专利名称：一种乳酸菌细胞壁裂解物的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
微生物学和免疫学领域。
背景技术：
胃肠道微生物生态系统是人和动物体内最复杂和最大的微生态系统，胃肠菌群自身以及与机体之间始终处于一种动态的平衡中，肠道菌群的平衡和稳定对机体的生理功能 具有重要的作用，对其宿主的健康具有深远的影响。肠道内益生菌主要包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、 肠球菌(Enterococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum) [2]。肠道益生菌可以通过非免疫调节作用来稳定微生态环境，即通过体内定植、黏附、竞争 占位提高内源宿主的防御机制；除了这一方面外，益生菌可以通过提高机体的体液免疫水 平和细胞免疫水平来增进机体的免疫防御机能。目前，乳酸菌活菌制剂已在肠道疾病的防治、泌尿系统炎症防治等方面得到一定 的临床应用(见《乳酸细菌——基础、技术和应用》P332-335、P343-343，张刚主编，化学工 业出版社，2007年)。但尚未见到将粪肠球菌细胞壁分离并临床用于免疫调节方面的报道。
发明内容
1.菌种筛选粪肠球菌为人体肠道的正常菌群。新加坡国立大学研究发现，粪肠球菌是人体肠 道乳酸菌中免疫调节性能最强的一类，而且其免疫调节机制与细胞壁组分有关。本发明从健康婴儿肠道中分离出27种乳酸菌，通过实验发现只有4种粪肠球菌具 有免疫调节的功能，表明了乳酸菌的免疫调节功能是依赖菌种的。从4种粪肠球菌中，又优 选出高免疫活性的MB508菌。2.粪肠球菌细胞壁裂解物制备方法将粪肠球菌培养液离心并洗涤菌体，再高温高压(121 ，0. IMPa, 20min)灭活使 菌体裂解，最后干燥，获得细胞壁裂解物质。
具体实施例方式1.粪肠球菌分离取健康儿童新鲜粪便25g，放入装有95mL无菌水和玻璃珠的三角烧瓶中，充分振 摇IOmin (250次/rain)，制成10-1的稀释液·再稀释得到10_2，10_3，10_4，10_5的稀释液·将各粪便稀释液分别取0. ImL涂布在肠球菌选择性培养基(Ec)平板上，37°C培养 48h后，选取紫红色、表面光滑凸起、周边整齐、直径1. 0 1. 5mm的菌落，分别传于Ec基础 斜面上.将各斜面菌种涂片、革兰染色、镜检，选取革兰染色阳性、圆形或卵圆形、单个、成 对或短链状排列的菌株，定名为MB508菌。2. MB508菌细胞壁裂解物制备将MB508菌培养液3000rpm离心5分钟，无菌水洗涤2 3次，高温高压(121 °C，0. lMPa,20min)裂解灭活，最后喷雾干燥，得到粪肠球菌细胞壁裂解3.用于改善接触性皮炎 用四周龄BALB/c小鼠做试验，分成二组，一组喂以通常饲料为对照组。另一组为 试验组，饲料中加MB508细胞壁物质(10mg/kg/天)，就诱导发性过敏反应的情况进行比较。 在16周龄时二组都用50 μ L0. 5%二硝基氟苯(DNFB)液处理以刺激诱导发生接触性皮炎， 处理后5天用0. 2% DNFB 20 μ L涂于耳壳使引起接触性过敏反应，在诱发过敏反应的24及 48小时后用千分厚度计(Dial thickness gauge，卡尺)测量耳壳肿胀厚度。喂给MB508的小鼠与对照组小鼠相比，耳壳肿胀可抑制一半，对耳壳组织做染色 观察，表明喂食MB508的小鼠炎症细胞的浸润明显可受到抑制。4.免疫调节18只小鼠随机分为2组，每组6只，分别为MB508组和生理盐水对照组，MB508组 小鼠腹腔注射用无菌生理盐水配制的lmg/mL MB508细胞壁物质，生理盐水对照组注射生理 盐水，2组每次均注射0. 5ml每只，连续2d，注射后第4d进行小鼠巨噬细胞吞噬实验测定和 血清溶菌酶活力的测定(按试剂盒说明测定)。结果吞噬功能影响
Hl吞噬率吞噬指数~
对照组 29. 50 + 2. 17b~~0. 97 士 0. 17B MB508 组 58. 60 士 4. 891 ~~2. 55 士 0. 48A对小鼠血清溶菌酶的影响
~m\血清溶菌酶活力 对照组 10. 15 士 2. 67^ MB508 组 ~18. 21 士 3. 49以上结果表明，MB508细胞壁物质能够增强巨噬细胞吞噬能力，促进其分泌血清溶 菌酶功能，提高巨噬细胞杀伤能力。
权利要求
乳酸菌细胞壁裂解物主要为肽聚糖和脂磷壁酸的混合制剂。
2.根据权利要求1所述乳酸菌细胞壁裂解物，来自乳酸菌肠球菌属的粪肠球菌 (E. Faecalis).
3.根据权利要求2所述粪肠球菌，是从健康儿童肠道筛选而得。
4.根据权利要求1所述乳酸菌细胞壁裂解物的制备方法为将乳酸菌接种于培养基， 37°C，培养24h后，将培养液离心，洗涤，得到湿菌体。高温高压破壁，最后浓缩干燥得到乳 酸菌细胞壁裂解物。
5.乳酸菌细胞壁裂解物在免疫调节方面的用途。
全文摘要
本发明涉及以人体肠道中筛选而得的粪肠球菌为菌种，经高密度发酵，高温高压破壁而得的一种乳酸菌细胞壁裂解物质，以及在免疫调节方面的用途。
文档编号A61K35/74GK101953855SQ20091005762
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者马明 申请人:明博医药技术开发(上海)有限公司