专利名称：附红细胞体裸鼠感染模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及的是一种预防医学领域的疾病动物模型的构建方法，具体涉及一种附 红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法。
背景技术：
附红细胞体(Eperythrozoon)病是由EH引起多种哺乳动物感染的一种常见传染 病，对畜牧业生产造成巨大危害，同时近年来越来越多的人感染EH的病例报告以及流行病 学调查证实EH感染严重威胁人类健康，并将其定义为一种新发人兽共患病，构成潜在的公 共卫生问题。该病原主要寄生于人和动物的红细胞表面、血浆及骨髓中，以贫血、黄疸、发热 等为主要临床症状。并有隐性感染、慢性迁延、条件致病、急性发病时致死率高的特征。因 此，建立一个稳定的附红细胞体病感染特点的动物模型对于研究该病的致病机理，免疫学， 流行病学都尤为重要。经过对现有方法的文献检索发现，附红细胞体动物模型的研究主要是通过以附红 细胞体的全血感染切脾或注射地塞米松的实验动物来获得。如刘冰等在2007年《中国兽 医科学》37期12-15页中，描述了一种附红细胞体裸鼠感染模型的建立方法。利用摘除脾或 注射地塞米松的昆明小白鼠，以腹腔注射方式人工感染附红细胞体全血建立了附红细胞体 感染模型，这种方法虽然可以建立附红细胞体的动物模型，但是，此模型存在两个缺陷(1) 采用全血作为感染源会将白细胞等其它血液组分一起注射至实验动物体内，而这些血液组 分对实验动物来讲是一大类免疫原，将会严重影响试验结果。(2)采用免疫抑制剂或切脾等 状态下的建立动物模型，步骤繁琐且容易引起外伤感染。因此，如果一个动物模型可以稳定 地复制出附红细胞体感染，并且能克服这两个缺陷，对附红细胞体的深入研究将具有独特 的价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题，本发明提供一种附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方 法。本发明采用分离纯化的附红细胞体作为感染源通过静脉注射SPF裸鼠得到。本发明是通过以下技术方案实现的本发明包括以下步骤①从感染附红细胞体病的抗凝血中分离纯化出附红细胞体；所述的分离纯化的附红细胞体是指从附红细胞体感染血液中通过热处理(50度 处理10分钟)，将附红细胞体与红细胞解离，梯度离心分离附红细胞体重悬于无菌的生理 盐水中，此悬液为分离纯化的附红细胞体悬液。②裸鼠的饲养，饲养于熏蒸消毒的隔离室内；③对裸鼠静脉接种；所述的对裸鼠静脉接种，是指对裸鼠接种纯化的附红细胞体悬液，具体为对7周 龄SPF裸鼠尾静脉注射IOOul纯化的附红细胞体悬液，其中附红细胞体数目大于等于IO7
④动物模型的检测，验证附红细胞体裸鼠感染模型显示出附红细胞体感染红细胞 的结构。所述的检测，是包括鲜血压片镜检，PCR检测和透射电镜镜检三步法的综合检测。其中PCR检测引物是根据附红细胞体16S rRNA序列设计，上游为 5 ‘ -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3 ‘，下游为5 ‘ -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3 ‘.可扩增出长度 为396bp的片段。根据上述步骤，通过三种检测方法验证，证实本发明中附红细胞体SPF裸鼠感染 模型构建成功。所述的感染，以分离纯化的附红细胞体作为感染源。由于感染源单一，使模型的建 立更为标准和稳定。所述的接种，是指静脉注射，对实验动物无需进行切脾手术或者注射 地赛米松等也能获得较高的感染率。所述的裸鼠为一种免疫缺陷型无胸腺裸鼠，有利于病 原在动物体内复制。本发明完全弥补了目前附红细胞体动物模型构建的缺陷，是一种理想的动物模 型。本发明的意义在于该模型可以用于附红细胞体病的致病机理，免疫学，流行病学等方面 的提供研究依据和实验手段。
具体实施例方式以下对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。SPF裸鼠，即无特定病原(Specific pathogen free animal, SPF)裸鼠的简称。为 实验用鼠的一个国际通用标准级别，适用于大部分实验研究。实施例1附红细胞体SPF裸鼠感染模型的构建(1)分离纯化附红细胞体首先无菌采集患有附红细胞体抗凝血200ml，2000r/min离心lOmin，去上清。将沉 淀红细胞泥加入等体积生理盐水重悬为红细胞悬液。在新的离心管中加入等体积的淋巴细 胞分离液和红细胞悬液，2500r/min离心20min，去最上层和中间的白细胞层，取下层红细 胞层。用等体积的生理盐水重悬红细胞层，50°C水浴15min后，油镜下可观察到附红细胞体 与红细胞分离，此时用2000r/min离心lOmin，取上清于一离心管。将沉淀重悬于生理盐水 中再2000r/min离心lOmin，取上清。将两次所得的上清一起收集，12000r/min离心，去上 清。将沉淀重悬于适量生理盐水中，即为纯化的附红细胞体悬液。O) SPF裸鼠的饲养试验前隔离室和饲养裸鼠的鼠笼需彻底消毒。先用来苏尔溶液擦拭隔离室地 面、门、窗和鼠笼，用紫外光照射12小时，然后对饲养裸鼠的房间进行熏蒸。首先测量房间 的体积大小，按福尔马林30毫升/立方米、高锰酸钾15克/立方米和水15毫升/立方米 计算用量。在房间熏蒸消毒之前，检查房间的密闭性。熏蒸时，先将水倒入陶瓷容器内，后 加入高锰酸钾，搅拌均勻，再加入福尔马林，人即离开，密闭房间。熏蒸消毒M小时以上，然 后换气通风。实验开始时，工作人员进入隔离室前，都必须进行手臂部消毒(1 1000稀释的新洁尔灭)，然后换上无菌工作服和口罩。7周龄裸鼠购自中国科学院上海试验动物中心，饲 喂灭菌鼠粮和灭菌水。SPF裸鼠分为对照组和感染组各30只，分别饲养在不同的隔离室。(3)接种采取尾静脉注射接种法，感染组每只裸鼠均接种IOOul纯化的附红细胞体悬液 (IOOul悬液中附红细胞体数目不少于IO7个)。对照组每只裸鼠接种IOOul无菌生理盐水。(4)鲜血压片检测感染3天后，分别将感染组和对照组裸鼠进行尾静脉采血，将采集的血液压片，在1000倍油镜下观察，可看到感染组裸鼠红细胞均出现明显变形。而对照 组的裸鼠红细胞为正常的双凹状。(5) PCR 检测根据附红细胞体16S rRNA序列设计特异性引物，上游为 5' -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3‘，下游为5' -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3‘.实验组和对照 组裸鼠分别心脏采血lml，按基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明提取模板DNA。PCR反 应体系为IXPCR buffer, 1. 5mM MgC12，250uM NTPs，12. 5pmole 引物，1. 25U Taq DNA聚合 酶和 Iul 模板 DNA。反应条件为94°C 5min 后，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，进行 36 个循 环后72°C延伸lOmin，实验组的样本均可扩增出长度为233bp的片段，经上海生工生物公司 测序后证明此片段为附红细胞体。而对照组样本不能扩增出相应条带。(6)透射电镜检测将实验组裸鼠尾静脉血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三 次，1 %锇酸固定液固定2-3h，再用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次。分别用50%乙醇，70% 乙醇，90%乙醇，90%乙醇90%丙酮(1 1)，90%丙酮和100%丙酮进行梯度脱水。丙酮 加包埋液逐级浸透，包埋。用Leica (徕卡)-ULTRACUT超薄切片机切片机切片厚度为60nm，3 %醋酸铀-枸橼 酸铅双染色后，用HitachU日立)-7650透射电子显微镜观察，拍片(X 10000)。从图片中 可以观察到附红细胞体可以疏松地结合在红细胞表面，而不贯穿红细胞膜。附红细胞体附 着在红细胞表面导致红细胞膜内陷，附红细胞体则嵌在内陷的红细胞膜中，附红细胞体与 红细胞膜之间有一定间隙(如
图1)。本实施例成功构建了附红细胞体病SPF裸鼠感染模型，该模型可用于该病的致病 机理，免疫学，流行病学等方面的研究。
权利要求
1.一种附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于步骤如下①从感染附红细胞体病的血中分离纯化出附红细胞体，从附红细胞体病血中分离出来 的附红细胞体重悬于无菌的生理盐水中，此悬液为分离纯化的附红细胞体悬液；②裸鼠的饲养，饲养于熏蒸消毒的隔离室内；③对裸鼠静脉接种，对裸鼠接种纯化的附红细胞体悬液，具体为对7周龄SPF裸鼠尾 静脉注射IOOul纯化的附红细胞体悬液；④动物模型的检测，验证附红细胞体裸鼠感染模型显示出附红细胞体感染红细胞的结构。
2.如权利要求1所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所述的附 红细胞体悬液中附红细胞体数目大于等于IO7个。
3.如权利要求1所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所述的感 染是以分离纯化的附红细胞体作为感染源。
4.如权利要求1所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所述的接 种是指静脉注射。
5.如权利要求1所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所述的检 测包括鲜血压片镜检、PCR检测和透射电镜镜检三步法的综合检测。
6.如权利要求1或5所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所述 的鲜血压片检测是指感染3天后，分别将感染组和对照组裸鼠进行尾静脉采血，将采集的 血液压片，观察。
7.如权利要求1或5所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所 述的PCR检测，其的引物是根据根据附红细胞体16S rRNA序列设计特异性引物，上游为 5' -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3‘，下游为5' -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3‘.
8.如权利要求1或5所述的附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于所 述的透射电镜检测，是指将实验组裸鼠尾静脉血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷 酸漂洗液漂洗三次，锇酸固定液固定2-!3h，再用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，梯度脱 水，逐级浸透，包埋，切片，观察。
全文摘要
本发明涉及的是一种预防医学领域的疾病动物模型的构建方法，具体涉及一种附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法，其特征在于步骤如下(1)附红细胞体的分离纯化；(2)SPF裸鼠饲养于熏蒸消毒的隔离室中；(3)接种；(4)动物模型检测评估。本发明完全弥补了目前附红细胞体动物模型构建的缺陷，是一种理想的动物模型。本发明的意义在于该模型可以用于附红细胞体病的致病机理，免疫学，流行病学等方面的提供研究依据和实验手段。
文档编号A61P33/02GK102068462SQ20091019922
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者王志超 申请人:上海瑞基生物科技有限公司