腺病毒向性的调节的制作方法

专利名称：腺病毒向性的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及腺病毒，并且特别涉及降低腺病毒对肝细胞的向性的方法。
背景技术：
腺病毒是肿瘤学、心血管学、再生医学中实验上以及完成的和进行的临床试验 中用于基因递送和作为疫苗载体使用的常见病原体(Schenk-Braat etal.，2007 ； Kawabata etal, 2006)。许多工作已经在临床前和临床上证明了腺病毒介导的基因疗法的潜在益处 和局限性，后者是通过1999年Jesse Gelsinger由于直接递送入肝动脉的极高剂量的5型腺 病毒(Ad5)而导致的死亡而引起重视(Raper et al.，2003)。这显著地突出了在载体可以 完全优化用于临床用途之前，充分理解界定了腺病毒的肝感染性以及体内毒性的病毒学和生物学方的需要。
已经广泛研究了基于人血清型5的腺病毒，但是关于感染机制，特别是体内感 染机制的根本问题仍待阐明。腺病毒主要由三种主要的衣壳蛋白组成六邻体、五邻体 和纤维。已经解析了 Ad2和Ad5六邻体的晶体结构(Athappilly et al., 1995 ； Roberts et al., 1986 ； Rux andBurnett, 2000)，并且其揭示了复杂的结构。腺病毒中主要的抗原性 位点六邻体(Pichla-Gollon，2007 ； Roberts et al., 2006 ； Sumida et al.，2005)是最丰富 的衣壳蛋白，并且位于病毒体的表面，排列成与相邻的单体相互连接的240同源三聚体 结构，因而提供了结构支持。与衣壳表面的五邻体基座衔接从病毒体突出的纤维(San Martin and Burnett, 2003)长度高度可变，并且被认为是决定细胞感染性的主要位点[综 述于(Nicklin et al., 2005)]。对于包括Ad5的亚群C腺病毒，位于三聚体纤维轴末端处 的球状纤维结与柯萨奇病毒(coxsackie)和腺病毒受体结合，并且在小鼠和人中以解剖学 上相似的方式表达(Bergelson et al., 1997 ； Tomko et al., 1997)，而亚群B腺病毒则利用 普遍地在人中表达但局限于小鼠的睾丸中的CD46 (Gaggar et al., 2003 ； Segerman et al., 2003)，Ad5内化是由整联蛋白与五邻体基座的衔接所介导(Wickham etal.，1993)。广泛 的研究工作主要集中于用于不同基因疗法应用中细胞相互作用的分析的纤维蛋白。血管内递送后，其是许多临床应用中重要的给药途径，肝是具有大量肝细胞 转导的Ad5隔绝(sequestration)的主要位点(Huard et al.，1995)。在啮齿类和非人灵 长类中，经诱变改造而缺乏CAR结合的Ad5载体在血管内注射后表现出相同的肝转 导(Alemany and Curiel，2001 ； Smith et al.，2003)，这表明了体内基因转移的替代途 径。利用离体灌注模型，包括凝血因子IX(FIX)与补体结合蛋白_4(C4BP)的许多 血浆蛋白被证明在肝中结合Ad纤维节并“桥接”病毒与替代受体，因而潜在地绕过 CAR(Shayakhmetov et al., 2005)。利用表面等离子体共振(SPR)，我们证实Ad5与维生 素K依赖性凝血因子X(FX)直接结合(Parker et al., 2006)。在用华法林预处理(去除 维生素K依赖性凝血因子的功能性水平)的小鼠中，对于CAR结合Ad5载体与CAR结 合突变体Ad5载体，肝感染都降低了几个数量级(Parker etal.，2006 ； Waddington etal., 2007)，这表明了肝靶向中宿主因子的重要功能。在静脉内Ad5注射前，向华法林处理的 小鼠注射生理水平的FX完全恢复了肝基因转移(Parker et al., 2006 ； Waddington et al.,2007)。FX还涉及脾的转导(Waddington et al.，2007)，脾的转导也可以促进腺病毒基因 递送载体的毒性。发明概述本发明部分源自将六 邻体，特别是六邻体的高变区(HVR)鉴定为主要负责与因 子X(FX)相互作用的病毒部分，该因子X介导体内肝细胞以及其他细胞类型的腺病毒感 染，所述其他细胞类型的转导由FX介导，诸如脾细胞。本发明人还将FX的Gla结构域 鉴定为参与该相互作用。这些发现使提供以下成为可能尤其是调节肝细胞和脾细胞的 腺病毒转导的方法，例如，通过稳定、增强、抑制或破坏FX与腺病毒之间的相互作用； 筛选能够调节该相互作用的新试剂的方法；以及具有对肝细胞与脾细胞的改变的向性的 新腺病毒和产生及鉴定这些新病毒的方法。本发明提供了抑制FX介导的细胞的腺病毒转导的方法，该方法包括使所述细胞 与所述腺病毒在能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂的存在下接触。因此，本发明提供了抑制肝细胞或脾细胞的腺病毒转导的方法，该方法包括使 所述肝细胞或脾细胞与所述腺病毒在能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的 试剂的存在下接触。应当理解，本发明的方法发现了特定的体内用途，特别是减少个体中肝细胞或 脾细胞的腺病毒感染或转导的用途，所述腺病毒是有意地向该个体给药，例如用于治疗 目的。因此，所述方法可以包括将所述试剂和所述腺病毒给予个体。在腺病毒给药前，将个体用所述试剂预处理是可取的，特别是当该试剂与FX 结合时。最优的预处理时间可以根据诸如个体的个性和物种、试剂的个性等的因素来确 定。因此，例如，预处理可以在给药的1小时内进行，例如，给药前30分钟或更少。可 选地，预处理可以在所述给药前至少1、2、3、4、5、6小时或更长。可选地，将试剂与腺病毒预混合是可取的，特别是当该试剂与腺病毒结合时。 混合可以在给药的1小时内进行，例如给药前30分钟或更少。可选地，预混合可以在所 述给药前至少1、2、3、4、5、6小时或更长。本发明还涉及体外或离体实施的方法。这些方法在含有FX的环境中实施，通常 为培养基。可以向培养基中单独地添加FX，或者FX可以为诸如血清(如，胎牛血清， FCS)的培养基的大量补充物的部分。对于体外实施的方法，腺病毒含有抑制腺病毒与柯萨奇病毒和腺病毒受体 (CAR)结合的突变是可取的。例如，这通过降低其它机制的细胞感染发生率，可以便于 FX与Gla之间的相互作用的研究。可选地，使用不具有CAR表达或具有低CAR表达的细胞类型是优选的，例如 SKOV3细胞。关于体外或体内实施的方法，抑制剂可以与FX的Gla结构域结合。例如，所述试剂可以是来自尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)的FX结合蛋白 (X-bp)、其类似物或以上任一的功能片段，所述功能片段能够与FX结合并抑制与六邻 体蛋白的相互作用的。与FX结合的抑制剂的另一实例是特异性针对FX的抗体，特别是特异性针对FX 的Gla结构域的抗体。然而，应当理解，抗体与Gla结构域直接结合以使其抑制Gla与六邻体之间的相互作用不是必须的。例如，抗体可以与FX分子的另一表位结合，该表 位在折叠的分子中与Gla结构域足够接近从而该抗体在空间上干扰Gla与六邻体的结合。 可选地，抗体可以间接地干扰相互作用，例如通过影响Gla分子的构象或三维结构。另一实例是包含能够与FX Gla结合的腺病毒六邻体蛋白片段的可溶分子。该分 子可以是全长六邻体蛋白或者可以包含全长六邻体蛋白。可选地，抑制剂可以与腺病毒六邻体蛋白结合。例如，抑制剂可以是特异性针对六邻体蛋白的抗体，特别是特异性针 对六邻体 蛋白的HVR的抗体。如上文关于Gla已经解释的，应当理解，抗体与HVR直接结合以 使其抑制Gla与六邻体之间的相互作用不是必须的。例如，抗体可以与六邻体分子的另一 表位结合，该表位在折叠的分子中与HVR结构域足够接近从而该抗体在空间上干扰Gla 与六邻体的结合。可选地，该抗体可以间接地干扰相互作用，例如通过影响六邻体分子 的构象或三维结构。能够与腺病毒六邻体蛋白结合的抑制剂的另一实例是FX类似物，其包含足以与 六邻体蛋白结合的Gla结构域片段，但是包含SP结构域的修饰，从而该类似物不能介导 腺病毒与肝细胞或脾细胞之间的相互作用。例如，该类似物可以包含SP结构域的硫酸 类肝素蛋白多糖结合胞外区(exocyte)中的突变，该突变减少或去除与肝细胞或脾细胞的 结合。可选地，FX类似物可以完全缺乏SP结构域。FX类似物可以包含完整的FXGla 结构域，但是缺乏一个或多个结构域，包括SP结构域，以及任选的EGF2结构域和/或 EGFl结构域。例如，FX类似物可以包含由Gla结构域单独组成、由Gla-EGFl组成或 由Gla-EGF1_EGF2组成的FX组分。FX类似物可以是融合蛋白，该融合蛋白包含FX组 分(例如单独的Gla结构域、Gla-EGFl或Gla-EGF 1-EGF2)和异源融合伴侣(即不源自 FX的蛋白或蛋白结构域)。腺病毒或六邻体蛋白可以是任何合适的血清型的。在某些实施方案中，其可以 是Ad2或Ad5六邻体蛋白。本发明的方法特别适用于作为或意图用作基因转移载体的腺病毒。本发明还提供了能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂在药物 制备中的用途，目的是抑制由腺病毒造成的肝细胞或脾细胞的感染。本发明还提供了能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂，目的 用于抑制由腺病毒造成的肝细胞或脾细胞的感染。本发明还提供了能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂，目的 用于医疗方法。上文列出了本发明的这些方面的优选特征。可以将如本说明书中所述的抑制剂配制为药物组合物和试剂盒。因此，本发明 提供了药物制剂，其包含能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间相互作用的试剂和腺病 毒，每个都与制药上可接受的载体组合。可以将抑制剂与腺病毒配制为单独给药或共同给药，以及配制在相同的或不同 的组合物中。本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包含第一组合物，其包含能够抑制FX与腺病 毒六邻体蛋白之间相互作用的试剂和腺病毒，以及包含腺病毒的第二组合物。优选地，每个组合物为包含各自的活性组分(抑制剂或腺病毒)以及制药上可接受的载体的药物组 合物。可以将组合物提供在单独的容器中，任选地带有给药说明书。六邻体蛋白与FX的Gla结构域之间的相互作用的知识还使将腺病毒靶向于所选 的组织或细胞类型的方法成为可能。因此，本发明提供了将基因递送至靶细胞或靶组织 的方法，该方法包括使所述细胞或组织与腺病毒基因转移载体以及靶向剂接触，其中所 述靶向剂包含能够与腺病毒基因转移载体的六邻体蛋白结合的FX Gla结构域片段，所述 转移载体与能够与所述靶细胞或靶组织结合的结合剂相连接。靶向剂可以包含FX组分，该FX组分包含完整的FX Gla结构域。所述FX组 分还可以包含FX的一个或多个其它结构域，如EGFl和/或EGF2。因此，FX组分可 以包含 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2，或者由 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2 组成。通
常，FX组分不包含FX SP结构域。如果存在SP结构域，则其通常包含修饰，从而其不 能介导腺病毒与肝细胞或脾细胞之间的相互作用，例如SP结构域的硫酸类肝素蛋白多糖 结合胞外区中的突变，其减少或去除与肝细胞或脾细胞的结合。结合剂与FX组分是异源的，即所述结合剂不包含源自FX的组分。所述结合剂 能够与存在于靶细胞或靶组织上的或与靶细胞或靶组织相关联的结合伴侣结合。例如， 所述结合剂可以包含表达于靶细胞或靶组织表面的分子的配体或受体，或其足以结合的 片段。例如，所述结合剂可以包含特异性针对表达于细胞或组织表面的任何分子的抗体 或适体、表达于细胞或组织表面的受体的配体、能够与存在于细胞或组织表面的碳水化 合物结合的凝集素，或者任何其它合适的分子。因此，结合剂所结合的结合伴侣可以是由细胞或组织表达的并且位于细胞或组 织表面的分子。优选地，结合伴侣对于靶细胞类型是特异性的，即专门地或优先地表达 于靶细胞的表面。例如，当靶细胞为转化的细胞时(如癌细胞或肿瘤细胞)时，结合伴 侣可以为对于该转化的细胞特异性的抗原。这些抗原通常称为肿瘤特异性抗原，但该术 语不应当用来暗示靶细胞必须为实体瘤。靶细胞可以为任何类型的转化的细胞。优选地，结合剂共价连接到FX组分。在某些实施方案中，靶向剂为包含单一多 肽链的融合蛋白，所述多肽链包含结合剂与FX组分。肽连接(linker)可以存在于结合剂 与FX组分之间。在腺病毒给药前，将个体用所述靶向剂预处理是可取的。最优的预处理时间可 以根据诸如个体的个性和物种、靶向剂的个性等的因素来确定。因此，例如，预处理可 以在给药的1小时内进行，例如，给药前30分钟或更少。可选地，预处理可以在给药前 至少1、2、3、4、5、6小时或更长。可选地，将靶向剂与腺病毒预混合是可取的。混合可以在给药的1小时内进 行，例如给药前30分钟或更少。可选地，预混合可以在给药前至少1、2、3、4、5、6 小时或更长。靶细胞通常不是肝细胞或脾细胞，靶组织通常不是肝或脾。然而，通过使用合 适的结合剂，所述方法可以适用于增加基因转移载体向肝细胞或脾细胞的靶向。本发明还提供上文所述的靶向剂在药物制备中用于通过腺病毒向靶细胞或靶组织进行基因转移的用途。本发明还提供了上文所述的靶向剂，目的用于通过腺病毒向靶细胞或靶组织进行基因转移。本发明还提供了上文所述的靶向剂，目的用于医疗方法。还可以将上文所述的靶向剂配制为药物组合物和试剂盒。因此本发明提供了药 物制剂，其包含上文所述的靶向剂和腺病毒，每个都与药学上可接受的载体组合。可以将靶向剂与腺病毒配制为单独给药或共同给药，以及配制在相同的或不同 的组合物中。本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包含第一组合物，其包含上文所述的靶向 齐U，以及包含腺病毒的第二组合物。优选地，每一组合物是包含各自的活性组分(靶向 剂或腺病毒)以及药学上可接受的载体的药物组合物。可以将组合物提供在单独的容器 中，任选地带有给药说明书。腺病毒六邻体蛋白(特别是HVRs)和Gla结构域已经被鉴定为介导腺病毒与FX 之间的相互作用的重要因子。因此，这使筛选能够调节该相互作用的试剂成为可能。例如，如上文所述，能够抑制或破坏该相互作用的试剂会发现在减少肝细胞和其它细胞类 型的腺病毒转导的方法中的用途，所述其它细胞类型的转导由FX介导，例如脾细胞。相 反，能够促进(例如稳定或增强)该相互作用的试剂会发现在将腺病毒载体靶向于肝细胞 以用于向肝进行基因转移，和诸如脾细胞的细胞类型，以用于向诸如脾的其它组织进行 基因转移中的用途，例如，用于肝功能障碍或感染的治疗。因此，本发明提供了筛选能够调节例如肝细胞或脾细胞的FX介导的腺病毒转导 的试剂的方法，该方法包括使测试剂与包含能够与FX结合的腺病毒六邻体蛋白片段的第 一物质以及包含能够与腺病毒六邻体蛋白结合的FX Gla结构域片段的第二物质接触，并 测定所述六邻体片段与所述FX Gla片段之间的结合。第一物质可以包含能够与FX Gla结合的六邻体蛋白的任何片段。例如，第一物 质可以包含单一分离的HVR，或者任选地具有中间支架(scaffold)序列的两个或更多(例 如2、3、4、5、6或7)HVRs，或者完整的六邻体蛋白。第一物质可以为来自诸如Ad2或Ad5的任何合适的血清型的野生型六邻体蛋白 或其片段。可选地，第一物质相对于野生型六邻体蛋白在支架或HVRs中可以含有一个 或多个突变或修饰。例如，第一物质在HVRs中可以含有一个或多个点突变，所述点突 变相对于对应的野生型HVR的调节与FX的结合。例如，第一物质在对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在 下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr269、Thr270和 Glu271]的残基处可以含有一个或多个突变(例如取代、缺失或添加)。这些位于HVR5 中。第一物质在对应于Ad5六邻体蛋白的Ile420、Asn421、Thr422、Glu423、Thr424、 Leu425、Asp447或Lys448[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列 中表示为 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和 Lys449]的残 基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7中。另外地或者可选地，第一物质在对 应于Ad5六邻体蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Glu451、Arg453和Val454]的残基处可以含有一个或多个 突变。这些位于HVR7侧翼的支架序列中。另外地或者可选地，第一物质在对应于Ad5 六邻体蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216, Ser267、Met314、Asn421、Thr426、Ser446或Aot449[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列中 表示为 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、 Ser447和Asn450]的残基处可以包含一个或多个突变。可以使用调节，特别是降低与FX 的结合的任何突变。例如，母体或野生型残基可以由存在于来自具有较低的FX亲和力 或者较低的转导肝细胞或脾细胞的能力的血清型的腺病毒的对应位置的残基所代替。例 如，可以使 Ad5 中的残基与来自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48之一的残基交换。第一物质在对应于Ad5的Thr269和Glu270[在登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr270和Glu271]之一或两者的残基处可以含有突变。在对 应于Thr269的位置处引入Pro或Asp是可取的。在对应于Glu270的位置处引入Gly或 Ser残基是可取的。因此，例如，第一物质可以含有对应于Ad5中的Thr269Pro和/或 Glu270Gly 的取代。第一物质在对应于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 个、2个、3个或全部4个的残基处可以含有突变。在对应于Ile420的位置处引入Gly是 可取的。另外地或者可选地，在对应于Thr422的位置处引入Aot是可取的。另外地或者 可选地，在对应于Glu423的位置处引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可选地，在对应 于Leu425的位置处引入Tyr是可取的。例如，第一物质可以含有对应于取代Ile420Gly、 Thr422Asn> Glu423Ser和Leu425Tyr的1个、2个、3个或全部4个的取代。在对应于 Ad5的Thr424的位置处引入Val或Ala也是可取的。引入突变的特别理想的位置可能是对应于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451]。该位置位于蛋白的最 终支架区中，HVR7的下游6个残基。在该位置处引入中性或带正电残基是可取的。特 别是，用另一残基代替在这个位置天然存在的Glu残基是可取的，所述另一残基优选为 中性或带正电残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。第二物质可以含有来自第一腺病毒血清型的支架和来自不同的腺病毒血清型的 一个或多个HVRs。当存在两个或更多个HVR时，每个HVR可以来自不同的血清型。 通常，第一物质至少不包含腺病毒纤维蛋白和五邻体蛋白之一。在一些实施方案中，第 一物质既不包含腺病毒五邻体蛋白或也不包含纤维蛋白。因此，第二物质可以包含来自Ad2或Ad5的支架，以及来自Adl7、Ad20、 Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44或Ad48中至少一个的一个或多个HVRs。在一些实 施方案中，至少 HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44 或 Ad48，例如，源自 Ad26 或 Ad48。它们还可以源自另一组D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。第二物质可以包含任何合适的FX片段或由任何合 适的FX片段组成，该FX片 段包含Gla结构域或其能够与六邻体蛋白结合的片段。因此，第二物质可以包含FX Gla-EGF 1、Gla-EGF 1-EGF2 或 Gla-EGF 1-EGF2-SP,或者由 FX Gla-EGF 1、Gla-EGF1-EGF2或Gla-EGF 1-EGF2-SP组成。在一些实施方案中，第二物质不是全长FX。第二物质可以为含有FX组分和异源融合伴侣(即不源自FX的蛋白或蛋白结构域)的融合蛋白。所述FX组分包含FX Gla结构域，并且可以包含EGFl结构域、 EGF2结构域和SP结构域中的一个或多个。例如，FX组分可以包含Gla-EGFl或 Gla-EGF 1-EGF2。为了便于分析，可以使第一物质或第二物质附着(如共价连接)至固体支持物。 因此，所述方法可以包括提供附着于固体支持物的第一物质或第二物质，使固体支持物 与分别含有第二物质或第一物质的样品(通常为液体样品)接触，并测定与支持物关联的 第二物质或第一物质的量。在接触与测定步骤之间可以包括一个或多个洗涤步骤以减少或最小化与支持物 非特异性地关联的第二物质或第一物质的量。第一物质与第二物质之间的结合可以直接 或间接测定。例如，可以标记第二物质，例如用放射性的或分光光度可检测的探针(如 荧光探针)。可选地，本方法可以包括使固体支持物与能够检测第一试剂与第二试剂之间 的复合物的其它结合剂接触，例如特异性针对未附着于支持物的物质的抗体。可以标记 结合剂自身。因此，检测到的结合量会取决于测试试剂破坏或防止结合的能力。技术人员会知道许多合适的技术和检测方式，包括ELISA、表面等离子体共振等。所述方法可以包括在存在或不存在测试试剂的条件下，测定六邻体片段与FX Gla片段之间的结合，并且如果结合在存在测试试剂的情况下与不存在测试试剂的情况下 不同(如较低或较高)，则选择测试试剂。测试试剂可以为任何合适的分子，包括蛋白质、碳水化合物、小分子(如分子 量小于500Da)等。例如，测试试剂可以为抗体、X-bp的类似物、分离的Gla结构域或 其片段或衍生物、分离的六邻体蛋白或其片段或衍生物等。所述方法可以包括测试许多测试试剂，所述测试试剂可以是或可以不是结构上 彼此相关的。优选地使用高通量方式。多种测试试剂可以为小分子文库或许多蛋白分 子，例如诸如X-bp的已知蛋白的许多类似物或变体。所述方法还可以包括利用能够调节HVR与Gla之间的相互作用的已知试剂作为 阳性对照。例如，在意图鉴定能够抑制或破坏相互作用的试剂的检测中可以将X-bp用 作合适的对照。因此，可以将任何给定的测试试剂的效力与已知对照试剂的效力直接比较。鉴定或选择了合适的测试剂后，证实其调节肝细胞或脾细胞的腺病毒转导的能 力是可取的。因此，所述方法还可以包括以下步骤使测试试剂与肝细胞或脾细胞及腺 病毒接触，并测定肝细胞或脾细胞的腺病毒转导。通常，腺病毒会含有与上文所述的第 一物质相同的六邻体片段。所述方法可以包括在存在和不存在测试试剂的条件下，将肝细胞或脾细胞的腺 病毒转导进行比较。所述方法还可以包括利用诸如X-bp的能够调节HVR与Gla之间的 相互作用的已知试剂作为阳性对照。可以在体内或体外测试测试试剂在调节肝或脾的腺病毒感染中的效力。当在体外进行时，腺病毒可以包含减少CAR结合的突变。可选地，使用不具有CAR表达或具 有低CAR表达的细胞类型是优选的，例如SK0V3细胞。可以在任何合适的模型上进行体内测试，如啮齿类或非人灵长类。体外或体内证实测试中所用的腺病毒可以是携带基因(如标记基因)的基因转 移载体，在转导的肝细胞或脾细胞中所述携带的基因的表达是可容易检测到的。因此， 所述方法可以包括直接或间接检测所述基因的表达产物的步骤，例如在肝细胞或脾细胞 中，在肝细胞或脾细胞的表面或者分泌自肝细胞或脾细胞。直接检测可以包括检测蛋白 或mRNA，例如利用能够与表达产物结合的结合剂。间接检测可以包括检测仅在所述表 达产物存在时产生的产物的存在的步骤。合适的标记基因包括编码酶、荧光蛋白、细胞 表面受体等的基因。本说明书中所述的发现还使具有改变的对于FX的亲和力的腺病毒六邻体蛋白的 产生成为可能，所述腺病毒六邻体蛋白随后可以用于创造具有改变的转导细胞的能力的 腺病毒，如基因转移载体，所述细胞的转导完全或部分地由FX介导，例如肝细胞或脾细 胞。具有降低的对于FX的亲和力的那些可以用于提供这样的载体，其显示出对肝和可能 的脾以外的细胞和组织类型改进的靶向，以及具有改进的安全谱(profile)。具有增加的 对于FX的亲和力的那些可以用于这样的载体，其意图向肝细胞或脾细胞进行基因转移， 例如用于肝功能障碍或感染的治疗。因此，本发明提供了筛选具有改变的对于FX的亲和力的腺病毒六邻体蛋白的方 法，该方法包括提供包含能够与FX结合的腺病毒六邻体蛋白片段的物质；使所述物质与能够与腺病毒六邻体结合的FX Gla结构域片段接触；以及测定所述六邻体片段与FX Gla片段之间的结合。所述物质可以包含能够与FX Gla结合的六邻体蛋白的任何片段，或者由能够与 FX Gla结合的六邻体蛋白的任何片段组成。例如，所述物质可以包含单一分离的HVR， 任选地具有中间支架序列的两个或更多个(如2个、3个、4个、5个、6个或7个) HVRs,或者完整的腺病毒六邻体蛋白。通常，所述物质至少不包含腺病毒纤维蛋白和五 邻体蛋白之一。在一些实施方案中，所述物质既不包含腺病毒五邻体蛋白也不包含纤维 蛋白。通常，所述方法会包括将两种或更多种这些物质之间的结合进行比较，这些物 质中每种都含有具有各不相同的序列的六邻体片段。因此，所述方法可以包括以下步 骤提供至少第一物质和第二物质，每种物质包含各自的第一腺病毒六邻体片段和 第二腺病毒六邻体片段；使每种所述物质与能够与六邻体蛋白结合的FX Gla结构域片段接触；以及测定每种所述六邻体片段与FX Gla片段之间的结合。因此，第一物质可以包含具有 已知的Gla结合性质(或FX结合性质)的参考六 邻体序列，如一个或多个分离的HVRs或者全长六邻体蛋白。第二物质(和任何后续物 质)可以包含诸如分离的HVR或六邻体蛋白的测试序列，所述测试序列的Gla或FX结 合性质将与参考比较。
第一物质和第二物质除它们的HVR序列以外基本上相同是可取的，目的是增加 结合性质中的任何差异都是由于HVRs之间的差异的机会。因此，第一六邻体片段可以具有野生型序列。第二六邻体片段可以具有未天然 发现的序列。例如，其氨基酸序列可以相对于第一序列包含一个或多个突变或者修饰， 例如在HVR中或者一个或多个支架氨基酸中。例如，第二六邻体片段在HVRs3、5和7 的一个或多个中可以具有一个或多个突变或者修饰。例如，第二六邻体片段在对应于Ad5六邻体 蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr269、 Thr270和Glu271]的残基处可以含有一个或多个突变(如取代、缺失或添加)。这些位 于HVR5中。第二六邻体片段在对应于Ad5六邻体蛋白的Ile420、Asn42U Thr422、 Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或Lys448[在下文提供的登录号为 AAW655Ill ; GI: 58177707 的序列中表示为 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]的残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7中。另外地或者可选 地，第二六邻体片段在对应于Ad5六邻体蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供 的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451、Arg453和Val454]的 残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7侧翼的支架序列中。另外地或者可 选地，第二六邻体片段在对应于Ad5六邻体蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216、Ser267、Met314、Asn42U Thr426、Ser446 或 Asn449[在下文提供的登录号 为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、 Asn217、Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447 和 Asn450]的残基处可以包含一个 或多个突变。这些残基被认为在六邻体与FX的相互作用中特别重要。可以使用调节， 特别是减少与FX的结合的任何突变。例如，母体或野生型残基可以由存在于腺病毒中 对应位置的残基代替，所述腺病毒来自具有较低的对于FX的亲和力或者较低的转导肝细 胞或脾细胞的能力的血清型。例如，可以使Ad5中的残基与来自Adl7、Ad20、Ad25、 Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 之一的残基交换。第二六邻体片段在对应于Ad5的Thr269和Glu270[在登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Thr270和Glu271]之一或两者的残基处可以含有突变。在 对应于Thr269的位置处引入Pro或Asp是可取的。在对应于Glu270的位置处引入Gly或 Ser残基是可取的。因此，例如，第二六邻体片段可以含有对应于Ad5中Thr269Pr0和/ 或Glu270Gly的取代。第二六邻体片段在对应于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 个、2个、3个或全部4个的残基处可以含有突变。在对应于Ile420的位置处引入Gly是 可取的。另外地或者可选地，在对应于Thr422的位置处引入Aot是可取的。另外地或 者可选地，在对应于Glu423的位置处引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可选地，在 对应于Leu425的位置处引入Tyr是可取的。例如，第二六邻体片段可以含有对应于取 代 Ile420Gly、Thr422Asn> Glu423Ser 和 Leu425Tyr 中的 1 个、2 个、3 个或全部 4 个的取 代。在对应于Ad5的Thr424的位置处引入Val或Ala也是可取的。引入突变的特别理想的位置可能是对应于Ad5的Glu450[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451]的位置。该位置位于蛋白的最终 支架区中，HVR7的下游6个残基。在该位置处引入中性或带正电残基是可取的。特别 是，用另一残基代替在这个位置天然存在的Glu残基是可取的，所述另一残基优选为中 性或带正电残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。当两种物质包含六邻体蛋白或由六邻体蛋白组成时，参考六邻体序列可以包含 野生型六邻体蛋白。测试六邻体序列可以包含嵌合六邻体蛋白，其中支架和一个或多个 HVRs源自不同的野生型六邻体蛋白。支架可以来自参考六邻体蛋白。例如，HVRs3、
5和7中的一个或多个可以与支架源自不同的血清型。HVRs可以源自六邻体蛋白，该六 邻体蛋白来自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。参考六邻体序列可以是血清型Ad2或Ad5的。测试六邻体序列可以是血清型Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48的。如果测试序列为嵌合序列，则其可以包含来自Ad2或Ad5的支架片段和至少 一个来自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一个的 HVR 序列。HVR序列还可以源自另一组D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，测试序列可以包含来自Ad2或Ad5的支架区和一个或多个来自Adl7、 Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一个的 HVRs。在一些实施 方案中，HVR3、HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它们还可以源自另一组D血清型，例如Ad9、 AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，第二或测试片段可以为第一或参考片段的有意修饰的形式。这可以通过 改造编码第一或参考片段的核酸而实现，从而产生第二或测试片段，例如包含一个或多 个不同的HVRs。优选地，只修饰HVR序列(和/或一个或多个侧翼氨基酸)。因此， 在这样的情况下，所述方法可以包括提供编码所述第一物质的第一核酸序列，并修饰所 述第一核酸以产生编码所述第二物质的第二核酸序列。应当理解，可以产生测试片段的文库。因此，所述方法还可以包括将所述第一 核酸序列突变以产生许多测试核酸序列(如至少5个、至少10个、至少50个、至少100 个、至少1000个、至少10000个、至少IO6个或者甚至更多的测试序列)，每个测试核酸 序列编码测试片段，其中测试片段彼此不同。可以在特别靶向的位置或随机位置进行突变或修饰，例如，在HVR内。在任何 情况下，它们可以包括引入随机取代基或特定的氨基酸。例如，可以将一个或多个位置 处的编码互不相同的HVR序列(任选地包含一个或多个侧翼氨基酸)的许多核酸引入编 码相同支架序列的核酸群体中，因而提供了用于筛选的不同HVR的文库。可以通过上文所述的测定方法，或者通过诸如噬菌体展示的高通量方法等进行 蹄选。鉴定出或选择了具有所 需的Gla或FX结合特征的合适六邻体片段后，测试肝细 胞或脾细胞的腺病毒转导是可取的，所述腺病毒包含含有该片段的六邻体蛋白。因此，所述方法可以包括选择含有具有所需的与Gla或FX结合特征的片段的物质，产生含有包 含各自片段的六邻体蛋白的腺病毒，使所述腺病毒与肝细胞或脾细胞接触，并测定肝细 胞或脾细胞的腺病毒转导。可以体内或体外测试腺病毒的感染性。当体外测试时，腺病毒可以包含降低 CAR结合的突变。可选地，使用不具有CAR表达或具有低CAR表达的细胞类型可能是 优选的，例如SKOV3细胞。体内测试可以在任何合适的模型上进行，例如啮齿类或非人灵长类。体外或体内证实测试中所用的腺病毒可以为携带基因的基因转移载体，在转导 的肝细胞或脾细胞中所述携带的基因的表达是可容易检测到的。所述方法可以包括检测 所述基因的表达产物的步骤，例如在肝细胞或脾细胞中，在肝细胞或脾细胞的表面上或 者分泌自肝细胞或脾细胞。检测可以为直接或间接的。无论使用哪种测试系统，将腺病毒转导肝细胞或脾细胞的能力与包含六邻体蛋 白的腺病毒转导肝细胞或脾细胞的能力进行比较都是可取的，所述六邻体蛋白含有第一 或参考六邻体片段。在一些情况下，不测试特定的六邻体蛋白其针对分离的Gla或FX的结合性质， 而是简单地测试具有特定的六邻体序列的腺病毒转导细胞的能力是可取的，所述细胞的 转导由FX介导，诸如肝细胞或脾细胞。通常，这会与参考腺病毒进行比较，所述参考腺 病毒具有已知参考六邻体序列并且其转导性质是已知的。因此，本发明提供了筛选具有改变的转导肝细胞或脾细胞的能力的腺病毒的方 法，该方法包括提供包含第一六邻体蛋白的第一腺病毒；提供包含第二六邻体蛋白的第二腺病毒；以及比较所述第一腺病毒和所述第二腺病毒转导肝细胞或脾细胞的能力。第一六邻体蛋白和第二六邻体蛋白具有不同的序列。通常，第一六邻体蛋白与 第二六邻体蛋白的差别在于一个或多个HVR序列和/或支架序列中的一个或多个氨基 酸。除了所述一个或多个HVRs或者支架残基以外，第一六邻体蛋白与第二六邻体蛋白 是基本相同的是可取的。第一腺病毒与第二腺病毒在所有其它方面是相同的也是可取 的，目的是增加结合或转导性质中的任何差异可以肯定地归结于六邻体蛋白之间的差异 的机会。例如，它们可以具有相同的五邻体蛋白和纤维蛋白。因此，第一六邻体蛋白可以包含具有已知的Gla结合性质(或FX结合性质)的 参考HVR。第二六邻体蛋白(和任何后续的六邻体蛋白)可以包含测试HVR，所述测试 HVR的Gla或FX结合性质将与参考比较。因此，参考HVR可以为野生型HVR。测试HVR可以具有未天然发现的序列。 例如，测试HVR的氨基酸序列可以包含相对于参考HVR的一个或多个突变或者修饰，例 如，在HVRs3、5和/或7的一个或多个中。例如，测试六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr269、 Thr270和Glu271]的残基处可以含有一个或多个突变(如取代、缺失或添加)。这些位 于HVR5中。测试六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Ile420、Asn42U Thr422、Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或Lys448[在下文提供的登录号为 AAW655Ill ； GI: 58177707 的序列中表示为 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]的残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7中。另外地或者可选 地，测试六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供 的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451、Arg453和Val454]的 残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7侧翼的支架序列中。另外地或者可 选地，测试六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216、Ser267、Met314、Asn421、Thr426、Ser446 或 Asn449[在下文提供的登录号 为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、 Asn217、Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447 和 Asn450]的残基处可以包含一个 或多个突变。例如，母体或野生型残基可以由存在于腺病毒中对应位置的残基代替，所 述腺病毒来自具有较低的对于FX的亲和力或者较低的转导肝细胞或脾细胞的能力的血清 型。例如，可以使Ad5中的残基与来自Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48之一的残基交换。测试六邻体蛋白在对应于Ad5的Thr269和Glu270[在登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr270和Glu271]之一或两者的残基处可以含有突变。在 对应于Thr269的位置处引入Pro或Asp是可取的。在对应于Glu270的位置处引入Gly 或Ser残基是可取的。因此，例如，测试六邻体蛋白可以含有对应于Ad5中的Thr269Pro 和/或Glu270Gly的取代。测试六邻体蛋白在对应于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]中 1 个、2个、3个或全部4个的残基处可以含有突变。在对应于Ile420的位置处引入Gly是 可取的。另外地或者可选地，在对应于Thr422的位置处引入Aot是可取的。另外地或 者可选地，在对应于Glu423的位置处引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可选地，在 对应于Leu425的位置处引入Tyr是可取的。例如，测试六邻体蛋白可以含有对应于取代 Ile420Gly、Thr422Asn、Glu423Ser 和 Leu425Tyr 中 1 个、2 个、3 个或全部 4 个的取代。 在对应于Ad5的Thr424的位置处引入Val或Ala也是可取的。引入突变的特别理想的位置可能是对应于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451]。该位置位于蛋白的最 终支架区中，HVR7的下游6个残基。在该位置处引入中性或带正电残基是可取的。特 别是，用另一残基代替在这个位置天然存在的Glu残基是可取的，所述另一残基优选为 中性或带正电残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。参考六邻体蛋白可以为野生型六邻体蛋白。测试六邻体蛋白可以为嵌合六邻体 蛋白，其中支架和一个或多个HVRs源自不同野生型六邻体蛋白。支架可以来自参考六 邻体蛋白。例如，HVRs3、5和7的一个或多个可以源自不同于支架的血清型。HVRs可 以源自六邻体蛋白，该六邻体蛋白来自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。参考HVR或六邻体蛋白可以是血清型Ad2或Ad5的。
测试HVR或六邻体蛋白可以是血清型Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、 Ad29、Ad44或Ad48的。当测试HVR或六邻体蛋白为嵌合的时，支架可以来自Ad2或 Ad,并且一个或多个 HVRs 可以来自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48。HVRs还可以源自另一组D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，测试六邻体蛋白可以包含来自Ad2或Ad5的支架区，以及一个或多个来 自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一个的 HVRs。在 一些实施方案中，HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它们还可以源自另一组D血清型，例如Ad9、 AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，第二或测试六邻体蛋白可以为第一或参考六邻体蛋白的有意修饰的形 式。这可以通过改造编码第一或参考六邻体蛋白的核酸序列而实现，从而产生具有不同 序列的第二或测试六邻体蛋白。优选地，只修饰一个或多个HVR区和/或侧翼氨基酸。 因此，在这样的情况下，所述方法可以包括提供编码所述第一或参考六邻体蛋白的第一 核酸序列，以及修饰所述第一核酸以产生编码所述第二或测试六邻体蛋白的第二核酸序 列。应当理解，可以生成测试蛋白的文库。因此，所述方法还可以包括将所述第一 核酸序列突变以产生许多测试核酸序列(如至少5个、至少10个、至少50个、至少100 个、至少1000个、至少10000个、至少IO6个或者甚至更多的测试序列)，每个序列编码 测试六邻体蛋白，其中测试六邻体蛋白彼此不同。可以在特定靶向的位置或随机位置进行突变或修饰，例如，在HVR内和/或上 文列出的位置处。无论哪种情况下，它们可以包括引入随机取代基或特定氨基酸。例 如，可以将编码在一个或多个位置彼此不同的HVR序列(任选地包含一个或多个侧翼氨 基酸)的许多核酸引入编码相同支架序列的核酸群体中，从而提供了用于筛选的含有不 同HVRs的六邻体蛋白文库。所述方法可以包括使至少分别的第一肝细胞和第二肝细胞或者至少分别的第一 脾细胞和第二脾细胞与至少所述第一腺病毒和第二腺病毒于体外在FX的存在下接触，并 测定由所述腺病毒造成的所述细胞的转导。在这样的检测中，腺病毒可以包含减少与CAR结合的突变。可选地，使用具有 低CAR表达或者不具有CAR表达的细胞类型是优选的，例如SKOV3细胞。可选地，所述方法可以在体内进行，并且因此可以包括向分别的第一个体和第 二(优选非人)个体给予所述第一腺病毒和第二腺病毒，并且测定肝细胞或脾细胞的转导。合适的个体可以为啮齿类或非人灵长类。所述方法可以包括选择具有最显著改变的(如增强或降低)转导的腺病毒。所述方法可以用于鉴定特定六邻体片段，如具有与FX特定结合的HVR序列或 者HVR序列和/或支架序列组(set)。然后，将这些序列引入不同腺病毒的六邻体蛋白中是可取的，例如一个不同血清型的；或者简单地将含有选择的HVR序列的六邻体蛋白 引入不同腺病毒。然后，如上文所述，可以测试所得的腺病毒在FX的存在下向肝细胞或 脾细胞的转导能力，任选地与合适的参考腺病毒比较。本文所述的发现还提供制备具有改变的对细胞类型的向性的新腺病毒的方法是 显而易见的，所述细胞类型的转导由FX介导，例如肝细胞或脾细胞。因此，本发明提供了调节腺病毒的肝或脾感染性的方法，该方法包括提供母体腺病毒六邻体蛋白；修饰所述母体六邻体蛋白以产生具有改变的对于FX的亲和力的修饰过的六邻体 蛋白；以及产生包含所述修饰过的六邻体蛋白的腺病毒；从而所述腺病毒与包含所述母体六邻体蛋白的腺病毒相比，具有改变的转导肝 细胞或脾细胞的能力。因此，包含修饰过的六邻体蛋白的腺病毒与参考腺病毒相比具有 改变的(即增加的或降低的)转导肝细胞或脾细胞的能力，所述参考腺病毒除了引入六邻 体蛋白的修饰以外，在所有方面都是相同的。特别是，这两种病毒会共享相同的五邻体 蛋白和纤维蛋白。本发明还涉及这些方法的产物。因此，本发明提供了含有修饰过的六邻体蛋白 的腺病毒，所述修饰过的六邻体蛋白包含相对于母体六邻体蛋白的突变，从而所述腺病 毒与包含所述母体六邻体蛋白的腺病毒相比具有改变的转导肝细胞或脾细胞的能力，但 条件是修饰过的六邻体蛋白不是包含来自Ad48六邻体蛋白的HVR的Ad5六邻体蛋白。 特别是，如Reynolds etal.，2006所述，修饰过的六邻体蛋白不是包含来自Ad48六邻体蛋 白的HVRl和野生型Ad5HVR2-7的Ad5六邻体蛋白，而且不是包含来自Ad48六邻体蛋 白的HVRsl-7的Ad5六邻体蛋白。突变可以在一个或多个HVRs或侧翼氨基酸中。因此，修饰过的六邻体蛋白和 母体六邻体蛋白通常具有相同的支架序列，并且只在一个或多个HVR中有差别。然而， 应当理解，每个都可以具有相对于野生型六邻体蛋白的突变。例如，修饰过的六邻体蛋白可以具有HVRs3、5和7的一个或多个中的一个或多
个突变或者修饰。然而，母体六邻体蛋白可以为野生型六邻体蛋白，例如Ad2或Ad5血清型的。例如，修饰过的六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr269、 Thr270和Glu271]的残基处可以含有相对于母体的一个或多个突变(如取代、缺失或添 加)。这些位于HVR5中。修饰过的六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Ile420、 Asn42U Thr422, Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或 Lys448[在下文提供的登录号 为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、 Thr425、Leu426、Asp448和Lys449]的残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7 中。另外地或者可选地，修饰过的六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的Glu450、 Arg452和Val453[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示 为Glu451、Arg453和Val454]的残基处可以含有一个或多个突变。这些位于HVR7侧 翼的支架序列中。另外地或者可选地，修饰过的六邻体蛋白在对应于Ad5六邻体蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216、Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446或Aot449[在下文提供的登录号为AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列中表示为 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和Asn450]的残基处可以包含一个或多个突变。可以使用调节，特别是降低与FX的结 合的任何突变。例如，母体或野生型残基可以由存在于腺病毒中对应位置的残基代替， 所述腺病毒来自具有较低的对于FX的亲和力或者较低的转导肝细胞或脾细胞的能力的血 清型。例如，可以使Ad5中的残基与来自Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48之一的残基交换。修饰过的六邻体蛋白在对应于Ad5的Thr269和Glu270[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr270和Glu271]之一或两者的残基处可 以含有突变。在对应于Thr269的位置处引入Pro或Asp是可取的。在对应于Glu270的 位置处引入Gly或Ser残基是可取的。因此，例如，修饰过的六邻体蛋白可以含有对应 于Ad5中的Thr269Pro和/或Glu270Gly的取代。修饰过的六邻体蛋白在对应于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示为 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 个、2个、3个或全部4个的残基处可以含有突变。在对应于Ile420的位置处引入Gly是 可取的。另外地或者可选地，在对应于Thr422的位置处引入Aot是可取的。另外地或 者可选地，在对应于Glu423的位置处引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可选地，在 对应于Leu425的位置处引入Tyr是可取的。例如，修饰过的六邻体蛋白可以含有对应于 取代 Ile420Gly、Thr422Asn、Glu423Ser 和 Leu425Tyr 的 1 个、2 个、3 个或全部 4 个的取 代。在对应于Ad5的Thr424的位置处引入Val或Ala也是可取的。引入突变的特别理想的位置可能是对应于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Glu451]。该位置位于蛋白的最 终支架区中，HVR7的下游6个残基。可以期望地在该位置处引入中性或带正电残基。 特别是，用另一残基代替在这个位置天然存在的Glu残基是可取的，所述另一残基优选 为中性或带正电残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。修饰过的六邻体蛋白可以具有未天然存在的HVR氨基酸序列。可选地，修饰过的六邻体蛋白可以为嵌合六邻体蛋白，其包含来自第一野生型 六邻体蛋白的支架以及至少一个来自第二野生型六邻体蛋白的HVR。嵌合六邻体蛋白可以具有来自第一腺病毒血清型的支架区以及至少一个来自第 二腺病毒血清型的HVR。例如，HVRs3、5和7的一个或多个可以源自不同于支架的血清型。HVRs可 以源自六邻体蛋白，该六邻体蛋白来自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。第一血清型/野生型可以为Ad2或Ad5。第二血清型/野生型可以为Adl7、 Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48，或者另一组 D 血清型，例如 Ad9、 Adl0, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，修饰过的六邻体蛋白可以包含来自Ad2或Ad5的支架区，以及一个或多个来自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一个的 HVRs。 在一些实施方案中，HVR3、HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、 Ad28、Ad29、Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它们还可以源自另一组D血 清型，例如 Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、 Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。修饰过的腺病毒可以为基因递送载体。本发明还提供用于医疗方法的如上文所述的修饰过的腺病毒。本发明还提供用于基因递送的如上文所述的修饰过的腺病毒。本发明还提供如上文所述的修饰过的腺病毒在制备用于基因递送或基因治疗的 药物中的用途。通过举例而并非限制的方式，结合附图和实施例，将更详细地描述本发明。附图描述

图1.FX与Ad5结合的分析。(A)人FX的结构域结构。球状表示钙离子。(B)凝血因子(FXa、EGF2-SP FXa)共价偶联到SA生物传感器芯片。描述的 是覆盖的感应谱(overlayed sensorgrams。箭头表示试剂注射的开始和结束。RU =响应 单位(responsive units)。(C)在Ad5注射前，在FX生物传感器芯片上预先注射定向针对FX Gla-EGFl的 抗体HX-1。HX-I减少FX_Ad5结合(δ RU)。箭头表示试剂注射的开始和结束。(D)在生理FX水平的存在下，将HepG2细胞暴露于AdKOl。FX与抗体HX-I
或IgG同种型匹配的对照预先孵育。在感染72h后定量细胞转导Γρ < 0.001与对照相 比)。误差棒表示SEM。(E) Ad5与FX和缺乏FX Gla结构域的FX-GD结合的SPR分析。显示出扣除
的感应谱(将FXI用作非特异性结合的对照)。箭头表示试剂注射的开始和结束。(F)在病毒注射前30min，MF_1小鼠用对照花生油或华法林预处理，并且在有 或没有FX或FX-GD预先注射的情况下，注射4X IO11VP/小鼠的Ad5。β -半乳糖苷酶 的定量ELISA显示出肝、脾和肺中的水平Γρ = 0.03)。图2.Ad5六邻体与FX结合，而并非纤维与FX结合。(A)用于评价FX与Ad5结合的纤维突变体的图示。Ad5_21R含有21个轴重 复，但是没有结；Ad5-7.5R只含有7.5个轴重复；Ad5_AF不含有纤维。(B)病毒被注射到生物传感器芯片上并与评价的FX结合。显示出扣除的感应谱 (FX-FXI)。箭头表示试剂注射的开始和结束。(C)在存在或不存在生理FX水平的情况下，将HepG2细胞暴露于每种腺病毒。
细胞结合的腺病毒进行定量。误差棒表示SEM。(D)将纯化的Ad5六邻体蛋白固定，并分析与FX的结合。显示出以7种不同 浓度的FX(50至0.781 μ g/ml，以2倍连续稀释)注射的感应谱。分析重复三次。注射 EDTA再生生物传感器芯片的表面。箭头表示试剂注射的开始和结束。图3.HVR修饰过的Ad5载体中FX结合与腺病毒感染的分析(A)来自Ad5和Ad5HVR48突变体的Ad六邻体HVRs的氨基酸序列比对。黑底白字为相同残基，灰底黑字为相似残基，白底黑字为不同残基。表示出HVRs(l-7)。(B)通过SPR分析(扣除的FX-FXI感应谱)，用来自Ad48的HVRs代替 Ad5HVRs去除了 Ad5与FX结合。箭头表示试剂注射的开始和结束。(C)在4°C下，在存在或不存在生理FX水平的情况下，将SKOV3细胞暴露于所 示的每种腺病毒lh。提取DNA并定量细胞结合的腺病毒。误差棒表示SEM。(ρ < 0.05 与不存在FX相比)。(D)在37°C下，在存在或不存在生理FX水平的情况下，将SKOV3细胞暴露于 所示的每种腺病毒3h。感染后48h，定量转基因表达。误差棒表示SEM。(ρ <0.05与 不存在FX相比)。(E)通过血管内途径以5X109、2X IOltl或5X IOltl或VP/小鼠，向MF-1小鼠注 射Ad5或Ad5HVR48，并且在48h时采集萤光素酶图像并定量为光子通量。肌肉内注射 作为比较显示。误差棒表示 SEM。*p = 0.00018，**p = 0.00002, ***ρ = 0.01368 与 Ad5相比。图4.由FX_Ad5复合物造成的肝的基因转移是通过FX中的外部位点(exosite)介
导(A)扣除的SPR感应谱(FX-FXI)显示出NAPc2或Ixolaris与FX结合而不抑制 后续的FX_Ad5结合。箭头表示试剂注射的开始和结束。(B)在存在或不存在生理FX士渐增浓度的NAPc2或Ixolaris的条件下，将
HepG2细胞暴露于AdKOl。在感染后72h定量转导。误差棒表示SEM。*〃p<0.01 与AdKOl+FX相比。(C)MF-I小鼠用对照花生油或华法林预处理，并且在有或没有单独的FX或者 用3倍摩尔过量的NAPc2或Ixolaris预先孵育的FX的预先注射的情况下，向小鼠注射 4XlOllVPAjH^mAdStj 48h后，进行肝中的β _半乳糖苷酶水平的定量ELISA，并与通 过单独的FX灌注达到的肝中的水平比较。误差棒表示SEM。< 0.05与对照相比。图5.由蛇毒蛋白X-bp造成的Ad5与FX的结合的药理阻断阻断了体内肝转导。(A)扣除的SPR感应谱(FX-FXI)显示出高亲和力的X_bp结合(X_bp注射后 RU升高)，并且去除了后续的FX_Ad5结合(Ad5注射后RU无变化)。箭头表示试剂注 射的开始和结束。(B)在单独FX或者与X-bp以不同FX X_bp摩尔比预先孵育的FX(如所示) 的存在下，将HepG2细胞暴露于AdKOl。* 〃 ρ < 0.0001与无X_bp相比。误差棒表 示 SEM。(C)MF-I小鼠用对照花生油或华法林预处理，并且在有或没有单独FX或者用3 倍摩尔过量的X-bp预先孵育的FX的预先注射的条件下，向小鼠注射4X IO11VP/小鼠的 Ad5。*p = 0.006 ； = 0.0002。误差棒表示 SEM。(D)在Ad5注射前30min，向MF-1小鼠(未经华法林处理)注射X_bp。48h 后，通过ELISA定量肝基因转移(条形图)，并通过对β-半乳糖苷酶染色显像(未显 示)。= 0.0002)误差棒表示SEM。 图6.FX与替代人腺病毒血清型结合 (A)显示的是系统树，其基于通过ClustalW进行的六邻体HVR氨基酸序列比对并通过Treeview (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)显不，该系统树显不 了 FX结合物(binder) ( “ + ”、“++”或“+++” )和非结合物(“_” )以及通过SPR
测定的FX结合强度。未通过SPR测试的Ad病毒以灰色显示。(B)代表性SPR感应谱描述了表现出与FX强结合(++或+++)、弱结合⑴或 不结合的人腺病毒血清型。插图显示放大的Y轴以表示弱结合(Ad35)或不可检测的结 合(Ad26和Ad48)。箭头表示注射的开始和结束。(C)在存在或不存在生理FX的情况下，将HepG2细胞暴露于每种腺病毒。提 取DNA并定量细胞结合的腺病毒。误差棒表示SEM。(ρ <0.05与不存在FX相比)。 图像显示在37°C下，在存在/不存在FX的情况下，暴露3h后转基因(eGFP)的表达。图7.在存在和不存在FX的情况下，由Ad5、Ad5HVR48和Ad48介导的体外 MDA-BB-435细胞的结合与转导。(A)在4°C下，将细胞暴露于1000VP/细胞lh，收获细胞并提取DNA用于 Taqman分析和基因组定量。(B)在37°C下，将细胞暴露于5000VP/细胞3h，在感染后 48h洗涤并收获细胞。从收获的细胞定量转基因表达并以蛋白含量标准化。*p<0.05 与不存在FX相比。NS=无显著差异。图8.FX的丝氨酸蛋白酶结构域在细胞结合中的作用。在Ad5 (1000VP/细胞)和FX或者与rNAPc2或蜱抗凝血肽(TAP ；作为对照)
预先孵育的FX的存在下，将HepG2细胞在4°C下在无血清培养基中孵育lh。通过实时 PCR定量病毒的细胞结合。NS=无显著差异。图9.凝血因子解救由Ad5造成的肝转导的体内评价。为了评价凝血因子“解救(rescue)”小鼠中肝转导的能力，在腺病毒注射前3 天和1天，向动物(MFl远交小鼠，6-12周龄，约30g)皮下给予133mg/小鼠的华法林 (Sigma-Aldrich，Dorset, UK)(悬浮于花生油中)。在病毒注射前30分钟，向小鼠注射 凝血因子。根据小鼠的因子VII、IX、X、XI和蛋白C的生理浓度(分别为10、90、 170、30和60nM)以及小鼠的循环血浆体积(约2ml)，小鼠被给予了足够恢复至生理水平 的凝血因子(分别为1.25、10、20、9.6和7.2微克/小鼠)。静脉内注射4X IO11VP/小 鼠的病毒。处死时(48h)收获器官，并通过商业ELISA(RocheDiagnostics，Mannheim, Germany)定量β _半乳糖苷酶的活性水平。图10.FVIK FIX、FX、FXI 和 PC 与 Ad5 六邻体结合。根据生产商的说明书(Biacore)，通过胺偶联，将纯化的Ad5六邻体(521RU)固 定于CM5生物传感器芯片上。通过SPR，分析凝血因子FX(A)、FVII (B)、PC(C)、 FIX(D)和FXI(E)的结合。针对对照的扣除的感应谱显示了重复三次的以11个不同浓 度的凝血因子的注射。通过注射5mM EDTA来再生传感器芯片。图ll.X-bp对大鼠中Ad5的肝靶向的影响。Ad5注射(1 X IO11VP/大鼠)前30min，向Wistar Kyoto大鼠注射盐水或3倍摩 尔过量的X-bp FX的X-bp (= Ι. μ g/gX-bp)。注射后5天，收集肝并将β -半乳糖 苷酶定量或利用X-gal正面(en face)显示。* ρ < 0.0001与Ad5相比。图12.来自不同人腺病毒血清型的六邻体蛋白的HVRs和侧翼支架序列的比对。图13.来自不同物种的FX序列的比对。
图14.腺病毒六邻体克隆策略，其示出用于同源重组的中间体和穿梭质粒。图15.用对照Ad5CMVlacZ和不同的六邻体HVR交换突变腺病毒载体感染的 HeLa细胞中β _半乳糖苷酶转基因表达的分析。转染后48小时分析值。图16.SKOV3细胞中对照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六邻体突变腺病毒的结合能 力的分析。展示了相对于媒介对照的倍数增加。图17.用对照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六邻体突变腺病毒载体感染的SKOV3 细胞中半乳糖苷酶转基因表达的分析。*ρ< 0.05与单独病毒相比。图18.用对照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六邻体突变腺病毒载体感染的SKOV3 细胞中，半乳糖苷酶转基因表达的分析。展示了相对于媒介对照的倍数增加。图19.用对照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六邻体突变腺病毒载体感染的SKOV3 细胞中半乳糖苷酶转基因表达的分析。展示了相对于媒介对照的倍数增加。图20.用对照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六邻体点突变腺病毒载体感染的HeLa 细胞中β “半乳糖苷酶转基因表达的分析。转染后48小时分析值。图21.SKOV3细胞中，对照Ad5CMVlacZ和不同点突变腺病毒结合能力的分析。图22.用对照Ad5CMVlacZ和不同点突变六邻体腺病毒载体感染的SKOV3细胞 中半乳糖苷酶转基因表达的分析。图23.用对照Ad5CMVlacZ和不同点突变六邻体腺病毒载体感染的SKOV3细胞 中半乳糖苷酶转基因表达的分析。展示了相对于媒介对照的倍数增加。图24.来自注射了 Ad5CMVlacZ或点突变六邻体腺病毒的小鼠的200 μ g肝蛋白
中半乳糖苷酶转基因表达的分析。图25.通过表面等离子体共振进行的FX-腺病毒颗粒相互作用的分析。图26.Ad5六邻体与FX之间的接触点。展示了来自人腺病毒血清型5、35、50、 49和26的氨基酸序列。方框表示高变区，箭头表示推定的FX结合位点。发明详述腺病毒腺病毒是含有线性双链DNA基因组的的无包膜病毒，其感染包括人在内的各种 哺乳动物物种。该基因组的长度通常约30_38kp，并且编码许多基因，包括称为早期基因 (Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4)和晚期基因(Li、L2、L3、L4、L5)，基因组侧翼有
5’和3’反向末端重复(ITR)的。该基因组还含有包装信号。该基因组被包围在衣壳中，所述衣壳由三种主要蛋白组成，即五邻体、六邻体 和纤维。腺病毒通常用作基因转移载体来将异源(即非腺病毒的)DNA递送到靶细胞或靶 组织。所述异源DNA通常包含异源基因或由异源基因组成(通常称为转基因)。这样的载体缺乏一个或多个病毒复制必需的基因。通常使病毒基因从基因组缺 失，并由异源基因代替。因此，这些载体是复制缺陷的，并且不能造成生产性感染，所 述生产性感染导致与母体相同的病毒后代的产生(除非同一细胞还被能够弥补存在于载 体基因组中的缺陷的辅助病毒感染)。目前已经产生了三代腺病毒载体。第一代缺乏El基因。第二代将El和/或E3的缺失与E2和/或E4的缺失组合。第三代仅保留了 ITRs和包装信号，而基因组其 余部分被异源DNA代替，并且通常称为“空壳(gutless)”或“空壳(gutted)”载体， 或者“辅助病毒依赖性腺病毒(helper-dependent adenoviruses) ”，因为它们依赖于辅助腺 病毒来供给所有的病毒蛋白。参见Alba et al. (2005)的综述。本说明书中所用的术语“腺病毒”意图包括这些复制缺陷的载体以及可复制的 病毒。本说明书中所用的术语“转导”是指通过基因转移载体将异源基因引入靶细胞或 靶组织的过程。在体外，腺病毒通过柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)感染肝细胞。然而，这种 感染途径在体内并不明显。已知许多突变降低或去除通过CAR的感染；实例描述于De Geest etal, 2005、O' Riordan et al, 1999、Niuetal.，2007、Lanciotti et al.，2003。对 于通过涉及六邻体蛋白和FX的机制的肝细胞的腺病毒感染或转导的体外研究，使用包含 该突变的病毒是可取的。另外地或可选地，使用不表达CAR或仅以低水平表达CAR的 细胞类型用于体外转导是可取的。实例为SKOV3细胞(Kim etal., 2002.)。腺病毒六邻体蛋白六邻体蛋白提供了腺病毒中抗原性的主要来源。在人中至少存在49种已知血清 型(参见图6A)。不同血清型的六邻体蛋白包含序列的支架和7个称为高变区(HVRs) 的高度可变的表面环，所述序列的支架在血清型之间是相对保守的并且形成六邻体蛋白 的主要结构片段。这些示于图12中。因此，在 Ad5 中，HVRl 具有序列 EAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK THVFGQAPYSGINITK，HVR2 具有序列 GVEGQTP，HVR3 具有序列 QWYETEINH， HVR4 具有序列 GILVKQQNGKLES，HVR5 具有序列 F STTEATAGNGDNLTP，HVR6 具 有序列 PTIKEGNSRELM，并且 HVR7 具有序列 INTETLTKVKPKTGQENGWEKDATE。在Ad26 中，HVRl 具有序列 TKEKQGTTGGVQQEKDVTKTF GVAATGGINITN, HVR2 具有序列 GTDETAENGKKD，HVR3 具有序 列 NWQENEA，HVR4 具有序列 AKFKPVNEGEQPKD，HVR5 具有序列 LDIDFAYFDVPGGSPPAGGSGEEYKA，HVR6 具有序列 PGTSDNSSEINL，并且 HVR7 具有序列 GTNSTYQGVKITNGNDGAEESEWEKDDA。在Ad48 中，HVRl 具有序列 EKKNGGGSDANQMQTHTFGVAAMGGIEITA， HVR2具有序列GIDATKEEDNGKE，HVR3具有序列NWQDSDN，HVR4具有序列 AKFKTPEKEGEEPKE, HVR5 具有序列 FDIPSTGTGGNGTNVNFKP，HVR6 具有序列 PGKEDASSESNL,并且 HVR7 具有序列 GTNAVYQGVKVKTTNNTEWEKDTA。可以通过与Ad5序列单独比对，或者直接通过图12来鉴定其它血清型中对应的 HVRs。当将给定的六邻体蛋白与参考六邻体蛋白比对以获得最大序列同一性时，可能 会鉴定出如图12所示鉴定支架序列和HVRs。参考六邻体蛋白可以是如图12所示的任 何六邻体蛋白，例如Ad5。因此，全长六邻体蛋白具有7个HVRs和8个支架区。用 于本发明的六邻体蛋白优选地具有与例如Ad5的至少一种图12显示出序列的六邻体蛋白 的对应支架区具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%,至少90%或至少95%的同一性的支架区。Ad5六邻体蛋白的全长序列为
1MATPSMMPQW SYMHISGQDA SEYLSPGLVQ FARATETYFS LNNKFRNPTV APTHDVTTDR61SQRLTLRFIP VDREDTAYSY KARFTLAVGD NRVLDMASTY FDIRGVLDRG PTFKPYSGTA121YNALAPKGAP NPCEWDEAAT ALEINLEEED DDNEDEVDEQ AEQQKTHVFG QAPYSGINIT181KEGIQIGVEG QTPKYADKTF QPEPQIGESQ WYETEINHAA GRVLKKTTPM KPCYGSYAKP241TNENGGQGIL VKQQNGKLES QVEMQFFSTT EAAAGNGDNL TPKVVLYSED VDIETPDTHI301SYMPTIKEGN SRELMGQQSM PNRPNYIAFR DNFIGLMYYN STGNMGVLAG QASQLNAVVD361LQDRNTELSY QLLLDSIGDR TRYFSMWNQA VDSYDPDVRI IENHGTEDEL PNYCFPLGGV421INTETLTKVK PKTGQENGWE KDATEFSDKN EIRVGNNFAM EINLNANLWR NFLYSNIALY481LPDKLKYSPS NVKI SDNPNT YDYMNKRVVA PGLVDCYINL GARWSLDYMD NVNPFNHHRN541AGLRYRSMLL GNGRYVPFHI QVPQKFFAIK NLLLLPGSYT YEWNFRKDVN MVLQSSLGND601LRVDGASIKF DSICLYATFF PMAHNTASTL EAMLRNDTND QSFNDYLSAA NMLYPIPANA661TNVPISIPSR NWAAFRGWAF TRLKTKETPS LGSGYDPYYT YSGSIPYLDG TFYLNHTFKK721VAITFDSSVS WPGNDRLLTP NEFEIKRS VD GEGYNVAQCN MTKDWFLVQM LANYNIGYQG781FYIPESYKDR MYSFFRNFQP MSRQVVDDTK YKDYQQVGIL HQHNNSGFVG YLAPTMREGQ841AYPANFPYPL IGKTAVDSIT QKKFLCDRTL WRIPFSSNFM SMGALTDLGQ NLLYANSAHA901LDMTFEVDPM DEPTLLYVLF EVFDVVRVHQPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT(登录号 AAW65514.1 ； GI: 58177707)Ad5六邻体蛋白中的氨基酸位置可以如该序列所示地编号。然而，有时使用替 代的编号，其中不计算起始的甲硫氨酸残基；随后的Ala残基被指定为位置1。因此，例 如，根据所用的编号系统，上文所示序列中位置451处的谷氨酸残基可以被指定为E450 或E451。然而，在上下文考虑时，在整个本说明书中，哪种编号应用于任何给定残基是 清楚的。HVR为可变的序列，通常其天然包含约7至约60个氨基酸。然而，据信可以 允许不同长度的HVRs。HVR可以但不是必须与图12所示的血清型的HVR具有大于约 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%或 95%的序列同一性。HVR的长度可以为5至150个氨基酸。通常，其长度为约5至约100个氨基 酸。例如，其长度可以为约7个氨基酸至约60个氨基酸(“约”表示+/-10%)。
例如，HVRl可以为约20至约60个氨基酸，例如21至54个氨基酸。 HVR2可以为约5至约20个氨基酸，例如8至14个氨基酸。
HVR3可以为约5至约15个氨基酸 HVR4可以为约5至约25个氨基酸 HVR5可以为约5至约25个氨基酸 HVR6可以为约5至约20个氨基酸
例如7至9个氨基酸。 例如6至18个氨基酸。 例如9至20个氨基酸。 例如11至14个氨基酸。 HVR7可以为约15至约35个氨基酸，例如21至29个氨基酸。 在HVRl中，在对应于Ad5六邻体蛋白的Alal71[在上文提供的登录号为
AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Alal72]的位置处具有Ala残基是可取的。另外地或可选地，在对应于Ad5六邻体蛋白的Ilel78[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Ilel79]的位置处具有Ile残基是可取的。在HVR5中，在对应于Ad5六邻体蛋白的Phe266[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Phe267]的位置处具有Phe残基是可取 的。另外地或可选地，在对应于Ad5六邻体蛋白的Phe265[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Phe266]的位置处具有Phe或Tyr残基是可 取的。在HVR6中，在对应于Ad5六邻体蛋白的Ser310[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Ser311]的位置处具有Ala或Ser残基， 和/或在对应于Ad5六邻体蛋白的Aot309[在上文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Aot310]的位置处具有Ser或Aot残基，和/或在对应于Ad5六 邻体蛋白的Met314[在上文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示 为Met315]的位置处具有Met或Leu残基是可取的。在HVR7中，在对应于Ad5六邻体蛋白的Trp438[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Trp439]的位置处具有Trp残基是可取 的。另外地或可选地，在对应于Ad5六邻体蛋白的Val428[在上文提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为Val429]的位置处具有Val或Ile残基是可取的。在一些实施方案中，当相对于野生型或母体HVR序列进行突变(如取代或缺失) 时，所得的HVR与野生型或母体HVR的差别为最多5个残基是可取的，例如最多4个残 基、最多3个残基、最多2个残基或者最多1个残基。因此，例如，修饰过的Ad5六邻体蛋白可以含有HVR3、HVR5和/或HVR7， 它们与野生型Ad5HVR3、HVR5和/或HVR7序列的差别为最多5个残基，例如最多4
个残基、最多3个残基、最多2个残基或者最多1个残基。例如，HVR5序列与野生型HVR5序列的差别为最多5个残基、4个残基、3个 残基、2个残基或者1个残基，这包括对应于Ad5HVR5的位置269和/或270的残基[在 上文提供的登录号为AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示为Thr270和Glu271]。 所述HVR5序列可以在这些位置处具有残基Pro和/或Gly。野生型HVR序列可以为 Ad5HVR5。HVR7序列与野生型HVR7序列的差别为最多5个残基、4个残基、3个残基、
2个残基或者1个残基，这包括对应于Ad5HVR7的位置420、422、423和425[在上文提 供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示为位置421、423、424和426] 中的一个或多个的残基。所述HVR7序列可以在这些位置处具有残基420Gly、422Asn, 423Ser和/或425Tyr中的一个或多个。因此，考虑为整体的六邻体蛋白可以与图12中的六邻体蛋白之一(如Ad5)的整 体序列具有至少60%的同一性，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%,至少90%或至少95%的同一性，但是其不需要达到这样，只要支架序列具有所需 程度的同一性。嵌合六邻体蛋白包含来自第一血清型的支架片段以及至少一个来自第二血清型的HVR。例如，嵌合六邻体蛋白可以含有来自Ad2或Ad5血清型的支架，例如Ad5 血清型，以及来自另一血清型的HVRs3、5和7中的一个或多个，特别是HVR5和/或 HVR7。所述其它血清型可以为(例如)Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48，例如Ad26或Ad48。在一些实施方案中，仅HVR5、仅HVR7或者仅HVR5和 HVR7来自其它血清型，并且其它HVRs来自与支架相同的血清型是可取的。然而，支架和HVR都可以含有相对于图12所示的序列的修饰或突变，例如取 代。能够与FX Gla结合的六邻体片段可以包含如图12所示的六邻体蛋白的至少20、 至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至 少800或至少900个连续氨基酸，或其变体，所述变体如上文所述，除了支架区，与图12 所示的任何序列具有至少60%的序列同一性。所述六邻体片段可以包含至少1个HVR， 并且可以包含2、3、4、5、6或7个HVRs。应当理解，图12没有示出相关六邻体蛋白的第一或最终(第8)支架区的全长序 列。应当理解，当规定了与特定支架区的序列同一性的程度时，其意指那些区的全长序 列，而不是简单地意指图12所示的那些区的片段。因子 X(FX)FX是凝血因子，其含有Gla、EGFU EGF2和丝氨酸蛋白酶(SP)结构域。FX
蛋白的结构域结构示于图1中，并且来自不同物种的FX的代表性序列示于图13中。Gla结构域含有45个氨基酸，包括许多遗传编码的谷氨酸残基，它们全部转变 为Y-羧基谷氨酸。Gla结构域已被发现参与到与六邻体蛋白的相互作用。分离的Gla结 构域(或其能够与六邻体蛋白结合的片段)发现了在本发明许多方面的用途。该Gla结构 域可以与诸如人Gla结构域的图13种所示的Gla结构域之一具有至少80%、至少85%、 至少90%或至少95%的序列同一性。通常，Y-羧基谷氨酸残基是保守的，因为它们被 认为在钙结合中起作用，并且与六邻体蛋白的相互作用是钙依赖性的。依赖于Gla与六 邻体之间相互作用的体外实施的方法通常在钙离子的存在下发生。包含Gla结构域的构建 体还可以包含一个或多个来自FX的其它结构域，例如EGFl结构域，但是可能也有EGF2 结构域。通常，它们不包含SP结构域，但是如果存在SP，则SP可以包含减少或去除与 硫酸类肝素蛋白多糖结合的突变或修饰。EGFl结构域、EGF2结构域或SP结构域可以 与图13所示的对应结构域之一具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列 同一性。因子X结合蛋白因子X结合蛋白(X-bp)是分离自尖吻蝮的蛇毒的蛋白。其与FXGla结构域结 合，并且能够抑制与六邻体蛋白的相互作用。因子X结合蛋白由两个亚基组成。亚基的 序列和与FX的复合物的结构示于Mizuno et al.，2001。因此，链A被认为具有以下序列DCSSGWSSYE GHCYKVFKQS KTWADAESFC TKQVNGGHLV SIESSGEADF VGQLIAQKIKSAKIHVWIGL RAQNKEKQC S IEWSDGSSIS YENWIEEESK KCLGVHIETG FHKWENFYCEQQDPFVCEA链B 被认为具有以下序列DCPSDWSSYE GHCYKPFNEP KNWADAENFCTQQHTGSHLV SFQSTEEADF VVKLAFQTFDYGIFWMGLSK IWNQCNWQWS NAAMLKYTDW AEESYCVYFK STNNKWRSIT CRMIANFVCEFQA本发明涉及X-bp的类似物的使用，所述类似物含有相对于上文给出的序列的一 个或多个修饰或者突变，但是保留与FX Gla结合的能力。例如，这样的类似物可以包含 与链A具有至少80 %的序列同一性的第一多肽链以及与链B具有至少80 %的序列同一性 的第二多肽链，其中所述类似物能够与FX Gla结合。所述类似物保留链A的E98和KlOO和/或链B的K100、N103、R107和Rl 12 中的一个或多个是可取的，因为这些残基被认为参与接触Gla结构域。保留链A 的 S20、S61、A62、K63、H65、E99、E115、N116、F117、Y118、 E120、Q12U Q122、D123 以及链 B 的 Y61、163、Y95、Y98、S108 中的一个或多个也
是可取的，因为这些残基被认为参与Gla结合中与水分子的相互作用。这些位点处的保 守性取代是可以接受的。序列同源件、突变和修饰本说明书中涉及特定氨基酸序列的突变或修饰可以包括点突变，即特定氨基酸 的缺失、取代和插入。非保守性取代可能特别适合于产生具有改变的与FX的结合的六邻 体变体，因为具有非保守性突变的突变体或变体比具有保守性取代的突变体或变体更不 可能保留原始功能。然而，保守性取代在产生变体六邻体蛋白中也可以是有用的，例如 在支架区。保守性突变还可以见于含有FX(如Gla)序列或X-bp序列的构建体中，其目 的是要保留野生型功能，例如与六邻体或Gla结合。然而，应当清楚，修饰不需要总是涉及点突变。例如，修饰可以涉及将氨基酸 序列段交换为氨基酸序列代替段，所述氨基酸序列代替段具有相同或不同的长度，并且 与原始序列具有或多或少的序列同一性。例如，用随机产生的序列代替HVR序列是可取 的，目的是测试改变的Gla结合。实际上，可以生成测试蛋白的群体(如“文库”)用 于筛选，从而鉴定具有所需结合性质的合适序列，每种测试蛋白包含诸如HVR的给定区 中的不同序列。技术人员应当熟知用于这样的文库的构建和筛选的合适技术。保守性取代可以定义为一种氨基酸类别中的取代和/或如下文所示在 BLOSUM62矩阵中得分为正的取代，因此非保守性取代可以定义为氨基酸类别间的取代 或在BLOSUM62矩阵中得分不为正的取代。根据一种分类，氨基酸类别为酸性、碱性、不带电极性和非极性的，其中酸性 氨基酸为Asp和Glu;碱性氨基酸为Arg、Lys和His ；不带电极性氨基酸为Asn、Gin、 Ser、Thr 禾PTyr ；以及非极性氨基酸为 Ala、Gly、VaL Leu、lie、Pro、Phe> Met、Trp 和 Cys。根据另一分类，氨基酸类别为小亲水、酸/酰胺/亲水、碱性、小疏水和芳香 的，其中小亲水氨基酸为Ser、Thr, Pro、Ala和Gly ；酸/酰胺/亲水氨基酸为Am、 Asp> Glu和Gln;碱性氨基酸为His、Arg和Lys ；小疏水氨基酸为Met、lie、Leu和 Val ；以及芳香氨基酸为Phe、Tyr和Trp。在BLOSUM62矩阵中得分为正的保守性取代如下
权利要求
1.抑制肝细胞或脾细胞的腺病毒转导的方法，其包括使所述肝细胞或脾细胞与所述 腺病毒在能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂的存在下接触。
2.如权利要求1所述的方法，其包括给予个体所述试剂和所述腺病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其包括在给予所述腺病毒前，用所述试剂预处理所述个体。
4.如权利要求2所述的方法，其包括在给予前，将所述试剂与所述腺病毒预先混合。
5.如权利要求1所述的方法，其是在含有FX的环境中体外或离体实施的。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述腺病毒含有抑制所述腺病毒与柯萨奇病毒和腺 病毒受体(CAR)结合的突变。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述肝细胞是不具有CAR表达或具 有低CAR表达的细胞，例如SKOV3细胞。
8.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抑制剂与FX的Gla结构域结合。
9.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抑制剂选自(i)来自尖吻蝮(Deinagkistrodonacutus)的FX结合蛋白(X_bp)或其能够与FX结合并抑制与六邻体蛋白的相互作用的功能性片段；(ii)特异性针对FX的抗体，例如特异性针对FX的Gla结构域的抗体；或者(iii)可溶性分子，其包含能够结合FXGla的腺病毒六邻体蛋白的至少一个片段，所 述分子可以是全长六邻体蛋白，或者可以包含全长六邻体蛋白。
10.如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述抑制剂与腺病毒六邻体 蛋白结合。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述抑制剂为ω特异性针对六邻体蛋白的抗体，例如特异性针对所述六邻体蛋白的HVR的抗 体；或者(ii)FX类似物，其包含足以与六邻体蛋白结合的Gla结构域的片段，并且缺乏SP结 构域或者包含所述SP结构域的修饰使得它不能介导腺病毒与肝细胞或脾细胞之间的相互 作用。
12.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述腺病毒或六邻体蛋白是 Ad2或Ad5血清型的。
13.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述腺病毒是基因转移载体或 意图用作基因转移载体。
14.能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂在制备用于抑制肝细胞 或脾细胞的腺病毒感染的药物中的用途。
15.能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂，其用于抑制肝细胞或 脾细胞的腺病毒感染。
16.能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂，其用于医学治疗方法。
17.药物制剂，其包含能够抑制FX与腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂以及 腺病毒，所述试剂和腺病毒都与药学上可接受的载体组合。
18.试剂盒，其包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含能够抑制FX与 腺病毒六邻体蛋白之间的相互作用的试剂和腺病毒，所述第二组合物包含腺病毒。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中每种组合物为包含各自的抑制剂或腺病毒以及 药学上可接受的载体的药物组合物。
20.将基因递送至靶细胞或靶组织的方法，其包括使所述细胞或组织与腺病毒基因转 移载体和靶向剂接触，其中所述靶向剂包含能够与所述腺病毒基因转移载体的六邻体蛋 白结合的FXGla结构域的片段，与能够结合所述靶细胞或靶组织的结合剂连接。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述靶向剂包含FX组分，所述FX组分包含完 整的FX Gla结构域。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述FX组分包含Gla-EGFl或 Gla-EGF 1-EGF2，或者由 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2 组成。
23.如权利要求20至22中任一权利要求所述的方法，其中所述FX组分不包含FXSP 结构域，或者包含修饰，使得FX结构域不能介导腺病毒与肝细胞或脾细胞之间的相互作用。
24.如权利要求20至23中任一权利要求所述的方法，其中所述结合剂包含表达于所 述靶细胞或靶组织表面的分子的配体或受体，或其足以与所述分子结合的片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述结合剂包含特异性针对表达于所述细胞或组 织表面的任何分子的抗体或适体，表达于所述细胞或组织表面的受体的配体，或者能够 与存在于所述细胞或组织表面的碳水化合物结合的凝集素。
26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中与所述结合剂所结合的结合伴侣 对于靶细胞类型是特异性的，例如肿瘤特异性抗原。
27.如权利要求20至26中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向剂为融合蛋白， 所述融合蛋白包含单一多肽链，所述多肽链包含所述结合剂与所述FX组分。
28.如权利要求20至27中任一权利要求所述的方法，其包括在给予所述腺病毒前， 用所述靶向剂预处理个体。
29.如权利要求20至27中任一权利要求所述的方法，其包括在给予前将所述靶向剂 与所述腺病毒预先混合。
30.如权利要求20至29中任一权利要求所述的靶向剂。
31.如权利要求20至29中任一权利要求所述的靶向剂在制备用于通过腺病毒向靶细 胞或靶组织进行基因转移的药物中的用途。
32.如权利要求20至29中任一权利要求所述的靶向剂，其用于通过腺病毒向靶细胞 或靶组织进行基因转移。
33.如权利要求20至29中任一权利要求所述的靶向剂，其用于医学治疗的方法。
34.药物制剂，其包含如权利要求20至29中任一权利要求所述的靶向剂以及腺病 毒，所述靶向剂和腺病毒都与药学上可接受的载体组合。
35.试剂盒，其包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含如权利要求20至 29中任一权利要求所述的靶向剂，所述第二组合物包含腺病毒。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中每种组合物为包含各自的靶向剂或腺病毒以及 药学上可接受的载体的药物组合物。
37.筛选能够调节肝细胞或脾细胞的腺病毒转导的试剂的方法，其包括使测试试剂与 第一物质和第二物质接触，所述第一物质包含能够结合FX的腺病毒六邻体蛋白的片段， 所述第二物质包含能够结合腺病毒六邻体蛋白的FX Gla结构域的片段，以及测定所述六 邻体片段与所述FX Gla片段之间的结合。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第一物质包含⑴至少一个HVR ；(ii)任选地具有中间支架序列的2个或更多个(如2个、3个、4个、5个、6个或7 个)HVRs;或者(iii)完整的六邻体蛋白。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述六邻体蛋白或其片段具有野 生型序列，例如Ad2或Ad5血清型的。
40.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述六邻体蛋白或其片段在所述 支架或HVRs中含有相对于野生型六邻体蛋白的一个或多个突变或者修饰。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述六邻体蛋白或其片段在HVR中含有相对于 对应的野生型HVR的一个或多个点突变，所述点突变调节与FX的结合。
42.如权利要求37至39中任一权利要求所述的方法，其中HVR3、HVR5和/或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48。
43.如权利要求37至42中任一权利要求所述的方法，其中所述第二物质包含 FX Gla-EGF 1、Gla_EGFl_EGF2 或 Gla_EGFl-EGF2-SP，或者由 FXGla-EGFl、 Gla-EGF 1-EGF2 或 Gla_EGFl-EGF2-SP 组成。
44.如权利要求37至43中任一权利要求所述的方法，其包括在存在和不存在所述测 试试剂的情况下，确定所述六邻体片段与所述FXGla片段间的结合，以及如果结合在存 在所述试剂与不存在所述试剂的情况下不同，则选择所述测试试剂。
45.如权利要求44所述的方法，其在鉴定出或选择了合适的测试试剂后，包括以下另 外的步骤使所述测试试剂与肝细胞或脾细胞及腺病毒接触，以及确定所述肝细胞或脾 细胞的所述腺病毒转导。
46.如权利要求45所述的方法，其包括在存在和不存在所述测试试剂的情况下，比较 所述肝细胞或脾细胞的所述腺病毒转导。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述腺病毒为携带报告基因的基因转移载 体，所述报告基因的表达在转导的肝细胞或脾细胞中是可检测的。
48.筛选具有改变的FX亲和力的腺病毒六邻体蛋白的方法，其包括提供包含能够结合FX的腺病毒六邻体蛋白的片段的物质；使所述物质与能够结合腺病毒六邻体的FX Gla结构域的片段接触；以及确定所述六邻体片段与所述FX Gla片段之间的结合。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述物质包含⑴至少一个HVR ；(ii)任选地具有中间支架序列的2个或更多个(如2个、3个、4个、5个、6个或7 个)HVRs;或者(iii)完整的六邻体蛋白。
50.如权利要求48或49所述的方法，其包括提供至少第一和第二所述物质，每种物质包含各自的第一和第二腺病毒六邻体片段；使每种所述物质与能够结合六邻体蛋白的FX Gla结构域的片段接触；以及确定每种所述六邻体片段与所述FX Gla片段之间的结合。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述第一六邻体片段与所述第二六邻体片段除了 一个或多个HVR序列以外是相同的。
52.如权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述第二六邻体片段在HVRs3、 5和7的一个或多个中包含相对于所述第一六邻体片段的一个或多个突变或者修饰。
53.如权利要求50至52中任一权利要求所述的方法，其中所述第二六邻体片段在对 应于以下的残基处含有相对于所述第一六邻体片段的一个或多个突变(如取代、缺失或 添加)⑴Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707 的序列中显示为 Thr269、Thr270 和 Glu271]；(ii)Ad5六邻体蛋白的 Ile420、Asn42U Thr422、Glu423、Thr424、Leu425、Asp447 或 Lys448[在登录号为 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中显示为 Ile421、Asn422、 Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 或 Lys449];(iii)Ad5 六邻体蛋白的 Glu450、Arg452 和 Val453[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中显示为Glu451、Arg453和Val454]；和/或(iv)Ad5六邻体蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216, Ser267、 Met314、Asn421、Thr426、Ser446 或 Asn449[在登录号为 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中显示为 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、 Asn422、Thr427、Ser447 或 Asn450]。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述第二六邻体片段在对应于Thr269的位置处 含有Pro或Asp，和/或在对应于Glu270的位置处含有Gly或Ser。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述第二六邻体片段在对应于Ile420、Thr422、 Glu423和Leu425中的1个、2个、3个或全部4个的残基处含有突变。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述第二六邻体片段在对应于Ile420的位置处含 有Gly，在对应于Thr422的位置处含有Aot，在对应于Glu423的位置处含有Ser或Ala， 和/或在对应于Leu425的位置处含有Tyr。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述第二六邻体片段在对应于Ad5的Glu450[在 以下提供的登录号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中显示为Glu451]的位置处含有 突变，并且其中在该位置处引入中性或带正电荷的残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg 或 Lys。
58.如权利要求51所述的方法，其中所述第一六邻体片段具有野生型六邻体序列，并 且所述第二六邻体片段具有嵌合六邻体序列，所述嵌合六邻体序列包含来自所述第一六 邻体蛋白的支架序列和来自不同野生型六邻体蛋白的一个或多个HVRs。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述第二六邻体片段的HVR3、HVR5和HVR7 的一个或多个与所述支架序列源自不同的血清型。
60.如权利要求58或权利要求59所述的方法，其中所述第一六邻体片段是血清型Ad2 或Ad5的。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述第二六邻体序列具有嵌合六邻体序列，所述 嵌合六邻体序列包含来自Ad2或Ad5的支架片段和至少一个来自Adl7、Ad20、Ad25、 Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一个的 HVR 序列。
62.如权利要求48至61中任一权利要求所述的方法，其还包括选择含有具有所需的 Gla或FX结合特性的片段的物质，生成含有包含各自片段的六邻体蛋白的腺病毒，使所 述腺病毒与肝细胞或脾细胞接触，以及确定所述肝细胞或脾细胞的所述腺病毒转导。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述腺病毒为携带报告基因的基因转移载体，所 述报告基因的表达在转导的肝细胞或脾细胞中是可检测的。
64.筛选具有改变的转导肝细胞或脾细胞的能力的腺病毒的方法，其包括提供包含第一六邻体蛋白的第一腺病毒；提供包含第二六邻体蛋白的第二腺病毒；以及比较所述第一腺病毒与所述第二腺病毒转导肝细胞或脾细胞的能力，其中所述第 一六邻体蛋白与所述第二六邻体蛋白的差别在于(i)HVR3序列和HVR7序列中的一个或多个；(ii)HVR5中对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中显示为Thr269、Thr270和Glu271]的残基处的点突变；(iii)所述支架序列中对应于Ad5六邻体蛋白的Ser267、Met314、Asn42UThr426、 Ser446、Asn449, Glu450、Arg452 和 Val453[在登录号为 AAW65514.1 ; GI : 58177707 的序列中显示为 Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447、Asn450, Glu451、Arg453 和Val454]的残基处的一个或多个氨基酸；和/或(iv)修饰过的六邻体蛋白为嵌合六邻体蛋白，其中HVR5源自与母体六邻体蛋白不 同的血清型的六邻体蛋白。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白与所述第二六邻体蛋白除了 所述差别以外是相同的。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述第一腺病毒与所述第二腺病毒除了所述差别 以外是相同的。
67.如权利要求64至66中任一权利要求所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白与所 述第二六邻体蛋白的差别在于位于HVR7中的对应于Ad5六邻体蛋白的Ile420、Asn42U Thr422, Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或 Lys448[在登录号为 AAW655Ill ; GI : 58177707 的序列中表示为 Ile421、Asn422、Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]残基处的一个或多个突变，或者位于HVR3中的对应于Ad5六邻体蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216[在登录号为 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中显示为 Glu213、Thr214、 Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和 Asn450]残基 处的一个或多个突变。
68.如权利要求64至67中任一权利要求所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白与所述第二六邻体蛋白的差别在于对应于Ad5的Glu450[在以下提供的登录号为 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中显示为Glu451]的位置处的突变，并且其中所述第 二六邻体蛋白在该位置携带中性或带正电荷的残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或 Lys。
69.如权利要求64至66中任一权利要求所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白为野 生型六邻体蛋白，并且所述第二六邻体蛋白为嵌合六邻体蛋白，所述嵌合六邻体蛋白具 有来自所述第一六邻体蛋白的支架序列和来自至少一种不同野生型六邻体蛋白的HVR3、 HVR5和HVR7的至少一个。
70.如权利要求69所述的方法，其中HVR3、HVR5和HVR7中的一个或多个与所述 支架源自不同的血清型。
71.如权利要求69或权利要求70所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白是血清型Ad2 或Ad5的，并且所述第二六邻体蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的一个或多个源自血清 型 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中的一种或多种。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述第一六邻体蛋白是血清型Ad5的，并且 HVR5和HVR7之一或两者源自Ad26。
73.如权利要求64至72中任一权利要求所述的方法，其包括提供编码所述第一六邻 体蛋白的第一核酸序列，并且修饰所述第一核酸以产生编码所述第二六邻体蛋白的第二 核酸序列。
74.如权利要求64至73中任一权利要求所述的方法，其包括使至少分别的第一肝细 胞和第二肝细胞或者第一脾细胞和第二脾细胞与至少所述第一腺病毒和所述第二腺病毒 在FX的存在下体外接触，并确定所述细胞的所述腺病毒转导。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述腺病毒包含减少与CAR结合的突变，和/或 其中所述肝细胞为具有低CAR表达或不具有CAR表达的细胞类型，例如SKOV3细胞。
76.如权利要求74所述的方法，其包括将所述第一腺病毒和所述第二腺病毒给予分别 的第一非人个体和第二非人个体，并确定肝细胞或脾细胞的转导。
77.如权利要求64至76中任一权利要求所述的方法，其包括选择具有改变的(如增 强的或降低的)肝细胞或脾细胞转导的腺病毒。
78.调节腺病毒的肝或脾感染性的方法，其包括提供母体腺病毒六邻体蛋白；修饰所述母体六邻体蛋白以产生具有改变的FX亲和力的修饰过的六邻体蛋白；以及产生包含所述修饰过的六邻体蛋白的腺病毒；从而所述腺病毒与包含所述母体六邻体蛋白的腺病毒相比，具有改变的转导肝细胞 或脾细胞的能力，其中所述母体六邻体蛋白与所述修饰过的六邻体蛋白的差别在于(i)HVR3和HVR7中的一个或多个；(ii)HVR5中对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中显示为Thr269、Thr270和Glu271]的残基处的点突变；(iii)所述支架序列中对应于Ad5六邻体蛋白的Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446、Asn449、Glu450、Arg452 和 Val453[在登录号为 AAW65514.1 ; GI : 58177707的序列中显示为 Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447、Asn450、Glu451、Arg453 和Val454]的残基处的一个或多个氨基酸；和/或(iv)所述修饰过的六邻体蛋白为嵌合六邻体蛋白，其中HVR5源自与所述母体六邻 体蛋白不同的血清型的六邻体蛋白。
79.修饰过的腺病毒六邻体蛋白，其与母体六邻体蛋白的差别在于(i)HVR3和HVR7中的一个或多个；(ii)HVR5中对应于Ad5六邻体蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登录号为 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中显示为Thr269、Thr270和Glu271]的残基处的点突变；(iii)所述支架序列中对应于Ad5六邻体蛋白的Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446、Asn449、Glu450、Arg452 和 Val453[在登录号为 AAW65514.1 ; GI : 58177707 的序列中显示为 Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447、Asn450、Glu451、Arg453 和Val454]的残基处的一个或多个氨基酸；和/或(iv)所述修饰过的六邻体蛋白为嵌合六邻体蛋白，其中HVR5源自与所述母体六邻 体蛋白不同的血清型的六邻体蛋白；从而包含所述修饰过的六邻体蛋白的腺病毒与包含所述母体六邻体蛋白的其它方面 相同的腺病毒相比，具有改变的转导肝细胞或脾细胞的能力。
80.如权利要求78或权利要求79所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体六邻体蛋 白与所述修饰过的六邻体蛋白除了所述差别以外是相同的。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述母体腺病毒与所述修饰过的腺病毒除了所述 差别以外是相同的。
82.如权利要求78至81中任一权利要求所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体 六邻体蛋白与修饰过的六邻体蛋白的差别在于位于HVR7中的对应于Ad5六邻体蛋白 的 Ile420、Asn421、Thr422、Glu423、Thr424、Leu425、Asp447 或 Lys448[在登录号 为 AAW65514.1 ; GI 58177707 的序列中显示为 Ile421、Asn422、Thr423、Glu424、 Thr425、Leu426、Asp448和Lys449]残基处的一个或多个突变，或者位于HVR3中的对应于Ad5六邻体蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216[在登录号为 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中显示为 Glu213、Thr214、 Glu215、Ile216、Asn217, Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和 Aot450]残基 处的一个或多个突变。
83.如权利要求82所述的方法或六邻体蛋白，其中所述修饰过的六邻体蛋白在对应于 Thr269的位置处含有Pro或Asp，和/或在对应于Glu270的位置处含有Gly或Ser。
84.如权利要求82所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体六邻体蛋白与所述修饰过 的六邻体蛋白的差别在于对应于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425中的1个、2个、3个 或全部4个的残基处的突变。
85.如权利要求84所述的方法或六邻体蛋白，其中所述修饰过的六邻体蛋白在对应于 Ile420的位置处含有Gly，在对应于Thr422的位置处含有Asn，在对应于Glu423的位置 处含有Ser或Ala，和/或在对应于Leu425的位置处含有Tyr。
86.如权利要求78至85中任一权利要求所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体六邻体蛋白与所述修饰过的六邻体蛋白的差别在于对应于Ad5的Glu450[在以下提供的登录 号为AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中显示为Glu451]的位置处的突变，并且其中所 述修饰过的六邻体蛋白在该位置携带中性或带正电荷的残基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg 或 Lys。
87.如权利要求78至86中任一权利要求所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体六 邻体蛋白为野生型六邻体蛋白，并且所述修饰过的六邻体蛋白为嵌合六邻体蛋白，所述 嵌合六邻体蛋白具有来自所述母体六邻体蛋白的支架序列以及来自至少一种不同的野生 型六邻体蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的至少一个。
88.如权利要求87所述的方法或六邻体蛋白，其中HVR3、HVR5和HVR7中的一个 或多个与所述支架源自不同的血清型。
89.如权利要求88所述的方法或六邻体蛋白，其中所述母体六邻体蛋白是血清型Ad2 或Ad5的，并且所述修饰过的六邻体蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的一个或多个源自 血清型 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中的一种或多种。
90.如权利要求89所述的方法或六邻体蛋白，其中所述第一六邻体蛋白是血清型Ad5 的，并且HVR5和HVR7之一或两者源自Ad26。
91.如权利要求78或者80至90中任一权利要求所述的方法，其包括提供编码所述母 体六邻体蛋白的第一核酸序列，并且修饰所述第一核酸以产生编码所述修饰过的六邻体 蛋白的第二核酸序列。
92.核酸，其编码如权利要求79至90中任一权利要求所述的修饰过的六邻体蛋白。
93.包含如权利要求92所述的核酸的表达载体。
94.包含如权利要求92所述的核酸或如权利要求93所述的表达载体的宿主细胞。
95.包含如权利要求79至90中任一权利要求所述的修饰过的六邻体蛋白的腺病毒。
96.通过如权利要求78或者80至91的任一中所述的方法产生的修饰过的腺病毒。
97.如权利要求95或96所述的腺病毒，其是基因递送载体。
98.如权利要求97所述的腺病毒，其用于医学治疗方法。
99.如权利要求97所述的腺病毒，其用于基因递送方法。
100.如权利要求97所述的腺病毒在制备用于基因递送或基因治疗的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于调节腺病毒对肝细胞和诸如脾细胞的其它细胞类型的向性的材料和方法。本发明涉及以下发现病毒六邻体蛋白的高变区(HVRs)与凝血因子FX的Gla结构域相互作用作为体内感染过程的部分。本发明提供了破坏六邻体与FX相互作用，从而减少肝细胞与脾细胞的感染的手段，以及包含Gla结构域或其片段从而将腺病毒载体定向于所需的靶细胞或靶组织类型的靶向剂的用途。
文档编号A61K38/16GK102014948SQ200980112169
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月9日 优先权日2008年2月7日
发明者安德鲁·贝克, 约翰·麦克维, 西蒙·沃丁顿 申请人:安德鲁·贝克, 约翰·麦克维, 西蒙·沃丁顿