专利名称：壳寡糖在制备预防动脉粥样硬化形成的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗动脉粥样硬化的药物，具体地说是壳寡糖在制备预防动脉粥样硬 化形成的药物中的应用，进一步说是壳寡糖在制备治疗细菌性感染及炎症因子所致动脉粥 样硬化的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
动脉粥样硬化系指由脂质、碳水化合物、血液成份的灶状沉积、结缔组织和钙沉积 所致，并伴有动脉中膜改变的联合病变。讫今，动脉粥样硬化已成为威胁西方发达国家人体 生命安全的主要疾病。随着我国生活水平的提高和饮食习惯的改变，动脉粥样硬化亦成为 影响国人机体健康的重要原因。据卫生部公布的生命统计资料显示，我国每年的总死亡人 数中约有1/3为心脑血管疾病患者，而几乎所有的心脑血管疾病均因动脉粥样硬化所致或 与之有关。因此，有效预防、治疗动脉粥样硬化疾病的发生、发展及转归，将是改善人类生活 质量所面临的迫切任务之一。动脉粥样硬化是一种多因素参与的复杂疾病，其发病机制尚未完全明了。大量人 及动物的病理生理观察多支持炎症反应学说，认为动脉粥样硬化病变始于血管内皮细胞受 损和/或由此引起的免疫细胞趋化，最终导致血管内皮功能不良。体外研究及动物学实 验表明，外源性刺激致血管内皮细胞受损后，后者将表达多种粘附分子(VCAM-1、ICAM-1、 MCP-1等)，介导单核细胞和T细胞的滚动、粘附、迁移和积聚，最终通过发生局部的炎症 反应以作为代偿性保护；另一方面，血管内皮细胞及趋化的免疫细胞将分泌致炎因子如 TNF-a、IL-6、IL_8等，进一步促进炎症反应的进程，最终演变为慢性炎症，并导致病理性斑 块的形成。此外，对动脉粥样硬化患者的病检亦发现，其血管粥样斑中多沉积有大量免疫细 胞(主要为单核细胞及T淋巴细胞)及相关炎性因子，此结果进一步提示，免疫系统及炎症 因子是动脉粥样硬化形成的主导因素。基于上述研究可知内皮功能障碍、免疫细胞趋化、 炎症反应发生及其相互之间形成的调节网络可能在动脉粥样硬化的发生、发展中起主导作 用。由上可见，炎症因子既是动脉粥样硬化发生的必要条件，又是动脉粥硬化形成的必然结^ o目前，抗动脉粥样硬化新药的研究进展迅速，临床一线的抗动脉粥样硬化药物的 作用机制主要包括消除、控制诱发因素；防治动脉粥样硬化的并发症；防止炎症的形成等 方面。常用的抗动脉粥样硬化药物主要包括调血脂类、抗氧化剂、降血压类等。研究证实， 壳寡糖具有抗氧化、降血脂、降低血糖、调节血压、改善消化机能等诸多功能，而针对壳寡糖 抗动脉粥样硬化作用的研究，国内外文献均无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供壳寡糖在制备预防动脉粥样硬化的药物中的应用，进一步 提供壳寡糖在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用；壳寡糖能够抑制动脉粥样硬化的形 成通过作用于人脐静脉内皮细胞，抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞内IL-8、IL-6及相关炎症因子的表达；抑制TNF-a诱导的人脐静脉内皮细胞内VCAM-1、ICAM-1及相关粘附 分子家族成员的表达；抑制TNF-a诱导的人脐静脉内皮细胞与人单核细胞的粘附，从而抑 制动脉粥样硬化的形成。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为壳寡糖在制备预防动脉粥样硬化形成的药物中的应用。所述壳寡糖可通过抑制血管内皮细胞内IL-8、IL-6、VCAM_1及ICAM-1等炎症介质 的表达而抑制炎症因子对血管内皮细胞的损伤，即壳寡糖可进一步用于制备治疗动脉粥样 硬化的药物中；所述治疗动脉粥样硬化的药物为治疗细菌性感染及炎症因子所致动脉粥样 硬化的药物。所述壳寡糖的糖链聚合度在1-10之间，其中以聚合度为2-6的寡糖效果最佳；各 寡糖脱脱乙酰度在0-95%之间，其中以脱乙酰度为85-95%的寡糖效果最佳；所述壳寡糖 于患处体液中的有效作用浓度为10-400 y g/ml。所述壳寡糖与药物学上可接受的药物辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂、粉剂、 针剂或水剂。在使用时可采取口服、皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生 理盐水、葡萄糖、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。本发明的优点为1、所述壳寡糖具有促进免疫细胞的增殖(Jiangli Dou, Chengyu Tan, Yuguang Du, Xuefang Bai, Keyi Wang, Xiaojun Ma. Effects of chitooligosaccharides on rabbit neutrophils in vitro. Carbohydrate Polymers 2007 ;69 :209_213.)、{呆护内皮 细胞的氧化性损伤(Hong-Tao Liu, Wen-Ming Li, Gang Xu, Xiu-Ying Li, Xue-Fang Bai, Pengffei, Chao Yu, Yu—Guang Dua. Chitosan oligosaccharides attenuate hydrogen peroxide-induced stress injury in human umbilical vein endothelial cells. Pharmacological Research 2009 ；59 :167-175.)、抑制肿瘤血管的生成、保护肝脏细胞免 受异源性刺激的损伤等功能。与现有抗动脉粥样硬化药物相比，壳寡糖可长期服用，且在药 用剂量范围内无明显毒副作用，同时兼有降低血糖、调节血脂、降低血压、提高机体免疫力 等多种功效。2、根据实施例2 实验证明，壳寡糖能够显著抑制由脂多糖诱导的人脐静脉内皮 细胞内IL-8及IL-6的转录。壳寡糖有效作用浓度在10-400 u g/ml，其中对IL-8的最大抑 制率为75. 3%，对IL-6的最大抑制率为74. 6%。3、根据实施例3 实验证明，壳寡糖能够显著抑制由脂多糖诱导的人脐静脉内皮 细胞内IL-8及IL-6的蛋白表达。壳寡糖有效作用浓度在10-400 y g/ml，其中对IL-8的最 大抑制率为43. 8%，对IL-6的最大抑制率为48. 2%。因此，壳寡糖具有抑制细菌性感染所 致血管内皮细胞损伤的潜在作用，有望开发成抗动脉粥样硬化相关的药物及与抗动脉粥样 硬化有关的保健食品和/或食品添加剂等。4、根据实施例4 实验证明，壳寡糖能够显著抑制由TNF-a诱导的人脐静脉内皮 细胞内VCAM-1及ICAM-1的转录。壳寡糖有效作用浓度在10-400 u g/ml，其中对VCAM-1的 最大抑制率为35. 4%，对ICAM-1的最大抑制率为53. 8%。5、根据实施例5 实验证明，壳寡糖能够显著抑制由TNF-a诱导的人脐静脉内
4皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达。壳寡糖有效作用浓度在10-400 y g/ml，其中对 VCAM-1的最大抑制率为44. 8%，对ICAM-1的最大抑制率为54. 1%。根据本发明实验结论， 壳寡糖可通过抑制血管内皮细胞中VCAM-1及ICAM-1的表达而减轻炎症因子对血管内皮的 损伤，有望研制开发成为更高效的抗动脉粥样硬化形成的药物。6、根据实施例6 实验证明，壳寡糖可显著抑制经TNF-a诱导的人脐静脉内皮细 胞与单核细胞的粘附。由本发明实验结论可知，壳寡糖能抑制免疫细胞向受损血管内皮细 胞的粘附、趋化，从而抑制了炎症反应的过度发生，有望开发成与抗动脉粥样硬化相关的免 疫调节剂。
图1.壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6的转录抑制作用。Control 正 常对照组；LPS 脂多糖模型组；壳寡糖-1 壳寡糖预保护组1 (50 u g/ml)；壳寡糖-2 壳寡 糖预保护组2 (100 u g/ml)；壳寡糖-3 壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。具体实验方案详见 实施例2。图2.壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6的蛋白表达抑制作用。Control 正常对照组；LPS 脂多糖模型组；壳寡糖-1 壳寡糖预保护组1 (50 u g/ml)；壳寡糖-2 壳 寡糖预保护组2 (100 u g/ml)；壳寡糖-3 壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。具体实验方案详 见实施例3。图3.壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的转录抑制作用。Control 正常对照组；TNF-a :TNF-a模型组；壳寡糖-1 壳寡糖预保护组1 (50g/ml)；壳寡糖_2 壳寡糖预保护组2 (100 u g/ml)；壳寡糖-3 壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。具体实验方案 详见实施例4。图4.壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达抑制作用。 Control 正常对照组；TNF-a :TNF-a模型组；壳寡糖-1 壳寡糖预保护组1 (50 y g/ml)； 壳寡糖_2 壳寡糖预保护组2 (100 u g/ml)；壳寡糖-3 壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。具 体实验方案详见实施例5。图5.壳寡糖对TNF- a (20ng/ml)诱导的人脐静脉内皮细胞内NF_ k B表达抑制的 免疫荧光分析。(A)空白对照组(Blank组)的免疫荧光谱图；(B)正常对照组(Control组) 的免疫荧光谱图；(C)TNF-a模型组的免疫荧光谱图；(D)壳寡糖预保护组(100 y g/ml)的 免疫荧光谱图。具体实验方案详见实施例6。
具体实施例方式动脉粥样硬化疾病的形成是由病理、生理、生化等多因素综合作用的结果，而炎性 因子刺激所致的血管内皮损伤则是其发生、发展的前奏。研究证实，炎症反应时，单核细胞 等免疫细胞首先通过胞膜上的粘附分子配体与受损血管内皮细胞上的粘附分子结合，并进 一步分泌TNF-a、IL-8、IL-6, IL_1 0等多种因子，最终导致动脉粥样硬化的形成。因此， 如何通过抑制单核细胞的粘附及炎症因子的表达以达到抗动脉粥样硬化的目，已成为当前 心血管疾病防治中的热点问题。壳寡糖具有良好的生物相容性及可降解性，有望被开发成 一种有效、安全的抗动脉粥样硬化的药物、保健食品或食品添加剂。
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本发明采用脱乙酰度> 95的壳寡糖，经细胞生物学方法研究发现，壳寡糖可明显 抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6的表达，亦可明显抑制TNF-a诱导 的人脐静脉内皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的表达，并能抑制人脐静脉内皮细胞与单核细胞 的粘附。说明壳寡能够通过抑制血管内皮细胞内炎症因子的表达而抑制动脉粥样硬化的形 成。参照 文献(Alison R. Hunter and Anthony J. Turner. Expression and localization of endothelin-converting enzyme-1 isoforms in human endothelial cells, inhibitors. Exp Biol Med, 2006 ；231 :718_722.)，人脐静脉内皮细胞的培养条件 为在完全培养基DMEM-F 12(Gibco，Grand Island, USA)培养液中添加10%胎牛血清、 30 u g/ml内皮生长因子添加剂、100U/ml青霉素、100 y g/ml链霉素；于37°C，5% C02条件 下培养。实验前先以含胎牛血清的培养基预孵育24h。实施例1壳寡糖以水剂形式给药，药液配制的具体操作如下①准确称取5mg壳寡糖，溶 于5ml含胎牛血清的DMEM-F12培养基中，形成终浓度为lmg/ml的壳寡糖药液；②用 0. 22 yM孔径的针式滤器对前述药液进行抽滤处理，即为无菌的壳寡糖贮存液；③将上述 贮存液分装后，于_80°C保存，以用于下述实施例中。实施例2壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6的转录抑制分析。主要操作如下 ①实验共分5组(图1)，即正常细胞培养组(Control)、脂多糖模型组、壳寡糖预保护组 1 (50 u g/ml)、壳寡糖预保护组2 (100 u g/ml)及壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。②用质量 浓度0. 125%的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，并按2X 106/瓶接种于25ml 培养瓶中，每瓶加入细胞悬液的总体积为4ml。③将培养瓶放入细胞培养箱中，5% C02, 37°C，培养24h。④取出培养瓶，弃上清后，Control组及脂多糖组分别加入3ml新鲜的 DMEM-F12培养基(Gibco, Grand Island, USA)；各壳寡糖预保护组分别加入含50、100及 200 u g/ml壳寡糖的DMEM-F12培养基，继续培养24h。⑤取出培养瓶，弃上清后，Control组 加入3ml新鲜的DMEM-F12培养基，其余各组分别加入含脂多糖(lOOng/ml)的DMEM-F12培 养基，继续培养4h。⑥取出培养瓶，进行RNA抽提处理，并使用商业化试剂盒(杭州博日技 术有限公司，浙江)对抽提得到的总RNA进行逆转录及PCR扩增分析，以检测IL-8及IL-6 的转录表达变化。图1结果表明，脂多糖可显著上调人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6在转录水平 的表达，而壳寡糖在50-200 y g范围内对IL-8及IL-6的转录表达具有明显的抑制作用，且 壳寡糖在100 y g/ml时的预保护效果最佳。实施例3壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内IL-8及IL-6的蛋白表达抑制分析。主要操作如 下①实验共分5组(图2)，即正常细胞培养组(Control)、脂多糖模型组、壳寡糖预保护 组1 (50 u g/ml)、壳寡糖预保护组2 (100 u g/ml)及壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。②用质 量浓度0. 125%的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，并按5X 103/孔的密度将细 胞接种于96孔中，每组重复5孔，每孔加入细胞悬液的体积为150 yl。③将培养板放入细 胞培养箱中，5% C02，37°C，培养24h。④取出培养板，弃上清后，Control组及脂多糖组分别加入150 u 1新鲜的DMEM-F12培养基；各壳寡糖预保护组分别加入150 yl含50、100及 200 u g/ml壳寡糖的DMEM-F12培养基，继续培养24h。⑤取出培养板，弃上清后，Control 组加入100 ill新鲜的DMEM-F12培养基，其余各组分别加入100 yl含脂多糖(lOOng/ml) 的DMEM-F12培养基，继续培养4h。⑥取出培养板，收集各孔中的上清液，采用商业化试剂盒 (R&D Systems Inc,Minneapolis,USA)检测各样品中的 IL-8 及 IL-6 浓度，以分析 IL-8 及 IL-6的蛋白表达变化。图2的结果表明，脂多糖可显著上调人脐静脉内皮细胞中IL-8及IL-6的分泌，而 壳寡糖在50-200 y g范围内对IL-8及IL-6的蛋白分泌具有明显的抑制作用，且壳寡糖在 100 u g/ml时的抑制作用最佳。实施例4壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的转录抑制分析。主要操作如 下①实验共分5组(图3)，即正常细胞培养组(Control)、TNF-a模型组、壳寡糖预保护 组1(50 y g/ml)、壳寡糖预保护组2(100 y g/ml)及壳寡糖预保护组3 (200 y g/ml)。②用 质量浓度为0. 125%的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，并按2X106/瓶接种 于25ml培养瓶中，每瓶加入细胞悬液的总体积为4ml。③将培养瓶放入细胞培养箱中，5% C02，37°C，培养24h。④取出培养瓶，弃上清后，Control组及TNF- a组分别加入3ml新鲜的 DMEM-F12培养基；各壳寡糖预保护组分别加入含50、100及200 u g/ml壳寡糖的DMEM-F12 培养基，继续培养24h。⑤取出培养瓶，弃上清后，Control组加入3ml新鲜的DMEM-F12培 养基，其余各组分别加入3ml含TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培养基，继续培养4h。⑥取 出培养瓶，进行RNA抽提处理，并使用商业化试剂盒(杭州博日技术有限公司，浙江)对抽 提得到的总RNA进行逆转录及PCR扩增分析，以检测VCAM-1及ICAM-1的转录表达变化。图3结果表明，TNF-a可显著上调人脐静脉内皮细胞中VCAM-1及ICAM-1的转录； 壳寡糖在50-200 y g范围内对VCAM-1及ICAM-1的转录具有明显的抑制作用，且壳寡糖在 100 u g/ml时的抑制作用最佳。实施例5壳寡糖对人脐静脉内皮细胞内VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达抑制分析。主要操作 如下①实验共分5组(图4)，即正常细胞培养组(Control)、TNF-a模型组、壳寡糖预保 护组1 (50 u g/ml)、壳寡糖预保护组2 (100 u g/ml)及壳寡糖预保护组3 (200 u g/ml)。②用 质量浓度为0. 125%的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，并按2X106/瓶接种 于25ml培养瓶中，每瓶加入细胞悬液的总体积为4ml。③将培养瓶放入细胞培养箱中，5% C02，37°C，培养24h。④取出培养瓶，弃上清后，Control组及TNF- a组分别加入3ml新鲜的 DMEM-F12培养基；各壳寡糖预保护组分别加入含50、100及200 u g/ml壳寡糖的DMEM-F12 培养基，继续培养24h。⑤取出培养瓶，弃上清后，Control组加入3ml新鲜的DMEM-F12培 养基，其余各组分别加入3ml含TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培养基，继续培养4h。⑥ 取出培养瓶，进行蛋白抽提处理，并对抽提得到的细胞总蛋白进行Western blot分析(抗 VCAM-1 及 ICAM-1 人源化抗体购自 Santa Cruz Biotechnology, CA, USA。显影方式为 ECL 化学发光法)，以检测VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达变化。图4结果表明，TNF-a可显著上调人脐静脉内皮细胞中VCAM-1及ICAM-1的蛋白 表达；壳寡糖在50-200 ii g范围内对VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达具有明显的抑制作用，且壳寡糖在lOOy g/ml时的抑制作用最佳。实施例6人脐静脉内皮细胞与人单核细胞(U937)的粘附实验。主要操作如下①实验共 分4组(图5)，即空白对照组(Blank)、正常细胞培养组(Control)、TNF-a模型组及壳寡 糖预保护组(100y g/ml)。②用质量浓度为0. 125%的胰蛋白酶消化单层培养的人脐脉内 皮细胞细胞，并按5 X 103/孔的密度将细胞接种于96孔暗培养板中，每组重复5孔，每孔加 入细胞悬液的体积为150 iU (空白对照组加入150 u 1培养基)。③将培养板放入细胞培 养箱，5% 0)2，37°0，培养2411。④取出培养板，弃上清后，Blank组、Control组及TNF-a 组分别加入150 u 1新鲜的DMEM-F12培养基；壳寡糖预保护组加入150 yl含100 u g/ml 药物的DMEM-F12培养基，继续培养24h。⑤取出培养板，弃上清后，Blank组及Control组 各加入100 u 1新鲜的DMEM-F12培养基，TNF- a组及壳寡糖预保护组分别加入100 yl含 TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培养基，继续培养6h。⑥取出培养板，吸弃上清，每孔加入 4X104个荧光标记的单核细胞，培养lh后，于荧光显微镜下进行拍照。由图5可知空白对照组未检测到荧光；正常对照组可检测到较低的荧光；TNF- a 模型组的荧光显著增强；壳寡糖预保护组的荧光强度介于正常对照组与TNF-a模型组之 间。上述结果表明，TNF-a可诱导人脐静脉内皮细胞与人单核细胞的粘附，而壳寡糖可逆 转TNF-a的诱导作用。总之，本发明将壳寡糖用于制备预防动脉粥样硬化形成的药物中；壳寡糖可通过 抑制血管内皮细胞内白介素_8 (IL-8)、白介素-6 (IL-6)、血管细胞粘附分子(VCAM-1)、细 胞间粘附分子(ICAM-1)及其它相关炎症因子的表达而抑制炎症因子对血管内皮细胞的损 伤，即壳寡糖可进一步用于制备治疗动脉粥样硬化的药物中。本发明以脂多糖(脂多糖) 及人源化基因重组肿瘤坏死因子-a (TNF-a)为诱导因子，以人脐静脉内皮细胞为研究 对象，结果表明①壳寡糖能显著抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞内IL-8、IL-6及相 关炎症因子的表达；②壳寡糖能显著抑制TNF-a诱导的人脐静脉内皮细胞的膜表面分子 VCAM-1、ICAM-1及相关粘附分子家族成员的表达。③壳寡糖能显著抑制TNE-a诱导的人 脐静脉内皮细胞与人单核细胞的粘附。
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权利要求
壳寡糖在制备预防动脉粥样硬化形成的药物中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于壳寡糖可进一步用于在制备治疗动脉粥 样硬化的药物中。
3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述治疗动脉粥样硬化的药物为治疗细 菌性感染及炎症因子所致动脉粥样硬化的药物。
4.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于壳寡糖可通过抑制血管内皮细胞内 IL-8、IL-6、VCAM-1、ICAM-I等相关炎性因子的表达，并能抑制血管内皮细胞与人单核细胞 的粘附，从而抑制炎症因子对血管内皮细胞的损伤。
5.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳寡糖的糖链聚合度在1-10之 间，各寡糖脱乙酰度为0-95%。
6.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳寡糖的糖链聚合度为2-6，各 寡糖脱乙酰度为85-95%。
7.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物中的壳寡糖于患处体液中 的有效作用浓度为10-400 μ g/ml。
8.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳寡糖与药物学上可接受的药 物辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂、粉剂、针剂或水剂。
全文摘要
本发明涉及治疗动脉粥样硬化的药物，具体地说是壳寡糖在制备预防动脉粥样硬化形成的药物中的应用；本发明以脂多糖(脂多糖)及人源化基因重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为诱导因子，以人脐静脉内皮细胞为研究对象，结果表明①壳寡糖能显著抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞内IL-8、IL-6及相关炎症因子的表达；②壳寡糖能显著抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞的膜表面分子VCAM-1、ICAM-1及相关粘附分子家族成员的表达。③壳寡糖能显著抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞与人单核细胞的粘附。
文档编号A61K31/722GK101849958SQ200910010979
公开日2010年10月6日 申请日期2009年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者刘启顺, 刘洪涛, 杜昱光, 白雪芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所