专利名称：人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法
技术领域：
本发明涉及医用组织结构检测标本提取的方法，特别是涉及一种应用“活体冷冻 技术-IVCT”人工提取活体器官组织超微结构及蛋白分布标本的方法。
背景技术：
上世纪九十年代末，Ohno S等建立了“活体冷冻技术”(in vivocryotechnique-以 下简称IVCT)的理论和方法。即在活体冷冻装置VI-Il ;Eiko Engineer Co. Ibaraki， Japan)上，采用异戊烷-丙烷混合冷冻剂，在_193°C下结合液态氮和冷冻置换等方法，瞬间 捕获活体鼠肾脏超微组织结构标本的方法。采用此项技术提取的活体鼠肾脏内的所有生物 进程被即刻停止，随后进行冷冻置换；此时结构组织中的水分子几乎同时冻结，形成无数个 极小的冰晶(约20nm3)，达到无定形微晶态或玻璃态，不会对细胞和组织造成传统方法制取 的损伤，能够原位保持其所有的结构与成分，并在含有固定液的无水有机溶液中使已冷冻 的细胞和组织内的某些物质成分被快速交联，限制可溶性分子的弥散，原位保留了某些暴 露的抗原位点。冷冻速度快(几毫秒 1秒)，能够捕捉细胞结构瞬间完成的生理过程，并 以大于104K/s的冷冻速率将生物组织固化至玻璃态或近似玻璃态，使生物组织的超微组织 结构和各种组份得到可信的保存。一定厚度的组织(约20-30 μ m)用IVCT冷冻固定法在 Ims左右的时间内能够被完全固定，其超微组织结构能得到极佳的保存。之后的冷冻置换可 以从-80°C (以往置换环境是_25°C )，开始逐渐置换组织标本中的水分子，此时标本的生理 活动基本上是处于停止状态，随着温度的上升，置换标本中水分子的速度加快，当标本的生 理活动随着温度的上升开始恢复时，标本中水分已经减少许多；温度上升至-20°C时，低温 置换的有机溶剂中所含的固定成分开始对标本进行二次固定和进一步脱水，直至标本温度 上升至室温，固定和脱水过程完成。IVCT结合冷冻置换使标本生理活动被迅速固定的同时 不会在后续的脱水过程中有所改变，制备的标本更符合其活体时的生理状态。而传统的形态学人工采取的组织结构标本，是经过浸入的标本快速冷冻并结合临 界点干燥法提取标本。如浸入固定或组织切割后快速冷冻，制取标本时均需将组织结构切 割形成离体状态，其过程通常需要数十秒或数分钟，不可避免的造成活体的心脏停跳、血液 循环停止的情况，形成人为的缺血、缺氧，很可能影响组织细胞结构形态、蛋白分布和分子 构象，很难提取到快速改变细胞结构标本；提取标本后的固定，一般采用浸入常温或4°C固 定剂中，或直接用固定剂灌流固定，一方面在上述温度下组织细胞的生理活动可能未完全 停止，另一方面固定剂的交联也需要一定时间，而这期间可溶性成分可能发生改变，使组织 和细胞变性，破坏他们的超微组织结构，都可能影响到真实反映活体状态下组织细胞组织 结构的生理病理情况；继而的临界点干燥法中，在组织溶剂里、室温条件下，采取的快速干 燥过程，也常导致标本组织结构皱缩和渗透性发生改变，临界点干燥法也会不可避免的伴 有人为操作等问题。因此，传统标本制备方法易引起细胞基质丢失和超微组织结构改变。另外，采用化学固定提取标本的方法，是通过化学固定剂与标本中的蛋白质等成 份交联成稳定的凝胶，使标本中的一些组份和结构固定下来。化学固定剂如戊二醛、多聚甲
3醛、锇酸等，与细胞和组织内分子的交联作用需要一定的时间，这期间可溶性成分可能发生 改变，组织和细胞可能变性，会引起超微组织结构发生变异，从而不能真实反映活体状态下 自身的生理病理状况，进而对正确分析细胞组织结构等带来一定的困难。综上所述，与化学和传统提取标本的方法相比较，IVCT在保持活体器官正常生存、 血液循环存在的条件下，即刻冷冻标本保存了具有功能意义的细胞、组织及其内在所有生 物学成分的原貌形态学和功能状态。相比之下，IVCT可减少从提取标本、固定到脱水过程 中产生的形态学改变，极大程度保存了真实的超微组织结构，减少了人为因素造成的影响。采用的先进提取活体组织结构标本的方法，结合当前应用的很多检测技术如HE 染色、免疫染色、免疫组化染色，以及荧光探针等，通过各种光学显微镜、共聚焦显微镜和电 子显微镜技术，显示了活体内生物成分的原始结构和细胞内定位、功能细胞的原始形态学， 已成为检验活体器官原始功能形态结构及对高度时间分辨率和时间依赖的细胞和组织结 构内动态的生物成分进行分析的良好方法。目前国外在活体冷冻装置VI-Il上，使用IVCT已经应用在小脑、肾、肝、脾、肺、卵 巢、睾丸、血管、眼球等脏器上，成功制取了活体标本；并证实了用化学固化或传统人工标本 制备方法从未发现的以及与以往不同的形态结构方面的改变。该种技术已成为世界性医学 领域中，能更真实地反映血液动力学改变时动物组织的形态学变化，为组织学及病理学的 发展提供了新思路。鉴于目前活体冷冻装置VI-Il ；Eiko Engineer Co. Ibaraki，Japan)价格昂贵，我 国使用尚少，不具备普及使用的条件；并且当前国内现有冷冻置换液的主要成分丙酮及保 温过程中使用的主要成分固态二氧化碳的纯度与该设备要求匹配的纯度相差很大。因此， 为了医疗事业的发展与世界先进水平相接近，更好地为社会服务，研究一种适合我国国情， 应用IVCT理论切实可行的，人工提取活体组织超微结构及蛋白分布标本的方法。
发明内容
本发明旨在根据我国国情，应用IVCT理论，在正常或异常血液循环条件下将动物 的器官、组织及其细胞内的所有生物学成分迅速即刻冷冻，保存了具有功能意义的细胞、组 织结构及其内所有生物学成分的真实形态和功能状态。提供了一种操作简单、快捷、方便、 可靠，且成本低廉、易于推广的人工提取活体组织超微结构及其蛋白分布标本的方法。为了达到上述目的，本发明是这样实现的本发明采用如下步骤1、在待取标本活体状态下，人工迅速将异戊烷-丙烷混合冷冻剂，直接倾倒在提 取标本的活体器官表面上；2、然后将液态氮浸泡在标本表面，并在液态氮中手工修剪组织结构标本；3、将提取后的组织结构标本置入多聚甲醛和制备原料纯度为99. 5-99. 7%丙酮， 经过提纯的冷冻置换液中；同时，用棉絮状固态二氧化碳结合丙酮进行保温，在-80°C环境 下进行缓慢冷冻置换48-72小时，并维持冷冻置换温度恒定；然后阶梯升温，冷冻置换过程 缓慢持续地进行；4、冷冻置换过程数次重复进行，直至标本组织细胞的水分子全部置换完为止。为确保完全置换出组织细胞中的水分子，采用增加更换冷冻置换液次数的方法。
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冷冻置换液的制备过程多聚甲醛和丙酮混合液需先在60-70°C条件下溶解多聚 甲醛于双蒸水中制成20%多聚甲醛溶液，然后用纯度为99. 5-99. 7%丙酮稀释；为达到冷 冻置换液的高纯度，吸出置换液中残留水分子，需在其中加入分子筛吸收水分子，并进行分 子筛更换，直到冷冻置换液中无水分子存在为止，制成多聚甲醛和丙酮混合的冷冻置换液， 其中多聚甲醛的终浓度达到2%。采用纯度为99. 5-99. 7%的丙酮，需分别更换3_6次分子筛来吸收水分子。本发明的有益效果1、因地制宜地研制出制取冷冻置换液的方法，弥补国内无纯丙酮和高纯度的固态 二氧化碳购买难、价格高、不易保存的缺点；此项技术研究应用成功，为实现人工提取活体 组织超微结构及蛋白分布组织标本的方法提供了成本低廉、易于推广的材料保证；2、该人工提取标本的方法替代了成本高、不易普及的冷冻置换装置，实现了操作 简单、方便、快捷、经济。
图1是国外使用的VI-Il活体制取标本的冷冻装置；(Eiko Engineer Co. Ibaraki, Japan)；图2是本发明在活体冷冻装置上提取的在光镜下大鼠肾脏结构标本HE染色 20 X ；图3是本发明采用人工IVCT制备的标本，在光镜下DAB染色显示正常血流条件 下，⑶2AP在毛细血管袢上的分布情况。图4是本发明采用人工IVCT提取的急性高血压动物模型中足细胞标志性蛋白 CD2AP在肾小球毛细血管袢分布的标本。图5是采用常规灌流固定方法提取的在光镜下观察水通道蛋白-1 (AQP-I)在近端 肾小管上皮细胞中的分布标本；图6是采用人工IVCT方法提取的在光镜下观察水通道蛋白-1 (AQP-I)在近端肾 小管上皮细胞中的分布标本。图7是采用常规浸泡固定方法提取的在共聚焦激光显微镜(CLSM)下观察血浆白 蛋白在心肌组织中分布的标本。图8是本发明采用人工IVCT方法提取的在共聚焦激光显微镜下观察血浆白蛋白 在心肌组织中分布的标本。图9是采用常规浸泡固定方法提取的在共聚焦激光显微镜(CLSM)下观察血浆可 溶性蛋白(IgG与白蛋白)在心肌组织中分布的标本；图10是本发明采用人工IVCT方法提取的在共聚焦激光显微镜下观察血浆可溶性 蛋白(IgG与白蛋白)在心肌组织中分布的标本。
具体实施例方式实施例1 步骤1 确定活体器官组织的目标在实验室里，选择成年C57BL/6小鼠，体重20_30克，或大鼠，雌雄不限，室内空气，鼠食喂养，自由饮水。戊巴比妥钠腹腔麻醉、开放腹腔或胸腔、确定器官目标，其下垫一铝 箔。步骤2:冷冻剂的配制 异戊烷大连安瑞森特种气体化工有限公司丙烷大连气体研究所异戊烷和99. 7%的丙烷均可在上述单位购得。步骤3 制备活体器官的标本在活体状态下采用人工方法迅速将制备好冷冻剂直接倾倒在提取标本的活体器 官表面上，随之将液态氮浸泡在其表面，并在液态氮中修剪提取组织结构标本。步骤4 冷冻置换冷冻置换液的合成方法冷冻置换液需先在60°C条件下溶解20g多聚甲醛于 IOOml双蒸水中制成20%多聚甲醛溶液，然后用99. 7%丙酮(国外采用纯丙酮，但国内几乎 没有)稀释20%多聚甲醛溶液；为了完全吸出混合液中丙酮带来的残留水分子，需在其中 加入type 3A的分子筛来吸收液体中的水分子，并进行3次的分子筛更换，并用变色分子筛 作为指示剂，其变色分子筛的指示颜色没有变化，表明冷冻置换液中已无水分子存在，制得 多聚甲醛和丙酮混合的冷冻置换液；其中，多聚甲醛的终浓度为2%。冷冻置换方法将提取后的组织结构标本置入多聚甲醛和丙酮的冷冻置换液 中；同时，应用气态二氧化碳制备的高纯度棉絮状固态二氧化碳结合丙酮对标本进行 保温，在-80°C环境下进行缓慢冷冻置换48小时，并维持冷冻置换温度恒定，然后分别 在-25X、-1(TC、4°C和室温梯度温度中各持续3小时，保证了冷冻置换缓慢持续地进行； 且提纯棉絮状固态二氧化碳纯度很高，确保了冷冻置换程序缓慢持续地进行；为更好的置 换组织细胞中的水分子，采用增加更换冷冻置换液次数的方法克服了未用纯丙酮造成的缺 点；经实验表明达到了国外在冷冻装置上采用纯丙酮同样的制备组织超微结构标本，为在 国内开展此项研究提供了至关重要的技术保证。步骤5 石蜡包埋经冷冻置换后标本，用提纯无水丙酮清洗2次，每次2小时，二甲苯透明3次，每次 10分钟，二甲苯与石蜡以3 4 1的比例浸蜡30分钟，混合蜡浸蜡3小时，石蜡包埋。步骤6:染色(1)、HE染色石蜡切片常规摊片、烤片后二甲苯脱蜡2次，每次15分钟。100%酒 精脱苯2次每次15分钟。逐级酒精水化，95%、90%酒精各10分钟；80%、70%酒精各5分 钟。苏木素染色15分钟，蒸馏水清洗。盐酸酒精中分化1分钟。蒸馏水中反兰20分钟。 0. 5%伊红染色5分钟。逐级酒精脱水，70%，80%酒精各1分钟；90%酒精5分钟；95%酒 精10分钟；100%酒精脱水2次每次15分钟。二甲苯脱酒精2次，每次15分钟。中性树胶封片。(2)、免疫组化染色石蜡切片常规摊片、烤片后二甲苯脱蜡2次，每次15分钟。 100%酒精脱苯2次每次15分钟。逐级酒精水化，95%、90%酒精各10分钟；80%、70%酒 精各5分钟。蒸馏水洗3次，每次5分钟。3%过氧化氢灭活10分钟。蒸馏水洗3次，每次 5分钟。PBS洗3次，每次5分钟。甩干，围绕组织划圈。血清封闭37°C温箱1小时。稀释 一抗，漩涡器混勻。加一抗37°C温箱1小时或4°C过夜。PBS洗3次，每次5分钟。加二抗， 37°C温箱1小时。PBS洗3次，每次5分钟。滴SABC，37°C温箱1小时。PBS洗4次，每次5 分钟。DAB显色，边显色边观察，约5分钟左右。清水冲洗约10分钟。苏木素复染1分钟。 水洗。盐酸酒精分化1分钟。水洗。反蓝15分钟。70%、80%酒精各5分钟；90%、95%酒 精各10分钟；100%酒精2次每次15分钟。二甲苯2次，每次15分钟。中性树胶封片。(3)、双重荧光染色将两种一抗按所需终稀释浓度混勻后滴加一抗于组织上，其 他步骤同前。加二抗的方法也按所需终稀释浓度混勻后加于组织上，37°C温箱1小时，甘油 PBS封片。步骤7 采用以下设备进行形态学鉴定(1)光学显微镜观察。(2)共聚焦激光显微镜观察。实施例2 步骤1 确定活体器官组织的目标在实验室里，选择昆明小鼠，体重20-25克，或大鼠，雌雄不限，室内空气，鼠食喂 养，自由饮水。戊巴比妥钠腹腔麻醉、开放腹腔或胸腔、确定器官目标，其下垫一铝箔。步骤2:冷冻剂的配制 异戊烷大连安瑞森特种气体化工有限公司丙烷大连气体研究所异戊烷和99. 7%的丙烷均可在上述单位购得。步骤3 制备活体器官的标本在活体状态下采用人工方法迅速将制备好冷冻剂直接倾倒在提取标本的活体器 官表面上，随之将液态氮浸泡在其表面，并在液态氮中修剪提取组织结构标本。步骤4 冷冻置换冷冻置换液的合成方法冷冻置换液需先在70°C条件下溶解20g多聚甲醛于 IOOml双蒸水中制成20%多聚甲醛溶液，然后用99. 5%丙酮(国外采用纯丙酮，但国内几乎 没有)稀释20%多聚甲醛溶液；为了完全吸出混合液中丙酮带来的残留水分子，需在其中 加入type 3A的分子筛来吸收液体中的水分子，并进行6次的分子筛更换，并用变色分子筛 作为指示剂，其变色分子筛的指示颜色没有变化，表明冷冻置换液中已无水分子存在，制得多聚甲醛和丙酮混合的冷冻置换液；其中，多聚甲醛的终浓度为2%。冷冻置换方法将提取后的组织结构标本置入多聚甲醛和丙酮的冷冻置换液 中；同时，应用气态二氧化碳制备的高纯度棉絮状固态二氧化碳结合丙酮对标本进行 保温，在-80°C环境下进行缓慢冷冻置换72小时，并维持冷冻置换温度恒定，然后分别 在-25X、-1(TC、4°C和室温梯度温度中各持续3小时，保证了冷冻置换缓慢持续地进行； 且提纯棉絮状固态二氧化碳纯度很高，确保了冷冻置换程序缓慢持续地进行；为更好的置 换组织细胞中的水分子，采用增加更换冷冻置换液次数的方法克服了未用纯丙酮造成的缺 点；经实验表明达到了国外在冷冻装置上采用纯丙酮同样的制备组织超微结构标本，为在 国内开展此项研究提供了至关重要的技术保证。步骤5、步骤6和步骤7与实施例1中的步骤5、步骤6和步骤7相同。另外，国内纯丙酮和保温用的高纯度的固态二氧化碳很难购买，且价格高，还存在 不易保存等缺点；此项技术研究应用成功，为实现人工提取检测活体组织超微结构及蛋白 分布的组织标本方法提供了材料保证。结合实施例说明标本附图如图2所示国内外首次创立的应用IVCT在人工活体冷冻提取的原位保持肾组织 结构标本，在光镜下20X下可见大鼠肾脏结构保持完整、清晰的HE染色。如图3所示人工IVCT制取的组织结构标本在光镜下40XDAB染色显示正常血流 下，⑶2AP在毛细血管袢上的分布情况；正常血流条件下，⑶2AP呈致密、连续、规律分布在 毛细血管袢上。如图4所示在光镜下DAB采用传统方法提取的急性高血压小鼠动物模型中足细 胞标志性蛋白⑶2AP在肾小球毛细血管袢标本；急性高血压条件时⑶2AP在肾小球毛细血 管袢上呈非连续性紊乱分布，且染色减弱。国内外首次应用活体冷冻技术观察到正常血流 及急性高血压条件下，肾小球足细胞标志性蛋白Podicin，Nestin, α -actinin4, Nephrin, CD2AP等在肾小球毛细血管壁上真实、客观的分布情况，首次证实急性高血压时上述蛋白分 布紊乱是造成蛋白尿肾损害的直接因素。如图5所示常规灌流固定提取的在光镜下水通道蛋白-I(AQP-I)在近端肾小管上 皮细胞中的分布标本；光镜40 X下(箭头所示)观察到常规灌流固定提取的标本水通道蛋 白-I(AQP-I)在近端肾小管上皮细胞中的分布状态；常规灌流固定方法中可见AQP-I在近 端肾小管上皮细胞刷状缘侧的分布呈倒伏状排列，侧壁及基底部的免疫染色较明显。如图6所示光镜下20X (箭头所示)冷冻置换后的标本，正常血液循环情况下，活 体冷冻技术的标本中AQP-I排列致密、规则，肾小管基底膜几乎无染色；肾脏AQP-I蛋白是 调节水离子代谢的极其重要的蛋白，客观、真实地反映其在肾脏中的分布情况是研究一些 重要肾脏疾病的基础。如图7所示采用常规浸泡固定方法提取的在共聚焦激光显微镜(CLSM)下血浆白 蛋白在心肌组织中分布的标本；共聚焦激光显微镜(CLSM)下可见采用常规浸泡固定方法 血浆白蛋白已经越过心肌血管内膜(以⑶34标记为红色)，分布在血管腔外(箭头所示)。如图8所示是采用人工IVCT方法提取的在共聚焦激光显微镜下血浆白蛋白在心 肌组织中分布的标本；采用人工IVCT固定组织则发现血浆白蛋白严格限制在血管腔内(箭 头所示)。
如图9所示采用常规浸泡固定方法提取的在共聚焦激光显微镜(CLSM)下血浆可 溶性蛋白IgG与白蛋白的标本；在共聚焦激光显微镜(CLSM)下可见采用常规浸泡固定方法 血浆可溶性蛋白IgG与白蛋白明显分布于心肌血管腔内外(箭头所示)。如图10所示国内外首次应用人工活体冷冻技术观察到血浆可溶性蛋白(白蛋白 及IgG)严格限制在血管腔内，客观真实地反映了血浆可溶性蛋白在心肌组织中的分布状 况(箭头所示)。但常规浸泡固定方法中由于组织缺血严重，导致血浆可溶性蛋白(白蛋白 及IgG)不仅分布于血管壁内，而且在心肌血管壁外侧也有明显溢出性分布，不能反映活体 内真实生理或病理状态，是人工造成的假象；是在错误的基础上得出错误的结论。
权利要求
人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法，其特征在于采用如下步骤(1)、在待取标本活体状态下，人工迅速将异戊烷 丙烷混合冷冻剂，直接倾倒在提取标本的活体器官表面上；(2)、然后将液态氮浸泡在标本表面，并在液态氮中手工修剪组织结构标本；(3)、将提取后的组织结构标本置入多聚甲醛和制备原料纯度为99.5 99.7％丙酮，经过提纯的冷冻置换液中；同时，用棉絮状固态二氧化碳结合丙酮进行保温，在 80℃环境下进行缓慢冷冻置换48 72小时，并维持冷冻置换温度恒定；然后阶梯升温，冷冻置换过程缓慢持续地进行；(4)、冷冻置换过程数次重复进行，直至标本组织细胞的水分子全部置换完为止。
2.根据权利要求1人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法，其特征 在于冷冻置换液的制备过程多聚甲醛和丙酮混合液需先在60-70°C条件下溶解多聚甲醛 于双蒸水中制成20%多聚甲醛溶液，然后用纯度为99. 5-99. 7%丙酮稀释；为达到冷冻置 换液的高纯度，吸出置换液中残留水分子，需在其中加入分子筛吸收水分子，并进行分子筛 更换，直到冷冻置换液中无水分子存在为止，制成多聚甲醛和丙酮混合的冷冻置换液，其中 多聚甲醛的终浓度达到2%。
3.根据权利要求1人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法，其特征 在于采用增加更换冷冻置换液次数的方法，完全置换出组织细胞中的水分子。
4.根据权利要求1或2人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法，其 特征在于采用纯度为99. 5-99. 7%的丙酮，需分别更换3-6次分子筛来吸收水分子。
全文摘要
一种人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法，本发明提供了一种操作简单、可靠、易于推广的人工提取活体组织标本的方法。本发明的要点为在待取标本活体状态下，人工迅速将异戊烷-丙烷混合冷冻剂，直接倾倒在提取标本的活体器官表面上；然后将液态氮浸泡在标本表面，并在液态氮中手工修剪组织结构标本；将提取后的组织结构标本置入多聚甲醛和制备原料纯度为99.5-99.7％丙酮，经过提纯的冷冻置换液中；同时，用棉絮状固态二氧化碳结合丙酮进行保温，在-80℃环境下进行缓慢冷冻置换48-72小时，并维持冷冻置换温度恒定；然后阶梯升温，冷冻置换过程缓慢持续地进行；冷冻置换过程数次重复进行，直至标本组织细胞的水分子全部置换完为止。
文档编号A61B10/02GK101919715SQ20091001201
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者李子龙 申请人:李子龙