专利名称：皮肤免疫用方法和组合物的制作方法
皮肤免疫用方法和组合物本发明涉及通过皮肤途径递送疫苗的方法和系统的开发。本发明更特别地涉及包 含用于表皮(epicutaneou)接种的冷凝隔室的装置的应用。本发明还涉及可以在无需任何 皮肤处理的条件下即获得有效的免疫应答的表皮接种方案。本发明还可用于任何哺乳动物 中，优选用于人类，以诱导抗任何类型的抗原的治疗性或预防性免疫应答。大多数病原体通过粘膜或皮肤进入体内。皮肤，如粘膜，因此具有发觉病原体 和自身防护所需的所有工具。这道防线特别地包括一支专职性的、驻留的抗原递呈细胞 (Langerhans cells，APCs)队伍。在正常情况下存在于表皮中的唯一的APCs是郎格罕氏 细胞(LC)，其是来自骨髓的树突状细胞(DC)。在捕捉抗原后，活化的LCs移动到引流淋巴 结中，在那里它们启动强大的全身免疫应答。因此，对于通过传统注射给药途径来开发更有 效的疫苗而言，皮肤代表了潜在的替代方法。另外，皮肤免疫系统还可以是用于诱导在不同 病变诸如自身免疫疾病、过敏性和可能还有癌症中的耐受性的理想靶标。然而，角质层(SC)，即皮肤的最顶层，是对抗流体、大分子(多肽和蛋白质)、或粒 子乃至微生物进入的有效的物化屏障。已经测试了许多技术以致力于经由表皮途径、即通 过向皮肤施用抗原获得有效的免疫应答。这些技术全部都涉及角质层的物理破坏，例如，轻 度或中度磨损(在敷用胶条或使用砂纸后)，通过应用超声或微针。这些不同的技术在或 大或小的程度上都表现出作为抗原施用前的先行步骤的效力，用于促进抗原进入包含免疫 细胞的皮肤表层(表皮)，和诱导免疫应答。例如，已显示向先前已经过磨损的皮肤共同施 加抗原和佐剂诸如霍乱毒素(CT)或大肠杆菌的不稳定毒素(LT)有效产生免疫抗体应答 (Glenn GM，Rao M，Matyas GR,Alving CR. Skin immunization madepossible by cholera toxin. Nature. 1998. 391 :851 ；Glenn GM, Scharton-Kersten T，Vassell R，Matyas GR, Alving CR. Transcutaneousimmunization with bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens andadjuvants. Infect Immun. 1999. 67 1100-6.)。另一方面，在施力口抗原之 前皮肤仅仅水合，无论是否随后进行封闭性处理，都决不引起特异性抗体应答。其仅能在皮 肤先前经处理，导致角质层的物理扰动，或者如果抗原与强力的佐剂(CT或LT)共同给药下 获得。其它工作后来显示出，使用封闭系统将疫苗制剂保持就位，以液体形式在动物皮 肤上沉积1-24小时的时段，使得只有在皮肤处理后方可在动物或在人中诱导免疫应答。然 而，使用0-24小时的接触时间诱导的应答，在质和/或量上没有变化。在WO 2004/03069申请中，其设想了借助于包含抗原和免疫刺激化合物的干形式 的组合物，使用PosIntro或ISCOM系统诱导免疫应答。在国际申请WO 2007/122226中还提议使用皮肤贴片以获得免疫应答。然而，该文 献中所述的方法采用佐剂。因此，如果没有任何先行的物理或物化处理(砂纸，乙醇，丙酮，胶条，甘油)或使 用强力的佐剂(LT或CT)或其它促进性赋形剂的话，不能检测到抗原特异性抗体应答。本发明首次描述了能够通过皮肤途径诱导抗原特异性免疫应答而无需使用佐剂 (CT或LT)或预处理或穿刺皮肤的方法。更具体地说，本发明描述了即使在缺乏任何佐剂下
4也是有效的表皮接种方法，该方法基于在允许形成冷凝隔室的条件下被施用于皮肤的干疫 苗制剂的应用。本发明表明了产生和维持皮肤水合导致SC扰动，允许抗原通过。另外，水 积聚在递送系统下，允许了干疫苗制剂再水合和溶解并开始与接触皮肤。我们在临床前试 验中已显示了，与目前为止所述的不同的皮肤系统相反，本发明允许在没有共同给药任何 佐剂(CT或LT类型)和无任何皮肤准备(磨损或穿刺)的条件下，诱导免疫原特异性抗体 应答。在特别值得注意的方式中，本发明能够在无任何积极处理的条件下进行大分子(主 要是多肽和蛋白质)的皮肤转运，这是现有技术所从未描述过的。如实施例中所阐述的，在 使用本发明的方法三次施用疫苗之后，观察到特别强的免疫应答。因此，本发明的一个目的在于疫苗制剂在制备哺乳动物、优选人的表皮接种用组 合物中的应用，特征在于所述疫苗制剂为干形式并且不含任何佐剂，以及特征在于所述疫 苗制剂借助于在接触皮肤时形成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室的皮肤装置而被施用于哺 乳动物的皮肤上进行给药。本发明的另一个目的在于皮肤给药装置在制备计划用于在没有任何先前皮肤处 理或没有任何佐剂的共同给药的条件下将包含抗原的疫苗制剂进行给药的组合物中的应 用，所述皮肤给药装置包含干形式的疫苗制剂并且不含佐剂化合物，并且在接触皮肤时形 成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室，从而允许在没有任何佐剂或先前皮肤处理的条件下所述 抗原进入表皮并诱导免疫应答。本发明的另一个目的在于在没有任何的先前皮肤处理或佐剂的共同给药的条件 下将包含抗原的疫苗制剂进行给药的皮肤给药装置的应用，所述皮肤给药装置包含干形式 的疫苗制剂并且不含佐剂化合物，并且在接触皮肤时形成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室， 从而允许在没有佐剂或任何先前皮肤处理的条件下所述抗原进入表皮并诱导免疫应答。本发明的另一个目的在于在哺乳动物中诱导抗原特异性免疫应答的方法，该方法 包括，在无任何的先前皮肤处理的条件下，对所述哺乳动物的皮肤施用包含干形式的疫苗 制剂的皮肤给药装置，该疫苗制剂包含抗原但不含任何的佐剂化合物，所述装置接触皮肤 时形成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室，施用时间足以允许所述抗原在无佐剂或先前皮肤处 理的条件下进入表皮并诱导免疫应答。本发明的另一个目的在于通过皮肤途径诱导抗原特异性免疫应答的方法，该方法 包括产生和维持局部的皮肤水合并使所述水合的皮肤接触不含佐剂的干疫苗制剂历时足 够使抗原进入并诱导免疫应答的时间。本发明的另一个目的涉及在对象中诱导抗蛋白质抗原的全身免疫应答的方法，该 方法包括借助于皮肤装置经表皮途径对所述对象给药所述抗原，所述皮肤装置包括背衬， 所述背衬的周边部分适于与皮肤形成密封室，其中所述背衬保持所述抗原位于所述背衬在 所述室内与皮肤接触的面上，在所述装置施用于所述皮肤上之后，所述抗原从所述背衬上 移去，然后经由表皮途径被递送至对象，所述给药导致在对象中诱导全身免疫应答。在一个具体的实施方案中，所述皮肤装置的背衬的周边部分对湿皮肤具有粘附性 质。在本发明的另一个实施方案中，在借助于皮肤装置给药抗原之后诱导的全身免疫 应答包括体液应答。在一个优选实施方案中，在将所述皮肤装置施用于皮肤之后在所述室内形成浓缩物，所述浓缩物引起或增加所述抗原的动作和表皮递送。特别地，该浓缩物可以通过出汗形 成。本发明的另一个目的涉及在对象中诱导抗蛋白质抗原的全身免疫应答的方法，其 中所述抗原为干形式或粒子形式。更特别地，所述抗原可以无需粘合剂地借助于静电力和 /或范德华力附着于载体，或借助于载体上的粘合涂层附着于载体。所述抗原优选可以借助于喷雾法/干燥法被施加于载体。所述抗原还可被溶解或 分散在液体中，在这种情况下，其被保持在所述载体上的吸附材料储库中。本发明的另一个目的涉及干形式的疫苗制剂在制备用于在哺乳动物中诱导免疫 应答的医药产品中的应用，特征在于所述疫苗制剂在没有任何佐剂化合物的条件下借助于 皮肤装置被施用于哺乳动物的未经处理的皮肤上，历时约48小时。本发明的另一个目的涉及干形式的疫苗制剂在哺乳动物中诱导免疫应答的应用， 特征在于所述疫苗制剂在没有佐剂化合物的条件下借助于皮肤装置被施用于哺乳动物的 未经处理的皮肤上，历时约48小时。本发明的另一个目的涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括借助于 不含佐剂化合物的皮肤装置向哺乳动物的未经处理的皮肤施用干形式的疫苗制剂，历时约 48小时。本发明的另一个目的涉及皮肤装置，其包括背衬，所述背衬的周边部分适于与皮 肤形成密封室，其中所述背衬保持所述抗原位于所述背衬在所述室内接触皮肤的面上，在 所述装置施用于皮肤之后，所述抗原从所述背衬被移去，然后经由表皮途径被递送至对象。本发明的另一个目的涉及疫苗组合物，特征在于所述疫苗组合物包括皮肤给药装 置，该皮肤给药装置在施用于对象的皮肤上之后形成冷凝隔室，所述隔室包含不含任何佐 剂化合物的干形式的疫苗制剂。本发明由这样的意想不到的发现得出，即可以在完好无损的皮肤上(即，未经先 前穿刺或物理和/或化学磨损)和在不使用佐剂的条件下经由皮肤途径诱导免疫应答。使 用干形式的疫苗制剂并借助于当接触皮肤时和/或历时适合的时段形成冷凝隔室的装置 施用该疫苗制剂，获得了这一效果。不受任何特定作用机理的约束，提出了皮肤的水合允许角质层的角化细胞发生溶 胀以及水分子在细胞间隙的脂质区域之间结合。这一水合还将诱导皮肤稳态的紊乱，尤其 导致产生的细胞因子在形态学方面的特性的改变，以及郎格罕氏细胞的表型改变或表皮单 核细胞数目的增加。尽管存在皮肤的屏障作用，但在生理条件下，在身体和大气之间，通过皮肤建立了 水朝向大气的流动。这一流动已知属于所谓的不显性水丢失(Insensible Water Loss, IWL)。本发明的方法使用冷凝隔室，有助于使一部分皮肤与周围介质隔离。在该现象期间， 在身体和大气之间的水蒸汽交换被干扰，这将导致水累积在所述隔室中以及整个表皮、特 别是形成抗物质吸收的主要屏障的角质层的皮肤水合增加。我们的结果表明，在人类中，在 除去冷凝隔室之后测量到的非常强的水流动反映了在所述皮肤表面上积聚的水的蒸发。所 述装置的冷凝隔室随着时间导致所述隔室体积的水蒸汽饱和(来自IWL)，然后导致冷凝， 达到平衡状态。在施用开始时，该体积因其包含环境气体，未被水蒸汽所饱和。一旦达到气 氛的饱和，水蒸气状态的水则冷凝成液态水形式。这一冷凝可由来自皮肤的残余水的流动提供。在这些条件下，达到平衡状态，这导致水累积在所述不透水装置的下方(参见图1B)。本发明因此通过提供这样一种方法可解决现有表皮接种方法的缺点，S卩，该方法 可使用任何类型的抗原、与即用型(ready-to-use)装置的生产相容并且不要求任何的皮 肤处理。在表皮中被诱导的强水合，水在角质层内和表面上的累积，使得有可能在水的存在 下调节疫苗分子和皮肤之间的分配系数，使角化细胞溶胀，以及破坏细胞间脂质相的组织。 这一调节使得活性成分溶解在皮肤表面上存在的液体中并透皮进入(经由被动扩散)，而 无需对皮肤进行穿刺或磨损。本发明可以采用任何的形成冷凝隔室的皮肤给药装置来实施。其优选是贴片或敷 料类型的装置，优选贴片。本发明的装置一般是采用被动扩散的皮肤类型，即，其不包含使 皮肤穿孔或磨损的机构。封闭贴片类型的装置，诸如使用专利申请WO 02/071950中所述的 VIASKINe技术生产的静电贴片，是有利的。在本发明的意义中，术语“隔室”是指在将装置施用于皮肤上之后在皮肤和所述装 置的背衬之间留下的空间，所述背衬不粘附于皮肤，从而留下用于在皮肤上积聚少量水的 空间(例如，参见图IA和1B)。所获得的结果表明了冷凝隔室在施用时期，由于皮肤在所述 隔室的方向中天然传递液体所致，维持了一定程度的水合，使用所述冷凝隔室允许大分子 抗原通过和诱导特异性应答。这些结果就现有技术数据而言特别令人意外，现有技术数据 强调需要求助于特定的佐剂和处理皮肤以获得满意的应答。在一个优选实施方案中，所述装置是这样的，其与皮肤接触形成体积为1到 300mm3/平方厘米装置表面的冷凝隔室。所述体积对应于约0. Olmm到3mm的隔室高度。在 一个优选实施方案中，对应于约0. 02到Imm的高度，所述隔室的体积为2到200mm7cm2装 置表面，或更优选2到100mm7cm2装置表面。所述装置在皮肤上的布及表面可由本领域技 术人员调节，并且通常为约0. 2到5cm2，更通常为0. 5到3cm2。冷凝隔室的壁(所述装置的背衬)不必完全是不可渗透的。反而，在常温和常压 的条件下一定程度的水蒸汽渗透性是可接受的，聚乙烯就是这样，条件是这种蒸发不阻止 所述隔室内通过存在的液态水对饱和水蒸汽气氛的维持。在一个具体实施方案中，所述冷凝隔室的壁包含渗透率小于15g/m2/24h，优选小 于10g/m2/24h，例如约9g/m2/24h左右的材料。所述材料可以选自例如聚合物，共聚物，塑料，陶瓷，任何生物相容的材料(如石 墨)等等。生物相容的聚合物的实例特别是聚乙烯(PE)，聚碳酸酯，聚酯(PET)，纤维素塑料 (CA，CP)，聚氯乙烯(PVC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚氨酯(PUR)，有机硅(PTFE)或聚偏 二氟乙烯(PVDF)。生物相容的共聚物的一个实例特别是乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)。具有与本发明相容的湿气透过率(MVTRs)的聚合物的实例，可特别提及的有 CoTran 9706 (MVTR = 26. 4g/m2/24h)，CoTran 9720 (MVTR = 9. 4g/m2/24h)禾Π CoTran 9722 (MVTR = 7. 9g/m2/24h)。在一个优选实施方案中，所述冷凝隔室由例如基本上圆形(所述背衬)且直径约2 到100mm、优选约5到70mm的聚乙烯聚合物圆盘形成，其被固定在(例如，胶粘在)例如聚 乙烯的生物相容材料环上，该环具有与所述圆盘的外径基本上相同的外径并且内径为1到 50mm，优选约2到20mm。所述圆盘和所述环的厚度为例如约0. 01到2mm，其限定了 0. 01到 2mm的隔室高度，所述隔室的体积虽小但决不为零，即便是所述背衬在某些点的挠性限定了其与皮肤的接触。所述圆盘可通过任何合适的方法被固定在所述环上。一般地，所述环具 有粘附性或被制成粘性以使其粘着于所述圆盘。如图IA所示，本发明装置的一种具体样式的组成如下-根据所述冷凝隔室体积/平方厘米表面的不同而异，具有可变直径和约0.01到 2mm高度的生物相容材料的环[1]。在如图IA所示的实施方案中，所述环至少在其外面具 有准备与皮肤接触的粘附性；_生物相容材料的圆盘[2]，其担当所述隔室的顶(包含干形式的活性成分)，附 着于所述环(例如借助于粘合剂)。所述圆盘表面的直径一般为至少5mm。所述圆盘(背 衬)的MVTR(湿气透过率)优选小于lOg/m2/^^。_保护所述环的粘合表面的剥离衬里[3]，其将在施用于皮肤上前被剥去。该衬里 有利地是圆盘，覆盖所述隔室从而使得在施用所述装置之前所述隔室是密封的。由所述装置形成的隔室是具有水合性质的冷凝隔室。水合性质产生这样的能力， 即作用于位于所述装置的冷凝隔室下面的整个表皮，有利地从施用于皮肤上正好第一个小 时开始，引起表皮水合率增加30% 100%，更精确地增加50%到70%。优选地，所述冷凝 隔室的水合性质必须使得在所述表皮的外表面上以及在所述装置的冷凝隔室内，其从施用 的第一个小时开始可以引起水的相对量增加40%到100%以上，并且进一步优选增加超过 50%。在一个优选实施方案中，所述装置通过确保所述冷凝隔室不透水的机构被保持于 皮肤上。任何粘合机构可用于这一目的，包括具有强粘合性质的胶、聚合物或塑料类型的材 料。本发明的优点是允许在即使完好无损的皮肤上进行接种，S卩，所述皮肤先前未经 历任何特殊处理。在本发明的意义下，“皮肤的处理”是指任何磨损或穿刺处理，导致皮肤的 至少表面层的至少部分破坏。另外，本发明的另一个优点是即使没有佐剂的共同给药也可获得主要的免疫应 答。在本发明的意义下，术语“佐剂”是指任何对皮肤具有物化和/或生物作用、促进抗原进 入皮肤、并且其增加对抗原的免疫应答的化合物。通过物化和/或生物作用，诸如本文定义 的所述佐剂是通过扰动角质层而使表皮渗透性变差的化合物，从而使得抗原能够通过所述 表皮并接触表皮的免疫活性细胞。佐剂化合物的实例特别是霍乱毒素(CT)或LT毒素(大 肠杆菌(E-coli)的不耐热毒素)。其它实例是由Paul等人描述的传递体(transfersomes) (Paul A， Cevc G， Bachhawat BK.Transdermal immunization with large proteins byultradeformable drug carriers. Eur J Immunol. 1995, 25 (12) :3521_4)，其使得抗原會巨 够转运进入膜。本发明可以采用任何干形式的疫苗制剂实施。术语“疫苗制剂”是指任何包含抗 原成分的制剂。其一般是包含一种或多种例如肽、多肽(或蛋白质)、脂质和/或糖类类型 或这些化合物的简单混合物或化学结合物的的抗原的制剂。一种优选的疫苗制剂包含一种 或多种抗原分子；分子量超过500Da的分子，最通常是超过1，500Da并具有预防性或治疗 性疫苗活性或意图的多肽和蛋白质，或分子量超过500Da并计划用于局部(治疗性)作用 于表皮的分子。一般地，所述疫苗制剂包含肽或多肽类型的至少一种抗原。例如，其可以 是细菌抗原，病毒抗原，肿瘤抗原等，诸如流感病毒的抗原，肝炎病毒(/或丙型肝炎)的抗原，流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae)的抗原，呼吸道合胞病毒的抗原，沙门氏菌 (Salmonella)(志贺氏菌(Shigella))的抗原，或肺结核(Tiphy)的抗原，或自身免疫疾病、 癌、阿尔茨海默氏病、过敏症等等的特征性抗原。所述疫苗制剂还可包含适于药学应用的赋 形剂或介质，或任何具有免疫调节活性的化合物诸如细胞因子，Toll受体的配体化合物等寸。所述疫苗制剂以“干形式”使用，S卩，以脱水形式，特别是以粉末、颗粒、团块、饼、干 燥形式等施用。所述干形式可以通过冷冻干燥或由简单蒸发而获得。在一个具体实施方案中，所述疫苗制剂为粉末形式。在另一个具体实施方案中，所述疫苗制剂被保持在所述装置的表面上，一般被保 持在所述隔室的背衬上，如果在该表面上没有粘合材料时，通过化学力或物化力保持。所述 疫苗制剂优选通过静电力或通过范德华力被保持在所述装置的表面上，一般被保持在所述 隔室的背衬上。在一个正常的实施方案中，所述装置包含0. 1μ g/cm2到500μ g/cm2、优选20μ g到 300 μ g/cm2、进一步优选20 μ g到100 μ g/cm2的疫苗制剂量。要理解，该量可由本领域技术 人员相对于目的、病变、治疗持续时间、对象等等进行调整。本发明使得能够诱导重要的免疫应答，即使是在没有佐剂和皮肤处理的条件下。 本发明可被用于抗任何类型的病原体(病毒、寄生虫、细菌、蛋白质等等)、抗肿瘤细胞或抗 自体抗原的预防性或治疗性接种，或用于治疗过敏性个体。给出的结果显示了抗原特异性 应答的诱导，特别是IgG类型抗体的应答。免疫应答的幅度可以通过改变所述装置的施用时间和/或通过进行反复施用进 行调适。如实施例所示的，在三次施用疫苗历时仅6小时后诱导的免疫应答，与施用时间为 24小时所观察到的免疫应答相等(实施例2)。我们已显示，例如，保持约6小时到24小时 时段的水合足以形成免疫应答，即使没有先前的皮肤处理和没有佐剂的共同给药。另外，我们还将施用时段延长到48小时和72小时(实施例5)。获得的结果显示 出，48小时时间给出了令人惊讶的结果，因为抗体特异性应答与24小时的施用时间相比增 加了几乎一个量级。继续施用超过48小时，例如72小时的施用时间，不再出现进一步促进 所述抗体应答的增加。在一个优选实施方案中，本发明包括对对象连续施用至少两个装置、优选至少三 个装置，每次施用间隔约7到30天，优选间隔10到20天，一般间隔约15天。对于每次施用，优选所述装置被保持在皮肤上历时约6到72小时、优选约6到48 小时、更优选约48小时的时段。一个特别优选的诱导免疫应答的方案包括至少三次连续施用装置历时约48小 时，每次施用间隔约15天。在上文中，表述“约”是指与给定值相比有士 10%的变化。本发明还表明，当所述疫苗制剂是干形式并且被施用历时一个或多个约48小时 的时段、优选反复施用约48小时的时段时，通过在完好无损的皮肤上表皮接种获得了主要 抗体应答。本发明可用于在任何哺乳动物中进行抗任何抗原的接种。其可用在儿童或成人中 并且基本上是无创的，且不要求使用佐剂。
本发明的其它方面和优点将通过阅读以下的实施例而变得显而易见，所述实施例 被视为是示例性的而非限制性的。
图1 :A-具有冷凝隔室的皮肤装置的示意图[1]生物相容材料环[2]通过双面粘 合剂粘附于所述圆盘上的“背衬”圆盘，[3]在施用之前被剥离并保护粘合剂的剥离衬里。 B-在冷凝隔室内的水蒸汽流动示意图。图2 使用包括冷凝隔室的装置，在没有佐剂的共同给药的条件下，在完好无损的 皮肤上经由表皮途径诱导抗原特异性抗体免疫应答。图3 包括冷凝隔室的装置在施用于皮肤上6小时或24小时后，经由表皮途径诱 导抗卵清蛋白抗体免疫应答。图4 进入所述隔室的水蒸汽的量与冷凝水的量之间的比率作为时间的函数■ 在所述隔室内积聚的水量，和 在所述隔室内冷凝的水量。O在20小时之后在水蒸气状态下的水量。20小时之后冷凝的水蒸气的量。图5 相对于包含冷凝隔室的装置的施用时间，表皮的不同层(上层表皮、上层和 中层表皮、整个表皮)的水合百分率的增加。图6 相对于包括冷凝隔室的装置的施用时间，在皮肤表面上积聚的水量的增加。图7 通过延长具有冷凝隔室的装置的皮肤施用时间，通过表皮途径诱导的抗卵 清蛋白抗体免疫应答的增强。图8 在没有任何佐剂或任何皮肤穿刺或磨损处理的条件下，通过与贴片类型的 系统相比较，经由表皮途径诱导的强大的免疫原特异性抗体免疫应答。图9 在没有任何佐剂的条件下，采用低剂量的抗原，经由表皮途径诱导的抗TT抗 体免疫应答。图10 与破坏皮肤稳态有关的表皮的诱导变厚，其与具有冷凝隔室的装置的皮肤 施用时间的延长成比例。图11 诱导抗原进入皮肤以及其由树突状细胞进行的处理，其与具有冷凝隔室的 装置的皮肤施用时间的延长成比例。图12 表皮郎格罕氏细胞网络中所诱导的变化，与这些细胞的活化有关，其与具 有冷凝隔室的装置的皮肤施用时间的延长成比例。图13 在将具有含肿瘤抗原的冷凝隔室的装置施用于皮肤24小时之后，诱导产生 对肿瘤抗原特异的抗体，能够在体外靶定表达该抗原的细胞。图14 在将具有含RSV抗原的冷凝隔室的装置施用于皮肤48小时之后，在幼年小 鼠中诱导的抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的部分防护。实施例实施例1包括冷凝隔室的皮肤装置的制备使用涂有泡沫环从而赋予隔室以所需高度的聚乙烯薄膜(3M)作为背衬，环的两 面制成粘合性，制备具有冷凝隔室的皮肤施用装置(厚度=0.7mm)。该装置因此具有在Icm2皮肤上的布及面积和用于空气扩散通过皮肤的70mm3的扩张隔室(参见图1A)。采用了几种具有不同湿气透过率(MVTRs)的聚合物，特别是COTran 9706(MVTR =26. 4g/m2/24h)，CoTran 9720 (MVTR = 9. 4g/m2/24h)和 CoTran 9722 (MVTR = 7. 9g/ m2/24h)。实施例2在没有任何佐剂化合物，也没有任何穿刺或磨损皮肤处理的条件下，经由表皮途 径诱导抗原特异性抗体免疫应答。根据实施例1制备了包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的卵 清蛋白模型抗原(OVA)，破伤风毒素(TT)，肿瘤抗原或市售的抗流行性感冒疫苗的IOmm3/ cm2体积，将所述装置施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6_10)的后背24小时，小鼠后背在施用 前一天经过剃毛和脱毛。在首次施用之后第2和4周重新施用。通过对最后一次施用之后 2周取样的动物血清进行ELISA，检测抗-抗原总IgG类型抗体。图2给出的结果用抗原特 异性抗体滴度表示。对于每只动物的血清，其是在450nm测量的吸光度等于对未试验过的 小鼠的血清测定截止值时的稀释度的倒数。获得的结果显示了即使不使用佐剂，所诱导的 强抗原特异性免疫应答。实施例3在没有佐剂化合物的条件下，在施用于完好无损的皮肤6或24小时之后，经由表 皮途径诱导抗卵清蛋白抗体免疫应答。根据实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的 OVAdOO μ g)的IOmmVcm2体积，将所述装置施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背6或 24小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。在首次施用之后2和4周重新施用。对 最后一次施用之后2周取样的动物血清使用ELISA，检测抗-抗原总IgG类型抗体。图3中 示出的结果表示为抗原特异性抗体滴度。对于每只动物的血清，其是在450nm测量的吸光 度等于在未试验过的小鼠血清上测定的截止值时的稀释度的倒数。获得结果的显示了施用 时间为6或24小时诱导强的抗原特异性免疫应答。实施例4研究在冷凝隔室中可获得的水的量和物理状态。皮肤允许生理量的水蒸气蒸发。该蒸发表示为不显性水丢失-IWL。其引起在冷 凝隔室内的水蒸汽的量增加。水蒸气量的增加又引起在隔室内部的水蒸气分压增加。从在 35°C下的53. 75毫巴的压力开始，隔室处于饱和状况。超过这一压力，水蒸气冷凝成液态 水，其沉积到皮肤的表面上并能够填充冷凝隔室。另外，在冷凝隔室的组合物中，在该实施 例中所用的背衬的聚合物不是完全不能渗透的，并允许被湿气透过率(MVTR)限定的一定 量水蒸气逃逸。因此，在该系统中，在以水蒸汽形式进入隔室内的第一水量和在通过聚合物膜传 递或通过冷凝离开所述隔室的第二水量之间存在平衡。这些不同的量如下评价Q1 = IWL*S*tQ2 = MVTR*S，*tQ = Q1-Q2P = nRT/V
其中Q1 =任何时候进入隔室的水蒸气的质量；Q2 =从聚合物逃逸的水蒸气的量；Q =残留在所述隔室内的水蒸汽的量；P =所述隔室内的压力；S =水蒸汽穿过皮肤的释放表 面；S’ =水蒸汽穿过聚合物的释放表面；t =时间。在从无毛发大鼠后背取得的皮肤样品上通过进行IWL测量来评价在施用冷凝隔 室之前和施用20小时之后的水的量。通过与未经受过所述装置的皮肤区域相比较来测定。 将皮肤片安装在Franz扩散池上。在接收器隔室中，用pH = 7. 4的PBS缓冲剂来维持皮肤 处于可与生理状态相比拟的水合状态下。当Franz池准备好时，将它们置于37°C的热水浴 中并在其中保持2小时，然后进行任何其它的操作，从而使得所述温度与生理流动温度平图4给出的结果表明以水蒸气形式被加到隔室的水在施用装置之后相当迅速地 开始冷凝。根据这些结果，其表示系统的最初数据和最后数据，在20小时之后计算的水蒸 汽和液态水的量分别是1. 08mg/cm2的液态水和0. 3mg/cm2的水蒸汽形式。在实验期间进行 肉眼检验时，水呈现以液态积聚在皮肤表面上。实施例5在施用具有冷凝隔室的装置之后，表皮的不同层(上层表皮、上层和中层表皮、整 个整体)随时间的水合百分率的增加。Hydrascan⑧是由Dermscan 开发的测量表皮水合的装置。测量原理是基于 瞬时传热(TTT)通过靠近热探测器的刺激器产生恒定热脉冲并通过表皮传播。皮肤 温度的每一变化与皮肤中水的量成比例(GirardP.，Beraud A.和Sirvent A. -Study of three complementary techniques formeasuring cutaneous hydration in vivo in human subjects NMRspectroscopy, transient thermal transfer and corneometry-application toxerotic skin and cosmetics.-Skin Research and Technology, 2000,6 :205_213)。测量值用mW/°C表示(其是导热率，测量在两个点之间的导热能力，与这两个点之 间的t°的差异有关)。该设备能够通过在三层即表皮的上层、中层和深层之间制造差别而测量表皮中的 水合。该研究在15名志愿者的组中进行年龄18-50岁的妇女，高加索人，正常皮肤，具 有70mm3的冷凝隔室的装置在28°C被施用于前臂。用Hydrascan测量方法在0小时、1小 时、2小时、3小时和4小时处进行水合动力学。在这些时间的每个时间点处测定在冷凝隔 室下面的表皮的水合并与在未经受过施用冷凝隔室的皮肤区域上的测定结果相比较。图5 中示出了获得的结果并表明从施用第1个小时开始，冷凝隔室内的水合率增加，该水合随 着时间得以维持。实施例6在施用具有冷凝隔室的装置之后，皮肤表面的水合随时间增加。该研究在15名志愿者的组中进行年龄18-50岁的妇女，高加索人，正常皮肤， 具有70mm3冷凝隔室的装置在26°C下被施用于前臂。不显性水丢失(IWL)的测定使用 Tewameter 210 (Courage and KhazakaElectronic Gmbh.，Κδ η, Germany)进行。一旦除去装置后，就使用在90秒内记录的每一秒IWL测量值来计算在冷凝隔室下方、因此是在皮肤上积聚的水量的测定值。计算每个测量时间的曲线下面积。在施用冷凝 隔室之后0小时、1小时、2小时、3小时和4小时处进行测量。图6示出了获得的结果并表明在处理期间皮肤表面上积聚的水量增加。实施例7通过延长皮肤施用时间，经由表皮途径诱导的抗卵清蛋白抗体免疫应答的增强。按照实施例1制备包括冷凝隔室的装置，但是其具有包含干形式的OVA(IOOyg) 或TT (100 μ g)的IOmmVcm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6图7A，η = 10图7Β) 的后背24或48小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。根据两种不同的方案重新 施用-方案1在首次施用之后2和4周(图7Α和7Β)，-方案2:在首次施用之后第2、7、9、14、21和28天(图7Β)。通过对最后一次施用之后第2周取样的动物血清进行ELISA，测试抗OVA总IgG类 型抗体。图7Α和7Β示出的结果用抗原特异性抗体滴度表示。对于每只动物的血清，其是 在450nm测量的吸光度等于在未试验过的小鼠血清上测定的截止值时的稀释度的倒数。结 果表明施用时间为48小时具有特别显著的抗体特异性应答。实施例8在没有任何佐剂化合物、也没有任何皮肤的穿孔或磨损处理的条件下，与贴片类 型的系统相比较，经由表皮途径诱导的强大的对免疫原特异的抗体免疫应答。按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的模型 免疫原霍乱毒素(CT)的10mm7cm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背24 小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。在首次施用之后2和4周重新施用。另外， 将用普通的橡皮膏覆盖的、由其上吸附有液态免疫原的纱布构成的贴片类型的系统，在与 先前所述装置相同的条件下施用于雌性BALB/c小鼠的后背上。对最后一次施用之后2周 取样的动物血清采用ELISA，检测抗-抗原总IgG类型抗体。图8中示出的结果用抗原特异 性抗体滴度表示。对于每只动物的血清，其是在450nm测量的吸光度等于在未试验过的小 鼠血清上测定的截止值时的稀释度的倒数。结果表明当采用以冷凝隔室皮肤给药时，与贴片类型的系统相比较，诱导了对免 疫原特异的强免疫应答。实施例9在没有佐剂化合物的条件下，使用低剂量抗原，经由表皮途径诱导抗TT抗体免疫应答。按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的 TT (10或100 μ g)的10mm7cm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背24或 48小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。在首次施用之后2和4周重新施用。对 最后一次施用之后2周取样的动物血清采用ELISA检测抗-抗原总IgG类型抗体。图9中 示出的结果用抗原特异性抗体滴度表示。对于每只动物的血清，其是在450nm测量的吸光 度等于在未试验过的小鼠血清上测定的截止值时的稀释度的倒数。结果表明诱导的抗原特异性抗体滴度，其相当于具有包含IOOiLg的冷凝隔室的 皮肤给药装置施用24小时，和相当于包含IOiLg的冷凝隔室的皮肤给药装置施用48小时。
实施例10表皮被诱导的变厚与具有冷凝隔室的装置的皮肤施用时间的延长成比例。按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但其具有包含干形式的 OVAdOO μ g/cm2)的IOmmVcm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 8-16)的后背0、24 或48小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。对冷凝隔室下方的皮肤区域进行取样 并冷却。将得自样品的皮肤切片用Hemalim-曙红染色。图10中的结果显示在χ200放大 倍数的显微镜下看到的观测结果。结果表明，施用具有包含OVA的冷凝隔室的皮肤给药装置，诱导表皮变厚，这在施 用24小时后可见，并且在施用48小时后显著。实施例11诱导抗原进入皮肤以及其由树突状细胞进行的处理，与具有冷凝隔室的装置的皮 肤施用时间的延长成比例。-按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的 OVAdOO μ g/cm2)偶联 Alexa 488 (A488)的 IOmmVcm2 体积施用于雌性 BALB/c 小鼠(η = 10-20)的后背6、24或48小时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。将冷凝隔室下的 皮肤区域取样。在从真皮分离表皮后(0.5%胰蛋白酶)，通过机械再悬浮分离表皮细胞并 通过酶消化(胶原酶/DNA酶)真皮细胞。在细胞悬液中和在树突状细胞中检测OVA-A488， 所述细胞通过通过流式细胞术(FACscallibur and Cellquest软件)使用CDllc标志进 行识别。图11中示出的结果用在每种细胞悬液(表皮和真皮)的总细胞中和树突状细胞 (⑶Ilc+)中的荧光细胞(OVA-A488+)的百分数表示。结果表明一些表皮细胞和真皮细胞是OVA-A488+,并且它们的比例随着具有含 OVA-A488的冷凝隔室的皮肤给药装置的施用时间延长而增加。这些OVA-A488+细胞中的一部 分是树突状细胞(CDllc+)并且类似地，树突状OVA-A488+细胞的百分数随着包括冷凝隔室的 皮肤给药装置的施用时间的延长而增加。-按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但是其具有包含干形式的 OVA (100 μ g/cm2)偶联 Alexa 488 (A488)的 10mm7cm2 体积，将其施用于猪(η = 1)的后背 24 小时，猪后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。对冷凝隔室下方的皮肤区域进行取样。在从真皮分离表皮后(0. 5%胰蛋白酶)， 通过机械再悬浮分离表皮细胞并通过酶消化(胶原酶/DNA酶)真皮细胞。在细胞悬液中和 在树突状细胞中检测OVA-A488，所述细胞通过流式细胞术(FACscallibur and Cell quest 软件)使用SLA-II标志进行识别。图11中示出的结果用在每种细胞悬液(表皮和真皮) 的总细胞中和树突状细胞(SLA-II+)中的荧光细胞(OVA-A488+)的百分数表示。结果表明在施用具有含OVA-A488的冷凝隔室的皮肤给药装置24小时之后，一些表 皮细胞和真皮细胞是0VA-A488+。这些OVA-A488+细胞的一部分是树突状细胞(SLA-II+)。图11中示出的结果表明包括冷凝隔室的皮肤给药装置促进了抗原进入皮肤，并 且促进其被树突状细胞的处理。实施例12表皮郎格罕氏细胞网络中被诱导的变化，其与具有冷凝隔室的装置的皮肤施用时 间的延长成比例。
按照实施例1制备包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但其具有包含干形式的 OVA (100 μ g)的IOmmVcm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 5)的后背0、24或48小 时，小鼠后背在施用前一天经过剃毛和脱毛。对冷凝隔室下方的皮肤区域进行取样并冷冻。 用CD207标志从得自样品的皮肤切片上识别郎格罕氏细胞。图12中的结果表明在χ200放 大倍数的显微镜检术下得到的观测结果。结果表明，施用具有含OVA的冷凝隔室的皮肤给药装置诱导表皮郎格罕氏细胞网 络的变化，这在施用24小时之后可见，在施用48小时之后显著。这一现象是这些细胞活化 的特征。实施例13诱导产生对肿瘤抗原特异的抗体，所述抗体能够在将具有含肿瘤抗原的冷凝隔室 的装置施用于皮肤24小时时间之后，在体外靶定表达该抗原的细胞。按照实施例1制备了包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但其具有包含干形式的肿瘤 抗原的10mm7cm2体积，将其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6)的后背24小时，小鼠后背在 施用前一天经过剃毛和脱毛。在首次施用之后2和4周重新施用。对在最后一次施用之后 2周取样的动物血清进行的ELISA，测试抗-抗原总IgG类型抗体。动物的血清与表达该肿 瘤抗原的细胞温育。通过流式细胞术(FACscallibur and Cell quest软件)，用荧光小鼠 抗Ig抗体标记之后，检测在细胞上固定的肿瘤抗-抗原抗体。图13中的结果以显示与细 胞数目有关的荧光强度的矩形图形式给出。结果表明使用具有含肿瘤抗原的冷凝隔室的皮肤给药装置，经由表皮途径进行免 疫的小鼠血清中所含的肿瘤抗-抗原抗体，表现出体外识别表达所述肿瘤抗原的细胞。实施例14在将具有含RSV抗原的冷凝隔室的装置施用于皮肤48小时之后，在幼年小鼠中诱 导的抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的部分防护。按照实施例1制备了包括冷凝隔室的皮肤给药装置，但其具有包含干形式的呼吸 道合胞病毒抗原的10mm7cm2体积，将其施用于幼年BALB/c小鼠(7日龄)的后背48小时。 经由鼻内途径与佐剂共同给药的抗原作为对照。病毒测试在经鼻途径接种之后第23天进 行。病毒RNAs的测试在感染之后第5天取样的肺上进行。图14中示出的结果用肺中与参 比基因相比较的相对量的病毒RNA表示，并相对于阳性对照(未接种个体)进行归一化。结果表明在幼年小鼠中的病毒载量，在具有含RSV抗原的冷凝隔室的装置皮肤施 用48小时之后，与未经处理的幼年小鼠相比，减低了一半。
1权利要求
疫苗制剂在制备哺乳动物、优选人的表皮接种用组合物中的应用，特征在于所述疫苗制剂为干形式并且不含佐剂，以及特征在于所述疫苗制剂借助于在接触皮肤时形成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室的皮肤装置而被施用于哺乳动物的完好无损的皮肤上进行给药。
2.皮肤给药装置在制备计划用于在没有任何皮肤处理或佐剂的共同给药的条件下将 包含抗原的疫苗制剂进行给药的组合物中的应用，所述皮肤给药装置包含没有佐剂化合物 的干形式的疫苗制剂，并且在接触皮肤时形成包含所述疫苗制剂的冷凝隔室，从而允许在 没有佐剂或先前皮肤处理的条件下所述抗原进入表皮和诱导免疫应答。
3.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述冷凝隔室的壁包含湿气透过率小于约 10g/m2/24h 的材料。
4.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述冷凝隔室的体积为1到300mm7cm2装 置表面、优选2到100mm7cm2装置表面。
5.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述冷凝隔室允许诱导在所述冷凝隔室内 和在表皮的外表面上的水合率在施用1小时后增加至少50%。
6.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述装置通过粘合机构被保持在皮肤上。
7.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述疫苗制剂为粉末形式。
8.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述疫苗制剂在装置表面不存在粘合材料 的条件下，通过化学或物化类型的力被保持在所述装置的该表面上。
9.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述疫苗制剂通过静电力或通过范德华力 被保持在所述装置的表面上。
10.前述权利要求中任一项的应用，特征在于所述装置包含0.1 μ g到500μ g/cm2表 面、优选20 μ g到300 μ g/cm2表面、更优选20 μ g到100 μ g/cm2表面的量的疫苗制剂。
11.前述权利要求任一项的应用，特征在于所述疫苗制剂包含肽或多肽类型、或具有不 同化学类型组分的多肽结合物的至少一种抗原。
12.前述权利要求中任一项的应用，特征在于其包括给对象连续施用至少两个装置、优 选至少三个装置，每次施用间隔约7到30天，优选10到20天，一般约15天。
13.前述权利要求中任一项的应用，特征在于，对于每次施用，所述装置被保持在皮肤 上历时约6到72小时、优选约6到48小时、更优选约48小时。
14.前述权利要求中任一项的应用，特征在于其包括对给对象至少连续三次施用装置 历时约48小时，每次施用间隔约15天。
15.前述权利要求中任一项的应用，用于制备诱导对抗抗原和对抗原特异的免疫应答 的疫苗。
16.前述权利要求中任一项的应用，用于制备诱导IgG类型的抗体应答的疫苗。
17.疫苗组合物，特征在于其包括在施用于对象的皮肤之后形成冷凝隔室的皮肤给药 装置，所述冷凝隔室包含干形式的且不含任何佐剂化合物的疫苗制剂。
18.权利要求17的组合物，特征在于所述疫苗制剂是粉末形式。
19.权利要求18的组合物，特征在于所述疫苗制剂借助于静电力被保持在所述冷凝隔 室的表面上。
20.干形式的疫苗制剂在制备用于在哺乳动物中诱导免疫应答的医药产品中的应用， 特征在于所述疫苗制剂在没有任何佐剂化合物的条件下借助于皮肤装置被施用于哺乳动物的未经处理的皮肤上，历时约48小时。
21.权利要求1-16和20中任一项的应用，特征在于所述疫苗制剂另外包含免疫调节化 合物或与免疫调节化合物共同给药，所述免疫调节化合物优选选自细胞因子和Toll受体 配体。
全文摘要
本发明涉及开发经由皮肤途径递送疫苗的系统。本发明更具体涉及包含冷凝隔室的装置在表皮接种中的应用。本发明还涉及允许在无任何皮肤处理的条件下即可获得有效免疫应答的表皮接种方案。本发明可以在任何哺乳动物、优选在人类中实施，以诱导对抗任何类型的抗原的治疗性或预防性免疫应答。
文档编号A61K9/70GK101883560SQ200880118865
公开日2010年11月10日 申请日期2008年12月3日 优先权日2007年12月3日
发明者约尔格·龙科, 西尔维·戈德弗鲁瓦, 贝特朗·杜邦 申请人:Dbv技术公司