当与在所述试剂 不存在的情况下的水平相比较时，基因表达水平的降低。
在一个实施方案中，减少的表达可以在转录或翻译水平或其组合 上受到影响。
根据本发明的这个方面，通过使用根据本发明的组合物和/或方法 而减少的表达是特异的。在一个实施方案中，表达的减少经由抑制靼 基因的能力，而不显示对于细胞的其他基因的作用。在其他实施方案 中，可以通过检查细胞或生物体的外在性质或通过生物化学技术来证 实抑制的后果，所述生物化学技术例如为RNA溶液杂交、核酸酶保护、 Northern杂交、用微阵列进行基因表达监控、抗体结合、酶联免疫吸 附测定法(ELISA) 、 Western印迹法、放射免疫测定法(RIA)、其他 免疫测定法、和荧光激活细胞分析(FACS)。
可以通过本领域常规使用的标准方法来评估在细胞内核酸的摄 取。例如，可以对于与本发明的组合物接触的细胞或组织，或由从施 用了本发明的组合物的个体中分离的样品执行滤膜杂交技术(例如， Northern或Southern印迹法)，或者在另一个实施方案中，可以执行 RM酶保护或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，以检测质粒或DNA 的摄取，和测量其表达。可以通过合适的测定法来检测基因产物，例 如通过所产生的蛋白质的免疫学检测，例如用特异性抗体，或者通过 功能测定法以检测基因产物的功能活性，例如酶促测定法。如果待由 细胞表达的目的基因产物无法容易地检验，那么首先可以通过使用与 待使用的调节元件和载体相连接的报道基因来优化表达系统。报道基 因编码这样的基因产物，所述基因产物可容易地检测，并因此可以用于评估该系统的功效。本领域中所使用的标准报道基因包括编码P-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶和人生长激素，或者本文 列出的任何标记物蛋白质的基因。
在某些实施方案中，其表达被减少或取消的基因包含编码补体组
分的序列，例如在NCBI's GenBank数据库中列出的那些，登录号AAA72968 、AAH22312 、NP-001726 、CAH70782 、NP一000195 、
NP一001728、AAH43484、1006226A 、CAA60121 、AAH63851 、
BAD02321、AAA85332、 AAB59537、 。07021、 CAI17449、CAM24859、
CAI41720 、CAM25395 、CAA69849 、AAA59651 、CAA50994 、
AAA51925 、AAA51856 、AAA51855 、AAH63289 、CAI41856 、
AAM10002 、AAD15289 、AAA99717 、AAA51889 、CAB66087 、
ABD48959 、AAR89906 、AAA51890 、AAA35617 、CAA72407 、
AAA35722 、BAB63292 、P01024 、 P0C0L4 、 P0C0L5、P01031 、
P00736、 P00751、 P06681、 P09871、 P02748、 P07358、 P07357，或者 包含DQ895516 、 DQ894720 、 DQ894514 、 DQ894443 、 DQ894054 、 DQ891410、 DQ891257、 NM-000064中所示的序列，或编石马卓卜体受体的序 列，例如在NCBI's GenBank数据库中列出的那些，登录号DQ894940、 DQ895197 、 CAI16725 、CAI16724 、CAI16723 、CAI16044 、 CAI16043、 CAI16042、 AAB60694、 A34924、 CAA48779、 AAA99005、 AAA99004 、 AAA37478 、AAA37477 、 AAA37447 、AAD15289 、 AAB60695、 AAB60694 、 NP一004045 、 NP-004045 、 NP-001002029 、 NP_001727、 AAD14919、 CAA40530、 CAA68674,或本领域已知的那些， 或与其同源的序列，或其组合的抑制或取消。
在一个实施方案中，本发明的组合物/方法进一步包含/利用凝血 因子或者减少出血和/或促进止血的其他试剂/因子("止血因子"或 "止血剂")，它们被施用给有此需要的受试者。在某些实施方案中， 所述凝血或止血因子是凝血因子XIII、凝血因子IX、凝血因子VII、凝 血因子Vin、凝血因子X、纤维蛋白原、凝血酶、抗纤溶酶(ct2-抗纤 溶酶，TAFI)或抗纤维蛋白溶解剂(例如抑酶肽)，或者其衍生物或
27变体，或者其组合。在某些实施方案中，此类因子可以包括天然存在 的或重组的形式，或者其衍生物或变体。
在某些实施方案中，除了CPAM试剂外，本发明的组合物或方法还
包括凝血因子vni蛋白质或多肽。凝血因子vni蛋白质(或"凝血因 子vin"或"Fviir )可以包括天然存在或重组的形式的凝血因子vin，
例如在美国专利号5， 563， 045 ，美国专利号5， 451, 521 ,美国专利号 5, 422, 260,美国专利号5， 004, 803，美国专利号4， 757， 006，美国专 利号5，661， 008，美国专利号5， 789， 203，美国专利号5， 681， 746，美 国专利号5， 595， 886，美国专利号5， 045， 455，美国专利号5， 668， 108， 美国专利号5， 633，150，美国专利号5, 693, 499 ，美国专利号 5, 587, 310，美国专利号5,171， 844，美国专利号5， 149， 637，美国专 利号5，112， 950，美国专利号4， 886， 876, WO 94/11503， WO 87/07144， WO 92/16557， WO 91/09122, WO 97/03195， WO 96/21035， WO 91/07490， EP 0 672 138， EP 0 270 618， EP 0 182 448， EP 0 162 067， EP 0 786 474, EP 0 533 862, EP 0 506 757， EP 0 874 057， EP 0 795 021， EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112， EP 0 160 457， Sanberg 等人，XXth Int. Congress of the World Fed. Of Hemophilia (1992)， 和Lind等人，Eur. J. Biochem. ， 232: 19 (1995)中公开的那种，所 述这些文献通过提及而以其整体合并入本文。在一个方面，在本发明 的方法或组合物中与CPAM试剂相组合的凝血因子是"凝血因子VIII多 肽，，。术语"凝血因子VIII多肽"包括但不限于，凝血因子VII,以及
凝血因子vni相关多肽。术语"凝血因子vnr， 一般意欲包括但不限
于，具有Toole等人，Nature 1984; 312: 342-347中所描述的氨基酸 序列(野生型人凝血因子VIII)的多肽及其等位基因变体。"凝血因
子vin相关多肽，，(其可以用作Fvni的替代物)可以包括但不限于这 样的凝血因子vni多肽，其相对于人凝血因子vni而言已进行了化学 l奮饰和/或包含一个或多个相对于人凝血因子vin而言的氨基酸序列 改变(即凝血因子vin变体)，和/或包含相对于人凝血因子vni而言 截短的氨基酸序列(即凝血因子viii片段)。通常，待在本文描述的
28方法/组合物中使用的凝血因子vni的变体，如同其他凝血因子的变体 一样，将会在氨基酸序列组成方面与相关/相应的人蛋白质具有高水平 的同一性(例如，与其，在该情况下与人凝血因子vin，具有至少约
80%、 85°/。、 90%、 92%、 93%、 95%、 97%或99%的同一性)，并且保留与 人蛋白质至少基本上类似的活性(例如，在调节出血方面，或者如在 相关测定法(例如在US 20030199444中所描述的凝血因子VIII活性测 定法)中所测试的)。术语"凝血因子VIII相关多肽，，意欲包括以其 未切割(酶原)形式存在的此类多肽，以及已经历了蛋白水解加工从 而产生其相应的生物活性形式(其可以称为"凝血因子VIIIa相关多肽" 或"与激活的凝血因子VIII相关的多肽")的那些。短语"凝血因子 VIII相关多肽"包括但不限于，展示出至少显著比例的相对于野生型 人凝血因子VIII而言基本上相同或改善的生物活性的多肽。凝血因子 Vin多肽的非限制性例子包括，例如在Fulcher等人，Proc. Acad. Nat. Sci. USA 1982; 79: 1648-1652和Rotblat等人，Biochemistry 1985; 24: 4294-4300中所描述的血浆衍生的人凝血因子Vin，以及例如在 Fass等人，Blood 1982; 59: 594-600和Knutson等人，Blood 1982; 59: 615-624中所描述的血浆矛汙生的猪FVni。凝血因子VII序列变体的 非限制性例子描述于例如Lollar等人，Blood 2000; 95 (2): 564-568 (杂合的猪/人FVIII多肽)和Lollar等人，Blood 2001; 97(1): 169-174中。商购可得的FVIII产品(所谓的替代产品)通常源自正常 的汇集的血浆或经基因改造的哺乳动物细胞系。常常根据最终纯度来 对替代产品进行分类，所述最终纯度被定义为比活性(凝血因子活性 的国际单位/mg蛋白质，IU/mg)。中间产品具有相对较低的比活性(<50 IU/mg)，因为它们还包含无关的血浆蛋白质，例如纤维蛋白原、纤连 蛋白和其他非凝血蛋白质。高纯度(>50 IU/mg)和超高纯度(>3000 IU/mg)包含很少的其他血浆蛋白质或实质上无其他血浆蛋白质，除了 作为稳定剂而添加的白蛋白外。可以根据本发明进行使用的商购可得 的凝血因子VIII产品(浓缩物和制剂)的非限制性例子为例如但不限 于，来自AHP/Genetics Institute的ReFacto (缺失了 B-结构域的
29rFVIII )、来自Alpha的Alphanate ( FVIII)、来自Aventis的Bioclate
(rFVIII)、来自Aventis的Monoclate-P (凝血因子Vni:C)、来自 Aventis的Helixate( rFVIII )、来自Baxter的Recombinate( rFVIII )、 来自Baxter的He迈ofil M( FVIII)、来自Bayer的Kogenate ( rFVIII )、 来自HemaSure的Nordiate (FVIII)、来自Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB)的FACTEUR VIII-LFB
(基于人血浆的FVIII)、来自Speywood的Hyate:C(猪FVIII)和来自 Bayer的Kogenate SF (用蔗糖配制的rFVIII)。高和超高活性产品的 非限制性例子为AlphanateTM( Alpha)(低)；ReFacto ( AHP/Genet ics Institute ) ， Kogenate SF( Bayer ), Kogenate ( Bayer ) ， Helixate
(Aventis) ， Recombinate ( Baxter ) ， Monoclate-P ( Aventis )， Hemofi 1 M ( Baxter )(全部超高)。
如上所述，在另一个实施方案中，本发明的组合物或方法可以包 括凝血因子IX多肽和CPAM试剂的组合。凝血因子IX蛋白质可以是人重 组凝血因子IX (rhFIX)。凝血因子IX蛋白质可以更特别地选自 BeneFix ( AHP/Genet ics Institute )、Mononine ( Avent i s)、 Proplex
(Baxter) 、 BebulinVH (Baxter) 、 FACTEUR IX-LFB (Uboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB))、 Immunine ( Baxter/I咖uno ) 、 0ctanyne (Octapharma) 、 OctanineF
(Octapharma) 、 Mono FIX-VF ( CSL )或Novact M (Kaketsuken)。 一般而言，短语"凝血因子IX多肽"包括但不限于，凝血因子IX，以 及凝血因子I X相关多肽(其中任何一种 一般可以用于/掺入本发明的方 法或组合物中)。术语"凝血因子IX，，意欲包括但不限于，具有Jaye 等人，Nucleic Acids Res. 1983中所描述的氨基酸序列(野生型人凝 血因子IX)的多肽，和可以从一个个体到另一个个体中存在和出现的 人凝血因子IX的天然等位基因变化形式。此外，糖基化或其他翻译后 修饰的程度和位置可以依所选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质而 变。术语"凝血因子IX"还意欲包括以其未切割(酶原)形式存在的 凝血因子IX多肽，以及已经历了蛋白水解加工从而产生其相应的生物活性形式(其可以称为凝血因子IXa)的那些(如与本文描述的其他凝 血因子的情况一样)。可以掺入本发明的方法和组合物中的"凝血因 子IX相关多肽"包括但不限于这样的凝血因子IX多肽，其相对于人凝 血因子IX而言已进行了化学修饰和/或包含一个或多个相对于人凝血 因子IX而言的氨基酸序列改变(即凝血因子IX变体)，和/或包含相对 于人凝血因子IX而言截短的氨基酸序列(即凝血因子IX片段)。通常， 待在本文描述的方法/组合物中使用的凝血因子IX的变体，如同其他凝 血因子的变体一样，将会与相关的人蛋白质具有高水平的同一性(例 如，与其具有至少约80°/ 、 85°/。、 90%、 92%、 93°/。、 95%、 97°/。或99°/。的同 一性)，并且保留与人蛋白质至少基本上类似的活性(例如，在调节 出血方面，或者如在相关测定法(例如在US 20030203845中所描述的 凝血因子IX测定法)中所测试的)。凝血因子IX多肽的非限制性例子 包括，例如在Chandra等人，Biochem. Biophys. Acta 1973， 328:456; Andersson等人，Thromb. Res. 1975， 7:451; S躍ela等人，Eur. J. Biochem. 1976， 71:145中所描述的血浆衍生的人凝血因子IX。在某些 实施方案中，所述凝血因子IX是凝血因子IX相关多肽，其中当在"生 色测定法，，(参见US 20030203845 )中进行测试时，所述凝血因子IX 多肽的活性和天然人凝血因子IX (野生型凝血因子IX)的活性之间的 比率为至少约1.25;在其他实施方案中，该比率为至少约2. 0;在进一 步的实施方案中，该比率为至少约4.0。商购可得的FIX产品(所谓的 替代产品)源自正常的汇集的血浆或经基因改造的哺乳动物细胞系。 常常根据最终纯度来对替代产品进行分类，所述最终纯度被定义为比 活性(凝血因子活性的国际单位/mg蛋白质，IU/mg)。中间产品具有 相对较低的比活性(〈50 IU/mg)，因为它们还包含无关的血浆蛋白质， 例如纤维蛋白原、纤连蛋白和其他非凝血蛋白质。高纯度(>50 IU/mg) 和超高纯度(>160 IU/mg)包含很少的其他血浆蛋白质或实质上无其 他血浆蛋白质，除了作为稳定剂而添加的白蛋白外。可以根据本发明 进行使用的商购可得的凝血因子IX产品(浓缩物和制剂)的非限制性 例子为例如但不限于，来自AHP/Genetics Inst i tute的BeneFix(rFIX)、来自Aventis的Mononine (FIX)、来自Baxter的Proplex (FIX复合物)、来自Baxter的Bebul in VH ( FIX复合物)、来自
Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB )的FACTEUR IX-LFB (基于人血浆的FIX ) 、 Immunine (Baxter/Immuno ) 、 Octanyne ( Octapharma ) 、 Octanine F (Octapharma) 、 Mono FIX-VF ( CSL) 、 Novact M (Kaketsuken)。
凝血因子IX和凝血因子X蛋白质(包括凝血因子IX和凝血因子X变体，
及其衍生物)也是本领域已知的.(参见例如，WO2006127896 ;
EP1728798-A1;和Schuettrumpf等人，Blood， 105 (6): 2316-2323 (2005))。
在一个实施方案中，凝血因子或止血因子和CPAM试剂的組合是所 述组合物或方法中的唯一活性试剂(或者CPAM试剂和凝血因子/止血因 子和/或第二抗炎剂的组合是所述组合物/方法中的唯一活性试剂)。
一般而言，在本文描述的方法或组合物中所牵涉的任何这些试剂的特 征可以为至少基本上分离的或纯化的。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包含具有编码凝血因子的 序列的核酸，和/或所述方法利用具有编码凝血因子的序列的核酸，例 如NCBI's GenBank的那些，登录号CAH72549、 AAA88042、 AAT85802、 P08709、 P00740、 P12259 、 P00748、 P03951 、 KFHU5 、 P00488、
AAB31518、AAB31517 、AAB31516 、NP-000121、NP一000124、
P00742 、NP一000123 、NP-000495 、NP—001984、1205236A、
AAB59401、NP—036283 、CAI43241 、AAH98389、AAH22513、
AAB28588、AAI22864 、AAI19015 、AAH64380、AAI11970、
AAI11968、AAC50211、 AAA52420、 AAB5949、 AAA70225、AAA58466、AAV85964、AAB59490 、AAA52421 、AAA51986、CAI95417、
CAI95416、CAI42103 、CAI41386 、CAI41385、CAI41382、
CAI41381、AAI30469 、AAH27963 、EAX09185、EAX09184、
EAX09183、EAX09182 、EAX04621 、EAX04620、ABJ51930、
ABJ51929、ABJ51928 、ABJ51927 、ABJ51926、ABJ51925、
32ABJ51924 、ABJ51923 、ABJ51922 、ABJ51921 、ABJ51931、
ABI26644 、BAA20295 、ABF69029 、ABF69028 、ABF69027、
ABF69026 、ABF69025 、ABF69024 、ABF69023 、ABF69022、
ABF69021 、ABF69020 、ABF69019 、ABF69018 、ABF69017、
ABF69016 、ABF69015 、ABF69013 、ABF69012 、ABF69011、
ABF69010 、ABF69009 、ABF69007 、ABF69006 、ABF69005、
CAA48315 、CAA48314 、ABK19831 、ABK19830 、ABK19829、
ABK19827、 ABJ55913、 ABJ55912、 ABJ55910、 ABJ55909，或本领域技 术人员已知的其他那些，或其同系物或变体，或其组合。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用促进 或增强凝血因子或其他止血剂的产生的试剂，其在一个实施方案中， 是编码所述凝血因子的核酸，其在另一个实施方案中，编码凝血因子 VIII。
在某些实施方案中，编码凝血因子VIII的核酸是载体，其包含凝 血因子VIII重链的前57个碱基对，例如如在美国专利申请^^开号 20050276787中所描述的。在某些实施方案中，所述载体将包含全长人 凝血因子VIII,例如如在美国专利号4， 757, 006中，或者在Toole等人， Nature 312:312-317， 1984; Wood等人，Nature 312:330-337， 1984; Vehar等人，Nature 312:337-342， 1984, WO 87/04187， WO 88/08035 和WO 88/03558，美国专利号4， 868， 112; EP 0 786 474; WO 86/06101; WO 87/07144中所描述的，以及本领域已知的其他那些。
在某些实施方案中，可以通过使用本领域技术人员已知的标准方 法(例如转染)来将载体和构建体引入细胞中。许多转染技术是本领 域普遍已知的(参见例如，Graham等人，Virol., 52:456 [1973]; Sambrook等人，同上；Davis等人，同上；和Chu等人，Gene 13:197 [1981])。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀法(Graham等人， Virol. ， 52: 456-467 [1973])、直接显微注射到培养的细胞中 (Capecchi， Cell 22: 479-488 [1980〗)、电穿孔(Shigekawa等人， BioTechn.， 6: 742-751 [1988])、脂质体介导的基因转移(Mannino
33等人，BioTechn., 6: 682-690 [1988〗、脂质介导的转导(Feigner等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 [1987])和l吏用高 速微粒发射技术的核酸递送(Klein等人，Nature 327: 70-73 [1987〗)。
在某些实施方案中，可以通过任何方法来检验凝血因子VIII的表 达和活性，例如Western印迹分析、Northern印迹分析、Southern印迹 分析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、逆转录酶-偶联的 聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附测定法ULISA)、放射免 疫测定法(RIA)和荧光免疫测定法UFA)。
在另一个方面，所述凝血因子是凝血因子VII或其变体或衍生物。 在某些实施方案中，所述凝血因子VIIa(术语凝血因子VII和凝血因子 VIIa在本文中在一定程度上可互换使用，应当认识到，在本发明的方 法/组合物中可以使用/掺入任何合适形式的凝血因子，通常使用/掺入 活性形式)是人凝血因子VIIa，如例如在美国专利号4， 784， 950中以该 文献的SEQIDNO: 1而/>开的(野生型凝血因子VII)。如已经记述的， 术语"凝血因子vn，，意欲包括以其未切割(酶原)形式存在的凝血因 子VII多肽，以及已经历了蛋白水解加工从而产生其相应的生物活性形 式(其可以称为凝血因子VIIa)的那些。通常，人凝血因子VII在残基 152和153之间进行切割，从而产生凝血因子VIIa。
在另一个实施方案中，将CPAM试剂与凝血因子VII类似物或变体 (术语相似物、类似物和变体在本文中可互换使用)相组合。FVII变 体可以是与野生型FVII相差一个或多个插入、缺失、添加等的任何变 体(通常，变体将与野生型人FVII氨基酸序列具有至少约85。/。、至少约 90%、至少约95%、至少约97%或更高的同一性，并且至少基本上保留与 人FVII类似的一些酶促活性)。凝血因子VII/凝血因子VIIa (FVIIa) 变体的非限制性例子包括S52A; S60A;在美国专利号5， 580， 560中/>开 的展示出增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；在PCT/DK02/00189中公 开的凝血因子VII变体；在WO 02/38162中公开的展示出增加的蛋白水 解稳定性的凝血因子VII变体；在WO 99/20767中公开的具有经修饰的 Gla-结构域且展示出增强的膜结合的凝血因子VII变体；和在WO01/58935; WO 01/83725; WO 02/22776; WO 02/077218; PCT/DK02/00635; 丹麦专利申请PA 2002 01423;丹麦专利申请PA 2001 01627; WO 0V3816Z中公开的凝血因子VII变体；在JP 2001061479中公开的具有 增强的活性的FVIIa变体；和缺乏Gla结构域的凝血因子VIIa (Nicolaisen等人，FEBS Letts. 317: 245-249， 1993 )。另外的修^ 饰的进一步非限制性例子包括R152E; S344A; L305V; L305V/M306D/D309S; L305I, L305T， F374P， V158T/M298Q， V158D/E296V/M298Q, K337A, M298Q, V158D/M298Q， L305V/K337A， V158D/E296V/M298Q/L305V, V158D/E296V/M298Q/K337A， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A， K157A， E296V， E296V/M298Q， V158D/E296V, V158D/M298K，和S336G， L305V/K337A, L305V/V158D， L305V/E296V， L305V/M298Q, L305V/V158T， L305V/K337A/V158T， L305V/K337A節8Q， L305V/K337A/E296V， L305V/K337A/V158D， L305V/V158D/M298Q， L305V/V158D/E296V， L305V/V158T/M298Q， L305V/V158T/E296V， L305V/E296V/M298Q， L305V/V158D/E296V/M298Q， L305V/V158T/E296V/M298Q, L305V/V158T/K337A/M298Q， L305V/V158T/E296V/K337A， L305V/V158D/K337A/M298Q， L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，
L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，
L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A， S314E/K316H， S314E/K316Q， S314E/L305V, S314E/K337A， S314E/V158D, S314E/E296V， S314E/M298Q, S314E/V158T， K316H/L305V， K316H/K337A， K316H/V158D， K316H/E296V， K316H/M298Q， K316H/V158T， K316Q/L305V， K316Q/K337A， K316Q/V158D， K316Q/E296V, K316Q/M298Q， K316Q/V158T, S314E/L305V/K337A， S314E/L305V/V158D， S314E/L305V/E296V， S314E/L305V/M298Q， S314E/L305V/V158T， S314E/L305V/K337A/V158T， S314E/L305V/K337A/M298Q， S314E/L305V/K337A/E296V， S314E/L305V/K337A/V158D， S314E/L305V/V158D/M298Q,S314E/L305V/V158D/E296V， S314E/L305V/V158T/M298Q，
S314E/L305V/V158T/E296V， S314E/L305V/E296V/M298Q，
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q，
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q，
S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q，
S314E/L305V/V158T/E296V/K337A，
S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q，
S314E/L305V/V158D/E296V/K337A，
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, K316H/L305V/K337A， K316H/L305V/V158D, K316H/L305V/E296V, K316H/L305V/M298Q, K316H/L305V/V158T， K316H/L305V/K337A/V158T, K316H/L305V/K337A/M298Q， K316H/L305V/K337A/E296V， K316H/L305V/K337A/V158D， K316H/L305V/V158D/M298Q， K316H/L305V/V158D/E296V, K316H/L305V/V158T/M298Q， K316H/L305V/V158T/E296V， K316H/L305V/E296V/M298Q， K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q， K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q， K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q， K316H/L305V/V158T/E296V/K337A， K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q， K316H/L305V/V158D/E296V/K337A， K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, K316Q/L305V/K337A， K316Q/L305V/V158D， K316Q/L305V/E296V, K316Q/L305V節8Q， K316Q/L305V/V158T， K316Q/L305V/K337A/V158T, K316Q/L305V/K337A/M298Q， K316Q/L305V/K337A/E296V， K316Q/L305V/K337A/V158D， K316Q/L305V/V158D/M298Q， K316Q/L305V/V158D/E296V, K316Q/L305V/V158T/M298Q，
36K316Q/L305V/V158T/E296V， K316Q/L305V/E296V/M298Q， K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q， K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q， K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q， K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A， K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A， K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, F374Y/K337A， F374Y/V158D, F374Y/E296V， F374Y/M298Q， F374Y/V158T， F374Y/S314E, F374Y/L305V, F374Y/L305V/K337A, F374Y/L305V/V158D， F374Y/L305V/E296V， F374Y/L305V/M298Q， F374Y/L305V/V158T， F374Y/L305V/S314E， F374Y/K337A/S314E， F374Y/K337A/V158T, F374Y/K337A/M298Q， F374Y/K337A/E296V, F374Y/K337A/V158D， F374Y/V158D/S314E， F374Y/V158D/M298Q， F374Y/V158D/E296V， F374Y/V158T/S314E， F374Y/V158T/M298Q, F374Y/V158T/E296V， F374Y/E296V/S314E， F374Y/S314E/M298Q, F374Y/E296V/M298Q, F374Y/L305V/K337A/V158D, F374Y/L305V/K337A/E296V， F374Y/L305V/K337A/M298Q, F374Y/L305V/K337A/V158T， F374Y/L305V/K337A/S314E， F374Y/L305V/V158D/E296V， F374Y/L305V/V158D/M298Q， F374Y/L305V/V158D/S314E， F374Y/L305V/E296V/M298Q， F374Y/L305V/E296V/V158T, F374Y/L305V/E296V/S314E， F374Y/L305V/M298Q/V158T， F374Y/L305V/M298Q/S314E， F374Y/L305V/V158T/S314E， F374Y/K337A/S314E/V158T， F374Y/K337A/S314E/M298Q， F374Y/K337A/S314E/E296V, F374Y/K337A/S314E/V158D， F374Y/K337A/V158T/M298Q, F374Y/K337A/V158T/E296V, F374Y/K337A/M298Q/E296V， F374Y/K337A/M298Q/V158D， F374Y/K337A/E296V/V158D，
37F374Y/V158D/S314E/M298Q， F374Y/V158D/S314E/E296V，
F374Y/V158D/M298Q/E296V， F374Y/V158T/S314E/E296V，
F374Y/V158T/S314E/M298Q， F374Y/V158T/M298Q/E296V，
F374Y/E296V/S314E/M298Q， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E，
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A，
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E，
F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E，
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A，
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E，
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E，
F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A，
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E，
F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E，
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E,
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A，
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A，
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E，
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E，
F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T，
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E，
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E,
F374Y/L305V/V158D/E296V節8Q/K337A，
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E，
F374Y/L305V/V158D/E296V節8Q/K337A/S314E; R152E， S3楊；
P11Q/K33E， T106N, V253N, R290N/A292T， G291N, R315N/V317T,
K143N/R315N/V317T;在从T233到N240的氨基酸序列中具有置换、添加
或缺失的FVII;和在从R304到C329的氨基酸序列中具有置换、添加或
缺失的FVII。
凝血因子VIIa衍生物的非限制性例子包括其上附着有聚乙二醇 (PEG)聚合物、酰基、磷酸酯或硫酸酯基团等的野生型和类似物凝血 因子VIIa多肽。凝血因子VIIa衍生物还可以包括包含已进行了化学或 酶促修饰的N-联或O-联寡糖的凝血因子VI I多肽，或已经历了蛋白水解 切割的凝血因子VIIa (野生型或类似物)多肽。凝血因子VII衍生物的 非限制性例子包括在WO 03/31464以及美国专利申请US 20040043446、 US 20040063911、 US 20040142856、 US 20040137557和US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)中公开的糖PEG化的FVII衍生物；在 WO 02/077218、 US 20030044908 ( Novo Nordisk A/S ) ; WO 01/04287、 美国专利申请20030165996、WO 01/58935、 WO 03/93465( Maxygen ApS ); 和WO 02/02764 、 美国专利申请20030211094 (University of Minnesota)中公开的FVII缀合物。
在一个实施方案中，所述CPAM试剂取消或减少C5a表达、C5a与关 联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含取消或减 少补体途径的激活的试剂以及凝血因子或其他止血剂。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含取消或减
在一个实施方案中，所述CPAM试剂是生物学试剂，其在一个实施 方案中是抗体，或者在另一个实施方案中是寡肽。在另一个实施方案
中，所述凝血因子是凝血因子vni。
在另一个实施方案中，所述CPAM试剂取消或减少C5a表达、C5a与 关联受体的结合、C5a受体信号传导、或其组合。
在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制成用于口服、静脉 内、皮下、关节中(局域性的)或局部施用，或者在另一个实施方案 中，所述药物组合物净皮配制为可注射制剂。
在某些实施方案中，本发明进一步提供了本发明的组合物及其使 用方法，其中所述组合物或方法进一步包括一种或多种第二抗炎治疗 剂或操作程序，例子包括但不限于合成和非合成的皮质类固醇试剂、 非类固醇抗炎药、抗风湿药、免疫调节剂、免疫抑制剂、关节功能增 强剂、白介素产生抑制剂、或其组合。皮质类固醇试剂的具体例子包 括但不限于，地塞米松、氢化可的松、曲安西龙、倍他米松、泼尼松 龙、曱泼尼龙、囟泼尼松、倍氯米松等。此类试剂的另外例子描述于 例如Romas等人，Rheum Di s CI in North Am. 2006 Nov; 32 (4): 759-73; Zhonghua等人，2006 Nov 21; 86 (43): 3055-8;和Katz等人，Curr Opin Rheumatol. 2007 Mar; 19 (2): 106-110中。
非类固醇抗炎剂的进一步具体例子包括但不限于，双氯芬酸、吲 哚美辛、布洛芬、酮洛芬、阿司匹林、二氯尼柳、氟芬那酸、夫洛非 宁、托芬那酸、舒林酸、芬布芬、水杨酸、阿西美辛、丙谷美辛、萘 丁美酮、丙替溱酸、噻洛芬(thiaprofen)、奥沙普秦、洛索洛芬、 阿明洛芬、扎托洛芬、氟比洛芬、氟比洛芬等。具有技能的从业人员 将会考虑患者的健康、年龄等，当考虑CPAM试剂与抗炎药的任何组合 时，特别是给定的与这些化合物相关的已知健康风险。
40在一个实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含至少一种吡
唑基苯磺酰胺化合物，例如在美国专利号5， 756， 529和美国专利号 5， 466， 823中所述的那些。在某些实施方案中，本发明的组合物可以进 一步包含可用于治疗炎症和/或疼痛的二芳基取代的吡唑。在某些实施 方案中，本发明的组合物可以进一步包含治疗量的任何类别的二芳基 取代的吡唑类，其同分异构体、类似物和/或代谢物。在某些实施方案 中，这些化合物主要经由抑制环加氧酶-2 (C0X-2)来减少炎症和/或 疼痛。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包含减少炎症和/或疼痛的 非类固醇试剂，例如塞来考昔、罗非考昔等。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包含醋氧乙、吡罗昔康、 替诺昔康、安吡昔康、美洛昔康、D-青霉胺、布西拉明、金硫丁二钠、 金诺芬、氯苯扎利、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、 咪唑立宾、环孢素等。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包含阿片样物质和其他镇 痛药，尤其包括麻醉性镇痛药、m受体拮抗剂、K受体拮抗剂、非麻 醉性(即非致瘾性)镇痛药、单胺摄取抑制剂、腺苷调节试剂、大麻 素衍生物、P物质拮抗剂、神经激肽-l受体拮抗剂和钠通道阻断剂。在 某些实施方案中，所述组合物进一步包含醋氯芬酸、阿西美辛、e-乙 酰氨基己酸、对乙酰氨基酚、醋氨沙洛、乙酰苯胺、乙酰水杨酸(阿 司匹林)、S-腺苷甲硫氨酸、阿氯芬酸、阿芬太尼、烯丙罗定、阿明 洛芬、阿洛普令、阿法罗定、二(乙酰水杨酸)铝、氨芬酸、氨氯苯喁 嗪、3-氨基-4-羟基丁酸、2-氨基-4-曱基吡啶、氨丙吡酮、氨基比林、 阿米西群、水杨酸铵、安吡昔康、呱氨托美丁、阿尼利定、安替比林、 水杨酸安替比林、安曲非宁、阿扎丙宗、苄达酸、贝诺酯、苯喁洛芬、 苄哌立隆、苄达明、苄吗啡、柏莫洛芬、贝齐米特、oc-红没药醇、溴 芬酸、p-溴乙酰苯胺、5-溴水杨酸乙酸酯、溴水杨醇、布西丁、布氯 酸、布可隆、丁苯羟酸、布马地宗、丁丙诺菲、布他西丁、布替布芬、 布托啡诺、乙酰水杨酸钙、卡马西平、卡比芬、卡洛芬、卡沙兰、三
41氯叔丁醇、氯西诺溱、水杨酸胆碱、辛可芬、桂美辛、西拉马朵、环 氯茚酸、氯美辛、氯尼他秦、氯尼辛、氯吡酸、丁香、可待因、溴曱 可待因、磷酸可待因、硫酸可待因、克罗丙胺、克罗乙胺、地索吗啡、 右奥沙屈、右吗拉胺、地佐辛、地恩丙胺、双氯芬酸钠、二苯米唑、 联苯吡胺、二氟尼柳、双氢可待因、乙酰二氢可待因酮、双氢吗啡、 乙酰水杨酸二羟铝、地美沙朵、地美庚醇、二甲噻丁、吗苯丁酯、地 匹哌酮、地匹乙酯、安乃近、地他唑、屈-恶昔康、依莫法宗、苯乙氨 茴酸、依匹唑、依他佐辛、依特柳酯、乙水杨胺、依索庚嗪、依托沙 秦、乙甲噻丁、乙基吗啡、依托度酸、依托芬那酯、依托尼秦、丁香 酚、联苯乙酸、芬布芬、芬克洛酸、芬度柳、非诺洛芬、芬太尼、芬 替酸、非普地醇、非普拉宗、夫洛非宁、氟芬那酸、氟诺洛芬、氟苯 乙砜、氟吡汀、氟丙喹宗、氟比洛芬、磷柳酸、龙胆酸、格拉非宁、 葡美辛、乙二醇水杨酸酯、愈创蓝油烃、氢可酮、氢吗啡酮、羟哌替 啶、异丁芬酸、布洛芬、异丁普生、水杨酸咪唑、吲哚美辛、吲哚洛 芬、三苯唑酸、依索拉醇、异美沙酮、异尼辛、伊索克酸、伊索昔康、 凯托米酮、酮洛芬、酮咯酸、对-乳酰乙氧苯胺、利非他明、左啡诺、 洛芬太尼、氯那唑酸、氯诺昔康、洛索洛芬、赖氨酸乙酰水杨酸、乙 酰水杨酸镁、甲氯芬那酸、曱芬那酸、麦啶、美普他酚、美沙拉秦、 美他佐辛、盐酸美沙酮、左美丙嗪、甲嗪酸、甲氧夫啉、美托酮、莫 非布宗、莫苯唑酸、吗拉宗、吗啡、盐酸吗啡、硫酸吗啡、水杨吗啉、 麦罗啡、萘丁美酮、纳布啡、水杨酸l-萘酯、萘普生、那碎因、奈福
泮、尼可吗啡、尼芬那宗、尼氟酸、尼美舒利、5'-硝基-r-丙氧基乙 酰苯胺、去甲左啡诺、去曱美沙酮、去甲吗啡、诺匹哌酮、奥沙拉秦、 阿片、奥沙西罗、奥沙美辛、奥沙普秦、羟考酮、羟吗啡酮、羟布宗、 阿片全碱、瑞尼托林、帕沙米特、喷他佐辛、哌立索唑、非那西丁、 苯吗庚酮、非那佐辛、盐酸非那吡啶、非诺可、苯哌利定、非诺吡酮、 乙酰水杨酸苯酯、保泰松、水杨酸苯酯、非尼拉朵、吡酮洛芬、匹米 诺定、哌布宗、哌立酮、吡洛芬、吡拉唑酸、哌腈咪特、吡罗昔康、 普拉洛芬、丙谷美辛、普罗庚嗪、Y-二甲哌替啶、丙帕他莫、丙吡兰、
42右丙氧芬、异丙安替比林、普罗喹宗、丙替嗪酸、雷米那酮、瑞芬太 尼、甲硫利马唑、醋水杨胺、水杨苷、水杨酰胺、水杨酰胺邻-乙酸、 水杨基硫酸、双水杨酯、沙维林、西美曲特、水杨酸钠、舒芬太尼、 柳氮磺吡啶、舒林酸、超氧化物歧化酶、舒洛芬、琥布宗、他尼氟酯、 替尼达普、替诺昔康、特罗芬那酯、粉防己碱、噻唑丁炎酮
(thiazolinobutazone)、塞洛芬酸、漆拉米特、替利定、替诺立定、 托芬那酸、托美丁、曲马多、托匹星、维米醇、联苯丁酸、希莫洛芬、 扎托洛芬和佐美酸(参见The Merck Index,第12版，Therapeutic Category and Biological Activity Index, 编辑S. Budavari (1996) pp. Ther-2至Ther-3和Ther-12 (Analgesic (Dental), Analgesic (Narcotic), Analgesic (Non-narcotic)， Anti-inflammatory (Nonsteroidal))。
根据本发明的化合物和药物制剂可以与 一种或多种其他治疗剂组 合使用，或者包括一种或多种其他治疗剂，所述其他治疗剂例如选自 本文所描述的抗炎剂、抗胆碱能剂(特别是M1、 M2、 M1/M2或M3受体拮 抗剂)、P2-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂(例如抗生素、抗病毒 剂)、抗组胺剂、或其任何组合。在某些实施方案中，本发明提供了 抑制或干扰补体途径的试剂连同一种或多种其他治疗活性试剂一起的 组合，所述其他治疗活性试剂例如为凝血因子，和/或任选地抗炎剂(例 如皮质类固醇或NSAID),抗胆碱能剂，P 2-肾上腺素受体激动剂，抗 感染剂(例如抗生素或抗病毒剂)，或抗组胺剂，或皮质类固醇，或 抗胆碱能药，或PDE-4抑制剂，或其任何组合。
对于本领域技术人员显而易见的是，适当时，所述治疗成分可以 以盐的形式(例如，碱金属或胺盐，或作为酸加成盐)、或以前体药 物的形式、或作为酯(例如，低级烷基酯)、或作为溶剂化物(例如， 水合物)进行使用，以优化治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特 征(例如溶解性)。还显而易见的是，适当时，所述治疗成分可以以 光学上纯的形式进行使用。
P 2-肾上腺素受体激动剂的例子包括沙美特罗(其可以是外消旋
43物或单种对映体，例如R-对映体)、沙丁胺醇、福莫特罗、沙甲胺醇、非诺特罗或特布他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐、沙丁胺醇的硫酸盐或游离碱、或者福莫特罗的富马酸盐。长效P2-肾上腺素受体激动剂是优选的，尤其是具有超过24小时时间段的疗效的那些，例如
沙美特罗或福莫特罗。
在某些实施方案中，P2-肾上腺素受体激动剂包括在W002/66422A 、 WO02/270490 、 WO02/076933 、 W003/024439 、WO03/072539 、 WO03/091204 、 WO04/016578 、 W004/022547 、WO04/037807 、 WO04/037773 、 WO04/037768 、 WO04/039762 、WO04/039766、 WO01/42193和WO03/042160中描述的那些，这些专利的7>开内容通过提及而合并入本文。
在某些实施方案中，P2-肾上腺素受体激动剂是
3- (4- {[6- ( {(2R) -2-羟基-2- [4-羟基-3- (羟甲基)苯基]乙基}氨基)己基]氧基} 丁基)苯磺酰胺；3- (3- {[7- ({(2R) -2-羟基-2- [4-羟基-3-
羟曱基)苯基]乙基}-氨基)庚基]氧基}丙基)苯磺酰胺；
4- {(1R) -2- [ (6- {2- [ (2， 6-二氯爷基)氧基]乙氧基}己基)氨基]-l-羟乙基} -2 (羟曱基)苯酚；4- {(1R) -2- [ (6- {4- [3-(环戊基磺酰基)苯基]丁氧基}己基)氨基]-1-羟乙基}-2-(羟甲基)苯酚；N-[2-羟基-5- [ (1R) -1-羟基-2- [ [2-4- [ [ (2R) -2-羟基-2-苯乙基]氨基]苯基]乙基]氨基]乙基]苯基]曱酰胺,N-2-U-[4-(3-苯基-4-曱氧基苯基)氨基苯基]乙基}_2-羟基-2-(8-羟基-2(lH)-喹啉酮-5-基)乙胺，或其组合。
在某些实施方案中，皮质类固醇可以包括甲泼尼龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6ot，9oc-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧基]-ll P -羟基-16 a-甲基-3-氧代-雄烷-1， 4-二烯-17 P -硫代羧酸S-氟甲基酯、6 a ， 9 a -二氟-11 P -羟基-l 6 a -甲基-3-氧代-l 7 a -丙酰氧基-雄烷-1, 4-二烯-17 P -硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯、6a ， 9 a -二氟-ll P -羟基-16 oc -甲基-17 a - (l-甲基环丙基羰基)氧基-3-氧代-雄烷-l， 4-二烯-17 P -硫代羧酸S-氟曱基酯、6 a ， 9 a-二氟-11 P-羟基-16a-曱基-3-氧代-17a-(2，2, 3， 3-四甲基环丙基羰基)
44氧基-雄烷-1， 4-二烯-17 P -羧酸氰甲酯、倍氯米松酯(例如17-丙酸酯或17,21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯(例如糠酸酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德、(16 ot ， 17- [ [ (R) -环己基亚甲基]二 (氧基)]-ll P ， 21-二羟基-孕烷-1， 4-二烯-3， 20-二酮)、丙酸布替可特、RPR-106541和ST-126。优选的皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6 ot ， 9a -二氟-11 p -羟基-l 6 a -甲基-17 ot - [ (4-甲基-1 ， 3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄烷-1， 4-二烯-17 P -硫代羧酸S-氟曱基酯和6 oc ， 9 ot -二氟-l 7 a - [ (2-呋喃基羰基)氧基]-11 P -羟基-l 6 ot -曱基-3-氧代-雄烷-1，4-二烯-17 P-硫代羧酸S-氟甲基酯，更优选6oc，9ct-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11 P -羟基-16 oc -曱基-3-氧代-雄烷-l， 4-二烯-17 p -硫代羧酸S-氟甲基酯。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用具有糖皮质激素激动作用的非类固醇化合物，其可以具有相对于反式激活而言对于反式阻抑的选择性，例如在W003/082827 、 W001/10143 、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009016、W004/009017、 W004/018429、WO03/104195 、 WO03/082787 、 WO03/082280 、 WO03/059899 、WO03/101932、 W002/02565、 WO01/16128、 WO00/66590、 WO03/086294、W004/026248、 W003/061651、 WO03/08277中^^开的化合物，这些专利通过提及而全部合并入本文。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用非类固醇抗炎药(NSAID's)，例如色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如，茶碱、PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂、白三烯合成的抑制剂(例如，孟鲁司特)、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、P-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如，腺苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如，趋化因子拮抗剂，例如CCR3拮抗剂)或细胞因子合成的抑制剂、或5-脂加氧酶抑制剂。合适的其他P 2-肾上腺素受体激动剂包括沙美特罗(例如，作为昔萘酸盐)、沙丁胺醇(例如，作为硫酸盐或游离碱)、福莫特罗(例如，作为富马酸盐)、非诺特罗或特布他林及其盐。iNOS
45(诱导型一氧化氮合酶抑制剂)优选用于口服施用。合适的iNOS抑制剂包括在W093/13055 、 WO98/30537 、 WO02/50021 、 W095/34534和W099/62875中公开的那些。合适的CCR3抑制剂包括在W002/26722中公开的那些。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用磷酸二酯酶4 ( PDE4 )抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂，例如顺-4-氰基-4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-l-羧酸、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环 丙基 甲 氧基-4-二氟曱氧基苯基)环己烷-l-酮和顺-[4-氰基-4- (3-环丙基甲氧基-4-二氟曱氧基苯基)环己烷-l-醇]。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用美国专利号5， 552， 438中所述的化合物；Hofgen， N.等人，15thEFMCInt. S卿.Med. Chem. (September 6-10, Edinburgh) 1998， Abst. P. 98; CAS参考号247584020-9 )的那种；命名为NCS-613的9-节基腺噤呤衍生物(INSERM);来自Chiroscience and Schering-Plough的D-4418;鉴定为C1-1018 (PD-168787 )并且归属于Pfizer的苯并二氮杂萆PDE4抑制剂；由Kyowa Hakko在W099/16766中公开的苯并间二氧杂环戊烯衍生物；来自Kyowa Hakko的K-34;来自Napp的V-11294A ( LandelIs, L. J.等人，Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (September 19-23，Geneva) 1998] 1998， 12 (Suppl. 28): AbstP2393 );来自Byk-Gulden的罗氟司特(CAS参考号162401-32-3 )， 二氮杂萘酮联苯(W099/47505，其公开内容通过提及而合并入本文)；作为混合的PDE3/PDE4抑制剂的普马芬群，(-)-p- [ (4aR*， 1 ObS*) -9-乙氧基-1， 2， 3， 4， 4a， 1 Ob-六氢-8-曱氧基-2-曱基苯并[(;][1，6]萘啶-6-基]-N,N-二异丙基苯曱酰胺，其已由Byk-Gulden (现在的Altana )制备并公开；处于Almirall-Prodesfarma的开发下的阿罗茶碱；来自Vernalis的VM554/而65;或T-440 ( Tanabe Seiyaku; Fuji, K.等人，J PharmacolExp Ther， 1998， 284 (1): 162 )，和T2585。其他可能的PDE-4和混合的PDE3/PDE4抑制剂包括在WO01/13953中列出的那些，所述专利的公开内容通过提及而合并入本文。在某些实施方案中，所迷组合物包含或者所述方法利用本文所描述的试剂的任何组合。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用抗胆碱能剂，例如颠茄植物的生物碱，如由诸如阿托品、东菜菪碱、后马托品、
茛菪碱所举例说明的；这些化合物通常作为盐(为叔胺)进行施用。这些药物，特别是盐形式，可容易地从许多商业来源获得或者可以根据文献进行制造或制备，例如阿托品一CAS-51-55-8或CAS-51-48-1
(无水形式)、疏酸阿托品一CAS-5908-99-6 ; 氧阿托品一CAS-4438-22-6 ，或其盐酸盐一 CAS-4574-60-l ，和曱硝阿托品一CAS-52-88-0;后马托品一CAS-87-00-3，氢溴酸盐一CAS-51-56-9，溴甲烷盐一CAS-80-49-9;策菪碱(d， 1) 一CAS-101-31-5，氢溴酸盐—CAS-306-03-6和硫酸盐一CAS-6835-16-l ; 和东茛菪碱一CAS-51-34-3，氢溴酸盐一CAS-6533-68-2，溴甲烷盐一CAS-155-41-9。在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用抗胆碱能药，例如但不限于以名称Atrovent进行销售的异丙阿托品(例如，作为溴化物)、氧托品(例如，作为溴化物)和噻托品(例如，作为溴化物)(CAS-139404-48-1 )。还令人感兴趣的是曱胺太林
(CAS-5 3-46-3 )、溴丙胺太林(CAS-50-34-9 )、甲溴辛托品或Valpin50( CAS-80-50-2 )、克利溴铵(Quarzan， CAS-3485-62-9 )、 copyrrolate
(Robinul)、异丙碘铵(CAS-H-81-8 )、溴美喷酯(美国专利号2, 918, 408 )、曲地氯铵(Pathilone， CAS-4310-35-4 )和甲硫己环铵(Tral， CAS-115-63-9)。还可参见盐酸环喷托酯(CAS-5870-29-l)、托吡卡胺(CAS-1508-75-4 )、盐酸苯海索(CAS-144-11-6 )、哌仑西平(CAS-29868-97-1 )、替仑西平(CAS-80880-90-9 ) 、 AF-DX 116、或美索托明，以及在WO 01/04118中公开的化合物，所述专利的公开内容通过提及而合并入本文。
在某些实施方案中，所述组合物包含或者所述方法利用抗组胺剂
(也称为Hl-受体拮抗剂)，其可以包括抑制Hl-受体的已知的众多拮抗剂中的任何一种或多种，并且对于人使用是安全的。在某些实施方案中，此类化合物包括乙醇胺类、乙二胺类和烷基胺类，例如但不限
47于马来酸卡比沙明、富马酸氯马斯汀、盐酸二苯基羟基胺、和茶苯海明、马来酸美吡拉敏、盐酸曲吡那敏、和柠檬酸曲吡那敏、氯非尼拉敏及其盐例如马来酸盐、和阿伐斯汀、盐酸羟溱、双羟萘酸羟溱、盐酸赛克力嗪、乳酸赛克力溱、盐酸美克洛溱、和盐酸西替利溱、阿司
咪唑、盐酸左卡巴斯汀、氯雷他定或其脱羧乙氧基Uescarboethoxy)类似物、和特非那定和盐酸非索非那定或另一种药学上可接受的盐、盐酸氮萆斯汀，或者本文所述的试剂的任何组合。
上文提及的组合可以方便地被提供用于以药物制剂的形式进行使用，并因此包含如上定义的组合以及生理学上可接受的稀释剂或载体的药物制剂代表了本发明的进一步方面。
本发明的化合物和/或任何次级试剂(例如，止血剂和/或凝血因子)可以用适合于所示施用途径(和所打算的贮存等)的许多合适的载体、稀释剂、赋形剂等(参见例如，Powell等人，"Compendium ofexcipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998)——术语"媒介物"和"载体"在本发明的描述的自始至终可以用于所有全体地以及通过提及而独立地指每种此类类型的试剂)和/或功能增强剂(例如稳定剂、表面活性剂、湿润剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、盐、增溶剂、去污剂、抗聚集剂(例如抗聚集氨基酸制剂)、分散介质、等渗剂、组织固定剂(tissue fixatives)、螯合剂、緩冲剂、抗菌剂、抗氧化剂、着色剂、调味剂、吸收延迟剂、控释试剂等)进行配制。此类另外的成分一般这样进行选择，以便不会不利地影响根据本发明的药物制剂的总体稳定性。合适的载体、稀释剂、佐剂以及功能增强剂，和此类组合物的施用/配制方式是制药学领域中众所周知的。参见例如,Remington: The Science and Practiceof Pharmacy,第19版，1995。还参见例如，Berge等人，J. Pharm.ScL， 6661 ). 1-19 (1977); Wang和Hanson, J. Parenteral. Sci.Tech: 42， S4-S6 1988)，美国专利6， 165， 779和6， 225， 289。另外的相关原理、方法和试剂例如描述于下列参考文献中Urquhart等人，Lancet, 16, 367 (1980)， Lieberman等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE
48FORMS-DISPERSE SYSTEMS (第2版，第3巻，1998); Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS (第7版， 2000); Martindale， THE EXTRA PHARMACOPEIA (第31版)，Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES (第16-20版);The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman和Gilman,编辑(第9版- 1996); Wilson and Gisvoids' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado和Remers，编辑(第IO版-1998),以及美国专 利5， 708， 025和5， 994， 106。配制药学上可接受的组合物的原理也描述 于例如Platt， Clin. Lab Med. ， 7:289-99 (1987)， Aulton， PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone (New York) (1988) ， EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998)，和"Drug Dosage, " J. Kans. Med. Soc.， 70(1)， 30-32 (1969)中。
本发明的组合物可以以任何合适的形式进行配制，例如液体、半 固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、 分散体或悬浮液等。关于任何组合物而言的最佳形式依赖于所期望的 施用方式、所述组合物或组合的性质、和治疗应用或其他预期用途。 用于递送本发明的组合物的通常方式是通过肠胃外施用(例如静脉内 施用)。在一个方面，本发明的组合物通过静脉内输注或注射而施用 给人患者。注射可以4吏用例如双桶注射器(dual barrel syringe)或 其他合适的装置来完成。可能合适的递送装置的例子描述于例如美国 专利号5， 104， 375、 4， 359， 049、 4， 631， 055和4， 874， 368中。其他合适 的递送装置包括移液管。
药学上可接受的组合物通常是无菌的，溶解了足够量的本发明的 化合物(和任何存在的次级试剂)，在用于制造和贮存的条件下是稳 定的，并且对于用于所提议的应用的受试者是无害的(或者至少对于 许多，常常是基本上大多数(至少约70y。、 80°/。、 85%、 90°/。、 95%、 97%、 98%、 99%等)的类似受试者是无害的，如可以通过例如临床试验所测 定的)。可以对由本发明所提供的(和/或在本文其他地方所描述的各
49种方法中所使用的)组合物实施常规的制药学操作，例如灭菌、纯化 等(从而使得其活性成分可以^皮视为至少基本上分离的或分离的)。
在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂，即包含 水的制剂。此类制剂通常是溶液或悬浮液。在本发明的一个进一步的 实施方案中，所述药物制剂是水溶液。术语"水性制剂"被定义为包
含至少5(^w/w的水的制剂。同样地，术语"水溶液"被定义为包含至 少50。/。w/w的水的溶液，并且术语"水悬浮液"被定义为包含至少50。/。w/w 的水的悬浮液。
在另一个实施方案中，所述药物制剂是经冷冻干燥的制剂，在使 用前医生或患者向其添加溶剂和/或稀释剂。
可注射药学产品通常被视为是"对于治疗应用而言可接受的"， 如果它是无菌、基本上无热原的，并且不具有医学上不可接受的效应。 例如，当注射到人受试者中时，该产品不应产生医学上不可接受的免 疫反应。医学上不可接受的效应可以由医学领域中的技术人员来确定。 通过纯化所述组合物的组分，根据本文描述和本领域已知的原理配制 此类组分，并且使用标准测试操作程序，无需过度实验或努力即可获 得符合本文描述的这些和/或其他特征的组合物。
由本发明所提供的联合疗法的各化合物可以在分开或组合的药物 制剂中顺次或同时施用。已知的治疗剂的合适剂量将会被容易地意识 到或者可由本领域技术人员用常规实验来测定。
在一个实施方案中，所述试剂作为药物组合物的一部分进行施用， 所述药物组合物在一个实施方案中被配制成用于口服、静脉内或局部 施用，或者在另一个实施方案中被配制为可注射制剂。应当理解，本 发明考虑并且包括任何施用途径，以及用于组合物的特定施用途径以 及关于本发明方法的任何制剂。
在某些实施方案中，所述组合物及其在本发明中的使用允许掺入 赋形剂，在某些实施方案中，所述赋形剂是固体或液体或两者。包含 赋形剂的本发明的组合物可以通过任何药剂学技术来制备，所述药剂 学技术包括将赋形剂与所需的试剂相混合。适合于颊或舌下施用的组合物包括例如，在调味基质(例如蔗糖
和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含选择的所述试剂的糖锭剂(lozenge), 以及在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包含所述试 剂的软锭剂(pastille)。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的悬浮液、糖浆剂和 酏剂，其包含本领域通常使用的惰性稀释剂例如水。此类组合物还可 以包含例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂，以及甜味剂、调味剂和芳香剂。
用于口服施用的固体单位剂型包含所需的试剂(包括以纳米颗粒 形式)以及赋形剂，并且最方便地被配制为片剂或胶囊。下面为可以 用于制备本发明的药物組合物的赋形剂的非限制性例子。
本发明的组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的稀释剂作 为赋形剂。举例来说，合适的稀释剂单独或组合地包括乳糖，包括 无水乳糖和乳糖一水合物；淀粉，包括可直接压缩的淀粉和水解淀粉 (例如CelutabTM和EmdexTM);甘露醇；山梨糖醇；木糖醇；右旋糖(例 如CereloseTM 2000 )和右旋糖一水合物；二碱价磷酸钙二水合物；基 于蔗糖的稀释剂；糖果剂的糖(confectioner's sugar); —碱价石危 酸钓一水合物；硫酸钙二水合物；颗粒状乳酸钙三水合物；葡萄糖结 合剂；肌醇；水解的谷类固体；直链淀粉；纤维素，包括微晶纤维素、 ot和无定形纤维素(例如，Rexcel )的食品级来源以及粉状纤维素； 碳酸钙；甘氨酸；膨润土；聚乙烯吡咯烷酮等。此类稀释剂，如果存 在，总共构成约5%-约99%，优选地约10°/ -约85%，和更优选地约20%-约80%的所述组合物的总重量。所选择的稀释剂优选地展示出合适的流 动性质，并且当需要片剂时具有可压缩性。
单独或组合地，乳糖和微晶纤维素是优选的稀释剂。这两种稀释 剂与塞来考昔在化学上是相容的。颗粒外的(extragranular)微晶纤 维素(即，在干燥步骤后添加到经湿法粒化的组合物中的微晶纤维素) 可以用于改善硬度(对于片剂)和/或崩解时间。乳糖，尤其是乳糖一 水合物，是特别优选的。乳糖通常以相对较低的稀释成本提供具有合 适的塞来考昔释放速率、稳定性、预压缩流动性和/或干燥性质的组合物。它提供了高密度基材，这在粒化过程中(当采用湿法制粒时)帮 助稠化，并因此改善了混合流动性质。
本发明的组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的崩解剂作 为赋形剂，特别是对于片剂制剂。合适的崩解剂，单独或组合地，包
括淀粉，包括羟乙酸淀粉钠(例如PenWest的ExplotabTM)和预胶化 玉米淀粉(例如NationalTM 1551、National 1550,和Colocorn"1 1500 ), 粘土 (例如VeegumTM HV),纤维素例如纯化的纤维素、微晶纤维素、 甲基纤维素、羧甲基纤维素和羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠 (例如FMC的Ac-Di-SolTM)，藻酸盐，交聚维酮，和树胶例如琼脂、瓜 耳胶、槐豆胶、卡拉雅胶、果胶和黄蓍胶。
可以在制备组合物的过程中，特别是在粒化之前或者在压缩前的 润滑步骤过程中，在任何合适的步骤处添加崩解剂。此类崩解剂，如 果存在，总共构成约O. 2%-约30%，优选地约O. 2%-约10%，和更优选地 约O. 2%-约5%的所述组合物的总重量。
交联羧甲基纤维素钠对于片剂或胶嚢崩解而言是优选的崩解剂， 并且如果存在，优选地构成约O. 2%-约10%，更优选地约O. 2%-约7%，和 更加优选地约O. 2%-约5%的所述组合物的总重量。交联羧甲基纤维素钠 赋予本发明的经粒化的组合物以优异的颗粒内崩解能力。
本发明的组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的粘合剂或 粘着剂作为赋形剂，特别是对于片剂制剂。此类粘合剂和粘着剂优选 地赋予待压片的粉末以足够的粘结力，以允许进行正常的加工操作， 例如过筛(sizing)、润滑、压缩和包装，但仍允许在摄入后片剂进 行崩解以及组合物被吸收。合适的粘合剂和粘着剂单独或组合地包括 阿拉伯胶；黄蓍胶；蔗糖；明胶；葡萄糖；淀粉，例如但不限于，预 胶化淀粉(例如Nationar 1511和National 1500 );纤维素，例如 但不限于，曱基纤维素和羧甲纤维素钠(例如TyloseTM);藻酸和藻酸 的盐；硅酸镁铝；PEG;瓜耳胶；多糖酸；膨润土；聚维酮，例如聚维 酮K-15、 K-30和K-29/32;聚甲基丙烯酸酯；HPMC;羟丙基纤维素(例 如Klucel.);和乙基纤维素(例如EthocerM)。此类粘合剂和/或粘
52着剂，如果存在，总共构成约O. 5%-约25°/。，优选地约O. 75°/。-约15%,和 更优选地约1%-约10%的所述组合物的总重量。
本发明的组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的湿润剂作 为赋形剂。此类湿润剂优选地被选择用于维持所述试剂与水紧密结合， 这是被认为改善组合物的生物利用度的条件。
子包括季铵化合物，例如苯扎氯铵、节索氯铵和西吡氯铵，琥珀酸 二辛酯磺酸钠，聚氧乙烯烷基苯基醚，例如壬苯醇醚9、壬苯醇醚IO 和辛苯昔醇9，泊洛沙姆(聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物)，聚氧乙 烯脂肪酸甘油酯和油，例如聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸甘油单和二酯(例 如Gattefosse的Labrasor"、聚氧乙烯(35)蓖麻油和聚氧乙烯(40) 氢化蓖麻油；聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯(20)鲸蜡硬脂基醚，聚 氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖 醇酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 (例如ICI的TweenTM 80), 丙二醇脂肪酸酯，例如丙二醇月桂酸酯(例如Gattefosse的 Lauroglycol )、月桂基硫酸钠，脂肪酸及其盐，例如油酸、油酸钠 和油酸三乙醇胺，甘油脂肪酸酯，例如单硬脂酸甘油酯，脱水山梨糖 醇酯，例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水 山梨糖醇单棕榈酸酯和脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，泰洛沙泊，及其混 合物。此类湿润剂，如果存在，总共构成约0. 25°/。-约15°/。，优选地约0. 4%-约10%，和更优选地约O. 5%-约5°/。的所述组合物的总重量。
在某些实施方案中，采用作为阴离子表面活性剂的湿润剂。月桂 基硫酸钠是湿润剂的一个实施方案。月桂基硫酸钠，如果存在，构成 约O. 25%-约7%,或者在某些实施方案中，约O. 4%-约4%，或者在某些实 施方案中，约O. 5%-约2°/。的所述组合物的总重量。
本发明的组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的润滑剂 (包括防粘剂和/或助流剂)作为赋形剂。合适的润滑剂单独或组合地 包括山嵛酸甘油酯(例如CompritorM 888 );硬脂酸及其盐，包括 硬脂酸镁、钙和钠；氢化植物油(例如SterotexTM);胶态硅石；滑石；
53蜡；硼酸；苯曱酸钠；乙酸钠；富马酸钠；氯化钠；DL-亮氨酸；PEG (例如CarbowaxTM 4000和CarbowaxTM 6000 );油酸钠；月桂基石克酸钠； 和月桂基硫酸镁。在某些实施方案中，此类润滑剂，如果存在，总共 构成约O. 1%-约10%，或者在某些实施方案中，0. 2%-约8%，或者在某些 实施方案中，0.25%-约5%的所述组合物的总重量。
硬脂酸镁是用于例如在片剂制剂的压缩过程中减少设备和粒化的 混合物之间的摩擦的优选润滑剂。
合适的防粘剂包括滑石、玉米淀粉、DL-亮氨酸、月桂基硫酸钠和 硬脂酸金属盐。滑石是用于例如减少制剂与设备表面粘附以及还减少 混合物中的静电的优选防粘剂或助流剂。滑石，如果存在，在某些实 施方案中构成约O. 1%-约10%，或者在某些实施方案中构成0. 25%-约5%, 或者在某些实施方案中构成约O. 5%-约2%的所述组合物的总重量。
其他赋形剂例如着色剂、调味剂和甜味剂是制药学领域中已知的， 并且可以在本发明的组合物中使用。片剂可以例如用肠溶包衣进行包 被或者不包被。本发明的组合物可以进一步包含例如緩冲试剂。
任选地， 一种或多种泡腾试剂可以用作崩解剂和/或用于增强本发 明的组合物的器官感觉性质。当存在于本发明的组合物中以促进剂型 崩解时， 一种或多种泡腾试剂所存在的总量为，在某些实施方案中， 所述组合物的约30重量％-约75重量％,或者在某些实施方案中，45重量 %-约70重量°/。，例如约60重量％。
在本发明的一个实施方案中，所迷组合物以单位剂量胶嚢或片剂 的形式存在，并且以所需量包含部分或全部地纳米颗粒的本文所描述 的试剂，以及一种或多种赋形剂，例如药学上可接受的稀释剂、崩解 剂、粘合剂、湿润剂和润滑剂。在某些实施方案中，所述組合物包含 一种或多种所选择的赋形剂，例如乳糖(最优选地，乳糖一水合物)、 月桂基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和 微晶纤维素。在某些实施方案中，所述组合物包含乳糖一水合物和交 联羧甲基纤维素钠。在某些实施方案中，此类组合物进一步包含一种 或多种载体材料，月桂基硫酸钠、硬脂酸镁和微晶纤维素。在某些实施方案中，如此选择用于本发明的胶嚢和片剂組合物的赋形剂，以便在标准崩解测定法中提供小于约30分钟的崩解时间，或 者在某些实施方案中，约25分钟或更少，或者在某些实施方案中，约 20分钟或更少，或者在某些实施方案中，约15分钟或更少。举例来说，对于片剂制剂，在常规生产规模的压片机器中以正常 压缩压力(例如在典型的压片模具中施加约l kN-约50 kN的力)，对 量足以制备均 一批次的片剂的成分的完全混合物实施压片。可以获得 在操作、制造、贮存和摄取方面方便的任何片剂硬度。对于IOO mg片 剂，在某些实施方案中，硬度为至少4 kP，或者在某些实施方案中， 约5 kP,或者在某些实施方案中，至少约6 kP。对于200 mg片剂，在 某些实施方案中，硬度为至少7kP,或者在某些实施方案中，至少约9 kP，或者在某些实施方案中，约llkP。然而，不将混合物压缩至这样 的程度，即后来当暴露于胃液时，在达到水合方面存在困难。在标准测试中，在某些实施方案中，片剂脆碎度小于约l， 0%，或 者在某些实施方案中，小于O. 8%，或者在某些实施方案中，小于约O. 5%。可以采用湿法制粒、干法制粒或者直接压片或包嚢方法，以制备 本发明的片剂或胶嚢组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含经研磨或微粉化的试剂。在 某些实施方案中，在试剂的冲击研磨例如针式研磨中所使用的常规研 磨机或碾磨机，给最终组合物提供了相对于其他类型的研磨而言改善 的混合均匀度。例如使用液氮来冷却待研磨的材料可以在研磨过程中 完成，以避免将试剂加热至不希望的温度。在某些实施方案中，经研磨或微粉化的试剂，如果有的话，可以 与所需量的所述组合物的其他组分相混合。在某些实施方案中，在这 个步骤中，所述试剂与一种或多种稀释剂、崩解剂和/或粘合剂，和任 选地一种或多种湿润剂相混合。在某些实施方案中，对于片剂制剂， 可能希望在干燥后添加微晶纤维素，以改善颗粒的可压缩性和从所述 颗粒制备的片剂的硬度。在某些实施方案中，将水例如净化水加入到干粉末混合物中，并55且将该混合物混合另外的时间段，以形成经湿法粒化的混合物。在某 些实施方案中，使用湿润剂，所述湿润剂在某些实施方案中，首先加入到水中，并且在将水加入到干粉末混合物中之前，混合至少15分钟， 或者在某些实施方案中，至少20分钟。在某些实施方案中，立刻、经 过一段时间逐步地、或经过一段时间以几部分向混合物中添加水。在 某些实施方案中，经过一段时间逐步地添加水。在某些实施方案中， 将湿润剂加入到干粉末混合物中，并且可以向所得到的混合物中添加 水。在某些实施方案中，在水添加完成后实施另外的混合时间段，以 确保水在混合物中的均匀分布。在某些实施方案中，经湿法粒化的混合物随后例如用筛磨机进行 湿法研磨，以去除作为湿法制粒操作的副产物而形成的大的材料聚集 体。在某些实施方案中，经湿法粒化或湿法研磨的混合物随后例如在 烘箱或流化床干燥器(例如流化床干燥器)中进行干燥，以形成干燥 的颗粒。在某些实施方案中，在干燥前使经湿法粒化的混合物挤出或 球化(spheronize )。在某些实施方案中，随后减少干燥的颗粒在制剂中的大小，以用 于压缩或包嚢。可以使用常规的颗粒大小减少设备，例如振荡器或冲 击研磨机(例如Fitz研磨机)。对于包含较少水量的混合物，随着混合时间增加，观察到颗粒大 小略微减少。假设当水浓度太低而无法充分活化所采用的粘合剂时， 颗粒内的初级粒子之间的粘结力不足以经受得住由混合叶片所产生的 剪切力，并且发生颗粒大小耗损而不是增长。相反地，增加水量以充 分活化粘合剂，允许初级粒子之间的粘结力经受得住由混合叶片所产 生的剪切力，并且随着混合时间和/或水添加率增加，出现颗粒增长而 不是耗损。与给料速率和/或研磨机速度的变化相比较，湿法研磨机的 筛号的变化趋向于具有更大的对于颗粒大小的影响。在某些实施方案中，干燥的颗粒随后被置于合适的掺合机例如双 壳掺合机(twin-shell blender)中，并且任选地添加润滑剂(例如56硬脂酸镁)和任何另外的栽体材料(例如在某些片剂制剂中的颗粒外 的微晶纤维素和/或颗粒外的交联羧甲基纤维素钠)，以形成最终的掺 合混合物。在某些实施方案中，当稀释剂包括微晶纤维素时，已发现， 在这个步骤过程中添加一部分的微晶纤维素大大增加了颗粒可压缩性 和片剂硬度。在某些实施方案中，对最终的掺合混合物进行包嚢(或者，如果 待制备片剂，那么通过使用适当大小的工具加工而压缩成具有所需重 量和硬度的片剂)。可以采用本领域已知的常规压缩和包嚢技术。通过采用在某些实施方案中约20 nim-约60 mm的床高，约0-约5 mm的压实 设定，和约60， 000粒胶嚢/小时-约130， 000粒胶嚢/小时的速度，对于 胶嚢获得合适的结果。当需要包衣片剂时，可以采用本领域已知的常 规包衣技术。在某些实施方案中，该操作组合产生这样的颗粒，其在单位剂量 水平上在药物含量方面均一，其容易地崩解，其足够容易地流动，从 而使得在胶嚢填充或压片过程中可以可靠地控制重量变化，并且其在 堆积方面足够密实，从而可以在所选择的设备中加工每批批料，并且 各剂量适合于指定的胶嚢或片剂模具。在某些实施方案中，本发明的任何组合物将包含以本文所述的任 何形式或实施方案的所描述的试剂。在某些实施方案中，本发明的任 何组合物将由以本文所述的任何形式或实施方案的所描述的试剂组 成。在某些实施方案中，本发明的组合物将基本上由以本文所述的任 何形式或实施方案的所描述的试剂组成。在某些实施方案中，术语"包 括，，是指包括所示的活性试剂，以及包括其他活性试剂，和药学上可 接受的载体、赋形剂、润滑药、稳定剂等，如制药工业中已知的。在 某些实施方案中，术语"基本上由……组成，，指这样的组合物，其中 仅活性成分为所示的活性成分，然而，还可以包括这样的其他化合物， 其用于使所述制剂稳定、保存等，但不直接牵涉所示活性成分的治疗 效果。在某些实施方案中，术语"基本上由……组成"可以指促进活 性成分的释放的组分。在某些实施方案中，术语"由……组成"指包57含活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了联合制剂。在一个实施方案中，术语"联合制剂"尤其定义了 "部件套盒(kit of parts)"，其含 义是如上定义的联合伙伴可以独立地或者通过采用具有显著量的联合 伙伴的不同固定组合，即同时地、并发地、分开地或顺次地，进行给 药。在某些实施方案中，部件套盒的部分随后可以例如同时地或按时 间顺序错开地施用，即对于部件套盒的任何部分来说在不同的时间点 处并且以相同或不同的时间间隔。在某些实施方案中，可以在联合制 剂中施用联合伙伴的总量的该比例。在一个实施方案中，可以改变联 合制剂，例如以便应付待治疗的患者亚群的需求或单个患者的需求， 所述不同的需求可以是由于特定的疾病、疾病严重度、年龄、性别或 体重，如可以由本领域技术人员容易地来进行的。部件套盒可以包含 有用于形成CPAM试剂和凝血因子/止血因子和/或第二抗炎剂的联合组 合物的材料，或者可以包含有在分开的单位剂量容器中的此类试剂的 组合(或用于制备其分开的单位剂量的工具-例如通过重悬浮或配 制药物形式如冻干形式)以用于分开施用。本文描述的试剂(例如CPAM试剂)通常将会被理解为在对于相当 的药学试剂而言一般可接受的纯度水平内至少基本上分离和/或纯化 的(通过任何合适的方便手段)或者分离的。应当理解，本发明一般地涉及本文所描述的组合物和联合疗法， 以用于任何疾病、病症或病状(在合适时)，如本领域技术人员将会 意识到的。此类组合物和联合疗法的某些应用已在上文中进行了描述， 用于特定的疾病、病症和病状，其代表了本发明的实施方案，并且通 过单独地或作为联合疗法的一部分施用本文所描述的取消或减少补体 途径的激活的试剂或者通过使用本发明的组合物来治疗受试者中的此 类疾病、病症和病状的方法，代表了本发明的另外实施方案。如其他地方所指出的，在一个方面，本发明涉及用于治疗滑膜炎 的方法，例如在出血病状的情况下和/或在患有出血病症例如血友病的 患者中治疗滑膜炎。在一个实施方案中，滑膜炎是急性的和/或急性前58期的，或者在另一个实施方案中，滑膜炎是慢性的。在某些实施方案中，可以通过本领域已知的任何手段来监测滑膜 炎和/或治疗效果，包括但不限于患病关节的超声检查和/或磁共振成像，以及Ritchie指数的评估，胂胀关节计数和得分，手和腕的肿胀关 节计数，晨僵的评价，疼痛强度，疾病活性得分(Disease Activity Score, DAS)，红细胞沉降速率，和C-反应蛋白。在某些实施方案中， 治疗方案可以根据对临床干预的应答性进行调整，例如可以改变剂量、 施用途径和/或时机，以及改变或调整联合疗法以优化受试者中的疗 法。在一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中治疗出血相关 炎症、减少出血相关炎症的发生率、减少出血相关炎症的严重度、或 者延迟出血相关炎症的发作(和/或延迟出血相关炎症的进展)的方法， 所述方法包括给受试者施用取消或减少所述受试者中补体途径的激活 的试剂。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗各种病状的组合物以 及用于治疗各种病状的方法，所述各种病状(在受试者中直接或间接) 与出血(或其显著和/或紧急的危险)或血液和炎症相关，包括系统性 红斑狼疮、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肌炎、神经痛、滑膜炎、 痛风、强直性脊推炎、粘液嚢炎或其他，如将由本领域技术人员所意 识的。在一个实施方案中，在除了炎性病症外还患有特定的出血病状 (例如，来自外创、外科手术、创伤等)和/或出血相关疾病、病症或 病状例如血友病的患者中治疗此类病症。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗炎症相关病症的组合 物以及用于治疗炎症相关病症的方法，所述炎症相关病症与血液、出 血或其危险相关，例如异常的伤口愈合、对于眼组织的急性损伤、血 管发生相关病症、血管成形术炎症、强直性脊推炎、细菌引起的炎症、 脑缺血、衣原体引起的炎症、凝血、冠状动脉旁路手术炎症、冠状动 脉疾病、冠状动脉斑块炎症、克罗恩病、动脉内膜切除术炎症、胃肠 出血、龈炎、痛风、痛风性关节炎、头部创伤、血友病、遗传性血管性水肿、低凝血酶原血症、IBD相关关节炎、特发性多肌炎、炎症相关 心血管病症、炎性肠病、肠易激惹综合征、人工关节植入物的松开、 心肌缺血、肌炎、肾炎、骨关节炎、复发性风湿性关节及关节周围炎、 消化性溃疡、手术后炎症、肺部炎症、复发性胃肠损伤、局限性回肠 炎、视网膜炎、视网膜病变、再血管化操作程序炎症、类风湿性关节 炎、结节病、巩膜炎、硬皮病、支架放置炎症、中风局部缺血、在损 伤后发生的肿胀、滑膜炎、系统性红斑狼疮、系统性类风湿性脉管炎、 系统性硬化症、肌腱炎、甲状腺炎、組织溃疡、溃疡性结肠炎、脉管 炎或其他。本发明还提供了用于促进CPAM试剂(单独地或与止血因子/ 凝血因子和/或第二抗炎剂相组合)的销售的方法，以用于治疗此类疾 病(例如通过直接对于消费者做广告，经由科学联络人进行促销，对 于关键意见引导者定向做广告等)。
本发明的组合物包含和/或本发明的方法利用本文所描述的试剂， 以阻抑、抑制、治疗等出血相关炎症，其是许多疾病(包括上文列表) 的特征性症状和/或病因学。在某些实施方案中，本发明的组合物包含 和/或本发明的方法利用试剂以阻抑血管发生，而所述血管发生可以构 成、加重或参与疾病严重度。在某些实施方案中，此类试剂可以包括 抗侵袭因子、视黄酸及其衍生物、紫杉醇、苏拉明、组织金属蛋白酶 抑制剂-1、组织金属蛋白酶抑制剂-2、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤 溶酶原激活物抑制剂-2、和各种形式的较轻的"d族"过渡金属。这些 和其他抗血管发生因子将在下文中更详细地讨论。
从软骨提取物中制备的抗侵袭因子或"AIF"包含负责抑制新血管 生长的组成成分。这些组成成分包括具有7种低分子量蛋白质(<50， 000 道尔顿)的家族 (Kuettner和Pauli, "Inhibition of neovascularization by a cartilage f"tor" in Development of the Vascular System, Pitman Books ( CIBA Foundation Symposium 100 ), 第163-173页，1983 )，包括具有针对各种蛋白酶的抑制效应的多种蛋 白质(Eisentein等人，Am. J. Pathol. 81:337-346， 1975; Langer 等人，Science 193: 70—72， 1976 ; 和Horton等人，Science
60199:1342-1345, 1978 )。通过利用本领域已知的技术可以容易地制备 适合于在本发明内使用的AIF (例如Eisentein等人，同上；Kuettner 和Pauli，同上；和Langer等人，同上)。AIF的经纯化的组成成分例 如软骨衍生抑制剂("CDI")(参见，Moses等人，Science 248:1408-1410， 1990 )也可以容易地制备，并且在本发明的情况下使 用。
视黄酸改变细胞外基质组分的代谢，从而导致血管发生的抑制。 可以利用脯氨酸类似物、血管生长抑制性类固醇(angiostatic steroid )或肝素的添加，以l更协同地增加反式视黄酸的抗血管发生效 应。可以在本发明的情况下使用的视黄酸及其衍生物可以从商业来源 容易地获得，包括例如Sigma Chemical Co. (# R2625 )。
紫杉醇是高度衍生化的二萜类化合物(Wani等人，J. Am. Chem. Soc. 93: 2325， 1971)，其已从收获并干燥的短叶红豆杉(rajf"s 6reW尸o7/a)(太平洋紫杉)树皮以及安德紫杉霉(Taxomyces Andreanae)(太平洋紫杉的一种植物内生真菌)中获得(Stierle等 人，Science 60:214-216， 1993 )。 一般地，紫杉醇通过结合微管蛋 白来发挥作用以稳定微管结构，从而形成异常的有丝分裂纺锤体。"紫 杉醇，，(其在本文中应当理解为包括类似物和衍生物，例如，TAX0L 、 TAX0TERE 、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物和紫杉醇的3' N-脱苯甲酰基 -3'N-叔丁氧基羰基类似物)可以通过使用本领域技术人员已知的技术 容易地制备(还可参见W0 94/07882， W0 94/07881， W0 94/07880， WO 94/07876， WO 93/23555， WO 93/10076，美国专利号5， 294， 637， 5， 283， 253， 5， 279， 949， 5， 274，137， 5， 202, 448， 5， 200， 534， 5， 229， 529 和EP 590267 ),或者从各种商业来源获得，包括例如Sigma Chemical Co., St. Louis， Mo. (T7402—来自短叶红豆杉)。
苏拉明是通常用作杀锥虫剂的多磺化的萘脲化合物。简而言之， 苏拉明阻断多种生长因子的特异性细胞表面结合，所述生长因子例如 为血小板衍生生长因子("PDGF")、表皮生长因子("EGF")、转 化生长因子("TGF-P")、胰岛素样生长因子("IGF-1")和成纤
61维细胞生长因子("PFGF")。苏拉明可以依照已知技术进行制备， 或从各种商业来源容易地获得，包括例如Mobay Chemical Co. ， New York (参见Gagliardi等人,Cancer Res. 52:5073-5075， 1992;和 Coffey, Jr.等人，J. of Cell. Phys. 132:143-148， 1987 )。
组织金属蛋白酶抑制剂-1 ( "TIMP")由内皮细胞分泌，所述内 皮细胞还分泌MTP酶。TIMP是糖基化的并且具有28.5 kDa的分子量。 TIMP-1通过与激活的金属蛋白酶结合来调节血管发生，从而阻抑血管 侵入细胞外基质中。组织金属蛋白酶抑制剂-2 ( "TIMP-2")也可以 用于抑制血管发生。简而言之，TIMP-2是21 kDa的非糖基化的蛋白质， 其与以活性形式和潜伏的酶原形式的金属蛋白酶结合。TIMP-1和 TIMP-2都可以从商业来源获得，例如Synergen， Boulder, Colo。
纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PA)是50 kDa的糖蛋白，其存在于血 小板中，并且还可以由内皮细胞和肌细胞合成。PAI-l抑制在内皮的基 底外侧位点处的t-PA和尿激酶纤溶酶原激活物，并且另外还调节纤维 蛋白溶解过程。纤溶酶原激活物抑制剂-2 (PAI-2) —般仅在某些情况 下，例如在妊娠中和在肿瘤存在的情况下，在血液中被发现。简而言 之，PAI-2是由单核细胞和巨噬细胞分泌的56 kDa的蛋白质。它被认为 调节纤维蛋白溶解活性，并且特别地抑制尿激酶纤溶酶原激活物和组 织纤溶酶原激活物，从而阻止纤维蛋白溶解。
他抗血管发生因子。代表性的例子包括血小板因子4 (Sigma Chemical Co., #F1385 );疏酸鱼精蛋白(绯精蛋白)(Sigma Chemical Co., #P4505 );硫酸化壳多糖衍生物(从雪花蟹的壳中制备的)，(Sigma Chemical Co.，并C3641; Murata等人，Cancer Res. 51:22-26， 1991); 硫酸多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(这种化合物的功能可以通过类固醇 例如雌激素和柠檬酸他莫昔芬的存在而得到增强)；星形孢菌素(Sigma Chemical Co., #S4400 );基质代谢的调节剂，包括例如脯氨酸类似 物U(L-氮杂环丁烷-2-羧酸(LACA)( Sigma Chemical Co. , #A0760 )), 顺羟脯氨酸，d，L-3,4-脱氢脯氨酸(Sigma Chemical Co. , #D0265 ),噢脯氨酸(Thiaproline) (Sigma Chemical Co. ， #T063. 1 ) ]， oc， ct-联吡啶(Sigma Chemical Co., #D7505 ) ， 氨基丙腈富马酸盐
(Sigma Chemical Co., #A3134) ]}; MDL 27032 ( 4-丙基-5-(4-p比 咬基)-2 (3H)-嚙峻酮；Merion Merrel Dow Research Institute); 甲氨蝶呤(Sigma Chemical Co. ， #A6770; Hirata等人，Arthritis and Rheumatism 32: 1065-1073， 1989);米托蒽S^ ( Polyer ini和Novak， Biochera. Biophys. Res. Comm. 140:901-907 ) ，肝素(Folkman， Bio. Phar. 34: 905-909， 1985; Sigma Chemical Co. ， #P8754 );干扰素
(例如Sigma Chemical Co. ， #13265 ) ; 2巨球蛋白-血清(Sigma Chemical Co., #M7151 ) ; ChIMP-3 ( Pavloff等人，J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992 );胰凝乳蛋白酶抑制剂(Sigma Chemical Co,, #C7268; Tomkinson等人，Biochem J. 286:475-480， 1992 ); P-环 糊精十四硫酸酉旨(Sigma Chemical Co., #C4767 ) ; Epo翻ycin;喜 树碱；夫马洁林(Sigma Chemical Co. ， #F6771 ;加拿大专利号 2, 024, 306; Ingber等人，Nature 348: 555-557， 1990 );金石危丁二 钠("GST" ; Sigma: G4022; Matsubara和Ziff， J. Clin. Invest. 79: 1440-1446， 1987 ); D-青霉胺("CDPT" ; Sigma Chemical Co.， 并P4875和P5000 (HC1) ); P-l-抗胶原酶-血清；oc 2-抗纤溶酶(Sigma Chem. Co.: A0914; Holmes等人，J. Biol. Chem. 262 (4): 1659-1664, 1987 );比生群(National Cancer Institute);氣笨4L利二4内(N—(2) — 羧基苯基-4-邻氨基苯甲酸二钠或"CCA" ; Takeuchi等人，Agents Actions 36:312-316， 1992 );沙利度胺；血管生长抑制性类固醇； AGM-1470; carboxy謹inolmidazole;金属蛋白酶抑制剂例如BB94和 肽CDPGYIGSR-NH2( SEQUENCE ID NO. 1 )( Iwaki Glass, Tokyo, Japan )。
实施例
给出下述实施例以便更充分地举例说明本发明的某些实施方案。 然而，它们决不应当被解l^为限制了本发明的花围。
63实施例l
患病关节中的C5aR表达 将进行处于正常和患病状态中的C5aR的人关节表达的分析。从经 历了滑膜切除术或全关节置换的成人中收集关节组织，其中在滑膜炎 的不同阶段(包括急性、亚急性和慢性滑膜炎)收集组织。从受试者 获得书面知情同意书。
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从经历外科手术的每个膝获得滑膜组织(直径1~2 cm,几个样 品)。在4%磷酸盐緩冲的福尔马林中固定组织切片，以用于免疫组织 化学研究。在固定后，对组织进行加工，包埋在石蜡中，切片，并放 置到栽玻片上。切片也在液氮中速冻并贮存，以用于免疫組织化学分 析。进行标准的组织学加工和染色，包括H & E染色。
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对载玻片进行脱石蜡，再水化，并且通过标准方案来猝灭内源性 过氧化物酶。将山羊血清用作封闭剂，并且用针对人C5aR而产生的小 鼠单克隆抗体(W17/1)来对载玻片进行探测。将鼠类IgGl用作对照抗 体。生物素化的大鼠抗小鼠免疫球蛋白为所使用的二抗，并且使载玻 片在湿润的室中进行温育。因为是AEC底物，所以添加辣根过氧化物酶 (HRP)，并且通过添加水来终止反应。
载玻片用Mayer's苏木精进行复染，观察，并记录。购买正常关节 组织，并且类似地进行加工和探测。正常组织染色的例子显示在图l 中(其在实施例4中进一步讨论)。
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将冷冻的组织样品在Trizol Reagent中进行均浆，随后为氯仿 /Trizol提取。对水相实施l: 2异丙醇/Trizol提取，以用于RM沉淀。 用乙醇/Trizol混合物洗涤RNA粒状沉淀，风干，并重新溶解在DEPC水中。
也可以通过标准方法从经福尔马林固定的组织中提取出RNA。
64因此，将通过RT-PCR而在患病组织以及健康组织中定量地进行测定C5aR表达。
预期将会在滑膜组织中检测出C5aR表达，并且C5aR表达在从滑膜炎患者获取的滑膜组织中相比于正常对照而言上调，这表明所述受体在疾病发病机制中^皮调节。
实施例2C5aR的消除和滑膜炎的发展将在遗传上破坏了C5aR表达的C5ar广^小鼠与在遗传上破坏了
凝血因子vin表达的F8t""az小鼠进行杂交，从而产生在任一蛋白质的
表达方面具有缺陷的小鼠。经由Southern印迹法或RT-PCR来完成基因型的确认。如Hakobyan N.等人，Haemophilia. 2005 May; 11(3):227-32和/或Valentino LA等人，Haemophilia. 2004 May;10 (3): 280-7中所描述的，在这些小鼠中进行血友病性滑膜炎的诱导。评估C5aR的不存在对于滑膜炎发展的影响，并且评估与凝血因子VIII敲除小鼠相比较，双敲除小鼠是否对于关节出血诱导更易感。预期由于不存在C5a/C5aR相互作用，双敲除小鼠将会对于关节出血更不易感。
实施例3阻抑C5aR的试剂的开发
通过标准方法来开发特异性地结合并阻断C5aR的单克隆抗体。在某些情况下，C57BL/6小鼠每14天进行腹膜内(IP)免疫接种，共6次，随后为在最后一次IP注射后4-5天的单次静脉内(IV)注射，其中使用Ll. 2/人C5aR表达性细胞，所述Ll. 2/人C5aR表达性细胞用丁酸激活24小时并且用丝裂霉素C处理。然后，处死小鼠，并且使其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞相融合，其中所得到的杂交瘤通过FACS来进行筛选，并且鉴定并分离产生针对C5aR的单克隆抗体的杂交瘤。
在其他实施方案中，可以根据Lee H.等人，2006 NatureBiotechnology 24: 1279-1284中所概括的方法来产生特异性地与人
65C5aR相互作用的单克隆抗体，或者可以利用其中所产生的抗体。
一旦产生了候选单克隆抗体，就评估它们阻断配体结合和/或嗜中
性粒细胞趋化性的能力。在滑膜炎的小鼠模型中鉴定和测试先导抗体，
例如如实施例2中所描述的。
也可以在具有血友病性滑膜炎的成人受试者中进行人临床试验。
可以给受试者施用抑制由C5aR介导的信号传导的单克隆抗体，包括所
谓的"人源化"形式的本文所描述的抗体。证明了抗体的治疗效果。
预期此类试剂将会提供有用的生理学、预防性和/或治疗性效果，如本
文所描述的。
实施例4
使用滑膜組织和抗C5aR抗体的免疫组织学染色正常滑膜购自Asterand plc( Detroit, MI, USA; Royston， Herts,UK)。它切除自82岁的患病男性高加索人。该滑膜組织由Asterand加工成经福尔马林固定的、用石蜡包埋的切片(厚5-IO微米)。
对于染色，以10iig/ml的浓度将小鼠抗人C5aRl W17/l单克隆抗体(Abeam - Cambridge, MA， USA)用作一抗。生物素化的大鼠抗小鼠IgGl (BD Pharmingen)用作二抗。缀合有链霉抗生物素蛋白的HRP(BDPharmingen)和AEC底物(BD Pharmingen)用于显色。用Mayer，s苏木精(Sigma)对栽玻片进行复染，并且安放好以进行观察。结果显示在
图1中。如图l中所显示的，正常滑膜组织看起来表达最低水平的C5aR。
从在切除时具有右膝的进行中的骨关节炎的65岁患病女性中获取的另外的滑膜组织购自Asterand, Inc. (Detroit, MI, USA)。在与上文关于图l而描述的相同条件下，使用相同的抗体(W17/1)来对组织进行染色。结果显示在图2中(因为图2是原始彩色显微照片的黑白复制品，所以难以看出鉴别染色的区域)；给该图添加了指示线以指出其中检测出C5aR的区域)。这个实验的结果反映了，与正常滑膜相比较，人骨关节炎滑膜表达中等水平的C5aR。如下进行进一步的研究。患者关节样品获自Rush University(Chicago, IL， USA)。该样品被描述为来自经历了滑膜切除术的血友病性滑膜炎患者的关节样品。在用石蜡包埋的人滑膜组织上执行免疫组织化学。将系列5-jim切片放置在载玻片上。通过放置在56-60'C烘箱中l小时，然后转移至二甲苯浴来使载玻片脱蜡。然后，使载玻片再水化，随后进行热诱导的表位修复(heat-induced epitoperetrieval, HIER)。栽玻片用PBS进行漂洗，随后用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。将载玻片与一抗一起在4'C下温育过夜，用PBS/0. ly。Tween洗涤3次，然后与抗小鼠-HRP聚合物(DAKO,未稀释的)在室温下温育30分钟。在PBS中洗涤后，在去离子水中漂洗载玻片，并根据制造商的指导用持久的AEC色素原(BioCare Medical )进行显现。载玻片用Mayer，s苏木精(Sigma)进行复染，通过酒精进行脱水，在二曱苯中清洗，并且用Permount (Fisher)盖上盖玻片。所测试的一抗是稀释了l: 100的小鼠抗人C5aR, W17/1 (Abcam, 0.1 mg/mL)。未稀释的小鼠IgG用作阴性对照(Dako， 6.1 mg/mL)。这个工作的结果呈现在图3中。如可在图3中看见的，在患病组织中显示出清楚的用抗C5aR的染色。
本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过提及而以其整体合并入本文，就如同每篇参考文献被单独地和具体地指明通过引用而合并入本文并且以其整体列出在本文中一样(至由法律所允许的最大程度)，而不管在本文其他地方所作的任何分开提供的关于具体文件的合并。
在描述本发明的情况下使用术语"a"和"an"和"the"以及类似的指示物应当被解释为涵盖了单数和复数，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛盾。
除非另外说明，本文提供的所有精确值是相应的近似值的代表(例如，适当时，关于特定因子或测量而提供的所有精确的示例性值可以被视为还提供了由"约"进行修饰的相应的近似测量值)。
67在本文中关于要素使用术语例如"包含"、"具有"、"包括"或"含有"来描述本发明的任何方面或实施方案，旨在提供关于"由所述特定要素组成"、"基本上由所述特定要素组成"或"实质上包含所述特定要素"的本发明的类似方面或实施方案的支持，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛盾(例如，在本文中被描述为包含特定要素的组合物应当理解为还描述了由那种要素组成的组合物，除非另外说明或者通过上下文而明显相矛盾)。
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本文中专利文件的引用和合并仅仅是为了方4更起见而进行的，并不反映关于此类专利文件的有效性、专利性和/或可行使性的任何观点。
曰A两.汰ff i吝开i沄砵;vr方面之中所阐述的主题的所有修饰和等价物，
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权利要求
1.抑制或减少C5a受体(C5aR)的激活的试剂用于治疗滑膜炎的用途。
2. 根据权利要求l的用途，其中所述试剂是对于C5aR特异的抗体。
3. 根据权利要求1或权利要求2的用途，其中所迷试剂用作用于在具有血友病的患者中治疗滑膜炎的药物。
4. 根据权利要求l-3中任一项的用途，其中所述试剂特异性地结合C5aR的胞外环。
5. 根据权利要求2-4中任一项的用途，其中所述抗体由下述杂交瘤表达，或者包含由下述杂交瘤表达的抗体的功能性部分具有ECACC登录号00110609、 02090226或02090227，或ATCC登录号HB 11 382、 HB 11384或HB-11625的杂交瘤。
6. 根据权利要求1-5中任一项的用途，其中所述滑膜炎是急性或亚急性的，或者慢性的。
7. (a)取消或减少C5aR的激活的试剂和(b)凝血因子或止血因子的组合用于治疗滑膜炎的用途。
8. 根据权利要求7的用途，其中所述凝血因子或止血因子选自凝血因子XIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子VII、凝血因子VIII、纤维蛋白原、凝血酶、任何前述物质的变体、任何前述物质的衍生物、以及任何前述物质的組合。
9. 抑制或减少C5aR的激活的试剂用于治疗出血相关炎症的用途。
10. 根据权利要求9的用途，其中所述试剂是对于C5aR特异的抗体。
11. 根据权利要求9或权利要求10的用途，其中所述试剂特异性地结合C5aR的胞外环。
12. 根据权利要求9-ll中任一项的用途，其中所迷抗体由下列杂交瘤表达，或者包含由下列杂交瘤表达的抗体的功能性部分具有ECACC登录号00110609、 02090226或02090227'或ATCC登录号HB 11382、 HB11384或HB-11625的杂交瘤。
全文摘要
本发明尤其提供了用于在有此需要的受试者中治疗滑膜炎和/或出血相关炎症，减少滑膜炎和/或出血相关炎症的发生率，减少滑膜炎和/或出血相关炎症的严重度，或者延迟滑膜炎和/或出血相关炎症的发作或进展的方法和组合物。所述组合物包含有效量的取消或减少所述受试者中C5aR补体途径的激活的试剂和任选地其他治疗剂，并且所述方法利用有效量的取消或减少所述受试者中C5aR补体途径的激活的试剂和任选地其他治疗剂，所述其他治疗剂包括凝血因子、其他止血因子和/或第二抗炎剂。
文档编号A61K39/395GK101668541SQ200880013874
公开日2010年3月10日 申请日期2008年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者Y·曹 申请人:诺和诺德公司