专利名称：一种神经生长因子海绵剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种神经生长因子海绵剂及其制 备方法。该海绵剂能使神经生长因子以有效剂量长时间持续地释放到 神经病变或创伤组织局部位置，发挥有效治疗神经组织损伤的作用。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是神经营养因子中 最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促进突起生长 双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经 元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作 用。NGF的制备来源有多种，有蛇毒、豚鼠前列腺、牛精浆、人胎 盘、小鼠颌下腺等，以雄性小鼠颌下腺中含量最为丰富。另外还有采 用基因工程重组技术制备重组人神经生长因子(rhNGF)和重组鼠神 经生长因子(raiNGF)。
NGF是目前国内外用于神经损伤治疗的唯一有效生物制剂，临床 上越来越广泛地应用NGF作为各种神经损伤修复，包括外伤性、生 理性神经损伤修复的手段。目前NGF正被广泛地应用于神经损伤、 偏瘫、卒中、颅脑损伤、小儿脑瘫等神经性疾病领域。然而，目前临 床应用的NGF制剂均为注射剂(冻干粉针剂或注射液)，且给药方式 均为肌肉注射。
唐刚华等用放射性碘标记NGF进行动物药代动力学研究，小鼠按剂量25 pg/kg静注125I-NGF后，测得血浆消除相半衰期(f;"微)为 3.65h;按剂量75、 25、 10、 3.3吗/kg肌注125I-NGF，测得血桨消除 相半衰期(&仰)分别为1.79、 2.25、 2.30、 3.24 h，平均达峰时间(Uj 为0.58h，平均血浆清除率(CLs)为0.37L/(h'kg)，表观分布容积(F》 为1.18L/kg，体内平均滞留时间(0为2.78h。(唐刚华，唐小兰，姜 国辉，等.^I-神经生长因子的制备及其药代动力学研究[J].核化学与 放射化学，2002， 24(1) : 56-60.)可见NGF活性半衰期短，肌肉注射的 药物经血液循环到达创伤神经组织部位时，因大部分NGF都被降解 而不能达到应有的最佳治疗效果。若能将NGF直接应用在神经病变 或创伤组织局部位置，并缓慢释放，即将NGF制成局部缓释制剂， 就能达到最佳治疗效果。
中国专利200310120873.8公开了一种神经生长因子乳膏剂或凝 胶剂，该外用制剂利用NGF具有促进体表创伤愈合，尤其是对难愈 合创面的修复功能，用于治疗头皮癣、妇科瘙痒，皲裂症，急、慢性 湿疹等皮肤病顽疾。该外用制剂仅能用于体表，使NGF直接作用于 患处，使药效持久。邹金生公开了一种含有高效神经生长因子(NGF) 的生物胶，改变了由注射途径使用NGF的低效率方法，而由人血生 物胶携带NGF直接应用于创伤神经组织部位，提高了 NGF对创伤神 经组织的修复、治疗效果。(中国专利申请200310111375.7，公开于 2004年11月10日)但人血生物胶在临床上应用存在以下缺点① 使用前需在手术台下提前溶解配制，并需组装喷雾装置，操作过程繁 琐、费时；②对创面黏附性差，易被血液或组织液冲脱；③因从血浆中制备而得，造价昂贵，临床售价高。
海绵剂作为药剂的一个剂型，在临床应用中越来越显现出了重要 作用。海绵剂系由亲水胶体溶液经发泡、固化、冻干和灭菌而制成的 一种海绵状固体制剂。海绵剂基质共分两类 一是用蛋白质为原料制 成的，如胶原海绵、明胶海绵；二是用淀粉为材料制成的淀粉海绵。 淀粉海绵质地松脆易碎；而胶原海绵和明胶海绵质柔软，临床应用较 多。海绵剂在临床上多用作外科辅助止血。由于海绵剂具有生物相容 性好、无毒副作用，在体内可彻底降解等优点，而且蛋白胶原类海绵 (胶原海绵和明胶海绵)本身具有诱导成纤维细胞及上皮细胞再生， 促进创面修复的功能，因此海绵剂，特别是细胞因子海绵剂在组织再 生修复中发挥了越来越重要的作用。这种新型制剂可以提高细胞因子 在组织缺损局部的浓度并延长其维持作用时间，诱导细胞实现局部的 定向分化和组织再生。
近年来，利用海绵剂良好的生物相容性，在体内能逐步降解的性 能，以其作为新型药物缓释制剂的研究成为热点。邹海燕等将碱性成 纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)引入胶原海 绵基质中，研制出bFGF胶原海绵。该制剂可以使bFGF固定在创面 上发挥作用，而且在海绵基质的包裹下，bFGF可以随着海绵基质的 降解而逐步释放，从而取得更好地促进伤口愈合作用和治疗效果。(邹 海燕，叶春婷，李斯明，等.bFGF胶原海绵的制备及其组织相容性评 价[J].生物医学工程与临床，2003， 7(1) :1-2. ) Hiroki Ueda等人将 转化生长因子-ei (TGFP1)引入到胶原海绵基质中，所得制剂可以缓慢释放具有生物活性的TGFP 1，对骨修复而言是理想的材料。 (Hiroki Ueda, Tatsuo Nakamura， Masaya Yamamoto, et al. Repairing of rabbit skull defect by dehydrothermally crosslinked collagen sponges incorporating transforming growth factor P l[J]. Journal of Controlled Release, 2003， 88 : 55-64.)上述几种细胞因子与胶原海绵基质的复合 制剂中，细胞因子与胶原海绵基质仅仅是简单的物理复合，细胞因子 与基质材料间仅靠物理吸附作用相结合，这种吸附作用是比较弱的结 合方式。该制剂在植入体内后，其中未与基质材料充分吸附或吸附作 用较弱的药物就会从基质中迅速扩散而导致爆破释放，因而这种制剂 难以实现较好的缓释作用。丁时踽等人通过^I-BSA/胶原基复合材料 的体内植入释放研究充分证实了这一点，^I-BSA/胶原基复合材料植 入早期具有很明显的爆破释放现象，植入2天后就释放了将近70%。 (丁时踽，刘玲蓉，李学敏，等.以胶原为载体的蛋白药物体内释放 和药代动力学的研究[J].中国生物医学工程学报，2005， 24(6): 775-779.)
若能提高细胞因子与基质材料间的吸附作用，比如通过化学交联 方法使细胞因子共价交联固定在基质材料上，就能真正实现细胞因子 随着基质材料的降解而逐步释放，达到较好的缓释目的。
发明内容
本发明的目的之一是提出一种神经生长因子海绵剂，使神经生长 因子以有效剂量长时间持续地释放到神经病变或创伤组织局部位置， 发挥有效治疗神经组织损伤的作用。本发明的目的之二是提出上述神经生长因子海绵剂的制备方法。 本发明的发明目的之一是通过选用一种神经生长因子海绵剂实
现的。该海绵剂包括0.01 2%重量百分含量的神经生长因子和胶原海 绵或明胶海绵基质，所述神经生长因子经醛类交联剂交联固定在胶原 海绵或明胶海绵基质上。
所述醛类交联剂为醛类物质化学交联剂，可以是甲醛、多聚甲醛、 甲基乙二醛或戊二醛，优选甲醛、多聚甲醛或戊二醛。
进一步说，胶原海绵或明胶海绵基质中含有
85~99%所述海绵剂重量百分含量的胶原蛋白或明胶；
0.3% 9%所述海绵剂重量百分含量的蛋白保护剂；
0.5% 5%所述海绵剂重量百分含量的增塑剂。
所述神经生长因子为动物源性神经生长因子或采用基因工程重 组技术制备的神经生长因子。
所述动物源性神经生长因子为从蛇毒、豚鼠前列腺、牛精桨、人 胎盘或小鼠颌下腺中提取的神经生长因子，优选人胎盘神经生长因 子、小鼠颌下腺神经生长因子或蛇毒神经生长因子。
所述采用基因工程重组技术制备的神经生长因子为重组人神经 生长因子(rhNGF)、重组鼠神经生长因子(raiNGF)、基因重组改构 的神经生长因子突变体或其化学修饰物，优选重组人神经生长因子 (rhNGF)或重组鼠神经生长因子(rmNGF)。
所述蛋白保护剂为本领域技术人员熟悉的生物活性蛋白保护剂， 包括大多数的糖类，可以为甘露醇、乳糖、蔗糖或葡萄糖；大多数的氨基酸，可以为甘氮酸、精氨酸或亮氨酸； 一些保护性蛋白，可以为 人血白蛋白或牛血清白蛋白，优选人血白蛋白或牛血清白蛋白。
所述增塑剂为提高该海绵剂的柔韧性等力学性能的物质，可以为 甘油、聚乙二醇或壳聚糖，优选甘油或聚乙二醇；所述聚乙二醇优选 聚乙二醇1000、聚乙二醇4000、或聚乙二醇6000。
所述明胶为市售医用明胶。
所述胶原蛋白为富含胶原蛋白的动物皮、跟腱或结缔组织中提取
制备的，优先为采用以下方法制备的
(1) 取猪腿、牛腿或马腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质，切 片后用冷纯化水清洗干净；
(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤2~3次脱脂、去血清等杂质；
(3) 溶于30 60倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4%的 胃蛋白酶，37'C搅拌消化1小时后，2 8。C放置继续消化5 10天；
(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.1~1%乙酸溶液中，离心 收集上清，加入NaCl至终浓度为1 2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集 沉淀，即得胶原蛋白。
本发明的发明目的之二是通过以下技术方案实现的， 一种制备上 述神经生长因子海绵剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步
骤
(1)将胶原蛋白或明胶溶于0.1%~1%乙酸溶液中，制成0.1 3% 胶原蛋白或明胶溶液，于0.2~2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4~8.0)中透析至中性；
(2) 在上述胶原蛋白或明胶溶液中，加入神经生长因子、蛋白保 护剂和增塑剂，使最终各组份重量百分含量分别为神经生长因子 0.01~2%，胶原蛋白或明胶85 99%，蛋白保护剂0.3% 9%，增塑剂 0.5% 5%，于—80 一2(TC冷冻2 5天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，30 45'C下用醛类交 联剂熏蒸交联固定1 24小时；
(4) 切割，真空包装，灭菌、灭病毒，制得神经生长因子海绵剂 成品。
其中步骤(3)中醛类交联剂为醛类物质化学交联剂，可以是甲 醛、多聚甲醛、甲基乙二醛或戊二醛，优选甲醛、多聚甲醛或戊二醛。
其中步骤(1)中所用的明胶为市售医用明胶；所述胶原蛋白为 富含胶原蛋白的动物皮、跟腱或结缔组织中提取制备的，优先为采用 以下方法制备的
(1) 取猪腿、牛腿或马腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质，切 片后用冷纯化水清洗干净；
(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤2~3次脱脂、去血清等杂质；
(3) 溶于30 60倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4%的 胃蛋白酶，37。C搅拌消化1小时后，2 8"C放置继续消化5 10天；
(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.1 1%乙酸溶液中，离心 收集上清，加入NaCl至终浓度为l~2mol/L， 2 8"C沉淀过夜，收集醛类交联剂是免疫组化中常用的组织细胞固定剂，其交联蛋白的 原理是醛类分子与蛋白产生分子交联，在蛋白分子末端基团(氨基、 亚氨基、酰氨基、羟基、巯基或芳香环等基团)间形成亚甲基桥
(methylene bridges)，即形成蛋白分子间的交联链，使不同蛋白分 子交联在一起。本发明巧妙地利用醛类交联剂将NGF化学交联固定 在蛋白海绵基质上，利用蛋白海绵基质可生物降解的特性，NGF随 着海绵基质材料的降解而逐步释放，达到药物缓释目的。本发明所述 的神经生长因子海绵剂具有以下优势
1、 应用于神经损伤组织时，海绵基质与组织液或血液接触并吸 附组织液或血液，迅速黏附在损伤组织上，使NGF相对局限于神经 受损部位，有效提高神经损伤局部药物浓度。
2、 NGF经醛类交联剂化学交联固定在海绵基质的纤维网状结构 中，使该海绵网状结构类似于一块贮药库，随着海绵基质材料被机体 降解而逐步缓慢释放NGF，较长时间维持有效药物浓度，避免反复 给药，较少患者病痛，降低患者经济负担。
3、 该海绵剂生物相容性好，无毒副作用，在体内可彻底降解， 同时海绵基质本身具有的促创伤愈合和组织修复作用也有利于创伤 神经组织的修复。制剂中增塑剂的加入，提高了该海绵剂的柔韧度， 大大减轻了海绵硬度刺激对创伤组织的损伤，使其更适用于神经损伤 组织。
4、 该制剂拆开包装即可使用，方便临床应用；制剂中蛋白保护剂的加入，使该制剂可在常温保存，方便储存和运输。该制剂生产工 艺简单，原材料来源丰富，生产成本低廉，临床售价较低。
目前临床上NGF给药方式均为肌肉注射，因NGF半衰期短，到
达神经损伤部位时有效药物浓度低，不能达到很好的治疗效果，患者
需反复多次给药。本发明所述的神经生长因子海绵剂能使神经生长因
子以有效剂量长时间持续地释放到神经病变或创伤组织局部位置，发
挥有效治疗神经组织损伤的作用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为神经生长因子海绵剂NGF累积释放率-时间曲线图。
具体实施例方式
实施例l:胶原蛋白的提取制备
(1) 取猪腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质，切片后用冷纯化 水清洗干净；
(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤3次脱脂、去血清等杂质；
(3) 溶于60倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4%的胃 蛋白酶，37'C搅拌消化1小时后，2 8'C放置继续消化5天；
(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于1%乙酸溶液中，离心收集 上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L, 2-8。C沉淀过夜，收集沉淀， 即得胶原蛋白。
实施例2:胶原蛋白的提取制备(1) 取马腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质，切片后用冷纯化 水清洗干净；
(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤2次脱脂、去血清等杂质；
(3) 溶于30倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4%的胃 蛋白酶，37。C搅拌消化l小时后，2 8'C放置继续消化10天；
(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.1%乙酸溶液中，离心收 集上清，加入NaCl至终浓度为lmol/L， 2-8。C沉淀过夜，收集沉淀， 即得胶原蛋白。
实施例3:胶原蛋白的提取制备
(1) 取牛腿肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质，切片后用冷纯化水 清洗干净；
(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤3次脱脂、去血清等杂质；
(3) 溶于50倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4%的胃 蛋白酶，37'C搅拌消化1小时后，2 8"C放置继续消化7天；
(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8t:沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.5%乙酸溶液中，离心收 集上清，加入NaCl至终浓度为1.5mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀， 即得胶原蛋白。
实施例4:神经生长因子海绵剂的制备
(1)将胶原蛋白溶于0.1%乙酸溶液中，制成0.3%胶原蛋白溶液， 于0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)中透析至中性；(2) 在上述胶原蛋白溶液中，加入小鼠颌下腺神经生长因子、人 血白蛋白和甘油，使最终各组份重量百分含量分别为小鼠颌下腺神
经生长因子0.13%，胶原蛋白94.81%，人血白蛋白3.16%，甘油1.90%， 于一3(TC冷冻3天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，3(TC下用戊二醛熏蒸 交联固定24小时；
(4) 切割，真空包装，钴60Y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
实施例5:神经生长因子海绵剂的制备
(1) 将明胶溶于0.5%乙酸溶液中，制成1%明胶溶液，于lmmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.6)中透析至中性；
(2) 在上述明胶溶液中，加入重组人神经生长因子、牛血清白蛋 白和聚乙二醇1000，使最终各组份重量百分含量分别为重组人神 经生长因子1.71%，明胶85.47%，牛血清白蛋白8.55%，聚乙二醇 1000 4.27%，于—80'C冷冻2天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，45"C下用甲醛熏蒸交 联固定1小时；
(4) 切割，真空包装，钴60Y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
实施例6:神经生长因子海绵剂的制备
(1)将市售医用明胶溶于0.5%乙酸溶液中，制成3%明胶溶液， 于lmmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)中透析至中性；(2) 在上述明胶溶液中，加入神经生长因子、人血白蛋白和甘油， 使最终各组份重量百分含量分别为神经生长因子0.01%，明胶
98.84%，人血白蛋白0.49%，甘油0.66%，于一80。C冷冻2天，冻干 得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，37'C下用多聚甲醛熏 蒸交联固定12小时；
(4) 切割，真空包装，钴60Y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
实施例7:神经生长因子海绵剂的制备
(1) 将实施例1制备的胶原蛋白溶于1%乙酸溶液中，制成0.4% 胶原蛋白溶液，于0.2mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)中透析至中性；
(2) 在上述胶原蛋白溶液中，加入重组鼠神经生长因子、人血白 蛋白和聚乙二醇4000，使最终各组份重量百分含量分别为重组鼠 神经生长因子0.48%，胶原蛋白95.24%，人血白蛋白2.38%，聚乙二 醇4000 1.90%，于—20。C冷冻5天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，3(TC下用戊二醛熏蒸 交联固定24小时；
(4) 切割，真空包装，钴60Y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
实施例8:神经生长因子海绵剂的制备
(1)将实施例2制备的胶原蛋白溶于1%乙酸溶液中，制成0.3% 胶原蛋白溶液，于2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中透析至中性；(2) 在上述胶原蛋白或明胶溶液中，加入蛇毒神经生长因子、人 血白蛋白和聚乙二醇6000，使最终各组份重量百分含量分别为蛇
毒神经生长因子0.63%，胶原蛋白94.34%，人血白蛋白3.14%，聚乙 二醇6000 1.89%，于一30'C冷冻5天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，37"C下用多聚甲醛熏 蒸交联固定12小时；
(4) 切割，真空包装，钴60Y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
实施例9:神经生长因子海绵剂的制备
(1) 将实施例3制备的胶原蛋白溶于1%乙酸溶液中，制成0.1% 胶原蛋白溶液，于0.2mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)中透析至中性；
(2) 在上述胶原蛋白或明胶溶液中，加入人胎盘神经生长因子、 人血清白蛋白和甘油，使最终各组份重量百分含量分别为人胎盘神 经生长因子0.35%，胶原蛋白87.41%，人血清白蛋白8.74%，甘油 3.50%，于一3(TC冷冻3天，冻干得到海绵状材料；
(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，3(TC下用多聚甲醛熏 蒸交联固定24小时；
(4) 切割，真空包装，钴60y射线照射灭菌、灭病毒，制得神 经生长因子海绵剂成品。
本申请人对本发明实施例4所述神经生长因子海绵剂(含小鼠颌 下腺神经生长因子0.13%)作了如下性质研究和效果验证取3片切割成大小为2X2X0. 25cm的神经生长因子海绵(理论 净重3.164mg/cm3，含NGF O細mg /cm3)，分别放于具塞试管中， 加入20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 2mL，并加入适量胶原酶(约 50单位/mL)，控制该海绵完全溶解时间为24h。置于37。C培养箱中 孵育，分别于0、 4、 8、 12、 16、 20、 24h，取出10ul，采用ChemiKine Nerve Growth Factor(NGF) Sandwich ELISA Kit (Cat. No. CYT304, CHEMICONB International, Inc.产品)检测NGF含量，将各时相点 NGF含量检测结果与海绵中NGF完全释放的理论含量(2ug/ml)相 比，得出各时相点的累积释放率及累积释放率-时间曲线。
结果如表1和图1， l一累积释放率-时间曲线拟合后符合一级方 程释药数学模型Ln(l-爽/l)二一;rt。释药方程为Y=—0.399Ln(X) + 4.992， R2=0.9917。结果显示神经生长因子海绵剂能较好的缓释NGF。 图1为神经生长因子海绵剂NGF累积释放率-时间曲线图。
表1神经生长因子海绵剂体外释放度试验结果时间(h)04812162024
0.240.661.051.411.631.811.93
NGF浓度(ug/ml)0. 260. 641.091.391. 591.731.82
0. 250.611.001, 301. 501.661.77
NGF浓度均值 (ug/ml)0. 250. 641.051. 371. 571. 731.84
RSD (%)4. 003.954. 314. 294. 234. 334.45
累积释放率(％)12. 331.952.368.478.586.791.8
l-累积释放率(％)87. 768. 147.731. 621. 513.38.2
2、神经生长因子海绵剂对大鼠外周神经损伤的修复作用(1)材料与方法
取清洁级健康成年SD大鼠50只，体重150 200g，雌雄不限， 随机分为5组，即生理盐水对照组、胶原海绵组、神经生长因子组、 神经生长因子海绵剂组和假手术组，每组10只。
大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg)，取右侧股后部 纵形切口，切开皮肤，分离肌肉，由股后外侧肌间隙显露右侧坐骨神 经，距梨状肌下缘8mm处用双面刀片切断坐骨神经，在显微镜下以神 经表面血管为解剖标志对位，用11-0显微缝线缝合神经外膜。生理 盐水对照组肌注生理盐水，l次/日，0.5ml/次，连续4周；神经生 长因子组肌注小鼠颌下腺神经生长因子(8ug/ml) ， l次/日，0.5m1/ 次；胶原海绵组用2X2X0. 25cm大小的胶原海绵包裹受损神经处； 神经生长因子海绵剂组用2X2X0. 25cm大小的神经生长因子海绵剂 (含小鼠颌下腺神经生长因子4ug/cm3)包裹受损神经处。假手术组 不切断坐骨神经，术后不做任何处理。
检测指标①肉眼观察各组动物手术后第2、 5、 8周观察伤口 情况及足部变化，记录右后肢肌肉萎縮程度。每次取标本前分别观察
神经吻合口与周围组织的关系及海绵基质降解情况。②组织学观察
术后2、 5、 8周(8周组于电生理检查，肌张力、肌湿重检测后)， 各组8只大鼠取右侧坐骨神经，置于福尔马林溶液内固定，用石蜡包 埋，在吻合口近、远段各lcm处做横切片，中段做纵切片，经伊红 和劳克坚牢蓝染色，进行组织学观察。同时取左侧相对应位置的一段 坐骨神经，同法固定、包埋、切片及染色，以作对照观察。③神经电生理检査测定实验动物两侧坐骨神经的潜伏期，诱发电位的波幅及 神经传导速度。计算手术侧坐骨神经运动神经潜伏期延迟率、波幅恢 复率和神经传导速度恢复率。④肌张力测定在跟腱止点处将两侧腓 肠肌切断并稍作游离，通过3/0丝线连接于肌张力换能器上，记录两 侧腓肠肌等长收缩时最大强直收縮张力，并计算手术侧肌张力恢复 率。⑤肌湿重测定迅速取双侧腓肠肌，用精密电子天平称重，计算 手术侧腓肠肌湿重恢复率。
第1项检测指标"肉眼观察"以假手术组为参照进行观察。后4 项指标仅评价除假手术组外的其余4组，该4组动物均以自身左侧未 损伤坐骨神经为参照，进行观察或计算。数据以均数士标准差表示， 采用F检验。
(2)结果
①肉眼观察各组大鼠术后伤口愈合良好，未出现感染、伤口裂 开或伤亡。术后2周各组右后肢关节僵直，趾爪蜷缩，假手术组右后
肢关节活动正常。术后5、 8周对照组、胶原海绵组右后肢肌肉萎縮，
神经生长因子组和神经生长因子海绵剂组肌肉萎縮程度较轻，假手术
组肢体正常。术后5周胶原海绵组和神经生长因子海绵剂组海绵基质
已完全降解吸收，神经吻合口处与周围组织间无粘连及分离现象，对 照组和神经生长因子组神经吻合口处与周围组织粘连较明显。②光镜
观察术后2周各组吻合口远侧轴索及髓鞘分解，雪旺细胞增生，呈 退行性变性；术后5周各组轴突再生，排列较松散，未形成束状结构； 术后8周神经生长因子海绵剂组再生轴突大都形成髓鞘，束状结构明显，神经生长因子组次之，而胶原海绵组和对照组明显差于前两组。 胶原海绵组和神经生长因子海绵剂组吻合口处光镜下未见明显炎症 反应或异物反应表现。③神经电生理检査、肌张力检测及肌湿重检测 结果如表2所示，术后8周运动神经潜伏期延迟率、神经传导速度 恢复率、肌张力恢复率、肌湿重恢复率神经生长因子海绵剂组分别与
对照组和胶原海绵组比较差异有显著性(尸<0.01或尸<0.05)，神
经传导速度恢复率、肌张力恢复率、肌湿重恢复率神经生长因子海绵
剂组与神经生长因子组比较差异有显著性(尸<0.05)。
实验结果证实神经生长因子海绵剂可促进大鼠坐骨神经损伤后 的神经功能恢复，其作用效果明显优于神经生长因子肌注组，能有效 治疗神经组织损伤。
表2术后8周大鼠神经电生理检查、肌张力检测及肌湿重检测结果(n-8， S土s)
运动神经潜伏运动神经波幅神经传导速度肌张力恢复率肌湿重恢复率 期延迟率(％) 恢复率(°/。) 恢复率(°/。) (％) (%)
牛理盐水
5=口 B3.39士21.42 25.74±11.92
对妝組
62.30±4.99 76.56±2.53 48.89±3.42 胶原海绵组129.63士17.6531.99±13.21 63.27±5.24 78.06±2.42 49.42±3.56
77.13±5.41*A83.61±3.36*A 57.61±2.89*厶
神经生长
IiS口 117.58±18.83 34.73±14.42
因子组
跳27土17.43" 42.20±13.65 89.07±4.82， 88.53±2.83*， 70.07±3.46**厶厶#
子海绵剂组__
注与对照组比较，><0.05， **尸<0.01;与胶原海绵组比较，A尸〈0.05,
^尸<0.01; 与神经生长因子组比较，"/^0.05。
权利要求
1、一种神经生长因子海绵剂，其特征在于，该海绵剂包括0.01～2％重量百分含量的神经生长因子和胶原海绵或明胶海绵基质，所述神经生长因子经醛类交联剂交联固定在胶原海绵或明胶海绵基质上。
2、 根据权利要求1所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于，所述胶原海绵或明胶海绵基质中含有85~99%所述海绵剂重量百分含量的胶原蛋白或明胶；0.3%~9%所述海绵剂重量百分含量的蛋白保护剂；0.5% 5%所述海绵剂重量百分含量的增塑剂。
3、 根据权利要求1所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述醛类交联剂为甲醛、多聚甲醛或戊二醛。
4、 根据权利要求1或2所述一种神经生长因子海绵剂，其特征 在于，所述神经生长因子为动物源性神经生长因子或采用基因工程重 组技术制备的神经生长因子。
5、 根据权利要求4所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述动物源性神经生长因子为人胎盘神经生长因子、小鼠颌下腺神经 生长因子或蛇毒神经生长因子。
6、 根据权利要求4所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述采用基因工程重组技术制备的神经生长因子为重组人神经生长 因子或重组鼠神经生长因子。
7、 根据权利要求2所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述蛋白保护剂为人血白蛋白或牛血清白蛋白。
8、 根据权利要求2所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于，所述增塑剂为甘油或聚乙二醇。
9、 根据权利要求8所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述聚乙二醇为聚乙二醇1000、聚乙二醇4000、或聚乙二醇6000。
10、 根据权利要求2所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述胶原蛋白为采用以下方法制备的(1) 取猪腿、牛腿或马腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质， 切片后用冷纯化水清洗干净；(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤2 3次脱脂、去血清等杂质；(3) 溶于30 60倍体积的1%乙酸溶液中，加入终浓度为0.4% 的胃蛋白酶，37'C搅拌消化1小时后，2 8。C放置继续消化5 10天；(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.1~1%乙酸溶液中，离心 收集上清，加入NaCl至终浓度为1 2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集 沉淀，即得胶原蛋白。
11、 根据权利要求2所述一种神经生长因子海绵剂，其特征在于， 所述明胶为市售医用明胶。
12、 一种制备权利要求2所述神经生长因子海绵剂的制备方法， 其特征在于，该方法包括如下步骤-(1) 将胶原蛋白或明胶溶于0.1%~1%乙酸溶液中，制成0.1 3% 胶原蛋白或明胶溶液，于0.2~2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4 8.0) 中透析至中性；(2) 在上述胶原蛋白或明胶溶液中，加入神经生长因子、蛋白 保护剂和增塑剂，使最终各组份重量百分含量分别为神经生长因子(0.01~2%，胶原蛋白或明胶85~99%，蛋白保护剂0.3% 9%，增塑剂 0.5% 5%，于一80 一20。C冷冻2 5天，冻干得到海绵状材料；(3) 将上述海绵状材料置于气体发生器中，30 45'C下用醛类交 联剂熏蒸交联固定1 24小时；(4) 切割，真空包装，灭菌、灭病毒，制得神经生长因子海绵 剂成品。
13、 根据权利要求12所述神经生长因子海绵剂制备方法，其特 征在于，步骤(1)中所用的胶原蛋白是采用以下方法制备的-(1) 取猪腿、牛腿或马腿的肌腱，去除表皮层、脂肪等杂质， 切片后用冷纯化水清洗干净；(2) 用20%氯化钠浸泡洗涤2~3次脱脂、去血清等杂质；(3) 溶于30 60倍体积的1°/。乙酸溶液中，加入终浓度为0.4% 的胃蛋白酶，37'C搅拌消化1小时后，2 8"C放置继续消化5 10天；(4) 将消化液离心，收集上清，加入NaCl至终浓度为2mol/L， 2 8。C沉淀过夜，收集沉淀；将沉淀重溶于0.1~1%乙酸溶液中，离心 收集上清，加入NaCl至终浓度为l~2mol/L， 2 8"C沉淀过夜，收集 沉淀，即得胶原蛋白。
14、 根据权利要求12所述神经生长因子海绵剂制备方法，其特 征在于，步骤(1)中所用的明胶为市售医用明胶。
15、 根据权利要求12所述神经生长因子海绵剂制备方法，其特 征在于，步骤(3)中醛类交联剂为甲醛、多聚甲醛或戊二醛。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种神经生长因子海绵剂及其制备方法。该海绵剂包括0.01～2％重量百分含量的神经生长因子和胶原海绵或明胶海绵基质，所述神经生长因子经醛类交联剂交联固定在胶原海绵或明胶海绵基质上。该海绵剂能使神经生长因子以有效剂量长时间持续地释放到神经病变或创伤组织局部位置，发挥有效治疗神经组织损伤的作用。
文档编号A61K9/00GK101612113SQ20091006283
公开日2009年12月30日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者李汝霖, 汤华东, 亚 陈 申请人:武汉海特生物制药股份有限公司