针对hiv-1的免疫方法和组合物的制作方法

专利名称：针对hiv-1的免疫方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防HIV-1感染的DNA疫苗，以及对有患HIV感染危险的受试者进行接种的方法。
背景技术：
尽管针对HIV-1进行二十多的努力，但其全球流行一直困扰着人类。至今，大约2千2百万人死于AIDS，目前超过3千6百万人感染HIV-1。对发展中世界的影响不成比例，占总病例的95％。在5％接受抗逆转录病毒治疗的人当中，绝大部分由于副作用不能耐受现有药物，另一部分具有药物抗性病毒变体。尽管公共卫生事业的发展可有助于延缓HIV-1在某些地区的传播速度，但是很明显，防护性的疫苗将是解决全球问题的最令人满意的方法。
目前，世界上50％以上的新HIV-1感染是由HIV-1病毒的亚型C引起的。亚型C从印度和缅甸传到了中国，估计是通过在国家西南部的静脉注射吸毒者中间传播的。云南省特别严重，约占全中国HIV-1病例中的一半以上。根据云南省卫生局的资料，2000年该省IVDU中HIV-1感染流行率是29％，预计到2005年将达到40.7％。云南省的5个县(文山、红河、德洪、陵长和大理)的流行率最高，估计为50-70％。HIV-1亚型C也已传播到邻省，例如四川和广西，并引起很远的新疆的许多感染。
DNA接种，或遗传免疫是疫苗学上有希望的新策略。先前设计针对HIV-1的疫苗的尝试表明常规方法如蛋白质/亚基或失活病毒对逆转录病毒的感染不起作用。另外，广泛认为活的减毒疫苗在用于对抗HIV-1时有不能接受的危险。因此，用核酸免疫是新的、及时的想法。
发明简述本发明提供了针对HIV-1的DNA疫苗，以及最大实用性和效率的接种方法学策略。本发明的预防疫苗方案包括用包含两种新DNA载体的接种物初始免疫，然后用表达相应HIV-1蛋白质的修饰的牛痘Ankara(Modified Vaccinia Ankara)(MVA)重组核酸加强免疫。
第一方面，本发明的特征在于核酸载体，其是从商品化的质粒(pVAX1)(InvitrogenTM)开发而来的(

图1)，并通过插入另外的启动子修饰。在一个实施方案中，该核酸载体包含人延伸因子1α(hEF1α)启动子(pADVAX)(图2)第二方面，本发明的特征在于包含两种HIV-1基因的核酸载体，其中每种HIV-1基因由不同的启动子控制。在更具体的实施方案中，本发明的核酸载体包含pCMV启动子和人延伸因子1α(hEF1α)启动子。在另一个实施方案中，HIV-1基因包含env和gag。在更具体的实施方案中，对核酸载体进行密码子优化以在人类受试者中表达。在另一更具体的实施方案中，该核酸载体进一步包含tPA前导序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)(SEQ ID NO1)。在更具体的实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1 env基因和tPA前导序列，其包含SEQID NO7的序列和编码SEQ ID NO8的氨基酸序列。在另一更具体的实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1 gag基因和tPA前导序列，其包含SEQ ID NO9的核酸序列，编码SEQ ID NO10的氨基酸序列。在另一实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1 tPA-env和tPA-gag基因，其具有SEQ ID NO15的序列(ADVAXI)。
在另一实施方案中，HIV-1基因包含pol、nef和tat。在更具体的实施方案中，对核酸载体进行密码子优化以在人类受试者中表达。在一个实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1 pol和tPA序列，其包含SEQ ID NO11的序列(其编码SEQ ID NO12的氨基酸序列)。在另一具体的实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1 nef-tat融合基因序列和tPA前导序列，其包含SEQ ID NO13的序列(编码SEQ ID NO14的氨基酸序列)。在另一实施方案中，核酸载体包含密码子优化的HIV-1tPA-pol和tPA-nef-tat基因，其具有SEQ ID NO16的序列(ADVAXII)。
第三方面，本发明的特征在于包含两种核酸载体的接种物，其中每种载体包含两个启动子，每个启动子控制一种或多种HIV-1基因的表达。在更具体的实施方案中，一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV-1基因gag和nev，另一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV-1基因pol、nef和tat。在另一个更具体的实施方案中，一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV-1基因gag-pol和nev，另一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV-1基因nef和tat。在更具体的实施方案中，接种物包含一种核酸载体(其包含密码子优化的HIV-1 tPA-env和tPAa-gag基因，具有SEQ IDNO15的序列(ADVAXI))和另一种核酸载体(其包含密码子优化的HIV-1tPA-pol和tPA-nef-tat基因，具有SEQ ID NO16的序列(ADVAXII))。
第四方面，本发明的特征在于包含两条插入到MVA DelIII区的核酸序列的修饰的牛痘Ankara(MVA)载体，其中每条核酸序列受单独的启动子控制。在更具体的实施方案中，第一种修饰的载体包含表达三种HIV-1序列，env和gal-pol融合序列的修饰的MVA载体，其中env序列是编码SEQ ID NO18氨基酸序列的的tPA-δV2 env(SEQ ID NO17)；融合基因序列tPA-gag-pol包含编码SEQ ID NO20的氨基酸序列(ADMVA1)的SEQID NO19的序列。
第五方面，本发明的特征在于另一种修饰的载体，其包含表达五种HIV-1融合基因序列env、gal-pol和nef-tat的修饰的DNA。更具体而言，该修饰的MVA载体包含编码氨基酸序列SEQ ID NO18的tPA-δV2 env(SEQ ID NO17)；编码SEQ ID NO20的氨基酸序列的tPA-gag-pol(SEQID NO19)，以及编码SEQ ID NO22的氨基酸序列(ADMVA2)的tPA-nef-tatSEQ ID NO21。
第六方面，本发明的特征在于针对HIV-1对人类受试者进行接种的方法，其包含给予DNA疫苗，该疫苗包含一种含有ADVAXI(SEQ ID NO15)的核酸及另一种含有ADVAXII(SEQ ID NO16)的核酸。在一个实施方案中，用ADVAXI和II初步免疫后，用表达相应HVI-1蛋白质的修饰的牛痘Ankara(ADMVA2)载体进行加强免疫。
第七方面，本发明的特征在于用于给予本发明的一种或多种核酸的试剂盒，其用于治疗有患HIV相关疾病危险或患有HIV相关疾病的人类受试者，其包含初始DNA疫苗ADVAXI和ADVAXII中的一种或两种(单独或联合使用)，以及用于制备或传递疫苗的试剂、缓冲液或溶液。该试剂盒还包括使用试剂盒中组分进行接种或治疗HIV相关疾病的用法说明。该试剂盒还可包括进行对本发明的核酸给药的仪器和装置，例如注射器和针。在本发明的一个实施方案中，该试剂盒包括两种初始DNA疫苗ADVAXI和ADVAXII，单独或联合使用，以及加强疫苗ADMVA2，和用于制备或传递该疫苗的试剂、缓冲液或溶液，及使用该试剂盒的说明。
本发明的其他特征和好处在发明详述、附图和实施例中很明显。
附图简述图1是pVAX1的简图。
图2是pADVAX(包括人延伸因子1α(hEF1α)作为另一启动子的修饰的pVAX1)的简图。
图3是为ADVAXII而进行的对pol基因的修饰的简要示意图。PR＝蛋白酶，RT＝逆转录酶，IN＝整合酶。蛋白酶中的缺失(DTGA)包含野生型基因的25-28位氨基酸。在逆转录酶中的点实变(M到G)是在野生型基因的184位。对用pVAX1-tPA-实变的pol(A)和单独的pVAX1(B)转染的293T细胞的上清液进行Western印迹。未断裂的tPA-pol是110KD。
图4是对用nef构建体单独的载体、nef、tPA-nef和tpa-nef-tat转染的293T细胞上MHC-I类的表达的流式细胞术分析结果。
图5是ADVAXI和ADVAXII的简图。
图6是对来源于肽混合物的Env和Gag的IFN-γELISpol反应。肽是有10处重叠的20聚体。每种混合物包括12种肽，除GagA-I是以前鉴定的BALB/c小鼠上CTL表位的特异的9聚体(AMGMLKDTI)(SEQ ID NO2)。Env P1包含24-144位的氨基酸，Env P4包含403-573位的氨基酸，GagP3包含251-380位的氨基酸，Gag A-1包含217-225位的氨基酸。
图7显示了用不同剂量的ADVAXI接种的小鼠中Env-和Gag-特异的IFN-γELESpot反应。
图8是从pLW7构建pZC1和pZC3的简图。
图9是从pLW22构建pZC22的简图。
图10.用不同的DNA疫苗接种的小鼠中血清抗Gag抗体。各组小鼠在0周、3周和6周用不同DNA疫苗IM(肌内注射)免疫。在第8周时收集每只小鼠的血清，每组混合在一起，并用ELISA分析抗Gag抗体反应。
图11.对来源于肽混合物的pol、Tat和Nef的IFN-γELISpot反应。肽是有11处重叠的15聚体，每种混合物包含25-30种肽。在我们修饰的基因中，Pol P2包含92-226位的氨基酸，Pol P4包含343-477位的氨基酸，Pol P7包含711-845位的氨基酸。Pol P8包含839-969位氨基酸，Nef P1和P2包括全部Nef蛋白。
图12.用不同剂量的ADVAXII接种的小鼠中Pol-和Nef-Tat-特异性IFN-γELISpot反应。如前所述，结果反映了对选择的肽混合物的免疫应答。
发明详述在描述本发明的方法学、载体和组合物之前，应当理解本发明不限于特定的方法，或实验化合物以及所述的实验条件，因为该方法和条件可能改变。也应当理解的是此处所用的术语只是为了描述特定的实施方案，不是为了限制，因为本发明的范围只由所附的权利要求来限制。
在本说明书和所附的权利要求中所用的单数形式除非上下文另有明确规定，包括复数范围。因此例如，涉及到“方法”时包括一种或多种方法，和/或此处所述的和/或在阅读本公开内容后对本领域技术人员很明显的方法等。
除非另有规定，此处所用的技术和科学术语与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的意义相同。尽管任何与此处所述的方法和材料类似或等价的方法和材料都可用于本发明的实践或检验，但此处描述的是优选的方法和材料。此处提到的所有出版物此处引用用来参考，以公开和描述与出版物中涉及的方法和/或材料相关的方法和/或材料。
定义短语“与HIV感染相关的疾病”或“HIV-1相关疾病”等，此处是指此HIV感染为特征的疾病状态。此类与HIV感染相关的疾病包括但不限于AIDS、卡波西肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、机会性感染例如由卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的感染；包括鹅口疮、毛状白斑和口腔溃疡的口腔损伤；全身淋巴结病；带状疱疹；血小板减少症；无菌性脑膜炎；神经系统疾病如弓形体病、隐球菌病(cyrptoco ccosis)、CMV感染、原发性CNS淋巴瘤和HIV相关的疾病；末梢神经病；癫痫发作和肌病。
有患HIV感染或HIV相关疾病“危险”的人是指其HIV感染的危险比群体的危险高的人。
术语“治疗上有效的剂量”是指因所给剂量而产生目的效果的剂量。确切的剂量取决于治疗的目的，并可由本领域技术人员利用已知的技术确定(例如参见Lieberman(1992)Pharmaceutical Dosage FormsVOl.1-3；Lolyd(1999)The Art，Science and Technology ofpharmaceutical Compounding；and Pickar(1999)Dosage Calculations)。对于本发明的DNA疫苗的治疗上有效的剂量是对个体HIV感染或AIDS治疗中获得成功的必需量，包括任何客观的和主观的标准，如HIV病毒抑制、与HIV感染和AIDS有关的病状的减少，或改善了病人的生理或心理健康。
发明概述本发明涉及将编码病毒抗原的DNA直接注射入皮肤或肌肉的策略。然后局部细胞吸收该质粒并表达外源蛋白本身，基本上在原位产生疫苗免疫原。该方法经济实用。但更重要的是，该方法可在体内非常有效。
已知细胞介导的免疫(CMI)对控制HIV-1复制非常重要(Ogg等人，(1998)Science 2792103-6；Schmitz等人，(1999)Science283857-60；Jin等人，(1999)J.Exp.Med.189991-8；McMichael等人，(2001)Nature 410980-7)。也许由于涉及从头表达，看起来DNA接种可以针对CMI的生成产生更好的抗原呈递作用。在一项研究中，DNA接种可至少部分保护恒河猴免受致病性SHIV的实验性攻击(Barouch等，(2000)Science 290486-92)。但是，在重组载体联合作为初始-加强免疫方案中，DNA接种甚至对刺激CMI和封闭SHIV的感染更有效(Robinson等，(1999)Nat.Med.5526-34；Hanke等，(1999)Vaccine17589-96；Hanke等，(1999)J.Virol.737524-32；Allen等，(2000)J.Immunol.1644968-78；Amara等，(2001)Science 29269-74；Barouch等，(2001)J.Virol.755151-8)。
在下述实验中，构建了两种独特的初始DNA疫苗，其包括两种双启动子载体表达env和gag的ADVAXI，以及表达pol和nef-tat的ADVAXII(图5)。这两种疫苗所携带的全部五种HIV-1基因都在体外进行了全面的评估，以确保在独特的质粒载体中的表达能力和安全性。该实验还描述了表达相应HIV-1蛋白质(ADMVA2)并用于接种ADVAXI和II后加强免疫应答的修饰的Modified Vaccinia AnKara(修饰的牛痘Ankara)(MVA)载体。
给药药物可接受的载体部分地由预给药的特定的组合物以及化合物给药的特定方法所决定。本发明包括包含核酸的药物组合物的传递。因此，存在许多该核酸药物组合物的合适制剂(例如参见RemingtonsPharmaceutical Science，17thed.1989)。可以任何常规的方式给药，例如，注射、口服、吸入法、经皮的应用或直肠给药。
适于非肠道给药(例如肌内的、皮内的和皮下途径)的制剂包括水性的和非水性等渗的无菌注射液，其可包括抗氧化剂、缓冲液、制菌剂，以及使制剂与受者血液等渗的溶质、水性和非水性的无菌悬液(其可包括悬浮剂、增溶剂、加厚剂、稳定剂和防腐剂)。在本发明的实践中，组合物可通过例如静脉注射、口腔、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内给药。非肠道给药是优选的给药方法。制剂可以单位剂量或多剂量密封在容器(如安瓿和小瓶)内存在。
利用本领域已知的方法制备用于给药的纯化的疫苗溶液，包括过滤溶液来除菌、稀释溶液、添加佐剂和稳定溶液。可以将该疫苗冻干，制备干燥形式的针对HIV的疫苗，以便于运输和贮存。进一步地可将该疫苗制成初始疫苗ADVAXI和ADVAXII单独成联合形式、单独加强疫苗ADMVA2形式或可包括至少一种其它抗原的形式，只要所加的抗原不干扰初始或加强疫苗的效力、不另外或协同增加副作用和有害的反应即可。
试剂盒本发明包括用于接种需要接种的对象的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒通常包括本发明的初始DNA疫苗，包括ADVAXI和ADVAXII(单独地或联合地)。在本发明的另一个实施方案中，试剂盒包括本发明的加强疫苗ADMVA2。在另一个实施方案中，试剂盒既包括单独或联合的初始疫苗ADVAXI和ADVAXII，也包括加强疫苗ADMVA2。试剂盒还包括给药本发明疫苗必需的试剂、溶液或缓冲液，以及医疗设备，如注射器和针，还有如何使用试剂盒中组分的用法说明。
DNA疫苗ADVAXI和II的构建本发明的预防性疫苗方案包括用包含两种新DNA载体的接种物初始免疫，然后用表达相应HIV-1蛋白质的修饰的牛痘Ankara(MVA)重组体加强免疫。用于瞬时疫苗的基因衍生自分化体C(clade C)菌株Circulating Recombinant Form007(循环重组型007)或HIVCHN.AD，其还包括分化体B(clade B)(在云南省内的优势亚型)中的小片段。
大多数针对HIV-1的疫苗研究涉及病毒的结构基因产物Env、Gag和Pol，其为包含潜在重要的免疫原性表位的蛋白质。但是，越来越多的证据表明HIV-1调节蛋白质如Nef和Tat的免疫原性重要性(Allen等，(2000)Nature 407386-90；Addo等，(2001)Pros.Natl.Acad.Sci.USA981781-6；Cafaro等，(1999)Nat.Med.5643-50；Pauza等，(2000)Proc，Natl.Acad.Sci.USA 973515-9；Cafaro等，(2001)Vaccine192862-77)，特别是针对CMI诱导的重要性。因为该基因产物在病毒生活周期的早期表达，因此它们可能是免疫控制HIV-1感染的关键物质。因此，结构基因和调节基因都包括在本发明策略中，并被设计为包含最多的免疫原性表位。
本发明的DNA疫苗以Invitrogen的商品化质粒pVAX1为基础(图1)。对该载体进行特别的设计以用于开发DNA疫苗，并构建该载体以符合美国食品与药品管理(FDA)的规定(Center for Biologics Evaluation andResearch，FDA，22 Dec 1996，Docket NO.96N-0400)。但是，通过插入另外的启动子对原始载体进行修饰。从商品化的载体pBudCE4.1(Invitrogen)中利用PCR扩增人延伸因子1α(hEF1α)启动子。将该启动子克隆到pVAX1的EcoR1/Not1位点，并用测序验证新构建体。其它人已对hEF1α启动子进行了完善的性质鉴定(Najjar等，(1999)Gene23041-5；Nishimura等，(1999)Vaccine 18675-80；Wallich等，(2001)Infect.Inmun.692130-6)。发现经过对pVAX1的这种改变产生的pADVAX(图2)允许另外基因插入片段的独立的高水平表达。pADVAX的双顺反子能力比利用内部核糖体进入位点或IRES获得的更有效(10-20倍)(Martinez-Salas(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10458-64)。Western印迹表明在pADVAX的双启动子的控制下的每一基因的蛋白质表达水平可以达到pVAX1中由CMV启动子单独驱动的水平。
在构建pADVAX载体后，准备用于插入的病毒基因。合成包含最适于哺乳动物表达的密码子的HIV-1 env和gag基因。密码子优化可以促进Rev/RRE-独立的核输出(Schneider等，(1997)J.Virol.714892-903；Kotsopoulou等，(2000)J.Virol.744839-52)，并且一直发现其可加强病毒基因的表达。用重叠PCR将具有反映该理想密码子选择的序列的寡核苷酸(80-960聚体，有16-18处重复)联结起来。由此，基因表达提高100-1000倍(由ELISA或Western印迹测量)。
还通过掺入组织纤溶酶原激活剂(tPA)前导序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)(SEQ ID NO1)、置换env的天然序列和补充gag基因对该基因进行进一步修饰。认为该序列通过协助蛋白质从内质网(ER)到高尔基体的运输而部分地增加表达(Haddad等，(1997)FEMS Immunol.Med.Microbiol.18193-202；Li等(1999)Infect.Immun.674780-6；Weiss等，(1999)Vaccine 18815-24；Qiu等，(2000)Virol.745997-6005)。通过该修饰，基因表达进一步被增加3-5倍。在利用针对env基因产物的多克隆抗体进行的Western印迹测量中，对通过密码子优化和加入tPA前导序列而得到的增加的env表达获得类似的结果(结果未列出)。该结果确定了利用基因修饰保存了Env功能。在涉及带有CD4/CCR5(HIV-1受体/共-受体)的Hela细胞的融合试验中，用tPA-优化的env载体转染的293T细胞能够融合形成合胞体(结果未列出)。
通过适当的所需的基因修饰，将两种HIV-1基因克隆到pADVAX中产生第一种疫苗ADVAXI。用Western印迹确证双顺子表达(结果未列出)。
再如上所述构建第二种疫苗，用重叠PCR联结密码子优化的寡核苷酸以合成pol、nef和tat。但是，采取另外的措施以确保体内应用的安全性。首先，在pol基因中包含蛋白酶(PR)活性位点的缺失。这可防止多肽的加工(Loeb等(1989)Nature 340307-400)，结果由Western印迹确证(图3)。采取了另外的预防措施，还在pol基因中的逆转录酶(RT)活性位点掺入了点突变(Wakefield等，(1992)J.Virol666806-12；Chao等，(1995)Nucleic Acid Res.23803-10)。
为了能将全部3种基因掺入到一个基于pADVAX的载体中，利用重叠PCR产生nef-tat融合基因。结果两种基因序列都保持完整，因而在所得的融合蛋白质中保留了所有免疫原性表位。同前一样，将tPA前导序列加入到pol和nef-tat中。通过对相关载体转染的293T细胞裂解物和上清液进行Western印迹证实获得的表达和分泌效率的增加。所用的抗体是多克隆兔抗-Nef抗体(由Cecilia Cheny-Mayer博士提供)。
重要的是，同Pol一样，必须确保Nef-Tat融合蛋白质体内应用的安全性。已知Nef下调CD4和I类MHC的表面表达(Collins等，(1998)Nature 391397-401；AiKen等，(1994)Cell 76853-64；Collins等，(1999)Immunol.Rev.16865-74)，Tat具有免疫抑制作用(可能通过作为一般的反式激活蛋白起作用)(Goldstein，(1996)Nat.Med.2960-4；Garber等，(1999)Curr.Opin.Immunol.11460-5)。但是通过流式细胞术分析，我们证明tPA前导序列使Nef对I类MHC的表达的作用失效(图4)。
类似地，在Nef-Tat融合蛋白质中，Tat失去其反式激活的能力。这种现象在“MAGI”实验中很明显，该实验中用到经改造在功能性HIV-1 Tat存在下表达β-半乳糖苷酶基因的Hela细胞(Kimpton等，(1992)J.Virol.662232-9)。因此，在加入X-gal底物后，只有在Tat有活性时，细胞才转为蓝色(结果未列出)。因此可以推出，该疫苗产生的Nef-Tat融合蛋白质在体内不会有免疫抑制作用。实际上，既使忽略了通常的反式激活的危险，也已发现编码野生型HIV-1 tat的DNA在无免疫应答的个体中用作疫苗也是安全的(Calarota等，(1999)J.Immunol.1632330-8)。
在ADVAXI和ADVAXII的构建和体外性质鉴定之后(如上所述)，用ELISpot方法评估该载体的体内免疫原性，因为该方法快速、可重复、并对检测CD8+和CD4+T细胞活性灵敏。用5种不同的疫苗pVAX1-env、pVAX1-gag、pVAX1-env、pVAX1-gag、pVAX1(对照)和ADVAXI免疫BALB/c小鼠。将各组处死的小鼠的脾细胞合并，并测定用Env和Gag抗原特异性肽混合物体外再刺激过程中干扰素-γ(IFN-γ)。针对两种单启动子驱动的载体(pVAX1-env和pAVX1-gag)都产生强的免疫应答，每种在每一百万脾细胞中产生大约700个点形成细胞(spot-forming Cell，SFC)。由ADVAX1诱导的免疫应答相对明显，针对所检测的Env和Gag肽混合物产生大约600SFC/百万脾细胞(图6)。
总之，该细胞介导的免疫应答定向针对至少九种不同的表位，包括一种被发现对CD8+或CD4+T细胞特异的表位(数据未列出)。没有检测到在ADVAXI的两种基因产物间有免疫原性协同作用或干扰作用。剂量放大实验揭示了明显的剂量-反应效果(图7)。
作为HIV-1疫苗的修饰的牛痘Ankara
目前痘苗病毒是在哺乳动物细胞的细胞质中表达基因的唯一的活载体。重组痘苗病毒已经作为科学工具用于研究防护包括AIDS的特异性感染性疾病所需的免疫应答的类型(Girard(1990)CaccerDetect.Prev.14411-3；Haynes(1996)The Lancet 348933-7；Moss(1996)Pros.Natl.Acad.Sci.USA 9311341-8)。由于痘苗病毒对人有感染性，因此使用活痘苗病毒时所关心的主要问题是它们的安全性。不能在无免疫应答的病人(例如带HIV的患者、血癌患者或正接受化疗的患者)中使用常规的痘苗病毒。为此，已经开发了几种高度减毒的痘苗病毒菌株用作天花疫苗(Paoletti(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9311349-53)。尽管不再需要这些减毒的病毒进行针对天花的免疫，但是它们在人类中的早期应用为指导筛选合适的AIDS疫苗的菌株提供了重要的安全信息。
三种高度减毒的和感染性的基于痘病毒的载体，包括NYVAC、金丝雀痘(Canarypox)(ALVAC)和修饰的牛痘Ankara(MVA)，可用于作为人和兽医药物中重组疫苗的定向应用(例如参见，Moss等，(1996)Adv.Exp.Med.Biol.3977-13)。MVA菌株已应用于大量的疫苗试验和超过120000人的初始免疫的临床实践。甚至在高危患者接受初始免疫时，也没有发现与其使用相关的副作用(Mayr等，(1978)ZBL Bakt Hyg.1Abt.Orig.B 167375-90)。
MVA是宿主范围限制的和高度减毒的痘苗病毒菌株。该MVA菌株已经在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中传代超过570次，由于其基因组中包含六个相对于牛痘WR菌株的重大缺失，MVA菌株已经失去了在大多数哺乳动物细胞系中繁殖的能力(Altenburger等，(1989)Arch.Virol.10515-27；Meyer等，(1991)J.Gen.Virol.711031-8)。该缺失位于病毒基因组两末端的附近，其中的一个缺失影响55K及32K的人类宿主范围基因。进一步分析表明病毒减毒部分由于大约三分之二的宿主范围基因的缺失引起。MVA菌株在禽类细胞中生长良好，但在测试的人类和大多数其它哺乳动物细胞中不能增殖。然而，MVA DNA的复制看起来正常，并在人类细胞中合成早期和晚期的病毒蛋白(Sutter等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910847-51)。
已经证明高度减毒和复制缺陷的重组MVA的免疫原性和保护效力比许多常规痘苗病毒(VV)强。利用感染复数(Multiplicity ofinfection，MOI)为1，该高度减毒株MVA唯一代表能诱导大量IFNα/β(其具有抗病毒作用)的VV。用五种熟知的常规VV菌株以及中国VV菌株TienTan(VVTT)作为重组疫苗不能诱导白细胞IFN(Buttner等，(1995)Vet，Immunol.46237-50)。在小动物中，表达HA-NP基因的重组MVA不但诱导血清IgG抗体、粘膜IgA抗体和强CTL反应，也保护免疫的小鼠的肺免受流感病毒的侵袭，甚至在口服免疫之后也能如此(Bender等，(1996)J.Virol.706418-24)。最重要的是，用SIV/SHIV重组MVA免疫的恒河猴比用SIV重组NYCBH-VV免疫的恒河猴更有可能成为长期不发展者(nonprogressor)(Hirsch等，(1996)703741-52；Amara等，(2001)Science 29269)。这些恒河猴，就象HIV-1感染的人类长期不发展者一样，具有低水平的、伴随持续病毒复制限制的初始血浆病毒血(症)，其与维持正常淋巴细胞亚群和完整的淋巴样结构相关。该结果和先前的有关MVA在人体中的安全性的数据一起暗示了重组MVA在人类AIDS的预防性接种中的重要用途。目前，还没有HIV重组MVA被构建或用于人类HIV-1接种。
原始的MVA插入载体pLW22和pLW7分别靶向MVA基因组的Del II区和Del III区，其从NIH的B.Moss处获得。基于该两种惠赠的载体，产生两种插入载体pZC22和pZC1，其同样靶向Del II区和Del III区。载体pZC1经pLW7修饰而来(图8)。该新插入载体pZC1被构建递送两种外源基因到MVA基因组的Del III区，而不是递送一种外源基因。由于pZC1带有两种不同的启动子，此处不存在潜在启动子竞争的问题。因此，pZC1可以递送env和gag-pol到MVA的Del III区，每种在单独的不同牛痘启动子控制之下，但在同一插入盒中。由于已经证实包膜免疫染色是灵敏的和可靠的，所以可以用env作为替代标志物去筛选gag-pol的存在，其本身很难检测。通过这种方法，对包膜染色呈阳性的细胞也具有整合到基因组上的gag-pol基因。经过多轮富集之后，可以通过western印记确证gag-pol的表达，其比原位免疫染色更灵敏。
如下所述，将HIV-1 env和gag-pol都插入到pZC1中单独的启动子下。通过同源重组将env-gag-pol pZC1插入到野生型MVA的Del III区。通过利用抗Env抗体的免疫染色鉴定重组的env-gag-pol MVA，并通过利用Western印记分析检测Gag-pol的表达进一步确证。因此，两种基因都在双启动子的构建体中进行表达。已经通过利用抗Env抗体的富集/选择进一步增殖了重组的env-gag-pol MVA菌株(“ADMVA1”)。
另一种插入载体(pLW22)经修饰产生pZC22(图9)，其递送外源基因至MVA基因组的Del II区。修饰去除了报告基因。Del II区在DelIII区上游超过120kbp处。理论上，利用pZC1和pZC22载体都可以将多HIV-1基因重组进单一的MVA基因组。
为了将5种HIV-1基因用于DNA接种，构建了称为ADMVA2的第2代ADMVA。将HIV-1 nef-tat基因插入pZC22，并经同源重组将该nef-tat pZC22引入噬斑纯化的ADMVA1的Del II区。通过利用抗Env和抗Nef抗体的双重免疫染色鉴定该重组的ADMVA2。已经通过利用抗Env和抗Nef抗体的选择噬斑纯化了该重组的ADMVA2。
用富集的ADMVA2评估感染后的细胞中五种HIV-1基因产物的表达。已经通过western印记分析确证了全部5种基因的有效表达。另外，已经确定全部5种基因都可从ADMVA2基因组DNA中扩增。序列分析已经确证了插入基因的身份。
ADMVA2的感染力可以达到108-109TCID50/mL，并且病毒很容易地以1∶10的比例扩增。ADMVA2在体外传代6次仍然稳定。除鸡胚胎成纤维细胞外，ADMVA2还可感染人细胞。
实施例提供下列实施例，为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整的公开和描述，并不想限制本发明人认为的其发明的范围。已经努力确保所用数据(例如量、温度等)的准确性，但是，应考虑到某些实验错误和误差。除非另有说明，份数是指重量份数，分子量是指平均分子量，温度是摄氏度，压力是或接近大气压。
实施例1.方案直接ELISA测量免疫动物中抗-HIV-1gag抗体Gag蛋白质-样品-抗小鼠IgG.ALP。用100μl溶于0.1M NaHCO3(pH9.6)溶液中的Gag蛋白质(0.5μg/孔)4℃过夜包被培养板(Immulon-2，Dynex Technologies，Chantilly，VA或Costar EIA/RIA高结合的96孔板9018，Corning Inc.，Corning，NY)。用200μl的PBS洗一次板，加入含5％脱脂奶粉、0.5％6BSA的PBS室温封闭1-2小时。将在封闭缓冲液中的无菌稀释的动物血清或对照加入到培养板中，并在室温温育1小时。用含有0.05％Tween-20的PBS将板洗涤4次。加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(Pharmingen BD，AKP多克隆山羊抗小鼠Ig，Cat#554000，lotM061790)，1∶10000稀释10ml封闭缓冲液中加入1μl的缀合物，并在室温温育板30分钟。用AmpliQ洗涤缓冲液洗4次板。AmpliQ的使用方法如下在每孔中加入100μl的新配制的底物(50μl溶液A+50μl溶液B)，室温作用15分钟。用AmpliQ终止溶液终止反应，并在15分钟内在490nm处读板(AmpliQDAKO Diagnostics Ltd.)。
实施例2.竞争性gp120-sCD4 ELISA方案抗gp120Abs-gp120-sCD4.IgG-抗人IgG.ALP。用溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)溶液中的抗gp120抗体室温过夜包被培养板。用PBS将板洗涤2次，加入含有4％脱脂奶粉、0.5％BSA的PBS室温封闭1小时。混合封闭液，并加入gp120上清，室温作用1小时。用含有Tween-20的PBS将板洗涤4次。加入用封闭缓冲液无菌稀释的sCD4或对照，并在室温温育板1小时。用含有Tween-20的PBS将板洗涤4次。加入固定浓度的sCD4-人IgG，并在室温温育板1小时。用含有Tween-20的PBS将板洗涤4次。加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG，并在室温温育板30分钟。用AMPAK洗涤缓冲液将板洗涤4次。按如下的AMPAK操作方法进行加入100μl的新配制的底物作用20分钟，然后加入100μl的扩增液作用10分钟。用50μl 0.5M的H2SO4终止反应，在492nm处读板。
实施例3.小鼠IFN-γELISpot试验第1天。将ELISpot过滤板进行如下预包被加入用包被缓冲液1∶50稀释的捕捉抗体(如小鼠IFN-γ)(例如在5ml包被缓冲液中加入125μl抗体)。在每孔中放置100μl的捕捉抗体/包被缓冲液，加盖，然后放在4℃温育过夜。
第2天。收获细胞，用PBST接种4块板。每孔用R10(200μl/孔)37℃封闭2小时。根据特定板的计划加入细胞。加入肽，并在CO2培养箱中37℃温育过夜。
第3天。用PBST洗板5次，然后，每孔加入100μl在1％BSA中1∶60稀释的检测抗体。将板4℃温育过夜。
第4天。用PBST洗板4次，然后在每孔加入100μl在1％BSA中1∶60稀释的SAP。将板室温温育2小时，用PBST洗涤4次，然后用ddH2O洗涤1次。每孔中加入100μl底物，然后室温避光温育大约15分钟或直到完全形成。用自来水洗板，彻底干燥，数点。
实施例4.体内免疫原性评估用ELISpot试验如上所述评估针对ADVAXI和II的CMI反应(也参见Hanke等，(1998)J.Gen.Virol 7983-90；Carvalho等，(2001)J.Immunol.Methods 252207-18；Tobery等，(2001)J.Immunol.Methods25459-66；Novitsky等，(2001)J.Virol.759210-28，该出版物此处全文引用以供参考)。
开始用ADVAXI的GLP级贮存物(Aldevron，Fargo，ND)免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。在0周、3周和6周IM给药200μg的疫苗。总共5组、每组6只小鼠，每组进行如下接种p VAX1-nev，p VAX1-gag，p VAX1-nev+p VAX1-gag，p VAX1(对照)和ADVAXI。肽代表如下的特异表位已知诱发CD4+细胞介导的反应的Env34(VPVWKEAKTTLFCASDAKAY)(SEQ ID NO3)，诱发CD8+细胞介导的反应的Env43(RNVSSDGTYNETYNEIKNCS)(SEQ ID NO4)，诱发CD4+细胞介导的反应的Gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)(SEQ ID NO5)和诱发CD8+细胞介导的反应的Gag A-I(AMQMLKDTI)(SEQ ID NO6或2)。
第3次注射两周后处死小鼠。合并每组的脾细胞，用ELISpot测定在用Env和Gag抗原特异性肽混合物(NIH AIDS研究和参考试剂)体外再刺激过程中其分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力。此时，只有来自异源株(HIV96ZM65.8，目录号3993)的Gag肽。类似地，在ELISpot测定时我们没有整套的同源Env肽(HIVCHN.AD，目录号4974，80％完整)。但是，结果表明针对两种单启动子驱动的载体(p VAX1-nev和p VAX1-gag)都有强的免疫应答，每种产生大约700个点形成细胞(spot-formingcells，SFC)/百万脾细胞。由ADVAXI诱导的免疫应答也很明显，大约产生特异性针对所检测的Env和Gag肽混合物的600SFC/百万脾细胞。可断定地，针对p VAX1对照的反应为零，由于脾细胞混合物中缺失CD8+细胞，没有检测到针对GAG A-I的ELISpot反应(图6)。
总之，该细胞介导的免疫应答定向针对至少9种不同的表位，包括被发现特异性针对CD8+或CD4+T细胞的表位(数据未列出)。没有检测到在ADVAXI的两种基因产物之间有免疫原性协同作用和干扰作用的证据。剂量放大试验表明了明显的剂量-反应效果(图7)。对于至少一种表位(Env34)，发现150μg时的ELISpot反应量是5μg时的大约7倍。但是，该剂量-反应趋势对所有检测的表位都是正确的，不管是特异性针对CD4+或CD8+细胞介导的反应。
实施例5.临床前体内免疫原性评估下列数据表明ADVAXI的体内体液免疫原性。在小鼠试验中，在最后(第三次)免疫后两周收集血清样品，用ELISA测试抗-Gag抗体。尽管在用p VAX1-gag接种的小鼠中的滴度最高，在用ADVAXI免疫组中也有较大的滴度，其与接受p VAX1-env+p VAX1-gag的动物中显示的反应相当(图10)。通过western印记也表明在ADVAXI组中收集的血清样本中有针对Env的抗体反应(数据未列或定量)。
用ADVAXII进行了类似的体内研究。具体地，用ADVAXII的GLP-级贮存物(Aldevron，Fargo，ND)免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。在0周、3周和6周IM注射200μg疫苗。每组5只、共5组小鼠，每组进行如下接种p VAX1-pol、p VAX1-nef-tat、p VAX1-pol+pVAX1-nef-tat、p VAX1(对照)和ADVAXII(只有双启动子载体)。第三次注射后两周处死小鼠。然后合并每组的脾细胞，并用ELISpot分析其在用Pol、Tat和Nef衍生的肽混合物体外再刺激过程中分泌干扰素-γ的能力。注意的是在分析中没有分化体C。此处的抗原特异性肽是基于分化体B的共有序列的15聚体(NIH AIDS研究和参考试剂计划Tat目录号5138，Nef目录号5189，和Pol目录号6208)。但是，和ADVAXI试验一样，我们发现单基因载体和双启动子疫苗都有很好的反应。例如，针对Pol混合物的反应最好的是单独的p VAX1-pol(300-800SFC/百万脾细胞，取决于混合物)。对于p VAX1-pol+p VAX1-nef-tat，结果为180-500SFC/百万脾细胞，对于ADVAXII，其反应为180-600SFC/百万脾细胞。针对Tat混合物，对于p VAX1-nef-tat，其反应大约为180SFC，对于p VAX1-pol+p VAX1-nef-tat和ADVAXII都是大约100SFC。利用Nef混合物，对于pVAX1-nef-tat，其反应为30-200SFC，对于p VAX1-pol+p VAX1-nef-tat和ADVAXII都是20-150SFC(图11)。
我们又用ADVAXII进行了剂量放大研究，表明了明显的剂量-反应效果(图12)。在0周、3周和6周给小鼠IM注射5μg、10μg、50μg、100μg或150μg的DNA。在第8周处死小鼠，合并脾细胞，用衍生自分化体B共有序列的肽体外再刺激(再次重申，没有分化体C试剂)。Pol的反应随剂量的升高而升高，从10μg的250-450SFC到100μg的500-700SFC。(150μg时的反应与100μg时的类似)。Nef的反应范围为大约20SFC至大约200SFC，Tat的反应在大约25至大约100SFC之间。
进行初始-加强疫苗方案的全部计划如下将ADVAXI和ADVAXII联合作为初始免疫组分，重组的MVA载体组成加强免疫的组分。因此将ADVAXI+II一起给药作为联合接种物进行体外试验。在0周、3周和6周对各组小鼠IM注射5μg、10μg、50μg、100μg或150μg的ADVAXI+II。对照组注射pVAX1-gag、pVAX1-env、pVAX1-pol和pVAX1-nef-tat各50μg的混合物。在最后的免疫之后两周，处死小鼠，将每组的脾细胞合并，用ELISpot测定干扰素-γ的释放。用包含CD4+和CD8+T细胞表位的Env、Gag和Pol特异性肽进行体外再刺激，同样用自体亚型CTat和Nef序列进行体外再刺激。如在单独的ADVAXI和ADVAXII试验中看到的结果一样，联合接种物也对两种载体显示比较好的反应。用ADVAXI+II接种的小鼠针对所有试验的肽(肽混合物)具有抗原特异性反应，并且该反应是以剂量依赖的方式诱导的(表1)。引人注意的是，在该试验中发现用亚型C衍生的Nef和Tat肽混合物体外再刺激的脾细胞上的反应特别强烈，相反，在ADVAXII试验中发现的反应较轻微。这种差异可能是由于异体和自体蛋白质之间的差异造成的。因此，我们相信，在ADVAXII中的nef-tat融合基因实际上可以诱导非常有效的免疫应答。另外，联合接种试验表明用干扰素-γELISpot测量在不同的抗原特异性反应中没有检测到干扰。因此我们可得到结论可以认为ADVAXI+II可以进一步临床开发为针对HIV-1的初步-加强疫苗策略中的初步免疫的组分。
表1.针对联合接种物和对照的抗原特异性干扰素-γELISpot反应疫苗 IFN-γ点形成细胞(SFC)/106脾细胞(剂量)Gag 26 Gag A-I Env 34 Env T-I Pol 223 Pol YLI Pol VGI Tat pool Nef pool1 Nef pool2pVAX1-gag+pVAX1-env+pVAX1-pol+pVAX1-nef-tat 120 150 350 700 70 500 500 110400 300(每种50μg)ADVAXI+II 112 252 400 700 117 700 830 120225 370(150μg+150μg)ADVAXI+II 70 210 400 600 100 550 500 70 200 330(100μg+100μg)ADVAXI+II 30 100 220 500 84 400 420 50 140 160(50μg+50μg)ADVAXI+II 30 60 180 250 70 275 375 30 110 140(10μg+10μg)ADVAXI+II 10 30 110 180 60 250 370 20 70140(5μg+5μg)注针对两种细胞输入水平归一化每百万脾细胞的点数，并根据双孔将每种样品和抗原进行平均。
Gag 26、Env 34和Pol 223包含CD4表位，而Gag A-I、Env T-I、Pol YLI和Pol VGI包含CD8表位。用于Tat和Nef的肽混合物衍生自自体亚型C序列。
序列表<110>Huang，YaoxingChen，ZhiweiHo，David<120>针对HIV-1的免疫方法和组合物<130>2570-1-003P<160>22<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>1Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Ala Val Phe Val Ser Ala Arg20<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>2Ala Met Gly Met Leu Lys Asp Thr Ile1 5<210>3<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>3Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Lys Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp1 5 10 15Ala Lys Ala Tyr20<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>4Arg Asn Val Ser Ser Asp Gly Thr Tyr Asn Glu Thr Tyr Asn Glu Ile1 5 10 15Lys Asn Cys Ser20<210>5<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>5Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp lle1 5 10 15Ile Leu Gly Leu20<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>片段<400>6Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile1 5<210>7<211>2520<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60agcgccgccg agaacttgtg ggtgaccgtg tactacggcg tgcccgtgtg gaaggaggcc120aagaccaccc tgttctgcgc ctccgacgcc aaggcctacg agaaggaggt gcacaacgtg180tgggccaccc acgcctgcgt gcccaccgac cccaaccccc aggagatggt gttggagaac240gtgaccgaga acttcaacat gtggaagaac gacatggtga accagatgca cgaggacgtc300atcagcttgt gggaccagag cctgaagccc tgcgtgaagt tgacccccct gtgcgtgacc360ttggagtgca ggaacgtgag cagcaacggc acctacaacg agacctacaa cgagatcaag420aactgctcct tcaacgccac caccgtgttg agggacagga agcagaccgt gtacgccctg480ttctacaggc tggacatcgt gcccctgaac aagaagaact ccagcgagaa ctccagcgag540tactacaggt tgatcaactg caacacctcc gccatcaccc aggcctgccc caaggtgacc600ttcgacccca tccccatcca ctactgcacc cccgccggct acgccatcct gaagtgcaac660gacaagacct tcaacggcac cggcccctgc cacaacgtga gcaccgtgca gtgcacccac720ggcatcaagc ccgtggtgtc cacccagctg ctgttgaacg gcagcctggc cgagagggag780atcatcatca ggtccgagaa cctgaccaac aacgtgaaga ccatcatcgt gcacctgaac840cagtccgtgg agatcgtgtg caccaggccc aacaacaaca ccaggaagag catcaggatc900ggccccggcc agaccttcta cgccaccggc gacatcatcg gcgacatcag gcaggcccac960tgcaacatca gcaaggacaa gtggaaggag accttgcaga gggtgggcaa gaagttggcc 1020gagcacttcc ccaacaagac catcgagttc gcctcctcct ccggcggcga cctggagatc 1080accacccaca gcttcaactg caggggcgag ttcttctact gcaacacctc cagcctgttc 1140aacggcacct acatgcccaa cggcaccgag ggcaactcca gctccatcat caccatcccc 1200tgcaggatca agcagatcat caacatgtgg caggaggtgg gccgcgccat gtacgccccc 1260cccatcgagg gcaacatcac ctgcaagtcc aacatcaccg gcctgctgtt ggtgcgcgac 1320ggcggcaagg agaccaacga caccgagacc ttcaggcccg gcggcggcga catgagggac 1380aactggagga gcgagttgta caagtacaag gtggtggaga tcaagccctt gggcatcgcc 1440cccaccgccg ccaagaggag ggtggtggag agggagaaga gggccgtggg catcggcgcc 1500gtgttcctgg gcttcctggg cgccgccggc agcaccatgg gcgccgccag catcaccctg 1560accgtgcagg cccgccagct gctgagcggc atcgtgcagc agcagagcaa cctgctgcgc 1620gccatcgagg cccagcagca cctgctgcag ctgaccgtgt ggggcatcaa gcagctgcag 1680acccgcgttc tggccatcga gcgctacctg aaggaccagc agctgctggg catctggggc 1740tgcagcggca agctgatctg caccaccgcc gtgcactgga acagcagctg gagcaaccgc 1800agccaggagg agatctggaa caacatgacc tggatgcagt gggaccgcga gatcagcaac 1860tacaccaaca ccatctaccg cctgctggag gacagccaga accagcagga gcgcaacgag 1920aaggacctgc tggccctgga caactggaag aacctgtgga gctggttcga catcaccaac 1980tggctgtggt acatccgcat cttcatcatg atcgtgggcg gcctgatcgg cctgcgcatc 2040atcttcgccg tgctgagcat cgtgaaccgc gtgcgccagg gctacagccc cctgagcttc 2100cagaccctga cccccaaccc cggcggcccc gaccgcctgg gccgcatcga ggaggagggc 2160ggcgagcagg acaagaaccg cagcatccgc ctggtgaacg gcttcctggc cctggcctgg 2220gacgacctgc gcaacctgtg ccgcttcagc taccacctgc tgcgcgacct gctgctgatc 2280gtggcccgca tcgtggagct gctgggccgc cgcggctggg aggccctgcg ctactggtgg 2340aacctgctga agtactgggt gcaggagctg aagaacagcg ccgtgagcct gctgaacgcc 2400accgccatcg ccgtggccga gggcaccgac cgcgtgatcg aggtggtgca gggcgcctac 2460cgcgccatcc tgcacatccc ccgccgcatc cgccagggct tcgaggccgc cctgcagtaa 2520<210>8<211>839<212>PRT<213>人<400>8Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Ala Val Phe Val Ser Ala Ala Glu Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr20 25 30Gly 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Lys Lys Lys Val305 310 315 320Glu Ser Lys Thr Lys Thr Asp Pro Phe Asp325 330
权利要求
1.包含两个启动子的核酸载体。
2.权利要求1的核酸载体，其中启动子是pCMV和人延伸因子1α(hEF1α)。
3.权利要求2的核酸载体，其包含至少两种核酸序列，其中每种在不同启动子的控制之下。
4.权利要求3的核酸载体，其中核酸序列是HIV-1核酸序列。
5.权利要求4的核酸载体，其中HIV-1核酸序列是env和gag。
6.权利要求5的核酸载体，其中HIV-1核酸序列进一步包含异源前导序列。
7.权利要求6的核酸载体，其中前导序列是tPA(SEQ ID NO1)。
8.权利要求5的核酸载体，其中HIV-1序列是tPA-env(SEQ ID NO7)。
9.权利要求5的核酸载体，其中HIV-1序列是tPA-gag(SEQ ID NO9)。
10.权利要求4的核酸载体，其包含SEQ ID NO15的核酸序列。
11.包含权利要求10的核酸载体的DNA疫苗。
12.权利要求4的核酸载体，其中HIV-1核酸序列是pol、nef和tat或其融合序列。
13.权利要求12的核酸载体，其中HIV-1核酸序列进一步包含异源前导序列。
14.权利要求13的核酸载体，其中前导序列是tPA(SEQ ID NO1)。
15.权利要求12的核酸载体，其中HIV-1 pol序列是SEQ ID NO11的序列。
16.权利要求5的核酸载体，其中nef和tat是包含SEQ ID NO13序列的融合nef-tat序列。
17.权利要求12的核酸载体，其包含SEQ ID NO16的核酸序列。
18.包含权利要求17的核酸载体的DNA疫苗。
19.包含两种核酸载体的组合物，其中每种载体包含两个启动子，每一个启动子都控制一种HIV-1基因的表达。
20.权利要求19的组合物，其中一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV-1基因gag和env，另一种核酸载体包含pCMV启动子和hEF1α启动子，以及HIV基因pol、nef和tat。
21.权利要求20的组合物，其包含SEQ ID NO15和16。
22.修饰的牛痘Ankara(MVA)载体，其包含至少三种插入到MVADelIII区的核酸序列，其中每一种核酸序列都在单独的启动子控制之下。
23.权利要求22的修饰的MVA载体，其中核酸序列是HIV-1序列env、gag和pol或其融合序列。
24.权利要求23的修饰的MVA载体，其中核酸序列是SEQ ID NO17和SEQ ID NO19。
25.权利要求24的修饰的MVA载体，其进一步包含HIV-1 nef-tat融合序列。
26.权利要求25的修饰的MVA载体，其中HIV nef-tat序列是SEQ IDNO21。
27.治疗有患HIV相关疾病危险的人类受试者的方法，其包含给予包含含SEQ ID NO15的一种核酸和含SEQ ID NO16的另一种核酸的核酸。
28.权利要求27的方法，其进一步包含给予包含SEQ ID NO17、19和21的修饰的牛痘Ankara载体。
29.权利要求27的方法，其进一步包含给予权利要求26的修饰的牛痘Ankara载体。
30.防护有患HIV-1相关疾病危险的人类受试者的方法，其包含给予包含含SEQ ID NO15的一种核酸和含SEQ ID NO16的另一种核酸的DNA疫苗。
31.权利要求30的方法，其进一步包含给予包含SEQ ID NO17、19和21的修饰的牛痘Ankara载体。
32.权利要求30的方法，其进一步包含给予权利要求26的修饰的牛痘Ankara载体。
33.改善患HIV-1相关疾病的受试者中HIV-1相关疾病的方法，其包含给予包含含SEQ ID NO15的一种核酸和含SEQ ID NO16的另一种核酸的DNA疫苗。
34.权利要求33的方法，其进一步包含给予包含SEQ ID NO17、19和21的修饰的牛痘Ankara载体(ADMVA2)。
35.权利要求33的方法，其进一步包含给予权利要求26的修饰的牛痘Ankara载体。
36.用于对人类受试者提供针对HIV-1感染的防护的试剂盒，其包含包括SEQ ID NO15的序列的一种核酸载体、包括SEQ ID NO16的序列的另一种核酸载体和包括SEQ ID NO17、19和21的加强牛痘疫苗以及进一步包含使用说明。
全文摘要
本发明提供了用于治疗有患HIV相关疾病危险或正患有HIV相关疾病的受试者的核酸分子。本发明包括两条初始的核酸分子ADVAXI和ADVAXII，以及加强牛痘核酸分子ADMVA2。本发明还包括用于治疗和/或防护HIV相关疾病的方法，对患有HIV相关疾病或有患HIV相关疾病危险的受试者接种的方法，以及包含本发明的核酸疫苗的试剂盒。
文档编号C12N5/00GK1490056SQ0215489
公开日2004年4月21日 申请日期2002年12月3日 优先权日2002年10月18日
发明者Z·陈, Y·黄, D·D·霍, Z 陈, 霍 申请人:阿隆戴蒙德艾滋病研究中心