抗cd4抗体和抗融合肽的缀合物的制作方法

专利名称：抗cd4抗体和抗融合肽的缀合物的制作方法
抗CD4抗体和抗融合肽的缀合物本发明涉及抗⑶4抗体和抗融合肽的缀合物，其中2至8个抗融合肽各自与抗⑶4 抗体的重链和/或轻链的一个末端缀合。抗融合肽的氨基酸水平可以不同、相似或相同。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(HIV)对细胞的感染受感染细胞的膜与病毒膜融合过程的影响。 认为该过程的普遍方案如下病毒被膜糖蛋白复合体(gpl20/gp41)与位于感染细胞膜上 的细胞表面受体相互作用。gpl20结合例如⑶4受体和共受体(例如，CCR-5或CXCR-4) 的组合导致gpl20/gp41复合体构象的改变。该构象改变的结果是gp41蛋白能够插入到 靶细胞的膜内。所述插入是膜融合过程的开始。由于天然存在的多态性，已知gp41蛋白 的氨基酸序列在不同HIV株之间不同。但是可以识别相同的结构域结构，更精确的，融合 信号、两个七残基重复序列结构域(HR1、HR2)和跨膜结构域(N-至C-端方向)。提示， 融合(或致融(fusogenic))结构域参与了细胞膜的被插入和分解。HR区域由多个包 含7个氨基酸(“七残基(heptad)")序列段(stretch)构成(参见例如，Shu, W.等人， Biochemistry38 (1999) 5378-5385)。除了七残基外，还存在一个或多个亮氨酸拉链-样基 序。上述组成是gp41蛋白卷曲螺旋结构形成以及源自这些结构域的肽的原因。卷曲螺旋 总体来说是由两个或多个相互作用的螺旋构成的寡聚体。具有从gp41的HRl或HR2结构 域推测的氨基酸序列的肽是有效的HIV摄入细胞内的体外和体内抑制剂(例如这样的肽， 参见例如 US 5，464，933、US 5，656，480、US 6，258，782、US 6，348，568 或 US 6，656，906)。 例如，T20(还已知为 DP178，Fuzeon , HR2 肽)、T651 (US 6，479，055)和 T2635 (W0 2004/029074)是HIV感染非常有效的抑制剂。已经尝试使用例如氨基酸置换或化学交联来 增加 HR2 衍生肽的功效(Sia，S. K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669 ； Otaka, Α.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937—2940)。肽与一些分子的缀合可以改变其药物动力学的性质，例如，可以增加此类肽缀 合物的血清半衰期。例如，报道了以下的缀合，聚乙二醇(PEG)和白介素_6(EP 0 442 724)，PEG和红细胞生成素(W0 01/02017)，包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子 (US 2005/008649)，基于融合蛋白的分泌抗体(US 2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽 (US 2005/0100991 ；人血清白蛋白 US 5，876，969)，PEG 化多肽(US 2005/0114037)以及 干扰素融合体。现有技术还描述了包含多花白树毒蛋白和抗体(W0 94/26910)的免疫毒 素，修饰的转铁蛋白-抗体融合蛋白(US 2003/0226155)，抗体-细胞因子融合蛋白(US 2003/0049227)，和由具有免疫刺激性、膜转运或嗜同性活性的肽和抗体组成的融合蛋白 (US 2003/0103984)。在WO 2004/085505中，报道了由生物学活性化合物与大分子化学连 接组成的长效生物学活性缀合物。根据表面糖蛋白⑶4和⑶8的存在，将T-淋巴细胞分成CD4+-和OT8+-T-细胞。 CD4表面糖蛋白的络合作用可以起始例如，T-细胞增殖或淋巴因子的释放。CD4是55kDa 的膜糖蛋白，通过与抗原呈递细胞上的MHC II类抗原相互作用，在起始T细胞应答中发 挥中心作用，所述抗原呈递细胞将肽展示给T细胞上的抗原特异性受体。用ρ56ΙΛ—— T淋巴细胞活化涉及的酪氨酸激酶，通过在胞质结构域中的基序，将效应传递至细胞质(Brady, R. L.禾口 Barclay，Α. N. ，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18 ；Rudd, C. Ε.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5190-5194 ；ffeilette, Α.等 A, Eur. J. Immunol. 20 (1990) 1397-1400)。CD4表面受体是HI-病毒进入细胞必需的靶。在HIV感 染后，CD4+-淋巴细胞成为无功能的细胞。在US 2006/0121480中，报道了用于预防辅助T细胞和其他靶细胞被HIV感染的 方法，所述方法是通过将靶细胞暴露在至少一种附着抑制剂和至少一种融合抑制剂的协同 组合下。在WO 2004/103312中，报道了用作HIV融合抑制剂的肽。在WO 2001/43779中，报 道了抗⑶4分子和HIV-I融合抑制肽的缀合物。在WO 2004/108885中，报道了具有抗HIV 药物的FC嵌合蛋白。发明概述发明包括这样的缀合物，所述缀合物包含两个或多个抗融合肽和抗-⑶4抗体 (mAb CD4)，特征是2至8个抗融合肽分别与所述抗CD4抗体的重链和/或轻链的一个末端 缀合(仅如果当mAb⑶4包含8个末端时，即包含例如两条重链和两条轻链，才可能每个 mAb⑶4具有8个抗融合肽的数量；如果mAb⑶4包含较少数量的C-和N-端，例如scFv， 缀合物中最大可能的抗融合肽的相应数量也降低，即降低至少于8)。在一个实施方案中，抗-CD4抗体链的羧基端氨基酸与抗融合肽的氨基端氨基酸 缀合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸与抗体链的氨基端氨基酸缀合，优选的通过具有或不 具有中间接头的肽键。在另一个实施方案中，缀合物的特征是如下通式
mAb CD4-[接头]m_ [抗融合肽]n其中，对于每种抗融合肽，m是独立的为0( S卩，在mAb⑶4和抗融合肽之间为肽键) 或者1 (即，在mAb⑶4和抗融合肽之间为接头)，n是从2至8的整数，在一个实施方案中， 是从2至8的偶数，优选的2或4。在一个实施方案中，mAb CD4的重链和/或轻链与抗融合肽的优选缀合物(“链缀 合物”)选自(从N-端至C-端方向)(1)[抗融合肽]-[接头]m_[重链]O)[重链]-[接头]m_ [抗融合肽](3)[抗融合肽]-[接头]m_ [重链]-[抗融合肽](4)[抗融合肽]-[接头]m_ [轻链](5)[轻链]-[接头]m_ [抗融合肽](6)[抗融合肽]-[接头]m_ [轻链]-[抗融合肽](7)[抗融合肽]-[接头]m_ [重链]-[接头]m_ [抗融合肽]
(8)[抗融合肽]-[接头]m_ [轻链]-[接头]m_ [抗融合肽]其中，所述链缀合物(之中或之间)的接头可以是相同或不同的，其中m是整数1 或0，在所述链缀合物(之中或之间)，m可以是独立的相同或不同的。肽或mAb CD4链的 左侧意指N-端，右侧意指C-端。因此，在(1)中，抗融合肽的C-端通过肽键或接头与mAb ⑶4的重链N-端相连。在另一个实施方案中，链缀合物被装配成包含mAb CD4(例如，由两条轻链和两条 重链组成，包括恒定的Fc结构域、scFv片段或Fab片段)的根据发明的缀合物。
优选的链缀合物是(2)、(3)、⑷和(7)。根据发明的优选缀合物包括h[mAb⑶4 轻链]和 2x (2)，2x [mAb CD4 轻链]和 2x (3)，或 2x [mAb CD4 重链]和 2x (4)，或 2x [mAb CD4 轻链]和。重链和/或轻链优选的包括恒定区。在其它实施方案中，根据发明的缀合物的特征是包含可变的重链结构域，所述结 构域由免疫球蛋白构架和⑶R3区组成，所述⑶R3区选自SEQ ID NO :29、30或31的重链 CDR3序列。在其它实施方案中，缀合物的特征是包含可变的重链结构域，所述结构域由免疫 球蛋白构架和⑶R3区、⑶R2区和⑶Rl区组成，所述⑶R3区选自SEQ ID NO :29、30或31 的CDR3序列，所述CDR2区选自SEQ IDNO :26、27或观的CDR2序列，所述CDRl区选自SEQ ID NO :23、M 或 25 的 CDRl 序列。在另一个实施方案中，缀合物的特征是包含重链可变结构域，其中重链可变结构 域包含SEQ ID NO :8或10。在一个实施方案中，缀合物的特征是包含可变的轻链结构域，所述结构域由免疫 球蛋白构架和⑶Rl区、CDR2区和⑶R3区组成，所述⑶Rl区选自SEQ ID NO :13、14、15或 16，所述 CDR2 区选自 SEQ ID NO 17、18 或 19，所述 CDR3 区选自 SEQ ID NO :20、21 或 22。在另一个实施方案中，缀合物的特征是包含SEQ ID NO 7的⑶R作为重链⑶R，和 SEQ ID NO 1 的 CDR 作为轻链 CDR，SEQ ID NO 8 的 CDR 作为重链 CDR，和 SEQ ID NO 2 的 CDR作为轻链CDR，SEQ IDNO 10的⑶R作为重链⑶R，和SEQ ID NO :4的⑶R作为轻链CDR， SEQ ID NO 11 的 CDR 作为重链 CDR JPSEQ ID NO :5 的 CDR 作为轻链 CDR，或者 SEQ ID NO: 12的CDR作为重链CDR,和SEQ ID NO 6的CDR作为轻链CDR0在一个实施方案中，缀合物的特征是包括可变的重链和轻链结构域，独立的选 自a)氨基酸序列SEQ ID NO 7定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 1 定义的轻链可变结构域；b)氨基酸序列SEQ ID NO 8定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 2 定义的轻链可变结构域；c)氨基酸序列SEQ ID NO 10定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 4定义的轻链可变结构域；d)氨基酸序列SEQ ID NO 11定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 5定义的轻链可变结构域；e)氨基酸序列SEQ ID NO 12定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 6定义的轻链可变结构域。在另一个实施方案中，缀合物的特征是包括氨基酸序列SEQ ID NO 7定义的重链 可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :1定义的轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO 8定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQID NO 2定义的轻链可变结构域；或氨基酸序 列SEQ ID NO 10定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO 4定义的轻链可变结构 域；氨基酸序列SEQ ID NO: 11定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :5定义的轻 链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO: 12定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :6定义的轻链可变结构域；接头(其选自氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)，三肽GST，和SEQ ID NO :46-76)；以及抗融合肽(其选自SEQ ID NO 35-44的抗融合肽)。在一个实施方案中，缀合物的特征是包括抗融合肽，其选自抗融合肽C34、T20、 T1249、T651、T2635、N36、DP107 或 afp_l。在另一个实施方案中，缀合物的特征是在重链的每个C-端或轻链的每个N-端包 括抗融合肽(两个抗融合肽)。在一个实施方案中，缀合物的特征是在重链的每个C-端和 轻链的每个N-端包括抗融合肽G个抗融合肽)。在另一个实施方案中，缀合物的特征是在 重链的2个C-端和轻链的2个N-端包括抗融合肽G个抗融合肽)。在一个实施方案中，缀合物的特征是包括2条SEQ ID NO 1的轻链可变结构域，2 个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO 7的重链可变结构域、SEQ ID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ ID NO 2的轻链可变结构域， 2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO 8的重链可变结构域，SEQ IDNO 75的接头和SEQ ID NO :42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ ID NO :4的轻链可变结构域，2 个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQID NO 10的重链可变结构域、SEQ ID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ ID NO 5的轻链可变结构域， 2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO=Il的重链可变结构域，SEQ ID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；或者，特征是包括2条SEQ ID NO 6的轻链可 变结构域，2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO 12的重链可变结构 域，SEQ ID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽。在一个实施方案中，缀合物的特征是所述抗-⑶4抗体是IgGl亚类或IgG4亚类 的。在一个实施方案中，所述抗-CD4抗体还是IgG4或IgGl或IgG2亚类的，具有在氨基 酸位置S228、L234、L235和/或D265的突变，和/或包含PVA236突变。在另一个实施方 案中，缀合物的特征是所述IgG4亚类的抗-⑶4抗体具有S228P突变，且所述IgGl亚类的 抗-CD4抗体具有L234A和L235A突变。发明包括了用于生产根据发明的缀合物的方法，特征是方法包括a)在适合缀合物表达的条件下，培养包含一个或多个质粒的细胞，每个质粒包含 一种或多种编码根据发明的缀合物的核酸分子，b)从细胞或上清液中回收缀合物。在一个实施方案中，编码与抗融合肽相连或不相连的mAb⑶4的轻链和重链的基 因位于相同的表达载体或不同的表达载体上。发明还包括药物组合物，所述组合物含有根据发明的缀合物，以及可药用的赋形 剂或载体。发明还包括了根据发明的缀合物的用途，用于生产用于治疗病毒感染的药物。在 一个实施方案中，用途的特征是所述病毒感染是HIV感染。发明包括了根据发明的缀合物的用途，用于治疗需要抗病毒治疗的患者，优选的 抗HIV治疗。发明的详述本发明报道了这样的缀合物，所述缀合物包含两个或多个抗融合肽和抗-⑶4抗 体(mAb⑶4)，特征是2至8个抗融合肽分别与所述抗-⑶4抗体的重链和/或轻链的一个 末端缀合。仅在如果mAb⑶4包含8个末端时，即包含例如两条重链和两条轻链，每个mAb⑶4上8个抗融合肽的数量才有可能。如果mAb⑶4包含较少数量的C-和N-端，例如scFv， 缀合物中最大可能的抗融合肽的相应数量也降低，即降低至少于8。“抗融合肽”是这样的肽，所述肽抑制与膜融合相关的事件，或膜融合事件本身，包 括抑制由于膜融合导致的病毒对未感染细胞的感染等。上述抗融合肽在一个实施方案中 是线性肽。例如，它们可以源自gp41胞外域，例如DP107、DP178。此类肽的实例可见于US
5,464, 933,US 5, 656, 480,US 6, 013, 263,US 6, 017, 536,US 6, 020, 459,US 6, 093, 794,US
6,060, 065,US 6, 258, 782,US 6, 348, 568,US 6, 479, 055,US 6，656，906、W01996/19495、W0 1996/40191、WO 1999/59615、WO 2000/69902 和 WO 2005/067960 中。例如，此类肽的氨基 酸序列包括或者可以选自 US5, 464，933 的 SEQ ID NO :1_10 ；US 5，656，480 的 SEQ ID NO 1-15 ；US6, 013，263 的 SEQ ID NO :1_10 和 16-83 ；US 6，017，536 的 SEQ ID NO :1-10,20-83 和 139-149 ；US 6，093，794 的 SEQ ID NO 1-10、17-83 和 210-214 ；US 6，060，065 的 SEQ ID NO 1-10、16-83 禾口 210-211 ；US 6，258，782 的 SEQID NO :1286 禾口 1310 ；US 6，348，568 的 SEQ ID NO :1129、1278-1309、1311和 1433 ；US 6，479，055 的 SEQ ID NO 1-10和 210-238 ； US 6，656，906 的 SEQID NO :1-171、173-216、218-219、222-228、231、233-366、372_398、 400-456、458-498、500-570、572-620、622-651、653-736、739-785、787-811、813-823、825、 827-863,865-875,877-883,885,887-890,892-981,986-999,1001-1003,1006-1018, 1022-1024、1026-1028、1030-1032、1037-1076、1078-1079、1082-1117、1120-1176、 1179-1213、1218-1223、1227-1237、1244-1245、1256-1268、1271-1275、1277、1345-1348、 1350-1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374-1376、1378-1379、1381-1385、1412-1417、 1421-1426、1428-1430、1432、1439-1542、1670-1682、1684-1709、1712-1719、1721-1753、 1755-1757 ；或者WO 2005/067960的SEQ ID NO :5_95。在一个实施方案中，抗融合肽具有包 含5-100个氨基酸的氨基酸序列，优选的10-75个氨基酸，更优选的15-50个氨基酸。在一 个优选的实施方案中，抗融合肽是C-34、T-20、T-1249, T-65UT-2635, N-36 (Root, Μ. J.等 人，Curr. Pharm. Des. 10(2004) 1805-1825)和 DP-107 (Wild，C.等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 91(1994) 12676-12680).在一个实施方案中，根据发明的缀合物包含一个或多个抗融 合肽和抗-CD4抗体(mAb CD4)，其中，i)所述抗融合肽是具有5-100个氨基酸的氨基酸序 列的线性肽，和ii) 1至8个抗融合肽分别与所述抗-CD4抗体的重链和/或轻链的一个末 端缀合。在另一个实施方案中，根据发明的缀合物包含一个或多个抗融合肽和抗-CD4抗 体(mAb CD4)，其中，i)所述抗融合肽源自gp41胞外域，和ii)l至8个抗融合肽分别与所 述抗-⑶4抗体的重链和/或轻链的一个末端缀合。术语“gp41胞外域”表示HIV-Igpieo 的始于氨基酸位置561且止于氨基酸位置620的氨基酸序列，或者HIV-lgp41的始于氨基 酸位置50且止于氨基酸位置109的氨基酸序列(SEQ ID NO 66)(还参见例如Bar，S.和 Alizon, M. J. Virol. 78(2004)811-820)。术语“抗体”涵盖了抗体结构的多种形式，包括完整的抗体和抗体片段。在一 个实施方案中，根据发明的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或T细胞抗原缺失抗 体(参见例如WO 98/33523、WO 98/5四76和W000/34317)。抗体的遗传加工例如描述在 Morrison, S. L.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5, 204, 244 ；Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327 ；Neuberger，Μ· S.等人，Nature 314(1985)268-270 ；Lonberg, N.，Nat. Biotechnol. 23(2005) 1117-1125。
“抗体片段”包括全长抗-CD4抗体的一部分，优选的其可变结构域，或至少其 抗原结合部分。抗体片段的实例是例如单链抗体分子(sCFV)、Fab、F(ab)2片段等，只要 其保留了抗-⑶4抗体的结合特征。scFv抗体例如，描述在Huston，J. S.，Methods in Enzymo 1. 203 (1991) 46-88中。Huston还描述了用于连接用于本发明的多肽的接头和方法。“CD4” 意指人 CD4，描述在例如 Brady, R. L.禾口 Barclay，Α. N.，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205(1996) 1-18 以及 SwissProt P01730 中。术语“结合 CD4 的抗体，，、 “抗-CD4抗体”或“mAb CD4”在本申请中是可互换的使用的，表示特异性结合CD4并且优选 的抑制HIV与靶细胞的融合的抗体。可以在基于细胞的体外ELISA测定中测试结合(使用 表达CD4的CHO细胞)。如果在lOOng/ml的抗体浓度时，讨论的抗体导致S/N(信号/噪 声)比例为5或更高，优选的10或更高，则发现了结合。术语“抑制HIV与靶细胞融合”指 抑制HIV与测定中测量的靶细胞融合，所述测定包括在存在讨论的抗体的条件下，将所述 靶细胞Gf^nPBMC)与病毒接触(所述抗体的浓度为有效抑制病毒和所述细胞之间的膜融 合的浓度)，以及测量例如，荧光素酶报道基因活性或HIV pM抗原浓度。术语“膜融合”指 表达⑶4多肽的第一细胞与表达HIV erw蛋白的第二细胞或病毒之间的融合。通过报道基 因测定(例如，通过荧光素酶报道基因测定)，通过遗传改造的细胞和/或病毒，确定膜融
合 O在本申请中使用的术语“嵌合”表示抗体或抗体结构域包含源自非人动物的抗体 的氨基酸序列，以及源自人起源的抗体的氨基酸序列。在例如 Reimann， K. Α.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13(1997)933—943、EP 0 512 112、US 5，871，732、EP 0 840 618、EP 0 854 885、EP 1266 965、US 2006/0051346、 WO 97/46697、WO 01/43779、US 6，136，310、W091/009966 中提及了优选的抗-CD4 抗体。 特别优选的抗-CD4抗体描述在US 5，871，732，和Reimann，K. Α.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13(1997)933-943，以及WO 91/009966中。特别优选的抗-CD4抗体的特征是当 向人施用时，是非免疫抑制性的或非缺失的抗体，并且也不阻断HIVgpl20与人CD4的结合。 在一个实施方案中，优选的抗-CD4抗体的特征还在于所述抗体包含可变重链结构域，所述 可变重链结构域由免疫球蛋白构架和⑶R3区组成，所述⑶R3区选自SEQ ID NO 29、30或 31的重链CDR3序列。在更优选的实施方案中，抗体包含可变重链区，所述可变重链区由免 疫球蛋白构架和CDR3区、CDR2区和CDRl区组成，所述CDR3区选自SEQ ID N0:29、或30或 31的CDR3序列，所述CDR2区选自SEQ ID NO 26或27的CDR2序列，所述CDRl区选自SEQ ID而23或对的⑶Rl序列。在优选的实施方案中，重链可变结构域还显示在SEQID N0: 8、10或12中。在优选的实施方案中，抗-CD4抗体还包含可变轻链结构域，所述可变轻链 结构域由免疫球蛋白构架和⑶Rl区、⑶R2区和⑶R3区组成，所述⑶Rl区选自SEQ ID NO 13、14或15的⑶Rl序列，所述⑶R2区选自SEQ ID NO 17或18的⑶R2序列，所述⑶R3区 选自SEQ ID N0:20或21的⑶R3序列。在一个实施方案中，抗-⑶4抗体的特征是包含SEQ ID NO 8 的 CDR 作为重链 CDR，和 SEQ ID NO 2 的 CDR 作为轻链 CDR, SEQ ID NO 10 的 CDR 作为重链CDR,和SEQ IDNO 4的CDR作为轻链CDR, SEQ ID NO :11的CDR作为重链CDR,和 SEQ ID NO 5 的 CDR 作为轻链 CDR，或者 SEQ ID NO 12 的 CDR 作为重链 CDR，和 SEQ ID NO 6的⑶R作为轻链⑶R。可 以根据 Kabat, Ε. A.等 人，Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)的标准定义确定 CDR 序列。SEQ ID NO :13-31 中显示了 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :12 的 CDR。在一个实施方案中，抗-⑶4抗体包括可变的重链和轻链结构域，独立的选自a)氨基酸序列SEQ ID NO 8定义的重链可变结构域，和SEQ ID NO 2定义的轻链 可变结构域；b)氨基酸序列SEQ ID NO 10定义的重链可变结构域，和SEQ IDNO 4定义的轻链 可变结构域；c)氨基酸序列SEQ ID NO 11定义的重链可变结构域，和SEQ IDNO 5定义的轻链 可变结构域；d)氨基酸序列SEQ ID NO 12定义的重链可变结构域，和SEQ IDNO 6定义的轻链
可变结构域。在一个实施方案中，根据发明的缀合物中使用的抗体的特征是恒定结构域是人源 的。此类恒定结构域是本领域现有技术中普遍已知的，例如Kabat(参见例如，Johnson, G.和 Wu，Τ. Τ. ,Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)描述的。例如，在一个实施方案中， 有效的人IgGl重链恒定区(ChI-绞合部-Ch2-Ch3)包含独立的选自SEQ ID NO :32,33的氨 基酸序列。例如，有效的人kappa (κ)轻链恒定结构域包括SEQ ID NO 34的kappa轻链 恒定结构域(κ轻链恒定结构域，Cl)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体的可变结 构域是小鼠起源的，并包括根据Kabat的小鼠抗体的抗体可变结构域序列构架(参见例如， Johnson, G.和 Wu，Τ. Τ.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)。在另一个实施方案中， 抗体的可变结构域是小鼠起源的，并且已经人源化。优选的抗-⑶4抗体表现出与具有可变结构域1 (US 5，871，732)或可变结构域 2(Reimann, K. Α.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943)的抗体结合相同的 CD4表位，或者由于结合的空间位阻或竞争性结合，被具有可变结构域1或可变结构域2的 抗体抑制与CD4的结合。根据Olson, W. C.等人，(J. Virol. 73(1999)4145-4155描述的用 于表位制图的方法，通过使用丙氨酸扫描研究表位结合。信号降低75%或更多表示突变的 氨基酸对所述抗体表位识别有贡献。如果研究的抗体和具有可变结构域1或可变结构域2 的抗体识别对表位有贡献的氨基酸，则发现抗体与相同表位的结合。术语“表位”表示能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由化学活性表 面的分子群组成，例如氨基酸或糖侧链，并通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷 特征。构象性表位和非构象性表位的区别是在存在变性溶剂的条件下丧失与前者而非后者 的结合。本文中使用的术语“可变结构域”(轻链的可变结构域，重链(Vh)的可变结 构域)表示抗体的成对轻链和重链的单个结构域，所述结构域直接涉及抗体与靶抗原的结 合。可变结构域通常是成对轻链和重链的N-端结构域。轻链和重链的可变结构域具有相同 的常规结构，即，它们具有“免疫球蛋白构架”，且每个结构域包括四个“构架区”(FR)，其序 列是普遍保守的，通过三个“高变区”(或“互补决定区”，⑶R)连接。构架区采用了 β-折 叠构象，⑶R可以形成连接β-折叠结构的环。通过构架区维持每条链的⑶R的三维结构， 并且所述CDR与其它链的CDR共同形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥了特别重要的作用，因此提供了发明的另一个对象。当在本文中使用时，术语“抗体的抗原-结合部分”或“抗体的抗原-结合位点”指 抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合位点包括来自“互补决定区”或“CDR” 的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域区域。 因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N-至C-端包括区域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4(免疫球蛋白构架)。特别地，重链的⑶R3区是最主要负责抗原结合的区域并且限 定了抗体。在一个实施方案中，根据发明的抗体的特征是它的重链可变结构域中包含SEQ ID NO : 或 SEQ ID NO :30 的 CDR3 序列。根据 Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)的标准定义来确定互补决定区(CDR)和构架(FR)区。抗-CD4抗体的“Fe部分”不直接参与CD4的结合，但表现出不同的效应子功能。 根据重链恒定区氨基酸序列，将抗体(免疫球蛋白)分为以下类别IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM0 一些上述类别进一步分成亚类(同种型)，即，IgG分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，或 IgA分为IgAl和IgA2。根据抗体所属的免疫球蛋白类别，将免疫球蛋白的重链恒定区分 另1J 标 i只为 α (alpha, IgA)、δ (delta, IgD)、ε (epsilon, IgE)、y (gamma, IgG)禾口 μ (miu, IgM)。在一个实施方案中，根据发明的抗体属于IgG类别。“抗体的Fc部分”是本领域技术 人员熟知的术语，是基于抗体的木瓜蛋白酶切割而定义的。根据发明的抗体含有人Fc部分 或者源自人起源的Fc部分作为Fc部分。在发明的其它实施方案中，Fc部分是人抗体IgG4 亚类的Fc部分，或人抗体IgGl、IgG2或IgG3亚类的部分，所述Fc部分经过修饰使得不 能检测到如下文所定义的任何Fc γ受体(例如，Fc y RIIIa)结合和/或Clq结合。在一 个实施方案中，Fc部分是人Fc部分，优选的来自人IgG4亚类，或人IgGl亚类的突变Fc部 分。在另一个实施方案中，Fc部分是来自人IgGl亚类的Fc部分，具有L234A和L235A的突 变。在其它实施方案中，Fc部分是SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33的Fc部分，SEQ ID NO 32具有突变L234A和L235A，SEQ ID NO 33具有突变S2^P。当IgG4表现出降低的Fc γ 受体(Fe YRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体表现出强烈的结合。然而，Pro238、Asp265、 Asp270、Asr^97(缺失 Fc 糖类)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Th r307、Gln311、Asn4;34或/和His435是这样的残基，如果改变也提供降低的Fc γ 受体结合(Shields, R. L.等人，J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604 ；Lund, J.等人，FASEB J. 9(1995) 115-119 ；Morgan, Α.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;EP 0 307 434)。在 一个实施方案中，在Fc γ受体与IgG4亚类或与IgGl或IgG2亚类的结合方面，根据发明的 抗体具有在L234、L235和/或D265的突变，和/或含有PVA236突变。在优选的实施方案 中，突变是S2^P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236意指来自IgGl的氨基酸位置 233-236的氨基酸序列ELLG (以单字母氨基酸代码给出)，或IgG4的EFLG被PVA取代)， 优选的，IgG4的突变S2^P，和IgGl的L234A和L235A。抗体的Fc部分直接参与ADCC (依 赖抗体的细胞毒性)和CDC (依赖补体的细胞毒性)。补体活化(CDC)是通过补体因子Clq 与大部分IgG抗体亚类的Fc部分结合来起始的。通过在所谓的结合位点的定义的蛋白 质-蛋白质相互作用，导致Clq与抗体的结合。此类Fc部分结合位点是现有技术已知的， 描述在例如 Lukas，Τ. J.等人，J. Immunol. 127(1981)2555-2560 ；Brunhouse, R.和 Cebra， J. J.，Mol. Immunol. 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.等人，Nature 288(1980)338-344 ；Thommesen, J. E.等 A, Mol. Immunol. 37(2000)995-1004 ；Idusogie, Ε. E.等人， J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.等人，J. Virol. 75(2001) 12161-12168 ； Morgan,A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ；和 EP 0 307 434 中。此类 Fc 部分结合位 点的特征是氨基酸 L234、L2;35、D270、^97、E318、K320、K322、P331 和 (根据 Kabat 的 EU指数编号)等。IgGl、IgG2和IgG3亚类的抗体通常表现出补体激活，包括Clq和C3结 合，而IgG4不激活补体系统，也不结合Clq和/或C3。不结合Fc γ受体和/或补体因子Clq 的抗-CD4抗体不引发抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和/或依赖补体细胞毒性(CDC)。在 一个实施方案中，该抗体的特征是它结合CD4，含有源自人起源的Fc部分，并且不结合Fc γ 受体和/或补体因子Clq。在优选的实施方案中，该抗体是人抗体，或人源化抗体，或T细 胞抗原缺失抗体。可以根据Idusogie,Ε. Ε.等人，J. Immunol. 164(2000)4178-4184来测量 Clq结合。如果在此类测定中，对于讨论的抗体，492-405nm的光密度(OD)低于Syg/ml的 抗体浓度时未修饰的野生型抗体Fc部分的人Clq结合值的15%，则没有发现“Clq结合”。 ADCC可以作为抗体与人NK细胞上的人Fc YRIIIa的结合来测量。在20 μ g/ml的抗体浓度 确定结合。“无Fcy受体结合”或“无ADCC”意指与相同的抗体如人IgGl(SEQ ID NO 32) 的结合相比，在20 μ g/ml的抗体浓度时，与人NK细胞上的人Fc Y RIIIa的结合达30%。
根据发明的缀合物中使用的抗体还包括，具有“保守序列修饰”的此类抗体(变体 抗体)，所述修饰是这样的氨基酸序列修饰，它们不影响或不改变根据发明的抗体的上述特 征。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，例如定点诱变和PCR-介导的诱变。保守 性氨基酸取代包括这样的取代，其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换了氨基酸残基。本 领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖 氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例 如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如， 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基 酸。因此，在一个实施方案中，可以用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代人抗-CD4 抗体中预测的非必需氨基酸残基。因此，“变体”抗"CD4抗体在本文中指氨基酸序列不同于 “亲本”抗-CD4抗体的氨基酸序列的分子，所述不同是在重链CDR3区之外的亲本抗体的一 个或多个可变结构域区域中，添加、缺失和/或取代在一个实施方案中达10处，在另一个实 施方案中，约2至约5处。每个其它的重链CDR区包含最多一个单氨基酸添加、缺失和/或 取代。发明包括修饰结合CD4的亲本抗体的CDR氨基酸序列的方法，特征是从SEQ ID Ν0 8或10的重链可变结构域中选择重链可变结构域，和/或从SEQ ID NO :2或4的轻链可变 结构域中选择轻链可变结构域，提供编码所述初始可变结构域的氨基酸序列的核酸，修饰 所述核酸使得重链CDRl中的一个氨基酸被修饰，重链CDR2中的一个氨基酸被修饰，轻链 CDRl中的1-3个氨基酸被修饰，轻链CDR2中的1_3个氨基酸被修饰，和/或轻链CDR3中的 1-3个氨基酸被修饰，在抗体结构中表达和掺入所述修饰的可变结构域氨基酸序列，测量所 述抗体是否结合CD4，并且如果抗体结合CD4，则选择一个或多个所述修饰的可变结构域/ CDR0在一个实施方案中，此类修饰是保守的序列修饰。可以通过基于分子建模的诱变来实 施氨基酸序列修饰，如 Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327，和 Queen，C.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 10029-10033 中描述的。
本申请中使用的术语“接头”或“肽接头”表示天然和/或合成起源的肽接头。所 述接头由线性的氨基酸链组成，其中20个天然存在的氨基酸是单体构件。链具有1-50个氨 基酸的长度，优选的在1和观个氨基酸之间，特别优选的在3和25个氨基酸之间。接头可 以包含重复的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有绞合部功能的多肽。通过允许 肽正确的折叠和适当的呈递，接头可以实施其生物学活性，所述接头具有保证肽与抗-CD4 抗体缀合的功能。在一个实施方案中，接头是“合成的肽接头”，其被设计为富含甘氨酸、谷 氨酸和/或丝氨酸残基。这些残基排列成例如多达5个氨基酸的小重复单元，如GGGGS、 QQQQG或SSSSG。该小重复单元可以重复2_5次，形成多聚单元。在多聚单元的氨基-和/ 或羧基末端，可以添加多达6个额外的任意的、天然存在的氨基酸。其它的合成肽接头包 括单个氨基酸，其重复在10-20次之间，并可以在氨基-和/或羧基-末端包括多达6个额 外的任意的、天然存在的氨基酸，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO :64)中的丝氨 酸。表2中显示了优选的接头。在一个实施方案中，接头选自WQ4]3GNN(SEQ ID NO 50), LSLSPGK(SEQ ID NO :46)、LSPNRGEC(SEQ ID NO :47)、LSLSGG(SEQ ID NO :71)、LSLSPGG(SEQ ID NO :72), G3 [SGJ2SG (SEQ IDNO :75)、或(^[SG4]2S(i2 (SEQ ID NO :76)。所有的肽接头都可 以由核酸分子编码，从而可以重组的表达。当接头自身是肽时，抗融合肽通过在两个氨基酸 之间形成的肽键与接头连接。在抗融合肽和与抗融合肽缀合的抗-CD4抗体链之间引入肽 接头。因此，分别存在2种或3种可能的序列(从氨基-至羧基-端的方向)a)抗融合 肽-肽接头-抗-CD4抗体多肽链，或b)抗-CD4抗体多肽链-肽接头-抗融合肽，或c)抗 融合肽-肽接头-抗-CD4抗体多肽链-肽接头-抗融合肽。在发明的一个实施方案中，缀合物的特征是包含i)氨基酸序列SEQ IDNO 8定义 的重链可变结构域，和SEQ ID NO :2定义的轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO 10 定义的重链可变结构域和SEQ ID NO :4定义的轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO 11定义的重链可变结构域和SEQ ID NO :5定义的轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID N0:12定义的重链可变结构域和SEQ ID NO :6定义的轻链可变结构域；ii)接头，其选自氨 基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)，三肽GSTJP SEQ ID NO :46-76或80或81 ；以及iii)抗 融合肽，其选自SEQ ID NO :35-44或83的抗融合肽。本发明的其它方面是SEQ ID NO 42 的抗融合肽afp-Ι。在一个实施方案中，抗融合肽是SEQ ID NO 36、38、39，或42或83的抗 融合肽。在另一个实施方案中，接头是SEQ ID N0:46、47、50、64、71、72、75或76的接头。在一个实施方案中，mAb CD4的重链和/或轻链与抗融合肽的缀合物(“链缀合 物”)选自以下顺序的链缀合物(1)[抗融合肽]-[接头]m_[重链]，O)[重链]-[接头] m_ [抗融合肽]，(3)[抗融合肽]-[接头]m_ [重链]-[抗融合肽],(4)[抗融合肽]-[接头] m_[轻链]，(5)[轻链]-[接头]m_[抗融合肽]，(6)[抗融合肽]-[接头]m-[轻链]-[抗融 合肽]，(7)[抗融合肽]-[接头]m_[重链]_[接头]m_[抗融合肽]，(8)[抗融合肽]-[接 头]m_ [轻链]-[接头]m_ [抗融合肽]，其中，在所述链缀合物之中或之间，接头可以是相同 或不同的，其中m是整数1或0，并且在所述链缀合物之中或之间，m可以是独立的相同或不 同的。例如，在包含链缀合物(7)和mAb CD4轻链的缀合物中，链缀合物(7)的两个接头可 以是相同的，即，具有相同的氨基酸序列和长度，或者可以是不同的，即，具有不同的氨基酸 序列和/或长度，或者可以缺失其中之一或两者。例如，在包含链缀合物( 和(4)的缀合 物中，链缀合物O)中含有的接头和链缀合物中含有的接头可以是相同的，即，具有相同的氨基酸序列和长度，或者可以是不同的，即，具有不同的氨基酸序列和/或长度，或者 可以缺失其中之一或两者。在链缀合物中，可以存在(m= 1)或缺失(m = 0)接头。优选的 链缀合物是链缀合物O)、(3)、(4)和(7)。本发明的一个实施方案是包含 [mAb CD4轻 链]和h链缀合物(2)的缀合物。该缀合物包含2条不缀合的抗-CD4抗体轻链，和2条 抗-CD4抗体重链，每条重链通过其C-端与单个抗融合肽的N-端缀合，任选的通过中间接 头。本发明的另一个实施方案是包含两条mAb CD4轻链和两条链缀合物C3)的缀合物。另 一个实施方案是包含两条mAb CD4重链和两条链缀合物(4)的缀合物。本发明的另一个实 施方案是包含两条mAb CD4轻链和两条链缀合物(7)的缀合物。重链和/或轻链优选的包 括恒定区(Fe)。发明还提供了用于生产药物组合物的方法，所述药物组合物包括有效量的根据发 明的缀合物，和可药用的载体，以及根据发明的缀合物用于此类方法的用途。发明还提供了有效量的根据发明的缀合物的用途，用于生产药物，所述药物优选 的与可药用的载体共同用于治疗患有AIDS的患者。本申请中使用的术语“氨基酸”表示羧基α -氨基酸类群，所述氨基酸可以由核酸 直接或以前体形式编码。单个氨基酸由三个核苷酸组成的核酸编码，称为密码子或碱基三 联体。每个氨基酸至少由一个密码子编码。这已知为“遗传密码的简并性”。本申请中使用 的术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸，其包括丙氨酸(三字母密码ala，单字 母密码A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷 氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，Ε)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮 氨酸(leu, L)、赖氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、丝 氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，Τ)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。本领域技术人员已知的，可用于实施本发明的方法和技术，描述在例如Ausubel， F. Μ.编著，Current Protocols in Molecular Biology，卷 I 至 III (1997)，Wiley 和 Sons ; Sambrook 等人，Molecular Cloning :A LaboratoryManual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y. (1989)中。在一个实施方案中，在根据发明的缀合物中，抗-CD4抗体链的羧基端氨基酸通过 肽键与抗融合肽的氨基-端氨基酸缀合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸通过肽键与抗-CD4 抗体链的氨基-端氨基酸缀合。在一个实施方案中，中间接头存在于抗融合肽和抗-CD4抗 体链之间。因此，根据发明的缀合物的特征是通式mAb CD4-[接头]m_ [抗融合肽]n其中，对于每个抗融合肽，m是独立的为0(即，在mAb CD4和抗融合肽之间直接的 肽键)或者1(即，在mAb⑶4和抗融合肽之间存在接头)，且η是从2至8的整数。在一个 实施方案中，η是从2至8的整数。在另一个实施方案中，η是从2至8的偶数。在另一个 实施方案中，η是从2至4的整数。在另一个实施方案中，η是整数2或4。发明的一个实 施方案是这样的缀合物，其特征是在抗CD4抗体的重链的每个C-端或在抗-CD4抗体轻链 的每个N-端包含抗融合肽。在该实施方案中，两个抗融合肽与一个抗-CD4抗体缀合。在 另一个实施方案中，缀合物的特征是在重链的每个C-端和在轻链的每个N-端包含抗融合 肽。在该实施方案中，四个抗融合肽与一个抗-CD4抗体缀合。与mAb⑶4相比，引入mAb⑶4重链和/或轻链的抗融合肽尺寸小。例如，最小的免疫球蛋白，G型免疫球蛋白，具有约150kDa的分子量；在一个实施方案中，抗融合肽具有 小于12. 5kDa的大小(分子量)，等价于约100个氨基酸，通常小于7. 5kDa,等价于约60个 氨基酸。在一个实施方案中，抗融合肽具有从5至100个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的 从10至75个氨基酸残基，更优选的从15至50个氨基酸残基。本发明的缀合物可用于药 物、治疗和/或诊断用途。可以与mAb CD4重链和/或轻链缀合的抗融合肽的数量，从1至 抗-CD4抗体多肽链的氨基和羧基末端的组合数。当本发明涵盖了不同类型的抗-CD4抗体 时，抗融合肽的可能数量可以改变。在含有两条重链和两条轻链的抗-CD4抗体的情况下， 氨基-末端(N-端)和羧基-末端(C-端)的组合数是8，这同时是缀合的抗融合肽能够达 到的最大总数；例如，在抗-CD4抗体片段(例如，单链抗体(scFv))的情况下，末端的组合 数以及因此能缀合的抗融合肽的最大数是2。如果单个抗融合肽与mAb CD4缀合，则肽可以 占据抗-CD4抗体链的任何一个末端。同样，如果mAb CD4缀合了最大可能数量的肽，则所有 的末端都被单个肽占据。如果与mAb CD4缀合的肽数量小于最大可能数，则在抗-CD4抗体 链的末端存在不同的肽分布是可能的。例如，如果G或E型免疫球蛋白缀合了 4个抗融合 肽，则可能有5种不同的组合(参见表1)。在2种组合中，一种类型的所有末端，即抗-⑶4 抗体链的所有4个氨基端或所有4个羧基端都分别与一个单个抗融合肽缀合。未缀合其它 的末端。在一个实施方案中，这导致修饰/缀合在抗-CD4抗体的一个区域的分配。在其它 情况下，多肽与多数的两个末端缀合。在这些组合中，缀合的肽分布在抗-⑶4抗体的不同 区域。在两种情况下，缀合的末端总数都是4。4个肽与由4条多肽链组成的抗-⑶4抗体的末端缀合的可能组合
权利要求
1.缀合物，其包含2个或多个抗融合肽，以及抗-CD4抗体，特征是2-8个抗融合肽各自 与所述抗-CD4抗体的重链和/或轻链的一个末端缀合。
2.根据权利要求1的缀合物，特征是抗-CD4抗体链的羧基端氨基酸与抗融合肽的氨基 端氨基酸缀合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸与抗体链的氨基端氨基酸缀合，优选的通过 具有或不具有中间接头的肽键。
3.根据权利要求1的缀合物，特征是缀合物具有通式 mAb CD4-[接头]m_[抗融合肽]n其中，对于每种抗融合肽而言，m是独立的为0或者1， 其中，η是从2至8的整数。
4.根据权利要求3的缀合物，特征是η是2或4。
5.根据权利要求1的缀合物，特征是缀合物包含mAbCD4的重链和/或轻链以及抗融 合肽(“链缀合物”)，选自(从N-端至C-端方向)(1)[抗融合肽]-[接头]m_[重链](2)[重链]-[接头]m_[抗融合肽](3)[抗融合肽]-[接头]m_[重链]-[抗融合肽](4)[抗融合肽]-[接头]m_[轻链](5)[轻链]-[接头]m_[抗融合肽](6)[抗融合肽]-[接头]m_[轻链]-[抗融合肽](7)[抗融合肽]-[接头]m_[重链]_[接头]m_[抗融合肽](8)[抗融合肽]-[接头]m_[轻链]_[接头]m_[抗融合肽]其中，在所述链缀合物中，接头可以是相同或不同的，其中m是整数1或0，在所述链缀 合物中，m可以是独立的相同或不同的。
6.根据权利要求5的缀合物，其包括 2x[mAb CD4轻链]和2x链缀合物(2)， 2x[mAb CD4轻链]和2x链缀合物(3)， 2x [mAb CD4重链]和h链缀合物(4)，或 2x[mAb CD4轻链]和2x链缀合物(7)。
7.根据权利要求1或4的缀合物，特征是所述可变的重链结构域由免疫球蛋白构架和 CDR3区组成，所述CDR3区选自SEQ ID NO :29、30或31的重链CDR3序列。。
8.根据权利要求7的缀合物，特征是缀合物包含可变的重链结构域，所述结构域由免 疫球蛋白构架和CDR3区、CDR2区和CDRl区组成，所述CDR3区选自SEQ ID N0:29、30或31 的CDR3序列，所述CDR2区选自SEQ ID NO 26、27或28的CDR2序列，所述CDRl区选自SEQ IDNO 23、24 或 25 的 CDRl 序列。
9.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其包含SEQID NO 8或10的重链可变结构域。
10.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其包含可变的轻链结构域，所述结构域由免 疫球蛋白构架和⑶Rl区、⑶R2区和⑶R3区组成，所述⑶Rl区选自SEQ ID NO 13、14、15 或 16，所述 CDR2 区选自 SEQ IDNO 17、18 或 19，所述 CDR3 区选自 SEQ ID N0:20、21 或 22。
11.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其包含SEQID NO 7的⑶R作为重链⑶R，和 SEQ ID NO 1 的 CDR 作为轻链 CDR，SEQ IDNO 8 的 CDR 作为重链 CDR，和 SEQ ID NO 2 的⑶R作为轻链⑶R，SEQ ID NO 10的CDR作为重链⑶R，和SEQ ID NO 4的CDR作为轻链 CDR，SEQ ID NO 11 的 CDR 作为重链 CDR JPSEQ ID NO :5 的 CDR 作为轻链 CDR，或者 SEQ ID NO 12的CDR作为重链CDR,和SEQ IDNO 6的CDR作为轻链CDR0
12.根据权利要求1或4的缀合物，特征是包括可变的重链和轻链结构域，独立的选自a)氨基酸序列SEQID NO 7定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO :1定义 的轻链可变结构域；b)氨基酸序列SEQID NO :8定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO :2定义 的轻链可变结构域；c)氨基酸序列SEQID NO 10定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 4定 义的轻链可变结构域；d)氨基酸序列SEQID NO 11定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 5定 义的轻链可变结构域；e)氨基酸序列SEQID NO 12定义的重链可变结构域，和氨基酸序列SEQ ID NO 6定 义的轻链可变结构域。
13.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其包括氨基酸序列SEQIDNO :7定义的重链 可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :1定义的轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO 8定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :2定义的轻链可变结构域；或氨基酸序 列SEQ ID NO: 10定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO :4定义的轻链可变结构 域；或氨基酸序列SEQ ID NO=Il定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ IDNO :5定义的 轻链可变结构域；或氨基酸序列SEQ ID NO :12定义的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO 6定义的轻链可变结构域；接头；以及抗融合肽，所述接头选自氨基酸甘氨酸(G)和 天冬酰胺(N)，三肽GST，和SEQ ID NO :46_76或80或81，所述抗融合肽选自SEQ ID NO 35-44或83的抗融合肽。
14.根据权利要求1或4的缀合物，特征是缀合物包括抗融合肽，其选自抗融合肽C34、 T20、T1249、T651、T2635、N36、DP107 或 afp-Ι，或 afp_2。
15.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其在重链的每个C-端或轻链的每个N-端包 括抗融合肽。
16.根据权利要求1或4的缀合物，特征是其在重链的每个C-端和轻链的每个N-端包 括抗融合肽。
17.根据权利要求1或4的缀合物，特征是包括2条SEQID NO 1的轻链可变结构域，2 个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ IDNO 7的重链可变结构域、SEQ ID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ ID NO 2的轻链可变结构域， 2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO 8的重链可变结构域，SEQID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ IDNO 4的轻链可变结构域， 2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO 10的重链可变结构域、SEQ ID NO 75的接头和SEQ IDNO 42的抗融合肽；特征是包括2条SEQ ID NO 5的轻链可变结构 域，2个(2)型缀合物，每个所述(2)型缀合物包含SEQ ID NO=Il的重链可变结构域，SEQID NO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽；或者，特征是包括2条SEQ ID NO 6的轻链 可变结构域，2个( 型缀合物，每个所述( 型缀合物包含SEQ ID NO 12的重链可变结 构域，SEQ IDNO 75的接头和SEQ ID NO 42的抗融合肽。
18.根据权利要求1或4的缀合物，特征是所述抗-⑶4抗体是IgGl亚类或IgG4亚类的。
19.根据权利要求18的缀合物，特征是所述IgG4亚类的抗-CD4抗体具有S228P突变， 且所述IgGl亚类的抗-⑶4抗体具有L234A和L235A突变。
20.根据权利要求1或4的缀合物，特征是所述抗-CD4抗体是人抗体、人源化抗体、嵌 合抗体或T细胞抗原缺失抗体。
21.用于生产根据权利要求1的缀合物的方法，特征是方法包括a)在适合缀合物表达的条件下，培养包含一个或多个质粒的细胞，所述质粒包含一种 或多种编码根据发明的缀合物的核酸分子，b)从细胞或上清液中回收缀合物。
22.SEQ ID NO 42的抗融合肽。
23.药物组合物，其包含根据权利要求1的缀合物，以及可药用的赋形剂或载体。
24.根据权利要求1的缀合物的用途，其用于制备用于治疗病毒感染的药物。
25.SEQ ID NO 83的抗融合肽。
全文摘要
本发明涉及缀合物，所述缀合物包含2个或多个抗融合肽和抗-CD4抗体(mAb CD4)，特征是1-8个抗融合肽分别与所述抗-CD4抗体的重链和/或轻链的一个末端缀合，并涉及所述缀合物的药物用途。
文档编号A61P31/18GK102099057SQ200880025361
公开日2011年6月15日 申请日期2008年7月18日 优先权日2007年7月20日
发明者E·科佩茨基, S·桑库拉特里, S·费舍尔, S·里斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司